能够与人和非人cd3结合的cd3结合分子的制作方法
【专利摘要】展示了能够与人和非人CD3结合的CD3结合分子，并特别是与非人哺乳动物(例如，食蟹猴)的CD3交叉反应的此类分子。展示了此类抗体和抗原结合片段在治疗癌症、自身免疫性和/或炎性疾病和其他病症中的用途。
【专利说明】能够与人和非人CD3结合的CD3结合分子
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求美国专利申请号61/488,716 (2011年5月21日提交；待审)和61/530, 353 (2011年9月I日提交；待审)的优先权，这两个申请各自都通过引用整体并入本文。
[0003]序列表的引用
[0004]根据37C.F.R.1.821et seq.，本申请包括一个或多个序列表，其以纸质和计算机可读介质两种形式被公开， 并通过引用将该纸质和计算机可读公开内容整体并入本文。
[0005]发明背景
发明领域
[0006]本发明涉及能够与人和非人CD3结合的CD3结合分子，并特别涉及与非人哺乳动物(例如，食蟹猴)的CD3交叉反应的此类分子。本发明还涉及此类抗体和抗原结合片段在治疗癌症、自身免疫性和/或炎性疾病和其他病症中的用途。
[0007]相关领域的描述
[0008]身体免疫系统用作针对多种病症，包括，例如，受伤、感染和瘤形成的防御，并由以下两个独立而相互关联的系统介导:细胞免疫系统和体液免疫系统。一般而言，体液系统由具有与被系统识别作为身体的外来物质的产物结合并中和该产物的能力的可溶性产物(抗体或免疫球蛋白)介导。相比之下，细胞免疫系统则包括起多种治疗作用的被称为T细胞的某些细胞的动员。T细胞是源自胸腺并在组织、淋巴系统和循环系统之间循环的淋巴细胞。它们针对或响应多种外来结构物(抗原)起作用。在许多情况下，这些外来抗原在宿主细胞上表达作为瘤形成或感染的结果。尽管T细胞自身不会分泌抗体，但它们通常是第二类淋巴细胞B细胞(其源自骨髓)分泌抗体所需的。关键地，T细胞呈现非同寻常的免疫特异性以能够区分不同的抗原。
[0009]幼稚T细胞，例如，还未遇到其特异性抗原的T细胞，当其首次遇到抗原呈递细胞上的特异性肽:MHC复合物时被活化。抗原呈递细胞可以是B细胞、巨噬细胞或树突细胞。当幼稚T细胞遇到抗原呈递细胞上的特异性肽:MHC复合物时，信号经由引起T细胞的淋巴细胞功能相关抗原(LFA)分子的构象变化的T细胞受体传递，并增加了它们对存在于抗原呈递细胞表面的细胞间黏附分子(ICAM)的亲和力。由T细胞与抗原呈递细胞的相互作用产生的信号是活化幼稚T细胞必需的，但不是足够的。第二共刺激信号是必需的。幼稚T细胞仅可被表面携带特异性肽MHC复合物和共刺激分子的抗原呈递细胞活化。不存在共刺激时通过幼稚T细胞的抗原识别导致T细胞变成无变应性的。对两种信号的需要以活化T细胞和B细胞如此以致它们实现适应性免疫应答，可提供用于避免对存在于系统中可由T细胞识别的位置处的抗原呈递细胞上的自身抗原的应答的机制。在T细胞与抗原呈递细胞接触导致仅两种所需的信号之一产生的情况下，T细胞不会变为活化的且适应性免疫应答不会发生。
[0010]人和其他哺乳动物形成对病原体和外来物质的免疫应答具有的效率依赖于两种特征:对抗原识别的免疫应答的精确特异性，和当由相同的抗原再活化时允许较快和更有力的应答的免疫记忆(Portol6s, P.等人(2009) “The TCR/Q)3Complex:Opening theGate to Successful Vaccination,，，Current Pharmaceutical Designl5:3290-3300 ;Guy, C.S?等人(2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at theTCR:CD3Complex，”Immunol Rev.232(1):7-21)。T细胞应答的特异性通过由包含T细胞受体(“TCR”)和细胞表面受体配体CD3的分子复合物对抗原(展示在抗原呈递细胞上(APC))的识别介导。TCR是共价连接的a和P链的异二聚体(“TCRa ^ ”)。这些链是长度为259(a)和296 ( P )氨基酸的I类膜多肽。⑶3分子是包含缔合为三个二聚体(e Y、e S、;;)的 CD3 y 链、CD3 8 链和两个 CD3 e 链的复合物(Guy, C.S.等人(2009)“0rganizationof Proximal Signal Initiation at the TCR: CD3Complex,，，Immunol Rev.232 (I): 7-21 ；Call, M.E.等人(2007) “Common Themes In The Assembly And Architecture OfActivating Immune Receptors, Nat.Rev.1mmunol.7: 841-850 ；ffeiss, A.(1993) “TCell Antigen Receptor Signal Transduction:A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases,，，Cell73:209-212)。TCR 和 CD3 复合物，与 CD3 4 链(链一起(还称为T细胞受体T3(链或⑶247)构成TCR复合物(van der Merwe, P.A.等人(2010 年 12 月 3 日电子出版)“Mechanisms For T Cell Receptor Triggering,，，Nat.Rev.1mmunol.11:47-55 ；ffucherpfennig, K.ff.等人(2010) “Structural Biology ofthe T-cell Receptor:1nsights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, andInitiation of Signaling, ^Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2:a005140) ? 由于其包含大量的(10个)基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，该复合物特别重要。
[0011]在成熟T细胞中，由缔合至自身-MHC分子的外来抗原肽的TCR/CD3活化是用于抗原特异性T细胞的增殖和它们分化为效应或记忆T淋巴细胞所需的第一步。这些过程包括TCR复合物的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化。由于TCR复合物具有如此大量的ITAM (总计10个)，且这些ITAM串联排列(由于组成的链的二聚化)，在TCR连接时的相关酪氨酸残基的磷酸化创建了用于包含Src同源2 (SH2)结构域诸如70kDa的4链缔合蛋白(ZAP-70)的蛋白的成对的停泊位点，并从而启动导致T细胞活化和分化的放大信号级联(Guy，C.S.等人(2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at theTCR:CD3Complex, ” Immunol Rev.232(1):7-21)。
[0012]这些过程的结果由抗原刺激的强度和质量，及由通过共受体和共刺激表面分子传递的伴随信号的性质，或由细胞因子受体调节(Portol6s，P.等人(2009) “The TCR/CD3Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination,，，Current PharmaceuticalDesignl5:3290-3300 ；Riha, P.等人(2010)“CD28 Co-Signaling In The Adaptive ImmuneResponse, ” Self/Nonself I (3): 231-240)。尽管TCR刺激是用于T细胞活化的先决条件，公认的是共刺激分子诸如CD28的接合(engagement)是完全的T细胞活化和分化所需的(Guy, C.S.等人(2009)“0rganization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3Complex, ” Immunol Rev.232 (I): 7-21)。
[0013]由于CD3在启动抗抗原应答中的基本性质，针对该受体的单克隆抗体已被提出作为能够阻断或至少调节免疫过程并因此作为用于治疗炎性疾病和/或自身免疫性疾病的剂。事实上，抗CD3抗体是被批准用于人治疗的第一个抗体(St.Clair E.W.(2009) “Novel Targeted Therapies for Autoimmunity，，，Curr.0pin.1mmunol.21(6):648-657)。抗 CD3 抗体(由 Janssen-Cilag 作为 0RTH0CL0NEtm0KT3? 推向市场)已被施用以减少具有器官移植的患者中的急性排斥反应并作为用于成淋巴细胞性白血病的治疗(Cosimi，A.B.等人(1981) “Use Of Monoclonal Antibodies To T-CellSubsets For Immunologic Monitoring And Treatment In Recipients Of RenalAllografts，，，N.Engl.J.Med.305:308-314 ;Kung，P.等人(1979)Monoclonal antibodiesdefining distinctive human T cell surface antigens，，，Science 206:347-349 ；Vigeral, P.等人(1986) “Prophylactic Use Of 0KT3Monoclonal Antibody In CadaverKidney Recipients.Utilization Of 0KT3As The Sole Immunosuppressive Agent，”Transplantation41:730-733 ;Midtvedt，K.等人(2003) “Individualized T CellMonitored Administration Of ATG Versus 0KT3In Steroid-Resistant Kidney GraftRejection, ” Clin.Transplant.17(1):69-74 ；Gramatzki, M.等人(1995) “Therapy With0KT3Monoclonal Antibody In Refractory T Cell Acute Lymphoblastic LeukemiaInduces Interleukin-2Responsiveness, ” Leukemia9 (3): 382-390 ；Herold, K.C?等人(2002) “Anti_CD3Monoclonal Antibody In New-Onset TypelDiabetes Mellitus，”N.Engl.J.Med.346:1692-1698 ;Cole，M.S.等人(1997) “Human IgG2Variants Of ChimericAnti~CD3Are Nonmitogenic to T cells，，，J.1mmunol.159 (7): 3613-3621 ;Cole，M.S.等人(1999)‘‘Hum291，A Humanized Anti_CD3 Antibody, Is Immunosuppressive To T CellsWhile Exhibiting Reduced Mitogenicity in vitro，，，Transplantation68:563-571 ;美国专利号 6，491，916 ;5，585，097 和 6，706，265) ?
[0014] 然而，此抗⑶3治疗被证明不是足够特异以避免副作用(Ludvigsson，J.(2009)uThe Role of Immunomodu lation Therapy in Autoimmune Diabetes，，，J.DiabetesSc1.Technol.3(2):320-330) 0 0KT3的重复的日常施用导致极大的免疫抑制并在肾移植之后提供了排斥反应的有效治疗。0KT3的体内施用导致T细胞活化和免疫应答的抑制二者。然而，0KT3的使用已被与最初的T细胞活化事件和在T细胞应答的免疫抑制之前发生的细胞因子的紧接着的释放相关的首次毒性剂量反应综合征妨碍。报道的该小鼠单克隆抗体的首次和有时第二次注射之后的副作用包括由以下组成的“流感-样”综合征:高热、寒战、头痛和胃肠道症状(呕吐和腹泻)且在严重的病例中，已指出了在治疗的数小时内的肺水肿(Thistlethwaite，J.R.Jr.等人(1988) “Complications and Monitoring of0KT3Therapy，” Am.J.Kidney Dis.11:112-119)。该综合征被认为反映了 0KT3 介导的 T 细胞表面的TCR/CD3复合物的交联及所导致的细胞因子(例如，肿瘤坏死因子a (TNFa )、干扰素-Y、白介素IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-1O和粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子的释放(Masharani，U.B.等人(2010) uTeplizumab Therapy For TypelDiabetesj ExpertOpin.Biol.Ther.10 (3): 459-465 ；Abramowicz, D.等人(1989) “Release Of TumorNecrosis Factor, Interleukin-2, And Gamma-1nterferon In Serum After InjectionOf 0KT3Monoclonal Antibody In Kidney Transplant Recipients，，，Transplantation47:606-608 ；Ferran, C.等人(1990) “Cytokine-Related Syndrome Following InjectionOf Ant1-CD3Monoclonal Antibody:Further Evidence For Transient In Vivo T CellActivation，nEur.J.1mmunol.20:509-515 ;Hirsch，R.等人(12989) “Effects Of In VivoAdministration Of Ant1-CD3Monoclonal Antibody On T Cell Function In Mice.11.1nVivo Activation Of T Cells, ” J.1mmunol.142:737-743)。在美国专利号 7，883，703、7，728，114,7, 635，472,7, 575，923 和 7，381，903，及在美国专利公布号 2010/0150918、2010/0209437、2010/0183554、2010/0015142、2008/0095766、2007/0077246 及在 PCT 公布W02008/119567中公开了抗CD3抗体的使用。
[0015]在先抗体的特定局限性是它们仅对人CD3特异性。该局限性是对开发此类抗体作为用于治疗人类疾病的治疗剂的重要阻碍。为了获得市场准入，任何新的候选药物必须通过严格的测试。该测试可被再分为临床前和临床阶段。而后者-进一步再分为通常称为临床阶段1、II和II1-在人患者中执行，前者则在动物中执行。临床前测试的目的是为了证明该候选药物具有期望的活性并最重要地该候选药物是安全的。只有当在临床前测试中已确立了候选药物在动物中的安全性及可能的效力时，该候选药物才将被相应的管理机构批准用于在人中的临床测试。可以以下面三种方式测试候选药物在动物中的安全性，(i)在相关的物种、即在其中候选药物可识别直系同源抗原的物种中，(ii)在包含人抗原的转基因动物中和(iii)通过使用能够结合存在于动物中的直系同源抗原的候选药物的替代物。转基因动物的局限性为该技术典型限于啮齿动物。然而，啮齿动物和人在生理学方面具有显著差异，该显著差异可使得外推在啮齿动物中获得的安全性数据来预测在人中的安全性复杂化。候选药物的替代物的局限性是与实际候选药物相比，物质的不同组成且通常使用的动物是啮齿动物，具有如以上讨论的局限性。因此，在啮齿动物中产生的临床前数据关于候选药物的预测能力有限。用于安全性测试的精选方法是使用相关物种，优选低等灵长类动物。本领域描述的目前适于在人中治疗干预的CD3结合分子的局限性是相关物种是高等灵长类动物，特别地是 食蟹猴。因此，能够与人和灵长类动物二者的CD3结合的抗CD3抗体是高度期望的。在美国专利公布号20100150918及在PCT公布W02008/119567中已描述此类抗体。
[0016]尽管有这样的进展，对能够与非人哺乳动物(例如，食蟹猴)的CD3交叉反应的抗人CD3抗体和它们的抗原结合片段仍有需求。本发明解决了该需求和用于癌症、自身免疫性和炎性疾病的改善的治疗的需求。
[0017]发明概述
[0018]本发明涉及能够与人和非人CD3结合的CD3结合分子，并特别涉及与非人哺乳动物(例如，食蟹猴)的CD3交叉反应的此类分子。本发明还涉及此类抗体和抗原结合片段在治疗癌症、自身免疫性和/或炎性疾病和其他病症中的用途。
[0019]详细地，本发明提供了包含抗体的抗原结合片段的CD3结合分子，其中该抗原结合片段包含抗体CD3特异性VL结构域(antibody CD3_specific VL domain)和抗体CD3特异性VH结构域(antibody Q)3_specific VH domain),其中⑶3特异性VL结构域和⑶3特异性VH结构域形成能够与人CD3的表位及与非人哺乳动物的CD3的表位二者免疫特异性结合的抗原结合结构域，其中:
[0020](I)CD3-特异性VL结构域选自由以下组成的组:h-mab2VL-l(SEQ ID NO:16)、h-mab2VL-2 (SEQ ID NO:18)、h-mab2VL_3 (SEQ ID NO:20)、h-mab2VL_4 (SEQ ID NO:22)、h-mab2VL-5 (SEQ ID NO:24)、h-mab2VL_6 (SEQ ID NO:26)、h-mab2VL_7 (SEQ ID NO:28)、h-mab2VL-8 (SEQ ID NO:30)、h-mab2VL_9 (SEQ ID NO:32)和 h-mab2VL_10 (SEQ ID NO:34)，且所述CD3-特异性VH结构域选自由以下组成的组:h-mab2VH-l(SEQ ID NO:36)、h-mab2VH-2 (SEQ ID NO:38)、h-mab2VH_3 (SEQ ID NO:40)、h-mab2VH_4 (SEQ ID NO:42)、h-mab2VH-5 (SEQ ID NO:44)、h-mab2VH_6 (SEQ ID NO:46)、h-mab2VH_6L (SEQ ID NO:54)、h-mab2VH-7(SEQ ID NO:48)、h-mab2VH_8(SEQ ID NO:50)、h-mab2VH_8L (SEQ ID NO:55)、h-mab2VH-8d1-l (SEQ ID NO:56)、h-mab2VH-8di_2 (SEQ ID NO:57)、h-mab2VH_6M(SEQ IDNO:72)、h-mab2VH-8M(SEQ ID NO:74)、h-mab2VH_2k(SEQ ID NO:87)和 h-mab2VH_5k(SEQID NO:88);或
[0021](II)CD3特异性VL结构域选自由以下组成的组:h-mabl VL-1 (SEQ ID NO:10)和h-mablVL-2 (SEQ ID NO:12)，且 CD3 特异性 VH 结构域是 h-mabl VH(SEQ ID NO:14)。
[0022]本发明特别涉及以上描述的CD3结合分子的实施方案，其中CD3特异性VL结构域是h-mab2VL-6(SEQ ID NO:26)。
[0023]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子的实施方案，其中CD3特异性VH结构域是h-mab2VH-8 (SEQ ID NO:50)、h-mab2VH_6 (SEQ ID NO:46)或 h-mab2VH_2k(SEQ ID NO:87)。
[0024]本发明特别涉及以上描述的CD3结合分子的实施方案，其中该分子是抗体，且特别地，其中该抗体缺乏Fe区或包含以下Fe区:
[0025](A)缺乏效应子功能或具有降低的效应子功能；或
[0026](B)损害该抗体的Fe区与Fe受体结合的能力；
[0027]其中效应子功能的降低和结合能力的损害是相对于野生型Fe受体的。
[0028]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子的实施方案，其中该分子是包含第一多肽链和第二多肽链的⑶3结合双抗体(diabody)，链与彼此共价结合，其中:
[0029]1.第一多肽链包含氨基末端和羧基末端及从N末端至C末端:
[0030](i)结构域(A)，包含⑶3特异性VL结构域；
[0031](ii)结构域(B)，包含第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区；和
[0032](iii)结构域(C)；
[0033]其中结构域(A)和结构域(B)不与彼此缔合形成表位结合位点；
[0034]和
[0035](II)第二多肽链包含氨基末端和羧基末端及从N末端至C末端:
[0036](i)结构域(D)，包含第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区；
[0037](ii)结构域(E)，包含⑶3特异性VH结构域；和
[0038](iii)结构域(F)；
[0039]其中结构域(D)和结构域(E)不与彼此缔合形成表位结合位点；和
[0040]其中:
[0041](I)结构域(A)和结构域(E)缔合以形成能够与人CD3及与非人哺乳动物的CD3二者免疫特异性结合的抗原结合结构域；
[0042](2)结构域(B)和结构域(D)缔合以形成与第二表位免疫特异性结合的结合位点，该第二表位与被由结构域(A)和结构域(E)的缔合形成的抗原结合结构域结合的CD3表位不同；且
[0043](3)结构域(C)和结构域(F)共价缔合在一起。
[0044]本发 明还涉及以上描述的CD3结合分子的实施方案，其中第二表位不是CD3的表位。
[0045]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子的实施方案，其中第二表位是与被由结构域(A)和结构域(E)的缔合形成的抗原结合结构域结合的CD3表位不同的CD3的表位。
[0046]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子或抗体或双抗体的实施方案，其中此分子被人源化。
[0047]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子或抗体或双抗体的实施方案，其中此分子能够与CD3及与荧光素免疫特异性结合。
[0048]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子或双抗体的实施方案，其中此分子能够与以下两项免疫特异性结合:(i)CD3和(ii) (a)肿瘤抗原，或(ii) (b)细胞表面抗原、受体或受体配体。
[0049]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子或双抗体的实施方案，其中该分子或双抗体能够与CD3及与肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原免疫特异性结合，其中该肿瘤细胞是来自选自由以下组成的组的癌症的肿瘤细胞:乳腺癌、前列腺癌、胃癌(gastric cancer)、肺癌、胃癌(stomach cancer )、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、口腔癌、鼻咽癌、食道癌、喉癌、骨癌、皮肤癌、黑色素瘤、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、脑癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病。
[0050]本发明还涉及以上描述的CD3结合分子或双抗体的实施方案，其中该分子或双抗体能够与CD3及与细胞表面抗原、受体或受体配体免疫特异性结合，其中细胞表面抗原、受体或受体配体是HER2/neu、B7-H3、CD20、PSMA、IGF-1R.、Ep-CAM，或是参与导致适应性免疫应答中T细胞或B细胞活化的T细胞-B细胞缔合的分子。
[0051] 本发明还涉及以上描述的CD3结合分子或双抗体的实施方案，其中该分子或双抗体能够与CD3及与参与T细胞-B细胞缔合的分子免疫特异性结合，且参与T细胞-B细胞缔合的该分子选自由以下组成的组:CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD32B、CD38、CD40、CD79a、CD79b、CD80、CD86、LFA-1, LFA-3 和 CFA-1。
[0052]本发明还涉及包含以上描述的任何CD3结合分子、抗体或双抗体及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
[0053]本发明还涉及以上描述的药物组合物用于治疗癌症或自身免疫性或炎性疾病。
[0054]本发明还涉及以上描述的药物组合物用于治疗选自由以下组成的组的自身免疫性或炎性疾病:1型胰岛素依赖型糖尿病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化、炎性肠病、重症肌无力、乳糜泻、Sjogren综合征、格雷弗氏病、克罗恩病、自身免疫性肝炎、银屑病、银屑病关节炎、哮喘、过敏性鼻炎、来自器官移植的影响、或移植物抗宿主病(GVHD)0本发明特别涉及以上描述的药物组合物用于治疗I型胰岛素依赖型糖尿病。
[0055]附图简述
[0056]图1A-1B显示了捕获ELISA的结果，其中使用人可溶性⑶3 (“sh⑶3”)评价了抗CD3抗体mABl (图1A)或抗体mABl的嵌合衍生物(ch-mAbl)(图1B)的能力。
[0057]图2A-2B显示了捕获ELISA的结果，其中使用人可溶性⑶3(“sh⑶3”)或可溶性食蟹猴⑶3 (“sc⑶3”)评价了抗⑶3抗体mAB2 (图2A)或抗体mAB2的嵌合衍生物(ch_mAb2)(图2B)的能力。
[0058]图3显示了分析以确定mAb2的轻链的Kabat编号的构架残基41-46中的变化的影响的结果。
[0059]图4显示了分析以确定mAb2的轻链的Kabat编号的构架残基36、38、44和46中的变化的影响的结果。
[0060]图5显示了分析以确定mAb2的轻链的Kabat编号的构架残基36、38和46中的变化的影响的结果。
[0061]图6显示了分析以确定mAb2的重链的Kabat编号的构架残基30、49和93中的变化的影响的结果。
[0062]图7显不了进彳丁另外的分析以确定mAb2的重链的Kabat编号的构架残基30、49和93中的变化的影响的结果。
[0063]图8A-8B显示了进行的分析以评价嵌合和人源化mAb2与非人CD3结合的能力的结果。
[0064]图9A-9D 显示了进行的 BIAC0RE? 分析以确定 ch_mAB2 或 h_mAb2 和 scCD3 或 scCD3的结合动力学的传感图追踪。
[0065]图10A-10D显示了对具有抗⑶3第一表位结合位点和与Her2/neu、⑶19、EGFR或B7-H3结合的第二表位结合位点的DART?双抗体执行的捕获ELISA的结果。
[0066]图1IA-1IB显示了 B7H3x CD3DART?双抗体介导再定向杀死(redirectedkilling)表达B7H3的肿瘤细胞的能力。
[0067]图12A-12E显示了 A33x⑶3DART?双抗体介导再定向杀死表达A33的肿瘤细胞的能力。
[0068]图13A 和 13B 显示了 CD19-h-mAb2DART? 和 CD19x CD3DART 双抗体诱导再定向 T细胞介导的杀死的能力的比较的结果。⑶19-h-mAb2DART?双抗体呈现了对人以及非人⑶3的特异性；CD19x⑶3DART双抗体则仅呈现对人⑶3的特异性。图13A =Raji人B细胞淋巴瘤细胞的再定向杀死；图13B JeKo-1人套细胞淋巴瘤细胞的再定向杀死。
[0069]图14A和14B显示了本发明的⑶19-h-mAb2DART?双抗体能够介导人或非人T细胞效应细胞的存在下的细胞溶解。
[0070]图15A和15B显示了当与⑶4+或⑶8+T细胞一起孵育时本发明的ERBITUXTM-h-mAb2DART? 双抗体或 ERBITUX?-T-Cell Receptor DART? 双抗体介导 CD69MFI的增加的能力；对照ERBITUX?-FN18⑶3 DART?双抗体(能够与EGFR及与食蟹猴⑶3结合)未能引起CD69MFI的增加。
[0071]图16A-16D 显示了 ERBITUXTM-h-mAb2DART? 双抗体、ERBITUXTM-m-mAb2DART? 双抗体或4420-h-mAb2DART?双抗体(阴性对照)或第二对照与A498或A431细胞(分别地图16A和16C)的结合，及介导再定向杀死此类细胞(分别地图16B和16D)的研究的结果。
[0072]发明详述
[0073]本发明涉及抗人CD3抗体和它们的抗原结合片段，及特别地涉及与非人哺乳动物(例如，食蟹猴)的CD3交叉反应的此类抗体。本发明还涉及此类抗体和抗原结合片段在治疗癌症、自身免疫性和/或炎性疾病和其他病症中的用途。
[0074]1.定义
[0075]如本文所用的`，术语“⑶3结合分子”表示通过位于该分子的可变区中的至少一个抗原识别位点(例如，抗体的抗原结合结构域)能够与人CD3及与非人哺乳动物的CD3 二者免疫特异性结合的分子。如本文所用的，与人CD3及与非人哺乳动物的CD3 二者免疫特异性结合的此能力不预期表示单个抗原结合结构域与此类CD3分子二者同时结合的能力，而是表示此抗原结合结构域呈现交叉反应性如此以致当在人CD3存在下孵育时其将与人CD3免疫特异性结合并当在此非人哺乳动物CD3存在下孵育时其将与非人哺乳动物的CD3免疫特异性结合。
[0076]如本文所用的，术语“CD3结合分子”不仅包含完整的多克隆或单克隆抗体，还包含其片段(诸如Fab、Fab'、F(ab' )2Fv)、单链(ScFv)、其突变体、天然存在的变体、包含具有期望的特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、“BiTEs?”、“DART?”双抗体分子、和包含期望的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。术语“BiTE”(双特异性T细胞接合体(engager))指具有两个抗原结合结构域的单个多肽链分子，这两个抗原结合结构域之一与T细胞抗原结合且其第二个与靶的表面上存在的抗原结合(W005/061547 ;Baeuerle，P等人(2008) “BiTE i< ANew Class Of Antibodies That Recruit T Cells,，，Drugs of the Future33:137-147 ；Bargou,等人(2008) “Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of aT Cell-Engaging Antibody,，，Science 321:974-977)。
[0077]术语“DART?”(Dual Affinity ReTargeting reagent,双亲和再祀向试剂)双抗体指包含缔合(特别地通过共价相互作用)以形成至少两个表位结合位点的至少两条多肽链的免疫球蛋白分子，其可识别相同的或不同的表位。DART?双抗体的每个多肽链包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但这些区不相互作用形成表位结合位点。而是，DART?双抗体多肽链之一(例如，第一条)的免疫球蛋白重链可变区与不同的(例如，第二条)DART?多肽链的免疫球蛋白轻链可变区相互作用以形成表位结合位点。相似地，DART?双抗体多肽链之一(例如，第一条)的免疫球蛋白轻链可变区与不同的(例如，第二条)DART?双抗体多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用以形成表位结合位点。DART?双抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性的，等等，因此能够同时结合一个、两个、三个或多个不同的表位(其可以是相同的或不同的抗原)。DART?双抗体可另外是单价、二价、三价、四价、五价、六价的，等等，因此能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或多个分子。DART?双抗体的这两个属性(即，特异性程度和化合价)可被组合，例如以制备四价(即，能够结合四组表位)的双特异性抗体(即，能够结合两个表位)，等等。在PCT公布W02006/113665、W02008/157379 和 W02010/080538 中公开了 DART? 双抗体分子。
[0078]本发明的双特异性(或三特异性或多特异性)分子将能够与人CD3和非人哺乳动物(例如，食蟹猴)的CD3 二者结合，且还将能够与第二(或另外的)及不同的抗原或表位结合。第二抗原或 表位优选是肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原。此类肿瘤细胞可来自癌症，例如，乳腺癌、前列腺癌、胃癌(gastric cancer)、肺癌、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、口腔癌、鼻咽癌、食道癌、喉癌、骨癌、皮肤癌、黑色素瘤、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、脑癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。另外的抗原或表位优选是细胞表面肿瘤抗原或表位(诸如:17-1A、A33、成人红细胞原内胚层I抗原、甲胎蛋白、RNA肿瘤病毒的包膜抗原、膀胱肿瘤癌胚抗原、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CA125、CD18、CD19、人 B-淋巴瘤抗原 _CD20、CD22、CD33、CD44、CD52、CEA、C017-1A、CTA-1、CTLA-4、表皮生长因子受体、Ep-CAM、EphA2、胎儿红细胞I抗原、纤维肉瘤抗原、神经节苷脂⑶2、神经节苷脂⑶3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂 GM3、GICA19-9、gp IIIb/IIla、gp72、HERl、HER-2/neu、HER3、HER4、高分子量黑色素瘤抗原、HLA-DR抗原、人白血病T细胞抗原_Gp37、人肺癌抗原L20、人肺癌抗原L6、人乳脂肪球抗原、IgE、KSl/4泛癌抗原、LEA、肺腺癌F3抗原、人恶性淋巴细胞抗原-AP0-1、黑色素瘤抗原gp75、黑色素瘤相关抗原p97、拟糖蛋白、nuC242、多形上皮粘蛋白抗原、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、前列腺酸性磷酸盐、SK-1抗原、TAG-72、T-抗原、肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUC1、肿瘤特异性移植类型的细胞表面抗原、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体和av03)。可选地，此类另外的抗原或表位可与病原体(诸如:甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹(HSV-1)、II型单纯疱疹(HSV-1I)、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、乳头瘤病毒、乳多泡病毒、巨细胞病毒、棘状病毒(echinovirus)、虫媒病毒、汉他病毒(hantavirus)、柯萨奇病毒、腿腺炎病毒、麻疫病毒、风疫病毒、脊髓灰质炎病毒、天花、Epstein-Barr病毒、人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒II型(HIV-1I)、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、登革热、天花；分枝杆菌立克次氏体(mycobacteria rickettsia)、支原体(mycoplasma)、奈瑟氏菌属(neisseria)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、破伤风、百日咳、霍乱、痕疫、白喉、衣原体(chlamydia)和军团菌属(Iegionella);利什曼原虫、球虫病、锥虫属(trypanosoma)或痕疾；衣原体和立克次氏体)相关。[0079]术语“单克隆抗体”指同质性抗体群体，其中单克隆抗体由参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在和非天然存在的)组成。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅包含完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包含其片段(诸如FatuFab' >F(ab/ )2Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包含具有期望的特异性的抗原识别位点和与抗原结合的能力的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。不预期限制关于抗体的来源或其制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物，等)。该术语包括以上在“抗体”的定义下描述的完整免疫球蛋白及片段，等。
[0080]术语“人源化抗体”指通常使用重组技术制备的嵌合抗体，具有源自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的其余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包含与恒定结构域融合的完整的可变结构域或仅包含接枝(graft)到可变结构域中适合的构架区上的互补决定区(⑶R)。抗原结合位点可以是野生型的或通过一个或多个氨基酸取代被修饰的。这消除了在人个体中作为免疫原的恒定区，而保留了对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio，A.F?等人(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics AndImmune Response, ” Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 86:4220-4224)。另一个方法不仅集中在提供源自人的恒定区，而且还集中在修饰该可变区，以改造它们与人中可变区的形式尽可能接近。已知的是重链和轻链二者的可变区包含对所讨论的抗原的应答不同及决定结合能力的三个互补决定区(CDR)，其侧翼为在给定物种中是相对保守的并推定提供用于CDR的支架的四个构架区(FR)。当制备关于特定抗原的非人抗体时，可变区可通过将源自非人抗体的CDR与存在于待被修饰的人抗体中的FR接枝而被“改造”或“人源化”。已由 Sato, K.等人(1993) Cancer Res53:851-856 ；Riechmann, L.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,，，Nature332:323-327 ;Verhoeyen, M.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies:Grafting An AntilysozymeActivity,，，Science239:1534-1536 ;Kettleborough, C.A.等人(1991) “HumanizationOf A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The Importance Of FrameworkResidues On Loop Conformation,，，Protein Engineering^:: 773-3783 ;Maeda, H.等人(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-NeutralizingActivity, Truman Antibodies Hybridoma2:124-134 ；Gorman, S.D.等人(1991)“ReshapingA Therapeutic CD4Antibody, ^Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 88:4181-4185 ；Tempest, P.R?等人(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit HumanRespiratory Syncytial Virus Infection in vivo,，，Bio/Technology9:266-271 ;Co, M.S.等人(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,，，Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 88: 2869-2873 ；Carter, P.等人(1992) “Humanization OfAn Ant1-pl85her2Antibody For Human Cancer Therapy,，，Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 89:4285-4289 ;和 Co, M.S.等人(1992) “Chimeric And Humanized AntibodiesWith Specificity For The CD33Antigen, ”J.1mmunol.148:1149-1154 报道了将该方法应用于多种抗体。
[0081 ] 在一些实施方案中，人源化抗体保留了所有⑶R序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小 鼠抗体)。在其他实施方案中，人源化抗体具有相对于原始抗体被改变的一个或多个CDR( —个、两个、三个、四个、五个、六个)，其还被称为“源自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。如下面公开的，本发明优选的抗体具有特异性鉴定的CDR。然而，本发明涵盖具有改变的CDR的等同抗体。
[0082]如本文所用的，如果相对于可选的表位，抗体或多肽与另一个分子的区(即，表位)更加频繁、更快速、以更长的持续时间和/或以更高的亲和力反应或缔合，抗体或多肽则被称为与那个表位“免疫特异性”或等同地、“特异性”结合。例如，与CD3表位特异性结合的抗体是以比其与其他CD3表位或非CD3表位结合更高的亲和力、亲合力、更快速和/或以更长的持续时间结合该CD3表位的抗体。通过阅读该定义还被理解的是，例如，与第一靶免疫特异性结合的抗体(或部分或表位)可以或可以不与第二靶特异性或优先结合。如此，“免疫特异性结合”不必然要求(尽管其可包含)“排他的”结合。通常，但不必然地，提及结合指“免疫特异性”结合。
[0083]如本文所用的，关于表位的术语“免疫活性”或“剩余免疫活性”指在不同条件在，例如，在表位已经受还原和变性条件之后，抗体(例如，抗CD3抗体)与表位结合的能力。例如，如果抗体不再能够与变性的表位结合，该表位则被称为已呈现免疫无活性的。
[0084]不同的生物功能与本发明的抗⑶3抗体相关，且此类抗体可呈现任何或所有以下的属性，或可缺少一个、两个、三个或多个此类属性:特异性结合在正常人T细胞的表面内源性表达的人CD3的能力；特异性结合在人白血病T细胞的表面内源性表达的人CD3的能力；特异性结合在正常的非人哺乳动物T细胞的表面内源性表达的非人哺乳动物(例如，食蟹猴)CD3的能力；特异性结合在正常的非人T细胞的表面内源性表达的非人CD3的能力；特异性结合在非人白血病T细胞的表面内源性表达的非人CD3的能力；中和(即，阻断或干扰结合)CD3复合物的形成的能力；中和TCR复合物的形成的能力；调节(拮抗或激动性地)由TCR复合物的信号传导；结合Fe受体的能力；竞争性抑制已知的抗CD3抗体与CD3的优先结合的能力，包括与原始抗体优先结合的相同CD3表位优先结合的能力；在体外或体内与暴露于活细胞的表面的CD3的部分结合的能力；与暴露在活的癌细胞的表面的CD3的部分结合的能力；将化学治疗剂递送进入癌性T细胞的能力；和/或将治疗剂、毒素或可检测的标志物递送进入T细胞的能力。如本文讨论的，本发明的多肽(包括抗体)可具有这些特征的任何一个或多个。
[0085]如本文所用的，术语“剂”指生物、药学或化学化合物。非限制性实例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素、或化学治疗化合物。可合成多种化合物，例如，小分子和低聚物(例如，寡肽和寡核苷酸)和基于多种核心结构的合成的有机化合物。另外，多种天然来源可提供用于筛选的化合物，诸如植物或动物提取物，等等。可随机选择或理性选择或设计本发明方法中采用的剂。如本文所用的，当在没有参与分子与其天然的结合配偶体或已知抗体的缔合的特定氨基酸或其他化学部分的在先考虑或知识的条件下选择剂时，剂被称为是随机选择的。随机选择的剂的实例是通过化学药品库或肽组合文库的使用和筛选鉴定的剂。如本文所用的，当在考虑靶位点的序列和/或其构象与剂的作用的联合的非随机基础下选择剂时，剂被称为是理性选择或设计的。可通过利用组成受体/配体和/或CD3/抗CD3抗体复合物的接触位点的肽序列理性选择或理性设计剂。例如，理性选择的肽的剂可以是其氨基酸序列与呈现在暴露于天然环境中的活细胞的表面的CD3上的表位一致的肽。如期望的，此剂将通过与抗CD3抗体或与天然配体结合减少或阻断抗CD3抗体与CD3的缔合或CD3与其天然配体的缔合。
[0086]如本文所用的，关于抗体的术语“标记的”预期包含通过偶合(即，物理连接)可检测的物质，诸如放射性剂 或突光团(例如，藻红蛋白(PE))或异硫氰酸突光素(fluoresceinisothiocyanate)(还称为异硫氰酸突光素(fIuoroisothiocyanate)或FITC)至抗体直接标记抗体，及通过与可检测的物质的反应性间接标记探针或抗体。
[0087]如本文所用的，关于抗体的术语“缔合”包括剂(例如，化学治疗剂)与抗体共价和非共价的附着或结合。抗体可通过直接结合或通过附着至共同平台(common platform)的间接结合与剂(例如，化学治疗剂)缔合，如此以致该抗体指导该剂定位至该抗体结合的癌性细胞，且其中该抗体和剂在生理条件下大致上不离解如此以致该剂不靶向该抗体结合的相同的癌性细胞或如此以致该剂的效力不被减弱。
[0088]术语“生物样品”包含从个体获得的多种样品类型并可被用于诊断或监测分析。该定义包括唾液、血液和生物来源的其他液体样品、固体组织样品诸如活检标本或组织培养物或源自其的细胞、和其子代，例如，从采集自怀疑患有癌症的个体的组织样品获得的细胞，在优选的实施方案中，从卵巢、肺、前列腺、胰腺、结肠和乳腺组织获得的细胞。该定义还包括在它们的取得之后以任何方式被操作的样品，诸如通过用试剂处理、溶解或特定的成分、诸如蛋白或多核苷酸的富集、或为了切片的目的在半固体或固体基质中包埋。术语“生物样品”包含临床样品，并还包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。[0089]术语“宿主细胞”包括可以是或已经是用于并入多核苷酸插入物的载体的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，及由于天然的、偶然的或有意的突变(在形态学方面或在基因组DNA互补链方面)与原始亲本细胞可以不必然完全一致的子代。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
[0090]如本文所用的，在一个实施方案中，药物组合物的“有效量”是足够产生包括但不限于以下的有益的或期望的结果的量:临床结果诸如使肿瘤的大小或生长速率缩小、推迟或减弱炎性反应、增加忍受疾病的个体的生命质量、减少治疗此疾病需要的其他药物的剂量、通过诸如靶向和/或内化增强另一种药物的效果、推迟疾病的进展和/或延长个体存活。可以以一次或多次施用来施用此有效量。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足够改善临床可观察到的病症的量。
[0091]在一些实施方案中，药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另外的药物、化合物或药物组合物联合获得。因此，可在施用一种或多种另外的剂的情况下考虑“有效量”，且如果与一种或多种其他剂联合，可考虑以有效量给予单个剂，则可获得或获得期望的结果。尽管个体的需要不同，每一种成分的有效量的最佳范围的确定在本领域技术之内。施用至患者的典型剂量典型地从患者体重的0.0001mg/kg至100mg/kg。优选地,施用至患者的剂量在患者体重的0.0001mg/kg和20mg/kg之间、0.0OOlmg/kg和10mg/kg之间、0.0001mg/kg 和 5mg/kg 之间、0.0001mg/kg 和 2mg/kg 之间、0.0001mg/kg 和 lmg/kg 之间、0.0001mg/kg 和 0.75mg/kg 之间、0.0001mg/kg 和 0.5mg/kg 之间、0.0001mg/kg 至 0.25mg/kg 之间、0.0001mg/kg 至 0.15mg/kg 之间、0.0001mg/kg 至 0.10mg/kg 之间、0.00 lmg/kg 至0.5mg/kg 之间、0.01mg/kg 至 0.25mg/kg 之间或 0.01mg/kg 至 0.10mg/kg 之间。本发明的分子的施用的剂量和频率可通过修饰诸如例如脂化增强本发明的分子的摄入和组织渗入而被减少或改变。
[0092]如本文所用的，当从天然存在于其原始来源的污染物核酸分子、抗体、剂、组合物或细胞等基本上分离核酸分子、剂、抗体、组合物或细胞等时，该核酸分子或剂、抗体、组合物或细胞等则被称为是“分离的”。
[0093]术语“个体”指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，人、农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。在最优选的实施方案中，术语个体指人。
[0094]术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白”在本文被互换地使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，其可包含修饰的氨基酸，且其可被非氨基酸中断。该术语还包含已天然地或通过干涉被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记成分的缀合。还被包括在该定义内的是，例如，包含氨基酸(包括，例如，非天然的氨基酸，等)的一种或多种类似物、及本领域已知的其他修饰的多肽。被理解的是，由于本发明的多肽基于抗体，该多肽可作为单链或作为缔合的链存在。
[0095]如本文所用的，术语“基本上纯的”指至少50%纯的(即，无污染物)、更优选地至少90%纯的、更优选地至少95%纯的、更优选地至少98%纯的、更优选地至少99%纯的、且最优选地大于99%纯的材料(material)。
[0096]如本文所用的，术语“毒素”指在细胞内产生不良应答的任何物质。例如，针对癌性细胞的毒素将对癌性细胞具有不良的、有时有毒的作用。毒素的实例包括，但不限于，紫杉烧(taxane)、美登素(maytansinoid)、奥里斯他汀(auristatin)(例如，单甲基奥里斯他汀(monomethyl auristatin) (MMAE)、单甲基奥里斯他汀 F(monomethyl auristatin F)(MMAF)、奥里斯他汀 E(AE)、等)(诸如在美国专利号 5，208，020,5, 416，064,6, 333，410、6，340，701,6, 372，738,6, 436，931,6, 441，163,6, 596，757,7, 276，497,7, 585，857 或7，851，432中公开的那些)、卡奇霉素、蒽环类药物(例如，阿霉素)、CC-1065类似物、多西他奇；组织蛋白酶B或E ;蓖麻毒素、白树毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、白喉毒素和RNase ;放射性标记的抗体(例如,缀合tiuxetan的或用有毒的放射性同位素(例如，9°Y、m1、177Lu、186Re、188Re、211At、212B1、213B1、225AC 等)标记的)。
[0097]如本文使用的，术语“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”指用于获得有益的或期望的结果，包括并优选地有益的或期望的临床结果的方法。此类有益的或期望的临床结果包括，但不限于以下的一种或多种:减少炎性或自身免疫应答、减少(或破坏)癌性细胞或其他患病的细胞的增殖、减少见于癌症的癌性细胞的转移、缩小肿瘤的大小、减少由疾病引起的症状、增加忍受疾病的个体的生命质量、减小治疗疾病需要的其他药剂的剂量、推迟疾病的进展、和/或延长个体的存活。
[0098]I1.制备本发明的抗体和多肽的方法
[0099]制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler, G.等人，(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of PredefinedSpecificity, ’^Nature256:495-497的方法或其修改形式。典型地,单克隆抗体在非人物种，诸如小鼠中形成。通常，小鼠或大鼠被用于免疫，但其他动物也可被使用。通过用免疫原性量的包含人CD3的细胞、细胞提取物或蛋白制剂免疫小鼠来制备抗体。免疫原可以是但不限于，原代细胞、培养的细胞系、癌性细胞、核酸或组织。
[0100]在一个实施方案中，通过使用过量表达CD3作为免疫原的宿主细胞获得与CD3结合的单克隆抗体。此类细胞包括，例如且不限于，人T细胞。
[0101]为了监测抗体应答，可从动物获得小的生物样品(例如，血液)并测试针对免疫原的抗体滴度。可移除脾和/或一些大的淋巴结并离解为单细胞。如需要，(在非特异性粘附细胞去除之后)可通过将细胞悬液施加至抗原涂覆的平板或孔筛选脾细胞。表达膜结合的抗原特异性的免疫球蛋白的B细胞，将与平板结合，并不会被剩余的悬液冲洗掉。随后，可将所得B细胞或所有离解的脾细胞与骨髓瘤细胞(例如，X63-Ag8.653和来自SaIkInstitute, Cell Distribution Center, San Diego, CA 的细胞)融合。聚乙二醇(PEG)可被用于融合脾或淋巴细胞与骨髓瘤细胞以形成杂交瘤。随后在选择性培养基(例如，次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷培养基，另外称为“HAT培养基”)中培养杂交瘤。随后，通过有限稀释将所得杂交瘤铺板，并使用例如FACS (荧光激活细胞分选术)或免疫组织化学(IHC)筛选分析与免疫原特异性结合的抗体的产生。随后，体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器)或体内(例如，在小鼠中作为腹水)培养选择的单克隆抗体-分泌杂交瘤。
[0102]作为细胞融合技术的另一个替代方式，可使用Epstein-Barr病毒(EBV)永生化的B细胞以制备本发明的单克隆抗体。如需要，增殖并亚克隆杂交瘤，并通过传统的分析方法(例如，FACS, IHC、放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析，等)分析上清液的抗免疫原活性。
[0103]在另一个替代方式中，可通过本领域已知的任何方法(例如，人源化、使用转基因小鼠制备全人抗体、噬菌体展示技术，等)测序和重组制备抗CD3单克隆抗体和任何其他等同抗体。在一个实施方案中，抗CD3单克隆抗体被测序且随后多核苷酸序列被克隆进入载体用于表达或增殖。编码目的抗体的序列可被保持在宿主细胞中的载体中且随后该宿主细胞可被增殖并冷冻用于以后使用。
[0104]抗CD3单克隆抗体和任何其他等同抗体的多核苷酸序列可被用于遗传操作以产生“人源化”抗体，以改进抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的一般原理包括保留抗体的抗原结合部分的基本序列，同时将该抗体的非人剩余部分置换为人抗体序列。存在人源化单克隆抗体的四个一般步骤。这些步骤为:(I)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即，决定在人源化过程中使用哪一个抗体构架区，(3)实际的人源化方法/技术和，(4)人源化抗体的转染和表达。见，例如，美国专利号 4，816，567,5, 807，715,5, 866，692 和 6，331，415。
[0105]已描述了包含源自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的一些“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物或修饰的啮齿动物V区和它们缔合的与人恒定结构域融合的互补决定区(CDR)的嵌合抗体(见，例如，Winter等人(1991) “Man-madeAntibodies, ” Nature349: 293-299 ;Lobuglio 等人(1989) “Mouse/Human ChimericMonoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,，，Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.)86:4220-4224 (1989)，Shaw 等人(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A)To A Colon Cancer Tumor-AssociatedAntigen,，，J.1mmunol.138:4534-4538,和 Brown 等人(1987) “Tumor-SpecificGenetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,，，CancerRes.47:3577-3583)。其他参考文献描述了在与适合的人抗体恒定结构域融合之前被接枝入人支撑构架区(FR)的啮齿动物⑶R(见，例如，Riechmann, L.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,，，Nature332:323-327 ；Verhoeyen, M.等 人(1988) “Reshaping Human Antibodies:Grafting An AntilysozymeActivity,，，Science239: 1534-1536 ;和 Jones 等人(1986) “Replacing TheComplementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From AMouse, ”Nature321:522-525)。另一个参考文献描述了由重组镶饰的(veneered)啮齿动物构架区支撑的啮齿动物⑶R。见，例如，欧洲专利公布号519，596。这些“人源化”分子被设计以使针对啮齿动物抗人抗体分子的不想要的免疫应答最小化，所述免疫应答限制了那些部分在人接受者中的治疗应用的持续时间和效力。Daugherty等人(1991) “PolymeraseChain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression OfA Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18Component Of LeukocyteIntegrins, ” Nucl.Acids Res.19:2471-2476 及在美国专利号 6，180，377,6, 054，297、5，997，867和5，866，692公开了还可被使用的人源化抗体的其他方法。
[0106]本发明还包括本发明的抗体，诸如mu-抗-⑶3的单链可变区片段(“scFv”)。通过使用短的连接肽连接轻链和/或重链可变区制备单链可变区片段。Bird等人(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins, ” Science242:423-426)描述了桥接一个可变区的羧基末端和其他可变区的氨基末端之间约3.5nm的连接肽的实例。已设计并使用了其他序列的连接体(Bird等人(1988) “Single-Chain Antigen-BindingProteins, ” Science242:423-426)。反过来,连接体可被修饰用于另外的功能,诸如药物的附着或与固相支持体的附着。可重组或合成制备单链变体。关于scFv的合成制备，可使用自动合成仪。对于scFv的重组制备，包含编码scFv的多核苷酸的适合的质粒可被引入适合的宿主细胞，真核细胞，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。可通过常规的操作，诸如多核苷酸的连接制备编码目的scFv的多核苷酸。可使用本领域已知的标准蛋白纯化技术分析所得scFv。
[0107]本发明包括对抗CD3抗体和它们的结合片段的修饰。多肽的修饰是本领域常规操作且本文不需要详细描述。修饰的多肽的实例包括具有不会显著有害地改变功能活性的氨基酸残基的保守取代、氨基酸的一个或多个缺失或添加，或化学类似物的使用的多肽。可被保守地彼此取代的氨基酸残基包括但不限于:甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化的和非糖基化的多肽，及具有其他翻译后修饰、诸如例如不同糖的糖基化、乙酰化及磷酸化的多肽。优选地，氨基酸取代将是保守的，即，取代的氨基酸将具有与原始氨基酸的化学性质相似的化学性质。此类保守的取代是本领域已知的，且以上已提供了实例。氨基酸修饰可从改变或修饰一个或多个氨基酸至完全重新设计区，诸如可变区的范围。可变区中的变化可改变结合亲和力和/或特异性。修饰的其他方法包括使用本领域已知的偶合技术，包括但不限于，酶的方法、氧化取代及螯合作用。修饰可被用于，例如，免疫分析的标记物的附着，诸如用于放射性免疫分析的放射性部分的附着。使用本领域建立的方法制备修饰的多肽并可使用本领域已知的标准分析进行筛选。
[0108]⑶R残基的单个氨基酸改变可导致功能结合的丢失的事实(Rudikoff，S.等(1982) “Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-BindingSpecificity, ” Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 79 (6): 1979-1983)提供了用于系统鉴定替代功能CDR序列的方法。在用于获得此变体CDR的一个优选的方法中，(例如，通过随机诱变或通过定点方法(例如，用编码突变的基因座的引物的聚合酶介导的链扩增))诱变处理编码CDR的多核苷酸以制备具有取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能)CDR序列中相关残基的同一性与取代的(无功能的)变体CDR序列的同一性，可鉴定关于该取代的BL0SUM62.1ij取代分数。BLOSUM系统提供了通过分析可信的比对的序列的数据库创建的氨基酸取代的矩阵(matrix) (Eddy, S.R.(2004) “Where Did The BL0SUM62Alignment Score Matrix Come From?,’’Nature Biotech.22 (8): 1035-1036 ；Henikoff, J.G.(1992) “Amino acid substitution matrices from protein blocks,，，Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA)89:10915-10919 ；Karlin, S.等人(1990) “Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By UsingGeneral Scoring Schemes, ”Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA)87:2264-2268 ；Altschul, S.F.(1991) “Amino Acid Substitution Matrices From An Information TheoreticPerspective, ” J.Mol.Biol.219，555-565)。目前，最高级的 BLOSUM 数据库是 BL0SUM62 数据库(BL0SUM62.1ij)。表1展示了 BL0SUM62.1ij取代分数(分数越高取代越保守并因此该取代将较不可能影响功能)。如果包含所得CDR的抗原结合片段未能够与CD3结合，那么BL0SUM62.1ij取代分数则被视为不够保守，进而选择并产生具有较高取代分数的新的候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)，且无功能的取代残基是组氨酸(H)，那么BL0SUM62.1ij取代分数将为O，且更保守的改变(诸如改变为天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、或赖氨酸)是优选的。
【权利要求】
1.一种CD3结合分子，所述CD3结合分子包含抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含抗体CD3特异性VL结构域和抗体CD3特异性VH结构域，其中所述CD3特异性VL结构域和所述CD3特异性VH结构域形成能够与人CD3的表位及与非人哺乳动物的CD3的表位二者免疫特异性结合的抗原结合结构域，其中: (I)所述CD3-特异性VL结构域选自由以下组成的组:h-mab2VL-l(SEQ ID NO:16)、h-mab2VL-2 (SEQ ID NO:18)、h-mab2VL_3 (SEQ ID NO:20)、h-mab2VL_4 (SEQ ID NO:22)、h-mab2VL-5 (SEQ ID NO:24)、h-mab2VL_6 (SEQ ID NO:26)、h-mab2VL_7 (SEQ ID NO:28)、h-mab2VL-8 (SEQ ID NO:30)、h-mab2VL_9 (SEQ ID NO:32)、和 h-mab2VL_10 (SEQ ID NO:34)，且所述CD3-特异性VH结构域选自由以下组成的组:h-mab2VH-l(SEQ ID NO:36)、h-mab2VH-2 (SEQ ID NO:38)、h-mab2VH_3 (SEQ ID NO:40)、h-mab2VH_4 (SEQ ID NO:42)、h-mab2VH-5 (SEQ ID NO:44)、h-mab2VH_6 (SEQ ID NO:46)、h-mab2VH_6L (SEQ ID NO:54)、h-mab2VH-7 (SEQ ID NO:48)、h-mab2VH_8 (SEQ ID NO:50)、h-mab2VH_8L (SEQ ID NO:55)、h-mab2VH-8d1-l (SEQ ID NO:56)、h-mab2VH-8di_2 (SEQ ID NO:57)、h-mab2VH_6M(SEQ IDNO:72)、h-mab2VH-8M(SEQ ID NO:74)、h-mab2VH_2k(SEQ ID NO:87)、和 h-mab2VH_5k(SEQID NO:88);或 (II)所述CD3特异性VL结构域选自由以下组成的组:h-mablVL-l(SEQ ID NO:10)和h-mablVL-2 (SEQ ID NO:12)，且所述 CD3 特异性 VH 结构域是 h_mablVH(SEQ ID NO:14)。
2.根据权利要求1所述的CD3结合分子，其中所述CD3特异性VL结构域是h-mab2VL-6(SEQ ID NO:26)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的CD3结合分子，其中所述CD3特异性VH结构域是 h-mab2VH-8 (SEQ ID NO:50)、h-mab2VH_4 (SEQ ID NO:42)、或 h-mab2VH_2k (SEQ ID NO:87)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的CD3结合分子，其中所述分子是抗体。
5.根据权利要求4所述的CD3结合分子，其中所述抗体缺少Fe区或包含以下Fe区: (A)缺乏效应子功能或具有减弱的效应子功能；或 (B)损害所述抗体的所述Fe区与Fe受体结合的能力； 其中，效应子功能的所述减弱和结合能力的所述损害是相对于野生型Fe受体的。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的CD3结合分子，其中所述分子是包含第一多肽链和第二多肽链的CD3结合双抗体，所述链与彼此共价结合，其中: .1.所述第一多肽链包含氨基末端和羧基末端及从N末端至C末端: (i)结构域(A)，包含所述CD3特异性VL结构域； (ii)结构域(B)，包含第二免疫球蛋白的重链可变结构域(VH2)的结合区；和 (iii)结构域(C)； 其中所述结构域(A)和所述结构域(B)不与彼此缔合形成表位结合位点； 且 (II)所述第二多肽链包含氨基末端和羧基末端及从N末端至C末端: (i)结构域(D)，包含所述第二免疫球蛋白的轻链可变结构域(VL2)的结合区； (ii)结构域(E)，包含所述CD3特异性VH结构域； 和(iii)结构域(F)； 其中所述结构域(D)和所述结构域(E)不与彼此缔合形成表位结合位点；且 其中: (1)所述结构域(A)和所述结构域(E)缔合以形成能够与人CD3及与非人哺乳动物的CD3 二者免疫特异性结合的所述抗原结合结构域； (2)所述结构域(B)和所述结构域(D)缔合以形成与第二表位免疫特异性结合的结合位点，所述第二表位与被由所述结构域(A)和所述结构域(E)的所述缔合形成的所述抗原结合结构域结合的所述CD3表位不同；且 (3)所述结构域(C)和所述结构域(F)共价缔合在一起。
7.根据权利要求6所述的CD3结合双抗体，其中所述第二表位不是CD3的表位。
8.根据权利要求6所述的CD3结合双抗体，其中所述第二表位是与被由所述结构域(A)和所述结构域(E)的所述缔合形成的所述抗原结合结构域结合的所述CD3表位不同的⑶3的表位。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的CD3结合分子、根据权利要求4-5中任一项所述的抗体、或根据权利要求6-8中任一项所述的双抗体，所述CD3结合分子、所述抗体或所述双抗体被人源化。
10.根据权利要求1-3或9中任一项所述的CD3结合分子或根据权利要求6-9中任一项所述的双抗体，所述CD3结合分子或所述双抗体能够与CD3及与荧光素免疫特异性结合。
11.根据权利要求1-3或9中任一项所述的CD3结合分子或根据权利要求6-9中任一项所述的双抗体，所述CD3结合分子或所述双抗体能够与以下两项免疫特异性结合:(i)CD3和(ii) (a)肿瘤抗原、或(ii) (b)细胞表面抗原、受体或受体配体。
12.根据权利要求11所述的CD3结合分子或双抗体，其中所述分子或双抗体能够与CD3及与肿瘤细胞上表达的肿瘤抗原免疫特异性结合，其中所述肿瘤细胞是来自选自由以下组成的组的癌症的肿瘤细胞:乳腺癌、前列腺癌、胃癌(gastric cancer)、肺癌、胃癌(stomach cancer)、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、口腔癌、鼻咽癌、食道癌、喉癌、骨癌、皮肤癌、黑色素瘤、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、脑癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病。
13.根据权利要求11所述的CD3结合分子或双抗体，其中所述分子或双抗体能够与CD3及与细胞表面抗原、受体或受体配体免疫特异性结合,其中所述细胞表面抗原、受体或受体配体是HER2/neu、B7-H3、CD20、PSMA、IGF-1R.、Ep-CAM,或是参与导致适应性免疫应答中T细胞或B细胞活化的T细胞-B细胞缔合的分子。
14.根据权利要求13所述的CD3结合分子或双抗体，其中所述分子或双抗体能够与CD3及与参与所述T细胞-B细胞缔合的分子免疫特异性结合，且参与所述T细胞-B细胞缔合的所述分子选自由以下组成的组:⑶19、⑶20、⑶22、⑶23、⑶27、⑶32B、⑶38、⑶40、CD79a、CD79b、CD80、CD86、LFA-1、LFA-3 和 CFA-1。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-3或9-14中任一项所述的CD3结合分子、权利要求4-5中任一项所述的抗体、或权利要求6-14中任一项所述的双抗体，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗癌症或自身免疫性或炎性疾病。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗选自由以下组成的组的自身免疫性或炎性疾病:1型胰岛素依赖型糖尿病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化、炎性肠病、重症肌无力、乳糜泻、Sjogren综合征、格雷弗氏病、克罗恩病、自身免疫性肝炎、银屑病、银屑病关节炎、哮喘、过敏性鼻炎、来自器官移植的影响、或移植物抗宿主病(GVHD)。
18.根据权利要求16所述的药物组合物， 所述药物组合物用于治疗I型胰岛素依赖型糖尿病。
【文档编号】C07K16/00GK103703024SQ201280036088
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年5月16日 优先权日:2011年5月21日
【发明者】菱·黄, 莱斯利·S·约翰逊 申请人:宏观基因有限公司