用于生产因子viii的方法
【专利摘要】本发明涉及在哺乳动物培养物中生产因子VIII多肽的方法。
【专利说明】用于生产因子Vl I I的方法
发明领域
[0001]本发明涉及用于生产因子VIII多肽的方法。
[0002]发明背景
因子VIII是重要的凝血因子。导致因子VIII蛋白减少或缺陷的因子VIII基因中的突变引起遗传疾病血友病A，其特征在于复发性的出血发作。血友病A的治疗需要血浆来源或重组的因子VIII的静脉输注。
[0003]尽管血浆来源的因子VIII可用于治疗血友病，但这种方法有多种问题，包括病毒向患者的传播。因此，优选施用已重组表达的因子VIII。
[0004]难以从细胞培养物获得大量的因子VIII。已知因子VIII以非常低的水平在哺乳动物细胞中表达。也已知因子VIII是在无血清或无蛋白培养基中不稳定的蛋白。各种物质的添加已用于改进重组生产的因子VIII的产量。例如，使用高强度的缓冲液提高因子VIII的产量。然而，这种苛刻的处理不允许细胞的后续重新使用。
[0005]尽管对因子VIII调控有所了解，但在商业制造使用的异源系统中，因子VIII的产量依旧显著低于其他重组蛋白。WO 2008/135501公开了使用结合因子VIII的C2结构域的配体(例如，正磷酸-L-丝氨酸(OPLS))获得改进的因子VIII产量。然而，需要进一步提高可以从细胞培养物分离的因子VIII 的产量的方法和组合物。
【发明内容】
[0006]本发明人意外地发现通过使培养细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂，释放到培养基且随后收获的因子VIII的量大幅增加。具体地，与向细胞基添加结合因子VIII的C2结构域的试剂OPLS时所见的产量相比，因子VIII的产量显著增加。
[0007]因此，本发明提供了用于生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括:
a)在使所述多肽表达的条件下培养能够表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞；和
b)在步骤(a)期间或步骤(a)之后，使所述细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂。
[0008]本发明进一步提供了:
-细胞培养基，其不含血清并且包含:i)选自乳凝集素、膜联蛋白V、抗磷脂抗体和因子VIII轻链的试剂，和ii)正磷酸-L-丝氨酸(OPLS)或抗凋亡蛋白。
-能够结合磷脂酰丝氨酸的化合物用于提高可以从哺乳动物细胞培养物分离的因子VIII的产量的用途。
[0009]序歹1丨
SEQ ID NO:1 (人B-结构域缺失的因子VIII):
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【权利要求】
1.用于生产因子VIII多肽的方法，所述方法包括: a)在使所述多肽表达的条件下培养能够表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞；和 b)在步骤(a)期间或步骤(a)之后，使所述细胞接触结合磷脂酰丝氨酸的试剂。
2.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括在所述细胞的生存力是至少80%的时间点，收获因子VIII多肽的步骤。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在2-3天后收获因子VIII多肽的步骤。
4.权利要求1的方法，其中将所述哺乳动物细胞培养在细胞培养基中，并且其中所述因子VIII多肽是人因子VIII多肽。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中通过i)将所述试剂与因子VIII共表达，或ii)向培养所述细胞的培养基添加所述试剂，使所述试剂接触所述哺乳动物细胞。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述试剂是特异性结合磷脂酰丝氨酸的蛋白，优选乳凝集素、膜联蛋白V、抗磷脂抗体或因子VIII轻链。
7.权利要求6的方法，其中所述乳凝集素、膜联蛋白V或因子VIII轻链以0.01至100 μ M的浓度添加或共表达。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中使一种、两种、三种或更多种能够结合细胞膜上的磷脂酰丝氨酸的试剂接触所述哺乳动物细胞。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中乳凝集素、膜联蛋白V、抗脂质抗体或因子VIII轻链与正磷酸-L-丝氨酸(OPLS)或抗凋亡蛋白一起接触所述哺乳动物细胞。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞培养在不含动物来源组分的细胞培养基中，其中所述方法进一步包括分离所述因子VIII多肽和将所述因子VIII多肽配制到药物组合物中。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中从培养所述哺乳动物细胞的细胞培养基分离所述因子VIII多肽，而基本不降低细胞的生存力，其中优选至少85%的细胞保持存活。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中在分离所述因子VIII多肽后，将相同的细胞用于根据前述权利要求中任一项的方法中。
13.细胞培养基，其不含血清并且包含:i)选自乳凝集素、膜联蛋白V、抗磷脂抗体和因子VIII轻链的试剂，和ii)正磷酸-L-丝氨酸(OPLS)或抗凋亡蛋白。
14.能够结合磷脂酰丝氨酸的试剂用于提高可以从哺乳动物细胞培养物分离的因子VIII的产量的用途。
【文档编号】C07K14/755GK103946235SQ201280057127
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年11月2日 优先权日:2011年11月21日
【发明者】L.B.约翰逊, M.P.科林德, P.L.诺拜 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司