粘接剂的制作方法
【专利摘要】本发明主要涉及蛋白粘接剂，如通式I所示的蛋白激酶的粘接剂。所述蛋白粘接剂可用以连接固相支撑体，以及可用于例如，检测广泛范围的蛋白质在样品中的存在。同时本发明还公开了合成所述蛋白粘接剂的方法，以及含有该蛋白粘接剂的试剂盒。式I
【专利说明】粘接剂
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及蛋白粘接剂，其生产方法以及在分离蛋白质中的应用。在一个实施例中，本发明涉及蛋白激酶粘接剂。
【背景技术】
[0002]蛋白激酶和人类疾病
[0003]人类基因组的蛋白激酶补体包括约500个成员，其可以表现出丝氨酸/苏氨酸_，酪氨酸，或双特异性(Manning等人，2002)。一个典型的哺乳动物细胞表达-300不同的蛋白激酶(Su等人，2002)。通过磷酸化特异蛋白目标，这些酶在介导细胞内信号传导事件中扮演了关键角色，并可调节多种细胞过程，包括细胞增殖、存活、代谢和蠕动。此外，蛋白激酶本身可进行能够调节酶的活性和下游信号的分子间的磷酸化活动。例如，在激酶结构域内进行的的活化环内磷酸化可以稳定许多激酶(Nolen等人，2004)的催化活性状态，而受体酪氨酸激酶(RTK)自身磷酸化可产生特异性效应分子的粘接位点(Lemmon等，2010)。然而，尽管对蛋白激酶家族有深入研究，但它的许多成员基本上在功能和调控方面仍是未知的。
[0004]重要的是，异常激酶信号与许多人类疾病存在很强的关联性。例如，大约有三分之一的蛋白激酶基因映射到癌症扩增子(Manning等人，2002)，以及许多激酶基因可归因于致癌基因重排或突变。例如，酪氨酸蛋白激酶Abl构成了 Bcr-Abl融合蛋白的局部，而该局部分别驱动了慢性髓性白血病(CML)的发展，并激活了在约40%的黑色素瘤和约15-30%的非小细胞肺癌(NSCLC)中出现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-Raf中的突变以及EGFR酪氨酸激酶受体。这导致了可选择性地靶向失调的激酶有效治疗方法的发展，包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)伊马替尼，厄洛替尼和PLX4032，并分别用于治疗慢性粒细胞白血病，EGFR突变的NSCLC和B-Raf的突变体黑色素瘤(Knight等人，2010 ；Brognard和Hunter, 2011 ;Pao及Chmielecki，2010)。此外，特定的蛋白激酶与其他重要人类疾病有关联，包括炎症性疾病(如类风湿关节炎，炎性肠病)(Cohen，2002)，心血管疾病(Belmonte和BlaxalI，2011)，神经系统疾病和神经退行性疾病(Su和Tsai，2010)，II型糖尿病(Donath和ShoelsondOll)和常染色体显性多囊肾病(Qin等人，2010)，并可能代表诊断或预后标志物，和/或治疗祀点。
[0005]细胞信号网络的质谱表征。
[0006]最新的基于质谱技术的蛋白质组学的进展(MS)使得许多类型的转换后修饰之普遍“快照”成为可能，包括蛋白磷酸化，从而提供了全面表征细胞信号网络的能力(Macek等人，2009)。一个例子 是使用组合免疫/MS方法在特定癌症亚型表征酪氨酸磷酸化信号(Hochgrafe等人，2010)。然而，这种方法无法检测非酪氨酸磷酸化的人类激酶组的显著比例。此外，由于许多蛋白激酶的细胞低丰度，仅基于蛋白质的磷酸化状态的肽富集会导致蛋白激酶亚类在随后的MS分析中无法显现，因而高度需要另外的纯化步骤(Daub等，2008)。最近的研究已尝试通过使用ATP-竞争性的小分子激酶抑制剂作为亲和试剂来解决这个问题。例如，将多广泛的特异性激酶配体与珠偶联(产生“kinobeads’)(Bantscheff等人，2007)，或者使用一系列含有鲜明但重叠选择性配置方案抑制剂的亲和柱(Daub等人，2008年)，来进行从细胞提取物提取更广范围蛋白激酶的尝试。当与诸如通过在培养物(SILAC)氨基酸的稳定同位素标记的定量技术组合使用时，这些方法通过蛋白的水平和激活状态等方式可以用来比较不同的细胞类型和处理条件所表达的激酶组(Daub等人，2008 ;Oppermann等人,2009)。然而,前面所述的广泛特异性激酶的配体只证明可粘接总激酶组的一个有限子集。例如，粘接到磁珠(“kinobeads”)的七种不同的ATP竞争性抑制剂(双(III)吲哚基马来酰亚胺，Purvalanol B,星形孢菌素，CZC8004和TO173955、舒尼替尼和凡德他尼的类似物)仅可从每5个不同的细胞系绑定约180蛋白激酶(Bantscheff等人，2007);在多亲和层析过程中使用的激酶抑制剂VI16832，双吲哚马来酰亚胺X，AX14596，SU6668和Purvalanol B (Dabu等人，2008)可从HeLa细胞中检测到219个蛋白激酶；根据Oppermann等人于2009年证实，当三个不同的激酶捕获试剂相比时，测定为最有效的是VI16832，此激酶已被证明能够从三个不同的细胞系中检测到总共170蛋白激酶。但是仍需发现一个具更广阔特异性的激酶配体，以便使一个单元的总激酶表达谱有更可靠的分析。此外，理想的蛋白激酶的配体可使得如多列亲和层析等复杂的纯化方法简单化。
【发明内容】
[0007]本发明人已经发现了一系列特别有效的蛋白质粘接剂。特别是，本发明人确定了一些对于粘接大范围蛋白激酶特别有效的化合物。因此，本发明提供以下通式I所示的化合物:
[0008]
【权利要求】
1.一种具有通式I的化合物:
2.权利要求1所述的化合物，其中Rl= H，R2 = C1，X = N，R3 = H、C0CH3或连接基团。
3.权利要求1或2所述的化合物，其中Rl= H，R2 = Cl，X = N和R3 = H。
4.前述任一权利要求所述的化合物，均粘附于固相支撑体。
5.权利要求4所述的化合物，其中的固相支撑体包括多个琼脂糖珠。
6.一种合成前述任一权利要求所述化合物的方法，该方法包括将式F4所示的化合物与一种酸，如三氟乙酸，在合适的反应条件下反应，其中Rl = H或Me，X = N或C，并且CF3基团可以选择性的被Cl取代，
7.权利要求1-5中任一项所述化合物的合成方法，该方法包括将式F6所示的氨基吡啶与式11或式12的苯胺在合适的反应条件下进行，
8.一种固相支撑体，包括所附的如权利要求1-3中任一项所述的化合物。
9.权利要求8所述的固相支撑体，包括多个琼脂糖珠。
10.权利要求8-9中任一项所述的固相支撑体，进一步包括额外附着的粘接剂。
11.权利要求10所述的固相支撑体，其中额外附着的粘接剂是双(III)吲哚基马来酰亚胺，Purvalanol B，星形孢菌素，CZC8004，舒尼替尼，凡德他尼，VI16832，双吲哚马来酰亚胺X，AX14596和SU6668中的任一种或多种。
12.权利要求11所述中的固相支撑体，其中额外的粘接剂是PurvalanolB，VI16832和SU6668中的任一种或多种。
13.—种检测样品中所含的一种或多种蛋白质的方法，包括将样品与权利要求1-5中任一项所述的化合物或者权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体接触。
14.权利要求13所述的方法，其中的一种或多种蛋白质均为蛋白激酶。
15.权利要求14所述的方法，其中蛋白激酶是STE，CMGC或AGC蛋白激酶子族中的一种或Akt激酶族中的一种。
16.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中蛋白质来自于从受试者采集的样品。
17.权利要求16所述的方法，其中所述样品包括采集自受试者的细胞。
18.权利要求17所述的方法，其中所述细胞需要先裂解，然后将样品与权利要求1-5中任一项所述的化合物或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体接触。
19.权利要求16-18中任一项所述的方法，其中样品是采集自患有或怀疑患有某种疾病的受试者。
20.权利要求19所述的方法，其中所述疾病是癌症或炎性病症。
21.—种诊断一种疾病存在的方法或诊断一位受试者感染一种疾病的倾向性的方法，包括:，通过将采集自受试者的样品与权利要求1-5中任一项所述的化合物或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体接触，从而检测样品中存在的一种或多种蛋白质，当样品中存在所述的一种或多种蛋白质时，则指示了所述疾病或感染所述疾病的倾向性。
22.—种监测受试者对疾病治疗性处理的响应性的方法，包括:在第一时间点，通过将采集自受试者的样品与权利要求1-5中任一项所述的化合物或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体接触，从而检测样品中存在的一种或多种蛋白质，；在之后的、且已经给予受试者治疗处理后的第二个时间点，通过将采集自受试者的样品与权利要求1-5中任一项所述的化合物或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体接触，从而检测样品中存在的一种或多种蛋白质；在第二个时间点样品中存在的所述一种或多种蛋白质指示了受试者对疾病治疗性处理的响应性。
23.权利要求21或22所述的方法，进一步包括确定样品中一种或多种特定蛋白质的表达水平。
24.一种将蛋白质从样品中分离的方法，包括将样品与权利要求1-5中任一项所述的化合物或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体接触。
25.—种筛选蛋白激酶粘接试剂的方法，包括:在一种测试试剂存在和缺失的情况下，将权利要求1-5中任一项所述的粘接剂或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体与含有一种或多种蛋白激酶的样品接触，若权利要求1-5中任一项所述的粘接剂或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体对于一种或多种蛋白激酶的粘接力水平在所述测试试剂存在时较所述测试试剂缺失时降低，则将测试试剂定义为一种能粘接蛋白激酶的试剂。
26.—种试 剂盒，包含权利要求1-5中任一项所述的化合物和/或权利要求8-12中任一项所述的固相支撑体以及使用说明书。
【文档编号】C07K1/22GK103998444SQ201280057020
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月21日
【发明者】罗杰·约翰·达利, 伊恩·彼得·福尔摩斯, 伊恩·斯帝利特, 史葛·雷蒙德·沃克 申请人:癌症治疗合作研究中心有限公司, 加尔文医学研究所