专利名称：一种抗结核多肽的免疫制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗结核多肽的免疫制备方法，属免疫医学和生物制药领域。
背景技术：
结核病是一种由结合分枝杆菌引起的严重危害人民健康的慢性传染病，目前全球有约20亿人被感染。我国是结核病的重灾区之一，每年死亡人数是其他传染病死亡人数的总和的2倍以上。抗结核化学药物治疗对控制结核病具有较好疗效，但存在服药时间长和易产生耐药性等问题。
抗结核多肽能传递结核杆菌的特异性细胞免疫信息，具有调节和增强机体特异性抗结核感染的细胞免疫的功能。当其进入人体后，可使患者的正常T细胞转变成特异性致敏T细胞。致敏T细胞分为杀伤性致敏T细胞(TC)和迟发型超敏反应性T细胞(TDTH)两种。杀伤性致敏T细胞(TC)能对带有结核杆菌寄生的细胞实行特异性杀伤，迟发型超敏反应性T细胞(TDTH)则可释放出多种淋巴因子，介导炎症反应，增强杀伤结核杆菌作用。同时释放的淋巴因子又可使机体内其他淋巴细胞致敏，形成更多的效应淋巴细胞，增强、扩大细胞免疫效应，从而达到调节人体特性免疫功能。尤其对临床上的难治性结核病人显示出明显疗效。
国内外多采用纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)或卡介苗单次免疫制备抗结核多肽，其免疫效果不稳定，进而容易特异性免疫效果低的问题。且其多肽的提取多采用反相色谱法进行分离纯化，也有少数用亲和色谱法(抗原吸咐柱层析分离纯化) 进行分离纯化的报道，亲和色谱法分离纯化特异性有效组分相对快、步骤简单，但需要大量可溶性抗原扩相应抗体，在短期内难以完成，不利于工业化生产。发明内容
本发明目的在于提供一种抗结核多肽的免疫制备方法，该制备工艺简便可控，制备的抗结核多肽的白细胞粘附抑制率可达33. 9-38%。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于它是以卡介苗脂质体皮下注射健康猪， 使其进行免疫反应，其中所述的卡介苗脂质体是由卡介苗和免疫增强剂混合而得；取免疫健康猪的脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入生理盐水，捣碎制取匀浆；将匀浆于一 20 一 30°C反复冻融后经超滤膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品； 再经白细胞粘附抑制实验检测得其白细胞粘附抑制率满足33. 9-38%的范围值要求后，经交联葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
按上述方案，所述免疫增强剂为不完全弗氏佐剂和卵磷脂、壳聚糖两者中至少一种的混合，当不完全弗氏佐剂和卵磷脂两者混合时，两种的质量比为1: O. 2-2， 当不完全弗氏佐剂和壳聚糖两种混合时，两者的质量比为1:0. 2-1 ;当不完全弗氏佐剂、卵磷脂和壳聚糖三种混合时，三者的质量比为1: O. 2-1 :0. 2-0. 8。
按上述方案，所述的卡介苗脂质体为将卡介苗和免疫增强剂按质量比为1:O.7-3. O，混合后超声处理30-60min而得，其中卡介苗的用量为O. 1-0. 6mg/Kg猪。
按上述方案，所述的注射为每10天一次，连续注射3 6次。
按上述方案，所述的冻融次数为3 7次。
按上述方案，按重量比计，所述的生理盐水的用量为待处理物的I 3倍。
按上述方案，所述超滤膜的孔径为3000 8000道尔顿。
按上述方案，所述交联葡聚糖凝胶层析柱为交联葡聚糖凝胶Sephadex G_15层析柱或交联葡聚糖凝胶Sephadex G_25层析柱。
本发明的有益效果本发明针对特定免疫对象猪，采用设定用量的卡介苗和特定的免疫增强剂混合而得的卡介苗脂质体通过皮下注射健康猪，经周期性多次注射免疫，可显著地提高其特异性免疫效果，而达到增加特异性抗结核多肽产量的效果，同时降低制备成本，由此制备而得的抗结核多肽的白细胞粘附抑制率可达33. 9-38%。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的发明内容作详细说明。
实施例1将卡介苗20mg和不完全弗氏佐剂10mg、卵磷脂3mg、壳聚糖2mg于超声波下混合搅拌 40min,制成卡介苗脂质体。选取50-60公斤的健康猪,皮下注射卡介苗脂质体，每10天注射一次，连续注射4次。宰杀卡介苗免疫的健康猪。取其猪脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入重量比为1:2的生理盐水，用组织捣碎匀浆机捣碎制取匀浆。于零下20度反复冻融4次后，再用5000道尔顿超滤膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品。经白细胞粘附抑制实验检测，得白细胞粘附抑制率为37. 1%，再采用交联葡 聚糖凝胶Sephadex G-15层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
实施例2将卡介苗25mg和不完全弗氏佐剂15mg、卵磷脂4mg、壳聚糖3. 5mg于超声波下混合搅拌60min,制成卡介苗脂质体。选取60-70公斤的健康猪,皮下注射卡介苗脂质体，每10天注射一次，连续注射5次。宰杀卡介苗免疫的健康猪。取其猪脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入重量比为1:3的生理盐水，用组织捣碎匀浆机捣碎制取匀浆。 于一 30度反复冻融5次后，再用6000道尔顿膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品。经白细胞粘附抑制实验检测，得白细胞粘附抑制率为33. 9%，再采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
实施例3将卡介苗15mg和不完全弗氏佐剂8mg、卵磷脂2mg、壳聚糖1. 6mg于超声波下混合搅拌 60min,制成卡介苗脂质体。选取40-50公斤的健康猪,皮下注射卡介苗脂质体，每10天注射一次，连续注射3次。宰杀卡介苗免疫的健康猪。取其猪脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入重量比为1:2的生理盐水，用组织捣碎匀浆机捣碎制取匀浆。于零下30度反复冻融3次后，再用5000道尔顿膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品，经白细胞粘附抑制实验检测，得白细胞粘附抑制率为35. 2%。再采用交联葡聚糖凝胶SephadexG-15层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
实施例4将卡介苗28mg和不完全弗氏佐剂15mg、卵磷脂4mg、壳聚糖3. 5mg于超声波下混合搅拌60min,制成卡介苗脂质体。选取50-60公斤的健康猪,皮下注射卡介苗脂质体，免疫健康猪每10天一次，连续注射5次。宰杀卡介苗免疫的健康猪。取其猪脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入重量比为1:1的生理盐水，用组织捣碎匀浆机捣碎制取匀浆。于零下20度反复冻融4次后，再用5000道尔顿膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品。经白细胞粘附抑制实验检测，得白细胞粘附抑制率为37.9%，再采用交联葡聚糖凝胶 Sephadex G_25层析柱分离纯化,冷冻干燥,得到抗结核多肽。
实施例5将卡介苗6mg和不完全弗氏佐剂7mg、卵磷脂6mg、壳聚糖5mg于超声波下混合搅拌 40min,制成卡介苗脂质体。选取50-60公斤的健康猪,皮下注射卡介苗脂质体，每10天注射一次，连续注射4次。宰杀卡介苗免疫的健康猪。取其猪脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入重量比为1:2的生理盐水，用组织捣碎匀浆机捣碎制取匀浆。于零下20度反复冻融4次后，再用6000道尔顿超滤膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品。经白细胞粘附抑制实验检测，得白细胞粘附抑制率为34. 7%，再采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
实施例6将卡介苗30mg和不完全弗氏佐剂15mg、壳聚糖6mg于超声波下混合搅拌60min,制成卡介苗脂质体。选取50-60公斤的健康猪，皮下注射卡介苗脂质体，每10天注射一次，连续注射5次。宰杀卡介苗免疫的健康猪。取其猪脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处 理物中加入重量比为1:2的生理盐水，用组织捣碎匀浆机捣碎制取匀浆。于零下20度反复冻融4次后，再用5000道尔顿超滤膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品。经白细胞粘附抑制实验检测，得白细胞粘附抑制率为35. 4%，再采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G_15 层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
权利要求
1.一种抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于它是以卡介苗脂质体皮下注射健康猪，使其进行免疫反应，其中所述的卡介苗脂质体是由卡介苗和免疫增强剂混合而得；取免疫健康猪的脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入生理盐水，捣碎制取匀浆；将匀浆于一 20 一 30°C反复冻融后经超滤膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品；再经白细胞粘附抑制实验检测得其白细胞粘附抑制率满足33. 9-38%的范围值要求后， 经交联葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。
2.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于所述免疫增强剂为不完全弗氏佐剂和卵磷脂、壳聚糖两者中至少一种的混合，当不完全弗氏佐剂和卵磷脂两者混合时，两种的质量比为1: O. 2-2，当不完全弗氏佐剂和壳聚糖两种混合时，两者的质量比为1:0. 2-1 ;当不完全弗氏佐剂、卵磷脂和壳聚糖三种混合时，三者的质量比为1:O.2~1 :0· 2_0· 8ο
3.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于所述的卡介苗脂质体为将卡介苗和免疫增强剂按质量比为1:0. 7-3. 0，混合后超声处理30-60min而得，其中卡介苗的用量为O. 1-0. 6mg/Kg猪。
4.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于所述的注射为每 10天一次,连续注射3 6次。
5.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于所述的冻融次数为3 7次。
6.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于按重量比计，所述的生理盐水的用量为待处理物的I 3倍。
7.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于所述超滤膜的孔径为3000 8000道尔顿。
8.根据权利要求1所述的抗结核多肽的免疫制备方法，其特征在于所述交联葡聚糖凝胶层析柱为交联葡聚糖凝胶Sephadex G_15层析柱或交联葡聚糖凝胶Sephadex G_25层析柱。
全文摘要
本发明涉及一种抗结核多肽的免疫制备方法。其特征在于它是以卡介苗脂质体皮下注射健康猪，使其进行免疫反应，其中所述的卡介苗脂质体是由卡介苗和免疫增强剂混合而得；取免疫健康猪的脾和淋巴结，去脂肪及粘膜，得待处理物，向待处理物中加入生理盐水，捣碎制取匀浆；将匀浆于-20～-30℃反复冻融后经超滤膜超滤，得到的滤液为抗结核多肽粗品；再经白细胞粘附抑制实验检测得其白细胞粘附抑制率满足33.9-38%的范围值要求后，经交联葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，冷冻干燥，得到抗结核多肽。该制备工艺简便可控，制备的抗结核多肽的白细胞粘附抑制率可达33.9-38%。
文档编号C07K16/12GK103059134SQ20131001816
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者吴建国, 邓兆群, 张儒林, 杨小钢, 刘君炎, 刘胜武, 屈雪菊, 谭秋萍 申请人:武汉辉斯特科技有限公司