基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法
【专利摘要】本发明涉及生物微分子提取【技术领域】，尤其是基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法，本发明利用多年生人参的根细胞培养，利用酶技术缩短细胞培养周期，来生产人参皂甙及多糖的方法。本发明采用细胞培养法来培养和生产人参植物细胞，进而提取人参皂甙和多糖，种子细胞收集时加入纤维素酶，能提高种子细胞收集率5%-10%，种子细胞培养中，加入生长素、果胶酶能诱使组织细胞加快生长繁殖，缩短培养周期，约能够减少1/4—1/6时间，有效降低了培养过程的感染率，提高产品收率。本发明工艺简单、稳定，并利用了酶技术缩短了细胞培养周期，提高收率，适合工业化生产。
【专利说明】基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物微分子提取【技术领域】，尤其是基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法。
【背景技术】
[0002]人参皂甙是人参的主要成分，可延缓神经细胞衰老并降低老年发生的记忆损伤，具有稳定膜结构和促进蛋白质合成的作用，可以提高记忆力。人参皂甙及单体、多糖广泛应用于食品、保健品、医药、化工等很多领域，随着社会高速发展，其用量越来越大，价格成本越来越高，但传统人参皂甙及多糖的提取方法是用人参的根、茎、叶、须根等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经越来越不能满足市场的需求。
[0003]随着生物技术的发展，用细胞进行人工培样繁殖提取植物的次代谢产物，不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞生物学技术生产人参皂甙及单体、多糖的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在工业化生产推广过程中也存在很多难题问题，如工艺复杂、条件苛刻、易污染、收率低等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了克服上述技术缺点提供基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法。
[0005]本发明解决技术问题采用的技术方案为:基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法，，是一种利用多年生人参的根细胞培养，利用酶技术缩短细胞培养周期，来生产人参皂甙及多糖的方法。具体步骤在下面进行阐述。
[0006](1)种子细胞采集:
[0007]①取新鲜的多年生人参的根清洗消毒，将洗净的人参块根用10-20%次氯酸钠溶液浸泡10-30分钟，用无菌水清洗块根至次氯酸钠无残留；
[0008]②将清洁后的块根放入打衆机加入MS (Murashige-Skoog)培养基,每1.5g加入10ml，打浆；
[0009]③将打浆液加入纤维素酶100mg/kg，放置3-5小时，用50_80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液用低速离心机分离，去杂质及上清液收集种子细胞；
[0010](2)种子细胞培养:
[0011]①将收集到的种子细胞接种到含改良MS培养基的种子罐(瓶)中，接种量为10-20(鲜种量)/L，调 pH5-6，温度 20-25°C ；
[0012]②摇床或震荡种子罐培养20-30小时，计算细胞数量20000-40000个/ml，即可扩大培养；
[0013](3)细胞扩大培养:
[0014]①将培养好的种子细胞接种于有机械搅拌的生物反应器内，悬浮培养，培养基用改良的MS培养基，接种量为15-25g (鲜种)/L，搅拌速率90-120r/min，pH5_6，通入过滤空气，速率 0.01-0.05m3/s ；
[0015]②加入生长素2，4_D (2，4-dichlorophenoxy、2, 4_ 二氯苯氧乙酸)0.5-lmg/L,果胶酶50-80mg/L，暗培养20-25天，细胞计数35000-50000/ml即停止培养；
[0016](4)采用离心或其他方法收集人参植物细胞，即可用常规方法提取人参皂甙及多糖。
[0017]本发明中，在种子细胞收集时加入纤维素酶，能提高种子细胞收集率5%_10%，在种子细胞培养中，加入生长素、果胶酶能诱使组织细胞加快生长繁殖，缩短培养周期，约能够减少1/4一 1/6时间。
[0018]本发明所具有的有益效果是:本发明采用细胞培养法来培养和生产人参植物细胞，进而提取人参皂甙和多糖，种子细胞收集时加入纤维素酶，能提高种子细胞收集率5%-10%，种子细胞培养中，加入生长素、果胶酶能诱使组织细胞加快生长繁殖，缩短培养周期，有效降低了培养过程的感染率，提高产品收率。本发明工艺简单、稳定，并利用了酶技术缩短了细胞培养周期，提高收率，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0019]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实例对本发明进行进一步的阐述。
[0020]1、细胞培养阶段:
[0021](1)种子细胞采集:
[0022]①取新鲜的多年生人参的根清洗消毒，将洗净的人参块根用10%次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗块根至次氯酸钠无残留；
[0023]②将清洁后的块根放入打浆机加入MS培养基，每1.5g加入10ml，打浆；
[0024]③将打浆液加入纤维素酶100mg/kg，放置3小时，用50微米孔径的微孔滤器过滤，滤液用低速离心机分离，去杂质及上清液收集种子细胞；
[0025](2)种子细胞培养:
[0026]①将收集到的种子细胞接种到含改良MS培养基的种子罐(瓶)中，接种量为20g/L，调 pH6，温度 25。。；
[0027]②摇床或震荡种子罐培养24小时，计算细胞数量20000-40000个/ml，即可扩大培养;
[0028](3)细胞扩大培养:
[0029]①将培养好的种子细胞接种于有机械搅拌的生物反应器内，悬浮培养，培养基用改良的MS培养基，接种量为20g/L，搅拌速率120r/min，pH6，通入过滤空气，速率0.03m3/s ；
[0030]②加入生长素2，4-Dlmg/L,果胶酶80mg/L，暗培养20天，细胞计数35000-50000/ml即停止培养；
[0031]2、提取阶段:
[0032]称取本发明细胞培养出得人参细胞组织，40目磨碎过筛，取15克，加甲醇300ml于索氏提取器加热回流8小时换取溶剂一次，共提3次，合并提取液，于旋转蒸发器中减压蒸去甲醇至浅黄色浸膏状。浸膏残留物加50ml水溶解，溶解液移入分液漏斗，每次用30ml乙醚脱脂，共8次，弃醚底。水层用50ml饱和水正丁醇萃取8次，合并正丁醇提取液，减压回收正丁醇至干，得浅黄色粉末为粗人参总皂甙，重0.632g，产率4.2%。
[0033]去上述提取的粗皂甙分别加1?2ml甲醇溶解，将甲醇溶液缓慢逐渐滴入20ml丙酮溶液，剧烈搅拌，皂甙以白色絮状沉淀析出，离心，80°C鼓风干燥，后置于干燥器内干燥2天称重，得精制人参总皂甙0.594g。
[0034]3、鉴定阶段:
[0035]①颜色反应:取总皂甙样本少去，加冰醋酸1ml溶解，缓缓加入浓硫酸2ml。两液界面由红色变为红棕色，最后呈暗棕色。
[0036]②比色鉴定:取总皂甙lmg，用少量醇溶解，吸取100μ 1于试管中，加5%香荚醛-冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml混匀、密塞，置60°C水浴加热15min，取出冷却至室温，显紫色。
[0037]③薄层层析:取总皂甙5mg加少量甲醇溶解，以硅胶G薄层(凉开，105°C活化40min)层离。以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)展开，以硫酸-水(1:1)作显色剂喷雾后凉开，105°C加热15min，显紫色斑点，以碘蒸气显色(将点样后硅胶板置碘气缸中数秒取出)，显黄色斑点。
[0038]4、得出结论:通过上述的提取和鉴定，可以很清楚的判定本发明所述的细胞培养法生产的产物为人参皂甙，并无别的可能。同时，由于在细胞收集和培养过程中采用了纤维素酶和生长素、果胶酶，使得生产的流程相应缩短，产率略有提高。
【权利要求】
1.基于细胞培养技术的人参皂甙提取方法，其特征在于，，是一种利用多年生人参的根细胞培养，利用酶技术缩短细胞培养周期，来生产人参皂甙及多糖的方法，具体流程为: (1)种子细胞采集: ①取新鲜的多年生人参的根清洗消毒，将洗净的人参块根用10-20%次氯酸钠溶液浸泡10-30分钟，用无菌水清洗块根至次氯酸钠无残留； ②将清洁后的块根放入打浆机加入MS培养基，每1.5g加入10ml，打浆； ③将打浆液加入纤维素酶100mg/kg，放置3-5小时，用50-80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液用低速离心机分离，去杂质及上清液收集种子细胞； (2)种子细胞培养: ①将收集到的种子细胞接种到含改良MS培养基的种子罐中，接种量为10-20g/L，调PH5-6，温度 20-25 °C ； ②摇床或震荡种子罐培养20-30小时，计算细胞数量20000-40000个/ml，即可扩大培养; (3)细胞扩大培养: ①将培养好的种子细胞接种于有机械搅拌的生物反应器内，悬浮培养，培养基用改良的MS培养基，接种量为15-25g/L，搅拌速率90-120r/min，pH5_6，通入过滤空气，速率.0.01-0.05m3/s ; ②加入生长素2，4-D0.5-lmg/L,果胶酶50_80mg/L，暗培养20-25天，细胞计数.35000-50000/ml即停止培养； (4)采用离心或其他方法收集人参植物细胞，即可用常规方法提取人参皂甙及多糖。
【文档编号】C07J17/00GK104342399SQ201310336081
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】李肖利 申请人:郑州同心创远生物科技有限公司