超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，将含有黄酮类化合物的蜂胶样品注入流动相，使含有样品的流动相通过填充了黄酮类化合物分离剂的色谱柱，即可得到单一高纯度黄酮类化合物，其中：所述流动相为添加有改性剂的超临界CO2流体。本发明所提供的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，利用填充了黄酮类化合物分离剂的色谱柱，以添加有改性剂的超临界CO2作为流动相，进行色谱的分离纯化，通过筛选超临界CO2流体温度、压力、改性剂种类等技术参数的基础上，可以得到单一高纯度黄酮类化合物。
【专利说明】超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及ー种黄酮类化合物的分离纯化的方法。
【背景技术】
[0002]超临界流体色谱(supercriticalfluid chromatography,简称 SFC)是以超临界流体为流动相的色谱法。超临界流体是物质在高于临界压カ和临界温度时的ー种状态，它具有气体和液体的某些性质，具有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液间的扩散系数等特征，SFC是GC和LC的补充，SFC可以解决气液色谱分离的难题，它可以分离气相色谱难汽化的非挥发性物质，同时具有比高效液相色谱更高的效率，分析时间更短。尤其是其所用的超临界流体一般为二氧化碳，与传统液相比较，产生的废弃有机溶剂少，污染小，所以超临界流体色谱技术有广阔的应用前景。
[0003]蜂胶(propolis)是蜜蜂采集胶原植物幼芽和新生枝叶芽的树脂状物质，在掺入蜜蜂舌腺腊腺的分泌物混合而成ー种胶状天然活性物质。大量的研究表明，蜂胶具有抗菌、消炎、抑制病毒、抗癌及増加机体免疫功能等生理及药理功能，蜂胶中所含的黄酮类、萜烯类、多糖、酶类、有机酸等对癌症患者又有独特作用。各国科学家研究证明蜂胶中黄酮类化合物对癌细胞核有明显抑制作用和抗癌作用。
[0004]研究和开发抗癌新药需要得到单一高纯度黄酮类化合物，超临界二氧化碳流体萃取的方法仅能得到混合的黄酮类化合物，而传统的高效液相色谱(HPLC)法，虽能得到単一高纯度黄酮类化合物，但产生的废弃有机溶剂多，污染大，耗时长。因此快速、高效、经济、环保的得到单一高纯度黄酮 类化合物是急需要解决的ー个重要课题。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了ー种快速、高效、经济、环保的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案来具体实现:
ー种超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，将含有黄酮类化合物的蜂胶样品注入流动相，使含有样品的流动相通过填充了黄酮类化合物分离剂的色谱柱，即可得到单一高纯度黄酮类化合物，其中:所述流动相为添加有改性剂的超临界CO2流体。
[0007]进ー步的，该色谱分离过程为ー循环封闭式系统，包括如下步骤:
1)样品的制备
将含有黄酮类化合物的蜂胶溶于有机沉溶剂中，得到蜂胶样品；
2)流动相的制备
将C02气体制作成超临界CO2流体，添加改性剂后，形成流动相；
3)分离
将蜂胶样品与添加有改性剂的流动相通过填充有黄酮类化合物分离剂的色谱柱(现有常规色谱柱即可，常用有C-18柱、苯基柱、腈基柱)，分别得到高纯度单一的黄酮类化合物；4)回收
色谱分离过程中产生的CO2废气，纯化后继续制作成超临界CO2流动相；色谱分离过程中产生的废液，净化回收作为蜂胶的有机溶剂。
[0008]优选的，
所述有机沉溶剂采用甲醇或环已烷；
所述超临界CO2流体的压カ为20-40MPa、温度为40°C。
[0009]所述改性剂为超临界CO2的流动相总量的5wt %至30wt %的极性液体物质。
[0010]更优的，
所述极性液体物质是选自水、こ腈、甲醇、こ醇、异丙醇。
[0011]最佳的，所述改性剂为水，占流动相总量的10%。
[0012]本发明的有益效果:
本发明所提供的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，利用填充了黄酮类化合物分离剂的色谱柱，以添加有改性剂的超临界CO2作为流动相，进行色谱的分离纯化，通过筛选超临界CO2流体温度、压力、改性剂种类等技术參数的基础上，可以得到单一高纯度黄酮类化合物。改性剂的加入，改善黄酮类化合物分离效率，与传统分离纯化方法比较，本发明申请保护的方法克服现有分离纯化方法的废弃有机溶剂多，污染大，耗时长的缺陷，具有快速、高效、经济、环保的特性。
【专利附图】
【附图说明】
·[0013]附图用来提供对本发明的进ー步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是本发明エ艺流程图；
图2是含有黄酮类化合物的蜂胶样品的紫外吸收谱图；
图3是本发明エ艺分离出的山奈素的红外谱图；
图4是本发明エ艺分离出的杨梅素的红外谱图；
图5是本发明エ艺分离出的槲皮素的红外谱图。
【具体实施方式】
[0014]以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015]样品的制备:
将含有的黄酮类化合物的蜂胶10g，溶于50ml的甲醇溶液中，其紫外吸收谱图參见附图2,在图中，纵坐标表不紫外吸收的强度,横坐标表不时间，一个吸收峰代表ー个成分，也就此混合物中各类成分在各个不同时间紫外吸收的强度，即浓度。由此可见，各种黄酮类化合物在蜂胶中所占的比例。
[0016]色谱柱选用c-18柱。
[0017]实施例1:
取5ml样品注入超临界流体色谱纯化分离系统的进料装置，与添加改性剂水的超临界二氧化碳流体混合通过分配器然后流入填充了黄酮类化合物分离剂分离色谱柱，经过分离物检测器的检测，分别得到对癌细胞核有明显抑制作用的高纯度单一黄酮类化合物，附图
3、4、5分别列举了其中的三个黄酮类化合物:山奈素、杨梅素、槲皮素，由图中可以看出，所分离出的物质为单一化合物，无其它杂质。本实例中超临界二氧化碳压カ25mpa，控制保温箱温度40°C，在CO2流体通过分配器的同时，不断掺入改性剂水，占CO2流体总量的10%。
[0018]实施例2:
取5ml样品注入超临界流体色谱纯化分离系统的进料装置，与添加改性剂こ腈的超临界二氧化碳流体混合通过分配器然后流入填充了黄酮类化合物分离剂分离色谱柱，经过分离物检测器的检测，同样分别得到对癌细胞核有明显抑制作用的高纯度单一黄酮类化合物。本实例中超临界二氧化碳压カ20mpa，控制保温箱温度40°C，在CO2流体通过分配器的同时,不断掺入改性剂こ腈，占CO2流体总量的5%。
[0019]实施例3:
取5ml样品注入超临界流体色谱纯化分离系统的进料装置，与添加改性剂こ腈的超临界二氧化碳流体混合通过分配器然后流入填充了黄酮类化合物分离剂分离色谱柱，经过分离物检测器的检测，同样分别得到对癌细胞核有明显抑制作用的高纯度单一黄酮类化合物。本实例中超临界二氧化碳压カ35mpa，控制保温箱温度40°C，在CO2流体通过分配器的同时,不断掺入改性剂こ腈，占CO2流体总量的30%。
[0020]实施例4:
取5ml样品注入超临界流体色谱纯化分离系统的进料装置，与添加改性剂こ腈的超临界二氧化碳流体混合通过分配器然后流入填充了黄酮类化合物分离剂分离色谱柱，经过分离物检测器的检测，同样分别得到对癌细胞核有明显抑制作用的高纯度单一黄酮类化合物。本实例中超临界二氧化碳压カ25mpa，控制保温箱温度40°C，在CO2流体通过分配器的同时,不断掺入改性剂こ腈，占CO2流体总`量的20%。
[0021]以上所述仅为本发明的`优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管參照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.ー种超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:将含有黄酮类化合物的蜂胶样品注入流动相，使含有样品的流动相通过填充了黄酮类化合物分离剂的色谱柱，即可得到单一高纯度黄酮类化合物，其中:所述流动相为添加有改性剂的超临界CO2流体。
2.根据权利要求1所述的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:该色谱分离过程为ー循环封闭式系统，包括如下步骤: 1)样品的制备 将含有黄酮类化合物的蜂胶溶于有机溶剂中，得到蜂胶样品； 2)流动相的制备 将CO2气体制作成超临界CO2流体，添加改性剂后，形成流动相； 3)分离 将蜂胶样品与添加有改性剂的流动相通过填充有黄酮类化合物分离剂的色谱柱，分别得到高纯度单一的黄酮类化合物； 4)回收 色谱分离过程中产生的CO2废气，纯化后继续制作成超临界CO2流动相；色谱分离过程中产生的废液，净化回收作为蜂胶的有机溶剂。
3.根据权利要求2所述的 超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:所述有机溶剂采用甲醇或环己烷。
4.根据权利要求1或2所述的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:所述超临界CO2流体的压カ为20-40MPa、温度为40°C。
5.根据权利要求1或2所述的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:所述改性剂为超临界CO2的流动相总量的5wt%至30wt%的极性液体物质。
6.根据权利要求5所述的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:所述极性液体物质是选自水、こ臆、甲醇、こ醇、异丙醇。
7.根据权利要求6所述的超临界流体色谱分离纯化单一高纯度黄酮类化合物的方法，其特征在于:所述改性剂为水，占流动相总量的10%。
【文档编号】C07D311/40GK103588741SQ201310568685
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】吴晓闻, 陈玥 申请人:无锡尚宝生物科技有限公司