碱基部保护寡核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于延伸的受保护核苷酸，其可通过液-液萃取操作有效地和高收率地进行纯化，并且可通过亚磷酰胺法实现寡核苷酸制备方法。已经发现可通过特定的碱基部保护寡核苷酸和/或特定的3’位含支链的芳族保护寡核苷酸来解决上述问题。
【专利说明】碱基部保护寡核苷酸
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种特定的碱基部保护寡核苷酸和使用其制备寡核苷酸的方法。此 夕卜，本发明涉及特定的含有支链的芳族保护基、具有被所述保护基保护的3'位羟基的寡核 苷酸，以及使用具有被所述保护基保护的3'位羟基的所述寡核苷酸制备寡核苷酸的方法。
【背景技术】
[0002] 寡核苷酸的合成方法包括：磷酸三酯法、H-膦酸酯法、亚磷酰胺法等，而使用亚磷 酰胺法的固相合成（固相方法）是目前最普遍使用的方法（非专利文献1)。固相方法就速 度方面而言是有利的，因为已对工艺进行优化并且已取得自动化进展。然而，与其相关的缺 陷在于：由于设备限制而限制了规模放大，使用过量的试剂和起始材料，并且难以在中间步 骤中确定反应进展状态、分析中间体结构等。
[0003] 还已对通过液相方法的寡核苷酸合成方法进行了研究。然而，通常，每个反应后的 处理通过如下方法来进行，所述方法包括（1)直接浓缩反应液，然后通过硅胶柱色谱法分 离和纯化；（2)用诸如二氯甲烷、氯仿等的溶剂萃取，用水溶液洗涤，浓缩，通过硅胶柱色谱 法纯化等，操作复杂且收率低。具体而言，难以大规模地快速合成长寡核苷酸，而且这些方 法作为工业生产方法而言不切实际。
[0004] 近年来，已报道拟似固相方法作为解决液相方法和固相方法的各自缺陷的尝试， 使用诸如单甲氧基聚乙二醇（MPEG)等的可溶性聚合物作为保护基的寡核苷酸制备方法被 公开作为其中一个实例（非专利文献2)。然而，尽管公开了高达20聚体的DNA的合成例， 但结晶分离操作对每个反应是必不可少的，并且由于MPEG分子本身不是单分子，因此难以 确定反应的进展状态等。
[0005] 此外，作为拟似固相方法，已报道了包括使用离子液体作为保护基的寡核苷酸制 备方法，并且示出高达五聚体的DNA的合成例（非专利文献3)。然而，所述方法在速度和效 率方面均不如固相方法，因为结晶分离操作对每个反应是必不可少的并且操作时间对于其 而目是必需的。
[0006] 此外，公开了包括使用疏水基团连接的核苷的寡核苷酸合成方法（专利文献1)。 虽然报道过所述方法合成了 21聚体的寡核苷酸，但所述方法需要每次在5'-保护基的脱保 护、偶联、氧化的各步骤中进行固化分离，非常复杂。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献 1 JP-A-2010-275254
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 1 :S. L. Beaucage，D. E. Bergstorm，G. D. Glick，R. A. Jones，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry ；John ffiley&Sons(2000)
[0012] 非专利文献 2 :Nucleic Acid Res.，1990, Vol. 18, No. 11,3155-3159
[0013] 非专利文献 3 J. Org. Chem.，2006, Vol. 71，No. 20,7907-7910。
【发明内容】
[0014] 本发明要解决的问题
[0015] 本发明的课题是提供一种用于延伸的受保护核苷酸，其可提供通过亚磷酰胺法进 行的寡核苷酸制备方法，所述制备方法能够通过液-液萃取操作来实现高收率的高效纯 化。
[0016] 解决问题的方法
[0017] 作为深入研究的结果，本发明人已发现可通过特定的碱基部保护寡核苷酸来解决 上述问题，这使得本发明得以完成。
[0018] 本发明包括以下内容。
[0019] [1] 一种碱基部保护寡核苷酸，其由式（I)表示：
[0020]
【权利要求】
1. 碱基部保护寡核苷酸，其由通式（I)表示：
式中，q表示0以上的任意整数； q+Ι个碱基2各自独立地表示被具有C5_3(l直链或支链烷基和/或C 5_3(l直链或支链烯基 的基团保护的核酸碱基； P1表示氢原子、或在酸性条件下可除去的临时保护基； X表示氢原子、任选被保护的羟基、卤素原子或与4位碳原子交联的有机基团； q个X'各自独立地表示氢原子、任选被保护的羟基、卤素原子或与4位碳原子交联的有 机基团； q+Ι个P2各自独立地表示在碱性条件下可除去的保护基； q个R34各自独立地表示氧原子或硫原子； Re和Rf各自独立地表示(V6烧基，或者表示与相邻的氮原子一起形成的5元或6元饱 和环状氨基。
2. 根据权利要求1所述的碱基部保护寡核苷酸，其中，q为0。
3. 根据权利要求1或2所述的碱基部保护寡核苷酸，其中，具有C5_3(l直链或支链烷基 和/或C 5_3(l直链或支链烯基的基团为由式（k)表示的基团、由式（1)表示的基团、由式（m) 表示的基团或者由式（s)表示的基团， 所述式（k)为：
式中/表示与核酸碱基的键合位置； R27表示C5_3(l直链或支链烷基或者C5_ 3(l直链或支链烯基， 所述式⑴为：
式中/表示与核酸碱基的键合位置； Qi表示-〇-、-S-或-NR3°-，式中R3°表示氢原子或Q_22烷基； R。和Rd各自独立地表示氢原子或(V22烷基； R28表示C5_3(l直链或支链烷基或者C5_ 3(l直链或支链烯基， 所述式（m)为：
式中/表示与核酸碱基的键合位置； 1表示1至5的整数； 1个％各自独立地表示单键，或者表示_〇_、_S-、-0C( = 0)-、-C( = 0) 0-、-〇-CH2-、-NH-、-NHC ( = 0) -、-c ( = 0) NH-、-NH-CH2-或-CH2-; 1个R29各自独立地表示C5_3(l直链或支链烷基或者C5_ 3(l直链或支链烯基； 环C表示苯环或环己烷环，该苯环或环己烷环除了具有1个Q2R29和? = 0之外，进一步 任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被一个以上的卤素原子取代的(；_6烷基、 和任选被一个以上的齒素原子取代的Ck烧氧基， 所述式（S)为：
式中/表示与核酸碱基的氨基形成亚氨基键的位置； R35和R36各自独立地表示C5_3(l直链或支链烷基或者C 5_3(l直链或支链烯基。
4. 根据权利要求3所述的碱基部保护寡核苷酸，其中，R27、R28、1个R29、R 35和R36各自 独立地为选自2,6,10,14-四甲基十五烷基、2,6,10-三甲基i^一烷基、2, 2,4,8,10,10-六 甲基-5- i-一烷基、2,6,10-三甲基i-一 -1，5,9-三烯基、2,6-二甲基庚基、2,6-二甲基 庚-5-烯基、2,6-二甲基庚-1，5-二烯基、9-十九烷基、12-甲基十三烷基、11-甲基十三烷 基、11-甲基十二烷基、10-甲基i^一烷基、8-十七烷基、7-十五烷基、7-甲基辛基、3-甲基 辛基、3, 7-二甲基辛基、3-甲基庚基、3-乙基庚基、5-i烷基、2-庚基、2-甲基-2-己基、 2-己基、3-庚基、4-庚基、4-甲基-戊基、3-甲基-戊基和2,4,4_三甲基戊基中的支链烷 基或支链烯基；或选自十四烷基、十三烷基、十二烷基、十一烷基、癸基、壬基、辛基、庚基、己 基和戊基中的直链烷基。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的碱基部保护寡核苷酸，其中，所述C5_3(l直链或 支链烷基和/或C5_3(l直链或支链烯基为C5_3(l支链烷基和/或C 5_3(l支链烯基。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的碱基部保护寡核苷酸，其中，P1为单甲氧基三 苯甲基或二甲氧基三苯甲基。 7. n+p聚体寡核苷酸的制备方法，该方法包括： (2)使p聚体碱基部保护寡核苷酸与η聚体寡核苷酸经由其5'位羟基通过亚磷酸三酯 键而缩合的步骤，所述Ρ表示1以上的任意整数，所述η表示1以上的任意整数， 所述P聚体碱基部保护寡核苷酸中，3'位羟基被亚磷酰胺化，5'位羟基被在酸性条件 下可除去的临时保护基保护，而且核酸碱基被具有C5_3(l直链或支链烷基和/或C5_ 3(l直链或 支链烯基的基团保护， 所述η聚体寡核苷酸中，5'位羟基未被保护，而且3'位羟基被保护。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其中，ρ为1。
9. 根据权利要求7或8所述的制备方法，其进一步包括以下步骤（3): (3) 向缩合步骤（2)的反应液中加入氧化剂或硫化剂，将缩合步骤中获得的η+ρ聚体寡 核苷酸的亚磷酸三酯键转化成磷酸三酯键或硫代磷酸三酯键的步骤。
10. 根据权利要求7至9中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤（1): (1)在缩合步骤（2)之前，在非极性溶剂中，使3'位羟基被保护且5'位羟基被在酸性 条件下可除去的临时保护基保护的η聚体寡核苷酸与酸反应来除去5'位羟基的临时保护 基的步骤。
11. 根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤（1)在选自吡咯衍生物和吲哚衍生 物的至少一种阳离子清除剂的存在下进行，且进一步包括在除去5'位羟基的临时保护基之 后，用有机碱进行中和的步骤。
12. 根据权利要求9至11中任一项所述的制备方法，其进一步包括以下步骤（4): (4) 仅以萃取操作从步骤（3)中获得的反应液中分离η+ρ聚体寡核苷酸的步骤。
13. 根据权利要求12所述的制备方法，其进一步包括以下步骤（5): (5) 除去步骤（4)中获得的η+ρ聚体寡核苷酸的所有保护基的步骤。
14. 根据权利要求7至13中任一项所述的制备方法，其中，ρ聚体碱基部保护寡核苷酸 为权利要求1至6中任一项所述的碱基部保护寡核苷酸，所述ρ聚体碱基部保护寡核苷酸 中，3'位羟基被亚磷酰胺化，5'位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且核酸碱 基被具有C 5_3(l直链或支链烷基和/或C5_3(l直链或支链烯基的基团保护。
15. 根据权利要求7至14中任一项所述的制备方法，其中，η聚体寡核苷酸的3'位羟 基被由通式（III)表示的基团保护： -L-Y-Z (III) 式中， L表示由式（al)表示的基团：
式中/表示与Y的键合位置Γ表示与核苷酸3'位羟基的键合位置； U表示任选取代的二价(V22烃基；且 。表示单键，或表示由#C( = C^NOa-RtNO?3广表示的基团，式中，表示与1^的键 合位置，μ表示与C = 0的键合位置，R1表示任选取代的Ci_22亚烷基，R2和R3各自独立地 表示氢原子或任选取代的Q_ 22烷基，或R2和R3任选地一起形成任选取代的Q_22亚烷基键， Y表示氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基，且 Z表不由式（a2)表不的基团：
式中/表示与Y的键合位置； R4表示氢原子，或者当Rb为由下述式（a3)表示的基团时，R4任选地与R 6-起表示单 键或-0-、并与环B -起形成芴基或咕吨基； k个Q各自独立地表示单键，或者表示-0-、-S-、-0C ( = 0)-、-NHC ( = 0)-或-NH-; k个R5各自独立地表示具有至少一个脂族烃基且总碳数为14以上且300以下的有机 基团，所述脂族烃基具有一个以上支链； k表示1至4的整数； 环A除了具有R4、k个QR5、和#C (Ra) (Rb)之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选 自齒素原子、任选被一个以上的齒素原子取代的<^_6烧基、和任选被一个以上的齒素原子取 代的Ci_ 6烧氧基； Ra表不氢原子；且 Rb表不氢原子、或由式（a3)表不的基团：
式中/表示键合位置； j表示0至4的整数； j个Q各自独立地表示与上述相同的含义； j个R7各自独立地表示具有至少一个脂族烃基且总碳数为14以上且300以下的有机 基团，所述脂族烃基具有一个以上支链； R6表示氢原子，或者任选地与R4 -起表示单键或-〇_、并与环A -起形成莉基或咕吨 基；且 环B除了具有j个QR7和R6之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、 任选被一个以上的齒素原子取代的<^_6烧基、和任选被一个以上的齒素原子取代的(ν6烧 氧基。
16. 根据权利要求7至15中任一项所述的制备方法，其中，η聚体寡核苷酸的至少一个 核酸碱基被具有C5_ 3(l直链或支链烷基和/或C5_3(l直链或支链烯基的基团保护。
17. 根据权利要求7至16中任一项所述的制备方法，其中，C5_3(l直链或支链烷基和/或 c5_3〇 c5_3〇 / ^ c5_3〇
18. 含支链的芳族保护寡核苷酸，其由通式（II)表示：
式中， m表示0以上的任意整数； m+1个碱基1各自独立地表示任选被保护的核酸碱基； P1表示氢原子、或在酸性条件下可除去的临时保护基； X表示氢原子、任选被保护的羟基、卤素原子或与4位碳原子交联的有机基团； m个X'各自独立地表示氢原子、任选被保护的羟基、卤素原子或与4位碳原子交联的有 机基团； m个P2各自独立地表示在碱性条件下可除去的保护基； m个R34各自独立地表示氧原子或硫原子； L表示由式（al)表示的基团：
式中/表示与Y的键合位置Γ表示与核苷酸3'位羟基的键合位置； U表示任选取代的二价(V22烃基；且 。表示单键，或表示由#C( = C^NOa-RtNO?3广表示的基团，式中，表示与1^的键 合位置，μ表示与C = 0的键合位置，R1表示任选取代的Ci_22亚烷基，R2和R3各自独立地 表示氢原子或任选取代的Q_ 22烷基，或R2和R3任选地一起形成任选取代的Q_22亚烷基键， Y表示氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基，且 Z表不由式（a2)表不的基团：
式中/表示与Y的键合位置； R4表示氢原子，或者当Rb为由下述式（a3)表示的基团时，R4任选地与R 6-起表示单 键或-0-、并与环B -起形成芴基或咕吨基； k个Q各自独立地表示单键，或者表示-0-、-S-、-0C ( = 0)-、-NHC ( = 0)-或-NH-; k个R5各自独立地表示具有至少一个脂族烃基且总碳数为14以上且300以下的有机 基团，所述脂族烃基具有一个以上支链； k表示1至4的整数； 环A除了具有R4、k个QR5、和#C (Ra) (Rb)之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选 自齒素原子、任选被一个以上的齒素原子取代的<^_6烧基、和任选被一个以上的齒素原子取 代的Ci_ 6烧氧基； Ra表不氢原子；且 Rb表不氢原子、或由式（a3)表不的基团：
式中/表示键合位置； j表示0至4的整数； j个Q各自独立地表示与上述相同的含义； j个R7各自独立地表示具有至少一个脂族烃基且总碳数为14以上且300以下的有机 基团，所述脂族烃基具有一个以上支链； R6表示氢原子，或者任选地与R4 -起表示单键或-〇_、并与环A -起形成莉基或咕吨 基；且 环B除了具有j个QR7和R6之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、 任选被一个以上的齒素原子取代的<^_6烧基、和任选被一个以上的齒素原子取代的(ν6烧 氧基。
19. 根据权利要求18所述的含支链的芳族保护寡核苷酸，其中，m为0。
20. 根据权利要求18或19所述的含支链的芳族保护寡核苷酸，其中，核酸碱基的至少 一个被具有C5_3(l直链或支链烷基和/或C 5_3(l直链或支链烯基的基团保护。
21. η' +p'聚体寡核苷酸的制备方法，该方法包括： (2'）使ρ'聚体寡核苷酸与η'聚体寡核苷酸经由其5'位羟基通过亚磷酸三酯键而缩 合的步骤，所述Ρ'表示1以上的任意整数，所述η'表示1以上的任意整数， 所述Ρ'聚体寡核苷酸中，3'位羟基被亚磷酰胺化，5'位羟基被在酸性条件下可除去的 临时保护基保护，而且核酸碱基任选被保护， 所述η'聚体寡核苷酸中，5'位羟基未被保护，而且3'位羟基被由通式（III)表示的保 护基保护： -L-Y-Z (III) 式中， L表示由式（al)表示的基团：
式中/表示与Y的键合位置Γ表示与核苷酸3'位羟基的键合位置； U表示任选取代的二价(V22烃基；且 。表示单键，或表示由#C( = C^NOa-RtNO?3广表示的基团，式中，表示与1^的键 合位置，μ表示与C = 0的键合位置，R1表示任选取代的Ci_22亚烷基，R2和R3各自独立地 表示氢原子或任选取代的Q_ 22烷基，或R2和R3任选地一起形成任选取代的Q_22亚烷基键， Y表示氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基，且 Z表不由式（a2)表不的基团：
式中/表示与Y的键合位置； R4表示氢原子，或者当Rb为由下述式（a3)表示的基团时，R4任选地与R 6-起表示单 键或-0-、并与环B -起形成芴基或咕吨基； k个Q各自独立地表示单键，或者表示-0-、-S-、-0C ( = 0)-、-NHC ( = 0)-或-NH-; k个R5各自独立地表示具有至少一个脂族烃基且总碳数为14以上且300以下的有机 基团，所述脂族烃基具有一个以上支链； k表示1至4的整数； 环A除了具有R4、k个QR5、和#C (Ra) (Rb)之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选 自齒素原子、任选被一个以上的齒素原子取代的<^_6烧基、和任选被一个以上的齒素原子取 代的Ci_ 6烧氧基； Ra表不氢原子；且 Rb表不氢原子、或由式（a3)表不的基团： 式中/表示键合位置；
j表示0至4的整数； j个Q各自独立地表示与上述相同的含义； j个R7各自独立地表示具有至少一个脂族烃基且总碳数为14以上且300以下的有机 基团，所述脂族烃基具有一个以上支链； R6表示氢原子，或者任选地与R4 -起表示单键或-〇_、并与环A -起形成莉基或咕吨 基；且 环B除了具有j个QR7和R6之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、 任选被一个以上的齒素原子取代的Ch焼基、和任选被一个以上的齒素原子取代的(^_6焼 氧基。
【文档编号】C07H19/073GK104114569SQ201380009595
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年2月15日 优先权日:2012年2月17日
【发明者】平井邦博, 片山智, 鸟居高好, 中谷辽太朗, 高桥大辅 申请人:味之素株式会社