一种复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，方法如下：称取粉碎后的棉籽粕，以料液比为0.15g/ml加入复配反胶束溶液中，经过60min的水浴恒温震荡或超声，高速离心15min，除去不溶固形物，得到含有蛋白的前萃液，是为前萃。取20ml前萃液加入等体积量的1.2mol/L的KCl水溶液，水浴恒温震荡90min，3000r/min离心15min得到上层含有表面活性剂的油相和下层含有蛋白的水相，经分液漏斗分离得到下层蛋白水溶液，即为后萃液，该过程即为后萃。将得到的后萃液浓缩，喷粉干燥或冷冻干燥得到纯化棉子蛋白。本发明具有操作简单，反应条件温和，无酸碱排放，生产成本低，且所用反胶束溶液具有类生命水核，能够保持目标产物的特性和营养成分不受损害。
【专利说明】一种复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及棉籽综合利用【技术领域】，尤其涉及一种复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]我国是世界第一产棉大国，棉籽年产量千万吨以上，是重要的食品与饲料资源。棉籽中棉仁含量在50-55%，棉仁中油分含量30-35%，蛋白含量在35-45%，榨油后的棉子柏中蛋白含量更是高达60%以上。食品工业“十二五”规划提出要增加棉籽油等油脂生产，提高油料作物规模化综合利用水平，开发提取蛋白产品。本研究旨在探索棉籽柏中蛋白提取纯化的新方法和工艺，以得到有别于传统萃取工艺高酸碱排放、高能耗的环保新工艺。
[0003]棉子蛋白从氨基酸组成与含量上看与大豆蛋白质量相当，除赖氨酸含量稍低外，其他氨基酸与其持平或略高，达到联合国粮农组织和世界卫生组织的推荐标准，并且无豆腥味和胀气因子，具有保健功能。棉子蛋白的必须氨基酸与非必须氨基酸的比例协调，为1:1.09，与理想蛋白质模式1:1十分接近。其棉酚含量在新的提取工艺条件下也降低至0.04g/Kg以下，远低于世界卫生组织、联合国粮农组织、联合国儿童基金会等国际组织推荐的食品中游离棉酚含量不大于600mg/kg的标准。若作为食品级蛋白，经过精加工后棉酚含量会更低。因此现有的棉子蛋白若能全部利用将满足一大部分动物和人的蛋白需要，从而缓解粮棉争地的矛盾和人口增长带来的粮食危机。
[0004]与传统的碱溶酸沉等蛋白纯化方法相比，反胶束萃取因其反应条件温和，形成的具有类生命介质的反胶束团水核对生物活性物质具有一定的保护作用，可减少蛋白活性损失，另外也因其成本低可连续操作等优点得到科研工作者的重视。用于制作反胶束溶液萃取蛋白质的表面活性剂有很多种类，不同的反胶束体系因为表面活性剂的性质不同，对蛋白的萃取能力也不一样。试验证明阴离子型的表面活性剂对等电点低、相对分子量大的蛋白质萃取效果更好，而阳离子型的对那些等电点高、相对分子量小的蛋白萃取更有效。而棉子蛋白的等电点较低，分子量也较大，一般在PH = 4.5左右时达到等电点，分子量集中在53.6-59.7kDa，因此在理论上阴离子表面活性剂形成的反胶束体系更适合棉子蛋白的纯化萃取。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，旨在解决传统的碱溶酸沉等技术，强酸强碱的使用量大，能耗高，对环境的污染严重的缺点。
[0006]本发明在借鉴前人研究和大量试验的基础上，比较AOT (丁二酸二异辛酯磺酸钠)单一反胶束体系、SDS (十二烷基硫酸钠)单一反胶束体系和A0T/SDS复配反胶束体系对棉籽蛋白的萃取效果，最后得出A0T/SDS复配反胶束体系对棉子蛋白的萃取率最高的结论。经过对其前萃和后萃两个过程影响因素的单因素试验分析和优化分析，得到其最佳工艺条件。[0007]本发明采取的技术方案是:
[0008]本发明的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法的具体步骤如下:
[0009](I)备料:
[0010]将棉籽柏，粉碎备用；
[0011](2)配制复配反胶束溶液:
[0012]将丁二酸二异辛酯磺酸钠与十二烷基硫酸钠置于容器中，丁二酸二异辛酯磺酸钠与十二烷基硫酸钠的重量比为4:2-5，然后加入异辛烷和正辛醇混合溶剂，混合溶剂与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为20-30: lml/g，然后在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加入浓度为0.05mol/L的KH2P04-Na2HP04缓冲液，缓冲液的加入量与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为2-3:2ml/g，缓冲液的pH在5.0-8.0，然后转移至恒温振荡器以180r/min的速率震荡至澄清透明，静置12h后能保持澄清透明即可；
[0013](3)前萃:
[0014]以0.15-0.3g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，pH控制在6.0-7.5，经过30-90min的水浴恒温震荡或超声，萃取温度为30-50°C，然后高速离心除去不溶固形物，得到含有蛋白的如萃液；
[0015](4)后萃:
[0016]取步骤(3)制备 的前萃液，加入等体积量浓度为1-1.4mol/L的KCl水溶液，pH控制在7.0-9.0,然后水浴恒温震荡60-120min，萃取温度为30_50°C，高速离心10_20min，得到上层含有表面活性剂的油相和下层含有蛋白的水相，经分液漏斗分离得到下层蛋白水溶液，即为后萃液；
[0017](5)精制:
[0018]将步骤(4)得到的后萃液浓缩，然后喷粉干燥或冷冻干燥得到纯化棉子蛋白。
[0019]步骤⑴中，棉籽柏的粉碎后的粒度为20-60目。
[0020]步骤(2)中，优选丁二酸二异辛酯磺酸钠与十二烷基硫酸钠的重量比为4:3。
[0021]步骤(2)中，异辛烷与正辛醇的体积配比为3-5:1，优选混合溶剂与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为25: lml/g。
[0022]步骤(2)中，优选缓冲液的加入量与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为3:2ml/g。
[0023]步骤(3)中，优选以0.15g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，经过60min的水浴恒温震荡或超声。
[0024]步骤⑷中，优选KCl水溶液的浓度为1.2mol/L。
[0025]步骤(4)中，优选水浴恒温震荡90min，萃取温度为30_50°C，高速离心15min。
[0026]步骤(5)中，可以通过半透膜透析的方法除去后萃液中的盐离子，半透膜规格为7000 ~12000Da。
[0027]本发明的积极效果如下:
[0028]本发明的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法解决了传统方法的缺点，具有简化生产工艺，耗能低、污染小、溶剂残留少，反应条件温和，可保持蛋白产物的活性，纯度高，品质好等优点，经过前萃与后萃两个过程，蛋白的萃取率为64.5 %，纯度为98.7 %，棉酚未检出。[0029]本发明具有操作简单，反应条件温和，无酸碱排放，生产成本低，且所用反胶束溶液具有类生命水核，能够保持目标产物的特性和营养成分不受损害。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是标准棉酚的液相色谱图。
[0031]图2是本发明实施例1制备的棉子蛋白中棉酚的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0032]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0033]实施例1
[0034]步骤一、备料:将棉籽柏粉碎备用。
[0035]步骤二、配制复配反胶束溶液:将1.6gA0T与1.2gSDS两种表面活性剂置于IOOmL锥形中，然后加入配比好的异辛烷溶剂和助溶剂正辛醇40ml，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加入2.4mlKCl浓度为0.05mol/L的KH2P04_Na2HP04缓冲液，其pH控制在5.0-8.0范围内，然后转移至恒温振荡器以180r/min的速率震荡至澄清透明，静置12h后能保持澄清透明。
[0036]步骤三、前萃:以0.15g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，萃取温度为30-50°C，经过30min的水浴恒温震荡或超声，然后高速离心除去不溶固形物，得到含有蛋白的前萃液。
[0037]步骤四、后萃:取20ml前萃液，加入等体积量KCl浓度为1.2mol/L的KCl水溶液，pH控制在8.0-9.0的范围内，萃取温度为30-50°C，然后水浴恒温震荡90min，高速离心15min，得到上层含有表面活性剂的油相和下层含有蛋白的水相，经分液漏斗分离得到下层蛋白水溶液，即为后萃液。
[0038]步骤五、精制:将得到的后萃液浓缩，然后喷粉干燥或冷冻干燥得到纯化棉子蛋白。
[0039]步骤(1)中，棉籽柏的粉碎后的粒度为20-60目。
[0040]步骤⑵中，异辛烷与正辛醇的体积配比为4:1。
[0041]步骤(5)中，可以通过半透膜透析的方法除去后萃液中的盐离子，半透膜规格为7000 ~12000Da。
[0042]实施例2
[0043]步骤一、备料:将棉籽柏粉碎备用。
[0044]步骤二、配制复配反胶束溶液:将1.6gA0T与0.8gSDS两种表面活性剂置于IOOmL锥形中，然后加入配比好的异辛烷溶剂和助溶剂正辛醇32ml，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加入1.6mlKCl浓度为0.05mol/L的KH2P04_Na2HP04缓冲液，其pH控制在5.0-8.0范围内，然后转移至恒温振荡器以180r/min的速率震荡至澄清透明，静置12h后能保持澄清透明。
[0045] 步骤三、前萃:以0.20g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，萃取温度为30-50°C，经过60min的水浴恒温震荡或超声，然后高速离心除去不溶固形物，得到含有蛋白的前萃液。[0046]步骤四、后萃:取20ml前萃液，加入等体积量KCl浓度为1.0moI/L的KCl水溶液，pH控制在8.0-9.0的范围内，萃取温度为30-50°C，然后水浴恒温震荡60min，高速离心lOmin，得到上层含有表面活性剂的油相和下层含有蛋白的水相，经分液漏斗分离得到下层蛋白水溶液，即为后萃液。
[0047]步骤五、精制:将得到的后萃液浓缩，然后喷粉干燥或冷冻干燥得到纯化棉子蛋白。
[0048]步骤⑴中，棉籽柏的粉碎后的粒度为20-60目。
[0049]步骤⑵中，异辛烷与正辛醇的体积配比为3:1。
[0050]实施例3
[0051]步骤一、备料:将棉籽柏粉碎备用。
[0052]步骤二、配制复配反胶束溶液:将1.6gA0T与2.0gSDS两种表面活性剂置于IOOmL锥形中，然后加入配比好的异辛烷溶剂和助溶剂正辛醇48ml，在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加入2.4mlKCl浓度为0.05mol/L的KH2P04_Na2HP04缓冲液，其pH控制在5.0-8.0范围内，然后转移至恒温振荡器以180r/min的速率震荡至澄清透明，静置12h后能保持澄清透明。
[0053]步骤三、前萃:以0.30g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，萃取温度为30-50°C，经过90min的水浴恒温震荡或超声，然后高速离心除去不溶固形物，得到含有蛋白的前萃液。
[0054]步骤四、后萃:取20ml前萃液，加入等体积量KCl浓度为1.4mol/L的KCl水溶液，pH控制在8.0-9.0的范围内，萃取温度为30-50°C，然后水浴恒温震荡120min，高速离心20min，得到上层含有表面活性剂的油相和下层含有蛋白的水相，经分液漏斗分离得到下层蛋白水溶液，即为后萃液。
[0055]步骤五、精制:将得到的后萃液浓缩，然后喷粉干燥或冷冻干燥得到纯化棉子蛋白。
[0056]步骤(1)中，棉籽柏的粉碎后的粒度为20-60目。
[0057]步骤⑵中，异辛烷与正辛醇的体积配比为5:1。
[0058]实施例4
[0059]对实施例1制备的棉子蛋白进行检测如下:
[0060]蛋白活性:由于本实验采用的是亚临界低温萃取柏，在蛋白纯化过程中所用的溶液无强酸碱，反应条件温和，低温萃取，无致使蛋白变性的强机械作用力，因此蛋白未变性。有研究者对反胶束纯化的大豆蛋白、花生蛋等采用圆二色谱分析其α -螺旋结构及差示扫描量热法做过活性验证试验，证实反胶束确能保持蛋白活性。
[0061]实施例1制备的棉子蛋白纯度及品质可以由表1和图2中看出:
[0062]表1
[0063]
【权利要求】
1.一种复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:所述方法的具体步骤如下: (1)备料: 将棉籽柏，粉碎备用； (2)配制复配反胶束溶液: 将丁二酸二异辛酯磺酸钠与十二烷基硫酸钠置于容器中，丁二酸二异辛酯磺酸钠与十二烷基硫酸钠的重量比为4:2-5，然后加入异辛烷和正辛醇混合溶剂，混合溶剂与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为20-30: lml/g，然后在磁力搅拌器上搅拌至完全溶解后，加入浓度为0.05mol/L的KH2P04-Na2HP04缓冲液，缓冲液的加入量与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为2-3:2ml/g，缓冲液的pH在5.0-8.0，然后转移至恒温振荡器以180r/min的速率震荡至澄清透明，静置12h后能保持澄清透明即可； (3)前萃: 以0.15-0.3g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，pH控制在6.0-7.5，经过30-90min的水浴恒温震 荡或超声，萃取温度为30_50°C，然后高速离心除去不溶固形物，得到含有蛋白的如萃液； (4)后萃: 取步骤⑶制备的前萃液，加入等体积量浓度为1-1.4mol/L的KCl水溶液，pH控制在7.0-9.0，然后水浴恒温震荡60-120min，萃取温度为30_50°C，高速离心10_20min，得到上层含有表面活性剂的油相和下层含有蛋白的水相，经分液漏斗分离得到下层蛋白水溶液，即为后萃液； (5)精制: 将步骤(4)得到的后萃液浓缩，然后喷粉干燥或冷冻干燥得到纯化棉子蛋白。
2.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(1)中，棉籽柏的粉碎后的粒度为20-60目。
3.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(2)中，丁二酸二异辛酯磺酸钠与十二烷基硫酸钠的重量比为4:3。
4.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(2)中，异辛烷与正辛醇的体积配比为3-5:1，混合溶剂与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为 25: lml/g。
5.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(2)中，缓冲液的加入量与丁二酸二异辛酯磺酸钠的体积重量比为3:2ml/g。
6.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(3)中，以0.15g/mL的料液比将棉籽柏加入复配反胶束溶液中，经过60min的水浴恒温震荡或超声。
7.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(4)中，KCl水溶液的浓度为1.2mol/L。
8.如权利要求1所述的复配反胶束体系纯化棉子蛋白的方法，其特征在于:步骤(4)中，水浴恒温震荡90min，萃取温度为30-50°C，高速离心15min。
【文档编号】C07K1/14GK103951739SQ201410174218
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】王延琴, 邢要非, 杨伟华, 周大云, 匡猛, 方丹, 马磊 申请人:中国农业科学院棉花研究所