一种蛋白质定点修饰的新方法
【专利摘要】本发明属于蛋白质定点修饰领域，涉及一种新的蛋白质定点标记新方法，可广泛适用于蛋白质光谱学研究领域，也适用于生物核磁研究，涉及含砜基（苯砜基，甲砜基）、硝基的顺磁标签PyMTA，DPA类似物T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8的合成，这些顺磁标签对巯基具有明显的活性及反应的专一性。在温和的条件下（室温，中性，水溶液），首次通过亲核取代反应将顺磁标签与蛋白质进行连接，连接产率接近100%。PyMTA类似物通过硫醚键直接与蛋白质连接，增强了标签的刚性，获得很好的PCS，而且硫醚键在还原性和高pH条件下非常稳定，并能长期稳定存在。
【专利说明】一种蛋白质定点修饰的新方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质化学修饰领域特别适用于蛋白质定点修饰荧光或功能基团，涉及一种新的蛋白质修饰和顺磁标记方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质的分子结构是其生物功能的基础，蛋白质定点修饰通过引入小分子探针可以更好地了解蛋白质的结构和功能。高场液相核磁共振技术(NMR)作为解析具有原子分辨率的蛋白质结构的两大主要手段之一，在近二十多年得到了迅速的发展。另一种主要手段是X-射线晶体衍射，到目前为止，X-射线晶体衍射技术是直观说明生物大分子空间结构信息的最主要技术手段，它为分子生物学的发展做出了非常杰出的贡献。但是这一技术其自身也有一定的局限性:(1)要求样品必须是晶体，但并不是所有的样品都容易结晶，并且晶体状态在生理条件下(pH，盐浓度，温度等)不易得到；(2)蛋白质样品在溶液中的结构其实是一个不断变化的过程，而一旦结晶仅仅是蛋白质的其中一个形态，并不能真实的反映出蛋白质在溶液中的具体形态；(3)虽然X-射线晶体衍射仪测出的温度因子可以反映生物大分子的柔性，但是不能反映出其动态变化的快慢。
[0003]利用核磁共振研究蛋白质溶液结构及功能的传统方法是奥沃豪斯效应(NuclearOverhauser Effect, NOE)和二面角等限制性约束条件,但是它们只能提供短程的信息。
[0004]与传统的核磁共振相比，顺磁核磁共振能够提供长程的结构限制信息，在解决大分子量蛋白质的溶液结构，蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-核酸相互作用等方面具有明显的优势。
[0005]物质中具有不成对电子的分子、原子或离子时，存在电子的自旋角动量和轨道角动量，也就存在自旋磁矩和轨道磁矩，在外加磁场的作用下，原来取向杂乱的磁矩将定向，从而表现出顺磁性。顺磁性是一种物质的磁性状态，与顺磁性相反的现象是逆磁性或称抗磁性。具有顺磁性的物质在外磁场条件下产生的磁矩与处在同一磁场中的自旋核相互作用，从而使该自旋核的弛豫时间、化学位移、谱峰宽度等发生变化，这种效应称为顺磁效应。
[0006]用顺磁标签位点专一的标记蛋白质和寡核苷酸可以在生物大分子中产生明显的顺磁效应，主要有三种效应可以提供长程的结构信息O； Biomol.NMR, 2010, 46: 101 -112):( I)顺磁弛豫增强(paramagnetic relaxation enhancement, PRE)； (2)贋接触化学位移(pseudocon tact shifts,PCS); (3)残余偶极稱合(residual dipolar couplings,RDC)。
[0007]顺磁核磁共振作为一种新兴的核磁共振技术，在结构生物学中起着越来越重要的作用，它提供的长程的结构限制信息，使研究蛋白质-蛋白质相互作用、多个结构域间的相对取向，蛋白质溶液结构的细化等变得更加方便。此外，基于片段的药物筛选与设计在过去10年开始出现并获得了重要的应用，数十种基于片段的药物已经进入临床测试期。源于靶标蛋白和小分子片段本质上的弱相互作用，现代核磁技术在其中发挥着无可替代的作用。近些年来出现的一些核磁新技术，例如顺磁弛豫增强(PRE)、贋接触化学位移(PCS)、残余偶极耦合(RDC)等能够更为准确的提供蛋白/片段之间的取向和距离信息，这些新技术的应用有望为基于片段的药物发现(FBDD)带来新的突破(波谱学杂志.2012，29，163 - 181)。而顺磁标签的设计则起着举足轻重的作用，一个好的顺磁标签将非常有利于生物顺磁核磁共振的研究。如何把顺磁标签弓丨入到蛋白质中，一般的方法是合成具有双功能团的小分子化合物，一端用于顺磁金属离子的螯合，另一端与蛋白质进行连接，标签与蛋白质的连接方式有以下几种:(1)二硫键连接；(2)蛋白质中的半胱氨酸与烷基卤或缺电子烯烃的烷基化形成硫醚键；(3)点击化学；(4)非天然氨基酸的插入。
[0008]图1为已经报道的以二硫键方式连接的顺磁标签，化合物1、12 O； Am.Chem.Soc., 2009，131: 14761 - 14767)是巯基吡啶活化的标签；化合物 2、3、4、5、6、10、11 O；Biomol.NMR, 2002，24: 143 - 148; J.Biomol.NMR, 2004，29: 351 - 361; Chem.Eur.J., 2005，11: 3342 - 3348; Org.Lett., 2006，8: 1275 - 1278)是甲基硫代磺酸活化的标签；化合物 7、8 O； Am.Chem.Soc., 2008, 130: 10486 - 10487 -,Chem.Eur.J., 2010，16: 3827 - 3832)需要 Ellman’s 试剂 5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)先和蛋白质的巯基反应形成活化的二硫键，然后上述活化二硫键与7、8发生二硫键交换反应生成新的二硫键；化合物9 (泛￡?.Eur.J., 2011, 17: 6830 - 6836)是一个二聚体，它可以直接与蛋白质的半胱氨酸巯基反应。二硫键连接是对蛋白质进行定点标记的一种最常用方式，但是二硫键不稳定，很容易被还原剂(如DTT，TCEP)破坏，而且在碱性环境下不稳定。
[0009]图2为已经报道的以硫醚键方式连接的顺磁标签，化合物13、14、15 (.Chem.Commun., 2012，48: 2704 - 2706; Chem.Eur.J., 2013，19: 1097 - 1103)与蛋白质的巯基发生迈克尔加成反应生成稳定的硫醚键，它在还原性环境和碱性条件下均能稳定存在。
[0010]Loh等)\XBioconjugate chem.，2013, 24: 260 - 268)通过点击化学的方法成功地将DOTA衍生物，即图3中的16定点标记到蛋白质上，具体方法是把非天然氨基酸/7-叠氮基-L-苯丙氨酸(AzF)引入到蛋白质中，Cu(I)作为催化剂，标签16和AzF发生环加成反应共价连接到蛋白质上。和常用的二硫键linker相比，三唑环有更好的刚性和化学稳定性，但是这个反应需要在无氧条件下进行，增大了实验的复杂性，而且催化剂Cu(I)会导致蛋白质样品沉淀。
[0011]Nguyen 等人(如职#.Chem., 2011, 123: 718 - 720)报道了一种非天然氨基酸联吡啶丙氨酸(BpyAla) 17,他们通过体外无细胞表达技术(cell-free)把化合物17引入到蛋白质中，因为化合物17只能和过渡金属离子配位，在过渡金属离子中只有Co2+等少数金属离子具有顺磁性，能测得明显的PCS，所以，测得的实验数据比较少，一定程度上限制了17的应用。由于稀土金属离子具有较多的配位数，引入一个螯合能力强的非天然氨基酸具有非常大的挑战性，另外非天然氨基酸的引入是否对蛋白质的折叠引起额外的影响也需要考虑。
[0012]Gempf 等人Commun., 2013, 49: 9104 - 9106)报道了一种 4-硝基吡唳镧
系络合物18，它可以和多肽或蛋白质的半胱氨酸巯基发生反应，生成更短的硫醚键，用于荧光研究。
【发明内容】
[0013]本发明的目的是提供一种新的使用合成的顺磁标签进行蛋白质定点修饰方法，可以广泛应用到蛋白质定点修饰的领域，也可用于生物核磁共振研究。
[0014]本发明提供的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，包括以下步骤:
(I)定量称取合成标签加入到MQ超纯水中配置成50 mM的合成标签溶液，(2)向蛋白质ubiquitin E18C中加入1.5倍量的TCEP，并调节pH为7.5，静置，(3)将蛋白质ubiquitinE18C逐滴加入到5-10倍体积量的合成标签溶液中，并保证滴加过程及最终pH为7.5左右。
(4)采集反应不同时间之后混合物的1H-15N HSQC谱图，对反应进程进行检测，直到反应完全为止。(5)反应完全后，通过roio脱盐柱或者阴离子交换柱进行产物分离，将多余的标签与新生成的小分子物质除去，修饰完成；
上述合成标签涉及图4所示的含砜基(苯砜基，甲砜基)、硝基的PyMTA，DPA类似物Tl、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8。
[0015]本发明所涉及的化合物Tl、Τ2、Τ3、Τ4、Τ5、Τ6、Τ7和Τ8中:R1为苯砜基、甲砜基、硝基；R2为溴、氢。
[0016]其具体合成步骤如下:
(一)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N、N'-四乙酸(Tl)的合成路线如图5所示
(I) 3-溴-2，6-二甲基吡啶，即图5中化合物20的合成
将2，6- 二甲基吡啶，溴素依次滴加到发烟硫酸中，上述三者的体积比为1: 0.18:5，滴加完毕后，加热4-5h至溶液上方红棕色蒸汽基本消失，停止反应，冷至室温，将其缓慢倒入过量冰水中，冰水浴下用NaOH固体调pH，用过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状物。
[0017](2) 3-溴-2，6- 二甲基吡啶-N-氧化物，即图5中化合物21的合成
将3-溴-2，6- 二甲基吡啶20，乙酸，30%H202混合，上述三者的质量体积比为1:10:1.85,加热至70-90°C，反应12h，冷至室温，将反应液浓缩，稀释至过量水中，用NaOH固体调pH，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过柱子，得白色固体。
[0018](3) 3-溴-4-硝基2，6- 二甲基吡啶-N-氧化物，即图5中化合物22的合成
将21，浓硫酸，发烟硝酸混合，上述三者的质量体积比为1:2.82:3.45，加热10h，冷至室温，将其稀释至过量冰水中，用NaOH固体调pH，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色粉末。
[0019](4) 3，4- 二溴-2，6- 二甲基吡啶-N-氧化物，即图5中化合物23的合成
将乙酰溴滴加到22和冰乙酸的混合物中，上述三者的质量体积比为1:0.12:1，黄色澄清体系，加热8-10h，冷至室温，将其倒入过量冰水中，冰水浴下用碳酸钠固体调pH，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得白色粉末。
[0020](5) 2-羟甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即图5中化合物24的合成
将23，二氯甲烷，三氟乙酸酐(TFAA)混合，上述三者的质量体积比为1:2.56:4.87，加热4-6h，旋干溶剂，用饱和NaHCO3溶液调节pH，加入过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得白色固体。
[0021] (6) 2-溴甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即图5中化合物25的合成将PBr3滴加到24和氯仿的混合物中，上述三者的质量体积比为1: 1.9:41，滴加完毕后，加热6h，冷至室温，将其倒入过量冰水中，用NaHCO3固体调节pH，过量二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得浅黄色粉末。
[0022](7) 2，6- 二溴甲基-3，4_ 二溴吡啶，即图5中化合物27的合成
将N-溴代丁二酰亚胺分批加入到25和CCl4的混合物中，上述三者的质量体积比为1:0.19:3，每次加的时候加入毫克级的过氧化苯甲酰(Bz2O2)作为引发剂，加热34-38h，冷至室温，过滤，二氯甲烷洗涤滤饼，滤液用饱和NaHCO3溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，旋干得到多个溴代的中间体26，将其加入质量体积比为2:0.35:0.27的THF，N, N-二异丙基乙胺，亚磷酸二乙酯混合物中，深棕黄色体系，搅拌18h，将其倒入过量冰水中，过量无水乙醚萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过柱子得浅黄色粉末。 [0023](8)3，4-二溴-2，6-二 [N, N'-二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡啶，即图5中化合物28的合成
将27，MeCN,亚氨基二乙酸二乙酯，DIEA混合，上述四者的质量体积比为1:18.2:1.1:1.2，加热反应10h，冷至室温，旋干溶剂，加入过量乙酸乙酯溶解产物，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得无色油状物。
[0024](9)3-溴-4-苯砜基-2，6-二 [N，N、二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡唆，即图5中化合物29的合成
将28，乙腈，苯亚磺酸钠，四丁基溴化铵混合，上述四者的质量体积比为1:34.5:0.53:0.05，白色浑浊体系，加热反应12h，冷至室温，旋干溶剂，加入过量水，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得浅黄色油状物。
[0025](10)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，NW-四乙酸，即图5中化合物Tl的合成
将29加入到乙醇，NaOH，水的混合物中，上述四者的质量体积比为1:17.5:0.45:17.5，搅拌3-5h，分批加入H+离子交换树脂调pH至酸性，过滤，旋干滤液得白色粉末。1H-NMRC400MHz，90%H20+10%D20，pH > 12) 5 ppm:7.95 (lH，s)，7.81 (2H，d，/= 7.0Hz)，7.63 (lH，t，/ = 6.8Hz)，7.49 (2H，t，/ = 7.0Hz),3.92 (2H，s)，3.96 (2H，s)，3.12 (4H，s)，3.08 (4H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm: 179.20，159.86，159.03，147.46，136.59，135.07，129.52，128.63，122.19，115.73，58.76，58.40，58.34，58.14。MS-ESI (-):586.0，588.00
[0026](二)3-溴-4-甲砜基-2，6-吡啶二甲氨基-队队^，^-四乙酸(了2)的合成路线如图6所示
用相似的方法合成化合物T2，其核磁数据如下=1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.79 (1H, s)，4.08 (2H, s)，3.82 (2H, s)，3.36 (3H, s)，3.12 (4H, s),
3.08 (4H,s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:179.26,179.19,159.66,159.16，147.22，121.94，115.63,58.68,58.36，58.17,41.42。MS-ESI ( - ):524.0，526.0。
[0027](三)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N'N'-四乙酸(T3)的合成路线如图7所示
(I) 2-羟甲基-3-溴-4-硝基-6-甲基吡啶，即图7中化合物31的合成将三氟乙酸酐(TFAA)滴加到22和二氯甲烷的混合物中，上述三者的质量体积比为1:0.58:3.84,滴加完毕后，加热7h，旋干溶剂，用饱和NaHCO3溶液调节pH，加入过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得白色固体。
[0028](2) 2-溴甲基-3-溴-4-硝基_6_甲基吡啶，即图7中化合物32的合成
将PBr3滴加到31和氯仿的混合物中，上述三者的质量体积比为1:4.2:50，滴加完毕后，加热4-6h，冷至室温，用NaHCO3固体调节pH，过量二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干过柱子得白色粉末。
[0029](3) 2，6- 二溴甲基-3-溴_4_硝基吡啶，即图7中化合物33的合成
将N-溴代丁二酰亚胺分批加入到32和CCl4的混合物中，上述三者的质量体积比为1:0.17:3.7，每次加的时候加入毫克级的偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，加热30_36h，冷至室温，过滤，二氯甲烷洗涤滤饼，滤液用饱和NaHCO3溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过柱子，旋干得浅黄色油状物。
[0030](4)3-溴-4-硝基-2，6- 二 [N，N、二(叔丁氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡唆，即图7中化合物34的合成
将33，亚氨基二 乙酸二叔丁酯，乙腈，DIEA混合，上述四者的质量体积比为1: 1.4:60:1.2，加热7-9h，旋干溶剂，加入过量水，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物。
[0031](5)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-Ν，Ν，Π-四乙酸，即图7中化合物Τ3的合成
将三氟乙酸滴加到34和二氯甲烷的混合物中，上述三者的质量体积比为1:0.05:0.8，搅拌24h，旋干溶剂，得黄色油状物，加入过量无水乙醚，立刻析出白色沉淀，过滤，得到白色粉末，为产物的三氟乙酸盐。1H-NmruoomHz, 90%H20+10%D20，pH > 12)5 ppm:7.60(1H,s)，4.07 (2H，s)，3.80 (2H，s)，3.16 (4H，s)，3.10 (4H, s)；13C-NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:179.23，179.18，159.94，159.79，156.63，116.62，109.10,58.52，58.33，58.28。MS-ESI ( - ):491.0,493.0。
[0032](四)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-队队^^-四乙酸(了4)的合成路线如图8所示
(1)4-溴吡啶-2，6- 二羧酸二乙酯，即图8中化合物36的合成将白屈氨酸，五溴化磷混合，上述两者的质量比为1:3.3，加热反应4h，冷至室温，然后加入过量氯仿，搅拌萃取，过滤，滴加质量体积比为1:10的无水乙醇，室温搅拌3h，旋干，用过量正己烷重结晶得白色针状晶体。
[0033](2) 4-溴吡啶-2，6- 二甲醇，即图8中化合物37的合成
将36，无水乙醇混合，上述两者的质量体积比为1:7.7，分批加入质量体积比为1:0.67的NaBH4,加热6-8h，冷至室温，旋干溶剂，加入过量饱和NaHCO3溶液，搅拌2h，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得白色粉末。
[0034](3) 2，6- 二溴甲基-4-溴吡唆，即图8中化合物38的合成
将PBr3滴加到37和氯仿的混合物中，上述三者的质量体积比为1:0.2:3.7，滴加完毕后，加热10h，冷至室温，将其倒入冰水中，用NaHCO3固体调节pH，过量二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得白色粉末。[0035](4)4-溴-2，6-二 [N，N、二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡啶，即图8中化合物39的合成
将38，MeCN,亚氨基二乙酸二乙酯，无水K2CO3混合，上述四者的质量体积比为1:20:1.3: 2，加热反应7h，冷至室温，旋干溶剂，加入过量乙酸乙酯溶解产物，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物。
[0036](5)4-苯砜基-2，6-二 [N，N、二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡啶，即图8中化合物40的合成
将39，乙腈，苯亚磺酸钠，四丁基溴化铵混合，上述四者的质量体积比为1:37.5:0.6:0.06，加热反应12h，冷至室温，旋干溶剂，加入过量水，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得浅黄色油状物。
[0037](6)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，NH-四乙酸，即图8中化合物T4的合成 将40加入到乙醇，NaOH，水的混合物中，上述四者的质量体积比为1:16.1:0.53:16.1，搅拌3-5h，分批加入H+离子交换树脂调pH至酸性，过滤，旋干滤液，得浅黄色粉末。1H-NMR(400 MHz, 90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm -J.93 (2H，d，/= 7.7Hz),7.83 (2H，s)，7.66(1H, t, / = 7.4Hz)，7.56 (2H, t, / = 7.7Hz)，3.84 (4H, s)，3.07 (8H, s) ； 13C-NMR (100MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.16,161.16,149.88,137.90,134.95,129.98,127.83,118.70,58.98,57.97。MS-ESI( - ):586.0,588.0。MS-ESI( - ):508.2。
[0038](五)4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N:N'-四乙酸(T5)的合成路线如图9所示
化合物4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N, NW-四乙酸(Τ5)的合成方法和化合物Τ3的合成方法类似，4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N、N、四乙酸(Τ5)的核磁数据如下:1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.05 (2H，s)，3.88 (4H，s)，3.12 (8H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.26，161.79，155.13，115.08，59.11,58.25。MS-ESI ( - ):413.1。
[0039](六)4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸(T6)的合成路线如图10所示 (I) 4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸二乙酯，即图10中化合物47的合成
将36，苯亚磺酸钠，乙腈，四丁基溴化铵混合，上述四者的质量体积比为1:1.11:30:0.1，加热反应36h，冷至室温，旋干溶剂，加入过量水，过量乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子得白色粉末，回收未反应完的原料36。
[0040](2)4-苯砜基吡啶-2，6- 二羧酸，即图10中化合物T6的合成
将47加入到乙醇，NaOH，水的混合物中，上述四者的质量体积比为1:13.6:0.43:13.6，搅拌10h，用浓盐酸调pH至强酸性，有白色固体析出，过滤，冷水洗涤滤饼，红外干燥，得白色粉末。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.33 (2H，s)，7.96 (2H，d，/ =8.1Ηz)，7.66(lH，t，/ = 7.5Hz)，7.56(2H，t，/ = 8.1Hz)；13C-NMR( 100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:170.61，154.97，150.58，137.53，135.21，130.05，128.07，121.66。
[0041](七)4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(T7)的合成路线如图10所示
用与Τ6类似的方法合成4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(Τ7)，其核磁数据如下=1H-NMR(400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.35 (2H，s)，3.26 (3H, s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.71，154.99，149.37，121.58，42.55。
[0042](A) 4-硝基吡啶-2，6- 二羧酸(T8)的合成路线如图11所示
将三氧化铬分批加入到浓硫酸和43的混合物中，上述三者的质量体积比为1:3.55:0.25,加热，反应2h，冷至室温，倒入过量冰水中，过滤，用冷水洗涤滤饼，得白色固体，红外干燥，得白色粉末。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.54 (2H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.47，155.73，155.65，117.66。
[0043]上述顺磁标签与蛋白质上的巯基发生亲核取代反应之后生成稳定的硫醚键，该反应具有明显的活性和专一性，上述标签的优点有以下几个方面:(1)体积较小；(2)不存在手性；(3)连接过程简便，反应速度快；(4)与蛋白质不存在非特异性作用；(5)在高pH及还原性环境下均能稳定存在。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为以二硫键方式连接的顺磁标签；
图2为以硫醚键方式连接的顺磁标签；
图3为其它方式连接的标签； 图4为以PyMTA，DPA为骨架的顺磁标签；
图5为Tl的合成路线；
图6为T2的合成路线；
图7为T3的合成路线；
图8为T4的合成路线；
图9为T5的合成路线；
图10为T6、T7的合成路线；
图11为Τ8的合成路线；
图12为化合物Τ1-Τ8与L-半胱氨酸的反应式；
图13为20°C，ρΗ=7.5时Tl与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图14为20°C，ρΗ=7.5时Τ2与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图15为20°C，ρΗ=7.5时Τ3与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图16为20°C，pH=7.5时T4与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图17为20°C，ρΗ=7.5时Τ5与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图18为20°C，ρΗ=7.5时Τ6与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图19为20°C，ρΗ=7.5时Τ7与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图20为20°C，pH=7.5时T8与L-半胱氨酸混合后在不同时刻的1H-NMR谱图；
图21为蛋白质与顺磁标签Tl的连接方式；
图22为25°C，pH=6.4条件下，1.0倍量的顺磁或逆磁金属离子分别滴加到0.10 mM的复合物ubiquitin E18C-T1蛋白质中的1H-15N HSQC重叠谱图。
【具体实施方式】
[0045]实施例1 合成标签 T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8。
[0046](一)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N、N、四乙酸(Tl)的合成路线如图5所示
(I)3-溴-2，6-二甲基吡啶，即图5中化合物20的合成
将发烟硫酸125.0ml加入500ml三口瓶中，滴加2，6- 二甲基吡啶25.0ml (0.22mol),溶液为浅黄色，溶液上方为白色雾状，接着滴加溴素4.5ml (0.09mol),滴加完毕后,体系为红棕色，移去冰源，加热4-5h至溶液上方红棕色蒸汽基本消失，停止反应，冷至室温，将其缓慢倒入冰水中，冰水浴下用NaOH固体调pH，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状物19.30g，产率:48.6%。1H-NMR (400 MHz ADCl3) δppm:7.67 (1H, ?, J = 8.1Ηz)，6.86 (1Η, ?, J = 8.1Ηz)，2.63 (3Η, s)，2.48 (3Η, S)。
[0047](2) 3-溴-2，6- 二甲基吡啶_N_氧化物，即图5中化合物21的合成
将 3-溴-2，6- 二甲基吡啶 20 13.0Og (70.28mmol),乙酸 130.0ml 加入 500ml 三口瓶中，无色澄清溶液，加热至70-90°C，加入30%H202 24.0ml，反应12h，冷至室温，将反应液浓缩，稀释至水中，用NaOH固体调pH，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过柱子，得白色固体10.00g，产率71.1%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 5 ppm:7.35 (1H, d，/ = 8.4Ηζ)，7.02 (1Η, d，/ = 8.4Ηζ)，2.72 (3Η, s)，2.48 (3Η, S)。
[0048](3) 3-溴-4-硝基2，6_ 二甲基吡啶-N-氧化物，即图5中化合物22的合成
将21 9.56g (47.56mmol)加入250ml三口烧瓶中，滴加浓硫酸27.0ml，滴加完毕后，再滴加发烟硝酸33.0ml，黄色澄清体系，加热10h，冷至室温，将其稀释至冰水中，用NaOH固体调pH，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色粉末10.26g，产率:87.7%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm -J.74 (1H, s),2.81 (3H, s),2.53(3H,s)。
[0049](4) 3，4- 二溴-2，6_ 二甲基吡啶_N_氧化物，即图5中化合物23的合成
将22 3.50g(14.23mmol)，冰乙酸28.0ml加入250ml三口瓶中，黄色澄清体系，滴加乙酰溴28.0ml，加热8-10h，反应过程中由红色体系变为亮黄色澄清体系，冷至室温，将其倒入冰水中，冰水浴下用碳酸钠固体调pH至弱碱性，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得白色粉末3.80g，产率:95.7%。1H-NMR (400 MHz，⑶Cl3) δppm:7.48 (lH，s)，2.84 (3H，s)，2.49 (3H，s)。
[0050](5) 2-羟甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即图5中化合物24的合成
将23 3.90g (13.93mmol)，二氯甲烷10.0ml加入100mL单口瓶中，滴加三氟乙酸酐19.0ml (TFAA)，滴加完毕后，加热4_6h，旋干溶剂，用饱和NaHCO3溶液调节pH，有白色固体析出，加入乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得白色固体 3.05g，产率:78.2%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm -J.43 (1H, s),4.72 (2H, ?, J =
4.4Ηζ)，4.48 (1Η, t,J = 4.4Ηζ)，2.55 (3Η, S)。
[0051](6) 2-溴甲基-3，4- 二溴-6-甲基吡唆，即图5中化合物25的合成
将24 2.1Og (7.50mmol)，氯仿40.0ml加入100mL三口瓶中，浅黄色澄清体系，滴加溶有PBr3 1.1ml (11.25mmol)的氯仿5.0ml，滴加完毕后，加热6h，冷至室温，将其倒入冰水中，用NaHCO3固体调节pH，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得浅黄色粉末 2.17g，产率:85.1%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm:7.38 (1H, s),4.73 (2H, s)，2.49 (3H, S)。
[0052](7) 2，6- 二溴甲基-3，4_ 二溴吡啶，即图5中化合物27的合成将25 1.91g (5.60mmol), CCl4 30ml加入100mL三口瓶中，浅黄色澄清体系，加热34-38h，加热过程中分批加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS，每批1.0Og),每次加的时候加入毫克级的过氧化苯甲酰(Bz2O2)作为引发剂，冷至室温，过滤，二氯甲烷洗涤滤饼，滤液用饱和NaHCO3溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，旋干得到多个溴代的中间体26，用20.0ml THF溶解，黄色澄清体系，加入N，N-二异丙基乙胺3.5ml (DIEA，21.12mmol )，亚磷酸二乙酯2.7ml[ HPO (OEt)2, 21.12mmol ]，深棕黄色体系，搅拌18h，反应过程中有白色沉淀析出，将其倒入冰水中，无水乙醚萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，过柱子得浅黄色粉末 1.65g，产率:70.5%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 5 ppm:7.68(lH，s)，4.77 (2H，s)，4.47 (2H，s)。
[0053](8)3，4-二溴-2，6-二 [N, ΝΛ-二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡啶，即图5中化合物28的合成
将 27 1.65g (3.94mmol),MeCN 30.0ml,亚氛基二乙酸二乙酷 1.8ml (9.85mmol),DIEA
2.0ml (11.82mmol)，加入100mL三口瓶中，加热反应10h，冷至室温，旋干溶剂，加入乙酸乙酯溶解产物，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得无色油状物1.44g，产率:57.6%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.86 (lH，s)，4.25 (2H，s)，4.14 (8H，m)，3.94(2H，s)，3.71 (4H，s)，3.57 (4H, s), 1.25 (12H，q，/= 14.4Hz)。
[0054](9)3-溴-4-苯砜基-2，6-二 [N，N'- 二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡唆，即图5中化合物29的合成
将 28 0.87g (1.36mmol),乙腈 30.0ml,苯亚磺酸钠 0.46g (2.72mmol),四丁基溴化铵43.52mg加入100mL三口瓶中，白色浑浊体系，加热反应12h，冷至室温，旋干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得浅黄色油状物 0.94g，产率:98.9%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm:8.49 (1H, s),7.99 (2H, ?, J =7.8Ηζ)，7.65 (1Η, t,J = 7.4Ηζ)，7.54 (2Η, t,J = 7.8Ηζ)，4.26 (2Η, s)，4.17 (10Η, m),
3.70 (4H，s)，3.65 (4Η, s), 1.27 (12H，m)。
[0055](10)3-溴-4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，NW-四乙酸，即图5中化合物Tl的合成
用乙醇10.0ml将29 0.57g (0.81 mmol)溶解在100mL单口瓶中，无色澄清体系，接着加入溶有NaOH 0.26g (6.48mmol)的水10.0ml，搅拌3_5h，分批加入H+离子交换树脂调pH至酸性，过滤，旋干滤液得白色粉末0.25g，产率:53.2%。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.95 (1H, s)，7.81 (2H, ?, J = 7.0Hz),7.63 (1H, t，/ = 6.8Ηζ)，7.49(2H，t，/= 7.0Η ζ)，3.92 (2H，s)，3.96 (2H，s)，3.12 (4H，s)，3.08 (4H, s) ； 13C-NMR (100MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.20,159.86,159.03,147.46,136.59,135.07,129.52，128.63，122.19，115.73，58.76，58.40，58.34，58.14。MS-ESI( - ):586.0，588.0。
[0056](二)3-溴-4-甲砜基-2，6-吡啶二甲氨基-队队^，^-四乙酸(了2)的合成路线如图6所示
用相似的方法合成化合物T2，其核磁数据如下=1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.79 (1H, s)，4.08 (2H, s)，3.82 (2H, s)，3.36 (3H, s)，3.12 (4H, s),
3.08 (4H,s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:179.26,179.19,159.66,159.16，147.22，121.94，115.63,58.68,58.36，58.17,41.42。MS-ESI ( - ):524.0，526.0。[0057](三)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N'K -四乙酸(T3)的合成路线如图7所示
(I) 2-羟甲基-3-溴-4-硝基-6-甲基吡啶，即图7中化合物31的合成 将22 6.0Og (24.40mmol)，二氯甲烷40.0ml加入100mL单口瓶中，滴加三氟乙酸酐
10.4ml (TFAA)，滴加完毕后，加热7h，旋干溶剂，用饱和NaHCO3溶液调节pH，加入乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得白色固体2.1Og,产率:35.0%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.42 (lH，s)，4.84 (2H，d，/= 4.6Hz),4.30 (lH，t，/ =
4.6Hz)，2.69 (3H, s)。
[0058](2) 2-溴甲基-3-溴-4-硝基_6_甲基吡啶，即图7中化合物32的合成
将31 2.1Og (8.50mmol)，氯仿20.0ml加入100mL三口瓶中，浅黄色澄清体系，滴加溶有PBr3 0.5ml (4.80mmol)的氯仿5.0ml，滴加过程中有白色沉淀析出，滴加完毕后，加热4-6h，冷至室温，用NaHCO3固体调节pH，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干过柱子得白色粉末0.90g，产率:34.5%。1H-NMR (400 MHz，CDC13) δ ppm:7.35 (lH，s)，4 .78 (2H，s)，2.65 (3H，s)。
[0059](3) 2，6- 二溴甲基-3-溴_4_硝基吡啶，即图7中化合物33的合成
将32 0.93g (3.02mmol), CCl4 20ml加入100mL三口瓶中，无色澄清体系，加热30h，加热过程中分批加入N-溴代丁二酰亚胺(NBS，每批0.54g)，每次加的时候加入毫克级的偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂，冷至室温，过滤，二氯甲烷洗涤滤饼，滤液用饱和NaHCO3溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过柱子，旋干得浅黄色油状物0.25g，产率:21.6%。1H-NMR (400 MHz，CDC13)5 ppm:7.67 (lH，s)，4.79 (2H，s)，4.56 (2H, s)；13C-NMR(100 MHz, CDCl3) δ ppm:158.80，157.93，117.44，110.46,32.18,31.04。
[0060](4)3-溴-4-硝基-2，6- 二 [N，N'_ 二(叔丁氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡唆，即图7中化合物34的合成
将 33 0.25g (0.65mmol),亚氨基二乙酸二叔丁酯 0.35g (1.43mmol),乙臆 15.0ml,DIEA 0.3ml(l.63mmol)加入100mL三口瓶中，黄色澄清体系，加热7_9h，旋干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物0.25g，产率:54.3%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.93 (lH，s)，4.32 (2H，s)，4.11 (2H，s)，3.63 (4H，s)，3.48 (4H, s), 1.48 (18H, s), 1.46 (18H，s)。
[0061](5)3-溴-4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，NH-四乙酸，即图7中化合物T3的合成
将34 0.25g(0.35mmol)，二氯甲烷4.0ml加入100mL单口瓶中，滴加三氟乙酸5.0ml，滴加完毕后，无色澄清体系，搅拌24h，旋干溶剂，得黄色油状物，加入15.0ml无水乙醚，立刻析出白色沉淀，过滤，无水乙醚洗涤，得到白色粉末0.21g，为产物的三氟乙酸盐，产率:77.8%。1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm -J.60 (lH，s)，4.07 (2H, s),
3.80 (2H, s)，3.16 (4H, s)，3.10 (4H, s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12)δ ppm:179.23，179.18，159.94，159.79，156.63,116.62，109.10,58.52,58.33,58.28。MS-ESI ( - ):491.0,493.0。
[0062](四)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-队队^^-四乙酸(了4)的合成路线如图8所示(1)4-溴吡啶-2，6- 二羧酸二乙酯，即图8中化合物36的合成将白屈氨酸15.0Og (81.96臟01)，五溴化磷50.0(^ (117.49mmol)加入250ml三口瓶中，加热反应4h，冷至室温，然后加入氯仿，搅拌萃取，过滤，滴加150.0ml无水乙醇，滴加完毕后，室温搅拌3h，旋干，用正己烷重结晶得白色针状晶体12.80g，产率:52.(Fc)tj1H-NMRUOOMHz, CDCl3) δ ppm:8.45 (2H, s)，4.52 (4H, q，/ = 7.1Hz), 1.48 (6H, t,J = 7.1Hz)。
[0063](2) 4-溴吡啶-2，6- 二甲醇，即图8中化合物37的合成
将36 19.45g (64.62mmol)，无水乙醇150.0ml加入500ml三口瓶中，分批加入NaBH412.97g(341.32mmol )，加热6_8h，冷至室温，旋干溶剂，加入饱和NaHCO3溶液，搅拌2h，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得白色粉末12.00g，产率:85.7%。1H-NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ ppm -J.50 (2H, s),5.66 (2H，t，/= 5.9Hz),4.53(4H, d，/ = 5.9Hz)。 [0064](3) 2，6- 二溴甲基-4-溴吡唆，即图8中化合物38的合成
将 37 12.00g(55.31mmol)，氯仿 120.0ml 加入 500ml 三口瓶中，滴加溶有 PBr3 60.0ml的氯仿100.0ml，滴加完毕后，加热10h，冷至室温，将其倒入冰水中，用NaHCO3固体调节pH，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得白色粉末18.00g，产率:97.3%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) δ ppm -J.55 (2H，s)，4.48 (4H，S)。
[0065](4)4-溴-2，6-二 [N, N'-二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡啶，即图8中化合物39的合成
将 38 1.0Og (2.93mmol), MeCN 20.0ml,亚氛基二乙酸二乙酷 1.3ml (7.1Immol),无水K2CO3 2.0Og (14.50mmol)，加入100mL三口瓶中，加热反应7h，冷至室温，旋干溶剂，加入乙酸乙酯溶解产物，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子，得浅黄色油状物 1.50g，产率:91.5%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm -J.72 (2H, s),4.17 (8H, q, / =
7.1Ηz)，4.01 (4H, s)，3.59 (8H, s), 1.27 (12H, t,J = 7.1 Hz)。
[0066](5)4-苯砜基-2，6-二 [N，N: 二(乙氧羰基甲基)氨基亚甲基]吡啶，即图8中化合物40的合成
将 39 0.80g (1.43mmol),乙腈 30.0ml,苯亚磺酸钠 0.48g (2.86mmol),四丁基溴化铵45.76mg加入100mL三口瓶中，白色浑浊体系，加热反应12h，冷至室温，旋干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得浅黄色油状物
0.62g，产率:69.7%。1H-NMR (400 MHz，CDCl3) 5 ppm:8.04 (4H，d，/= 5.4Hz),7.63 (1H,t,J = 7.1Ηz)，7.56 (2H，t，/ = 7.5Ηζ)，4.18 (8H，q，/ = 7.1Ηz)，4.12 (4H，s)，3.60 (8H,s), 1.28 (12H, t,J = 7.1Hz)。
[0067](6)4-苯砜基-2，6-吡啶二甲氨基-N，NH-四乙酸，即图8中化合物T4的合成
用乙醇10.0ml将40 0.62g(1.00 mmol)溶解在100ml单口瓶中，浅黄色澄清体系，接着加入溶有NaOH 0.33g(8.30mmol)的水10.0ml，搅拌3_5h，分批加入H+离子交换树脂调pH至酸性，过滤，旋干滤液，得浅黄色粉末0.41g，产率:80.6%。1H-NMRC400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:7.93 (2H, ?, J = 7.7Ηζ)，7.83 (2Η, s)，7.66 (1Η, t，/ = 7.4Ηζ)，7.56(2H，t，/ = 7.7Hz),3.84 (4H，s)，3.07 (8H，s);13C_NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12)δ ppm:179.16，161.16，149.88，137.90，134.95，129.98，127.83,118.70,58.98,57.97。MS-ESI( - ):586.0,588.0。MS-ESI( - ):508.2。
[0068](五)4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N^-四乙酸(T5)的合成路线如图9所示
化合物4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N, NW-四乙酸(T5)的合成方法和化合物T3的合成方法类似，4-硝基-2，6-吡啶二甲氨基-N，N，N' N、四乙酸(T5)的核磁数据如下:1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.05 (2H，s)，3.88 (4H，s)，3.12 (8H,s) ； 13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:179.26，161.79，155.13，115.08，59.11,58.25。MS-ESI ( - ):413.1。
[0069](六)4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸(T6)的合成路线如图10所示
(1)4-苯砜基吡啶-2，6-二羧酸二乙酯，即图10中化合物47的合成
将 36 1.0Og (3.32mmol),苯亚磺酸钠 1.1lg (6.64mmol),乙腈 30.0ml,四丁基溴化铵106.24mg加入100mL三口瓶中，白色浑浊体系，加热反应36h，冷至室温，旋干溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，过柱子得白色粉末0.44g，回收未反应完的原料 36，产率:36.7%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm:8.68 (2H, s),8.04(2H, d，/ = 7.5Ηζ)，7.70 (1H, t,J = 7.4Ηζ)，7.56 (2H, t,J = 7.5Ηζ)，4.52 (4H, q，/ =7.1Hz), 1.48 (6H, t,J = 7.1Hz)。
[0070](2)4-苯砜基吡啶-2，6- 二羧酸，即图10中化合物T6的合成
将 47 0.44g (1.21 mmol),NaOH 0.19g (4.84mmol),乙醇 6.0ml,水 6.0ml 加入 100ml单口瓶中，白色浑浊体系，搅拌10h，用浓盐酸调pH至强酸性，有白色固体析出，过滤，冷水洗涤滤饼，红外干燥，得白色粉末0.28g，产率:75.7%。1H-NMR (400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.33 (2H, s)，7.96 (2H, d，/ = 8.1Ηz)，7.66 (1H, t，/ = 7.5Hz)，7.56(2H, t，/ = 8.1Hz) ； 13C-NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.61，154.97，150.58，137.53，135.21，130.05，128.07，121.66。
[0071](七)4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(T7)的合成路线如图10所示
用与Τ6类似的方法合成4-甲砜基吡啶-2，6-二羧酸(Τ7)，其核磁数据如下=1H-NMR(400 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.35 (2H，s)，3.26 (3H, s)；13C-NMR (100 MHz,90%H20+10%D20, pH > 12) δ ppm:170.71，154.99，149.37，121.58，42.55。
[0072](A) 4-硝基吡啶-2，6- 二羧酸(T8)的合成路线如图11所示
将浓硫酸7.0ml加入100mL三口瓶中，分批加入43 0.50g (3.29mmol)，加热，分批加入三氧化铬1.97g (19.74mmol),墨绿色浑池体系,反应2h,冷至室温,倒入冰水中，过滤,用冷水洗涤滤饼，得白色固体，红外干燥，得白色粉末0.38g，产率54.3%。1H-NMR (400 MHz,90%H20+10%D20,pH > 12) δ ppm:8.54 (2H, s)；13C-NMR (100 MHz, 90%H20+10%D20,pH > 12)δ ppm:170.47，155.73，155.65，117.66。
[0073]实施例2化合物T1-T8与L-半胱氨酸反应
分别配制50.0 mM的T1-T8溶液，稀释成1.0 mM的T1-T8溶液(用磷酸盐缓冲液配制，含20%D20)，调pH至7.5，用Bruker-600 MHz超导核磁共振谱仪采样，接着分别加入100.0mM pH=7.5的L-半胱氨酸(6 equiv)充分混合，间隔30 min采样。
[0074]图12为化合物T1-T8与L-半胱氨酸的反应式，L-半胱氨酸的巯基与化合物T1-T8在温和条件下(室温，中性，水溶液)发生亲核取代反应，生成稳定的硫醚键。[0075]图13为20°C，pH=7.5时化合物Tl与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 Tl ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 Tl (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min ； (C):混合后30 min ； (D):混合后I h ； (E)混合后2 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，Tl吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:8.31)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.40)的峰强度逐渐增强，2 h后，反应完全。
[0076]图14为20°C，pH=7.5时化合物T2与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T2 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T2 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min ； (C):混合后30 min ； (D):混合后I h ； (E)混合后3 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T2吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:8.11)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.40)的峰强度逐渐增强，混合3 h后，反应基本进行完全。
[0077]图15为20°C，pH=7.5时化合物T3与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T3 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T3 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min ； (C):混合后I h ； (D):混合后3 h ； (E)混合后5 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T3吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.95)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.40)的峰强度逐渐增强，混合5 h后，反应基本进行完全。
[0078]图16为20°C，pH=7.5时化合物T4与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T4 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T4 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min; (C):混合后I h; (D):混合后4 h; (E)混合后6 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T4吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.90)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.36)的峰强度逐渐增强，混合6 h后，反应基本进行完全。
[0079]图17为20°C，pH=7.5时化合物T5与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T5 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T5 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min; (C):混合后I h; (D):混合后3 h; (E)混合后6 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T5吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:8.15)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.36)的峰强度逐渐增强，混合6 h后，反应进行48.1%，反应速率明显比Tl、T2、T3、T4低。
[0080]图18为20°C，pH=7.5时化合物T6与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T6 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T6 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min;(C):混合后I h;(D):混合后3 h;(E)混合后5 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T6吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:8.28)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.77)的峰强度逐渐增强，混合5 h后，反应进行88.5%。
[0081]图19为20°C，pH=7.5时化合物T7与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T7 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T7 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min;(C):混合后I h;(D):混合后3 h;(E)混合后5 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T7吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:8.30)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.77)的峰强度逐渐增强，混合5 h后，反应进行87.6%。[0082]图20为20°C，pH=7.5时化合物T8与L-半胱氨酸混合后不同时刻的1H-NMR谱图。(A):1.0 mM 的 T8 ；(B):550.0 ul 1.0 mM 的 T8 (I equiv)与 35.0 ul 100.0 mM 的 L-半胱氨酸(6 equiv)混合后5 min;(C):混合后I h;(D):混合后3 h;(E)混合后5 h。从谱图中可以看出，随着反应的进行，T8吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:8.50)的峰强度逐渐减弱，产物吡啶环上氢(1H-NMR δ ppm:7.77)的峰强度逐渐增强，混合5 h后，反应进行67.8%。
[0083]同时研究了 PyMTA，DPA系列中Tl、T6在pH=7.5条件下与赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、丝氨酸(Ser)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)的反应情况，结果显示，混合48 h后，也不发生反应，说明了 T1-T8与L-半胱氨酸反应的专一性。
[0084]实施例3 Tl与蛋白质的连接
图21为Tl与蛋白质的连接示意图，用来连接标签的蛋白质是15N标记的人体泛素蛋白质 ubiquitin (Ubi)的突变体:ubiquitin E18C。
[0085]连接过程:(1)配置50 mM的Tl标签溶液:定量称取，加入MQ超纯水，溶液呈无色。
(2)采集蛋白质ubiquitin E18C在ρΗ=7.5时的1H-15N HSQC谱图作为空白对照。(3)向蛋白质ubiquitin E18C中加入1.5倍量的1^^?，并调节？!1为7.5，放置一段时间。(4)将蛋白质ubiquitin E18C逐滴加入到5_10倍量的标签中，并保证滴加过程及最终pH为7.5左右。(5)采集反应不同时间之后混合物的1H-15N HSQC谱图，对反应进程进行检测，直到反应完全为止。(6)反应 完全后，通过roio脱盐柱进行产物分离，将多余的标签与新生成的小分子物质除去，若标签无法除干净，可以通过阴离子交换柱进行分离，最终得到目标产物。
[0086]图22为25°C，pH=6.4条件下，1.0倍量的顺磁或逆磁金属离子分别滴加到0.10 mM的复合物ubiquitin E18C-T1蛋白质中的1H-15N HSQC重叠谱图，灰色表示加入的逆磁Y3+，黑色表示加入的顺磁Tb3+。灰色峰和黑色峰在H维的差值即为赝接触化学位移值(PCS)，从谱图中可以看出，有比较大的PCS。
[0087]可以看出化学探针Tl通过亲核取代反应与蛋白质进行连接，连接产率接近100%。硫醚键直接与蛋白质连接，增强了标签的刚性，可以广泛应用到荧光能量共振转移和生物核磁研究中，并且硫醚键在还原性和高PH条件下非常稳定，并能长期稳定存在。
【权利要求】
1.一种蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，包括以下步骤: (I)定量称取合成标签加入到MQ超纯水中配置成50 mM的合成标签溶液，(2)向蛋白质ubiquitin E18C中加入1.5倍量的TCEP，并调节pH为7.5，静置，(3)将蛋白质ubiquitinE18C逐滴加入到5-10倍体积量的合成标签溶液中，并保证滴加过程及最终pH为7.5左右，(4)采集反应不同时间之后混合物的1H-15N HSQC谱图，对反应进程进行检测，直到反应完全为止，(5)反应完全后，通过roio脱盐柱或者阴离子交换柱进行产物分离，将多余的标签与新生成的小分子物质除去，修饰完成；
其中合成标签包括具有双功能基团的顺磁标签Tl、T2、T3、T4、T5、T6、T7和T8，其结构式如下:
2.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的Tl的合成方法为2，6- 二甲基吡啶通过溴素溴化在吡啶环3位上一个溴原子，双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化得到第一中间体22，溴化，去氮氧化物，溴代，用NBS进行第二次溴代，然后和亚氨基二乙酸二乙酯反应生成第二中间体28，最后与苯亚磺酸钠反应，水解得到Tl。
3.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T2的合成方法为2，6- 二甲基吡啶通过溴素溴化在吡啶环3位上一个溴原子，双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化得到第一中间体22，溴化，去氮氧化物，溴代，用NBS进行第二次溴代，然后和亚氨基二乙酸二乙酯反应生成第二中间体28，最后与甲基亚磺酸钠反应，水解得到T2。
4.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T3的合成方法为2，6- 二甲基吡啶通过溴素溴化在吡啶环3位上一个溴原子，双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化得到第一中间体22，去氮氧化物，溴代，用NBS进行第二次溴代，然后和亚氨基二乙酸二叔丁酯反应，最后用三氟乙酸水解得到T3。
5.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T4的合成方法为白屈氨酸溴化，酯化得到第三中间体36，接着用硼氢化钠还原，溴代，和亚氨基二乙酸二乙酯反应，最后与苯亚磺酸钠反应，水解得到T4。
6.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T5的合成方法为2，6- 二甲基吡啶通过双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化，去氮氧化物得到第四中间体43，用NBS进行溴代，然后和亚氨基二乙酸二叔丁酯反应，最后用三氟乙酸水解得到T5。
7.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T6的合成方法为白屈氨酸溴化，酯化得到第三中间体36与苯亚磺酸钠反应，水解得到T6。
8.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T7的合成方法为白屈氨酸溴化，酯化得到第三中间体36与甲基亚磺酸钠反应，水解得到T7。
9.根据权利要求1所述的蛋白质定点修饰的新方法，其特征是，所述的T8的合成方法为2，6- 二甲基吡啶通过双氧水氧化得到吡啶氮氧化物，接着硝化，去氮氧化物得到第四中 间体43用三氧化铬氧化得到T8。
【文档编号】C07K1/107GK103923161SQ201410173848
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】苏循成, 王金涛, 刘洪开, 裴莹莹, 李庆锋 申请人:南开大学