己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒，该法结合了免疫反应和化学发光技术，通过优化实验条件，将传统两步式化学发光酶免疫分析法简化为一步。该法应用在动物源性食品中己烯雌酚残留检测，具有快速、简便、特异、灵敏、准确、检测范围宽等特点，更加符合快速检测的要求，具有较好的应用前景。本发明试剂盒的最低检测限是0.006μg/L，IC50为0.50μg/L，回收率为72.43～113.62％，与英国Randox雌酚类酶联免疫试剂盒的阴阳性符合率为100％，适合用于己烯雌酚的痕量分析与批量检测。
【专利说明】己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于己烯雌酚检测分析领域，尤其涉及一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]己烯雌酹(DiethyIstilbesrtol, DES)是一种人工合成的雌激素,在促进子宫、输卵管、乳腺的生长发育和蛋白质合成、减少脂肪、提高日增重等方面效果显著，因而曾作为促生长剂用于畜禽、水产生产中。然而，许多科学研究表明DES能通过改变内分泌系统引发人和动物的癌症，还可以经胎盘致癌，即妊娠期使用，可导致胎儿生殖器官的畸变，甚至癌变。另外，DES很难降解，如排出体外，会严重污染水源和土壤，并通过食物链威胁人类健康和生态环境，形成恶性循环。因此，我国在1999年制定《中国人民共和国动物及动物源食品残留监测计划》中规定在动物源性食品卫生中不得检出DES，2002年又将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》(农业部公告193号)。然而，由于巨大利益的驱使，违法添加DES的情况仍屡禁不绝，严重威胁着人类健康。
[0003]目前，文献报道的DES检测方法主要有色谱法(气相色谱、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱等)、免疫法(放射免疫法、酶联免疫吸附法、化学发光酶免疫分析法)以及荧光分光光度计法、辐照分光光度法、生物分析法等。由于DES在体内代谢快，组织浓度较低，所以其检测方法应更灵敏、准确。化学发光酶免疫分析法(Chemiluminescence enzymeimmunoassay, CLEIA)以其灵敏度高、特异性好、操作简便、无福射、标记物有效期长等优点，越来越多地用于临床样品的高通量筛选，是一项十分有发展前景的分析监测技术，近年来已被应用于多种药物残留的检测。目前我国DES检测试剂盒主要是ELISA检测试剂盒，而且几乎完全进口，如英国RAND0X、德国r-Biopharm等，因此，建立检测DES的化学发光酶免疫分析法及其试剂盒有较好的实际意义。
[0004]中国专利“一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒”(专利号201010244284.0
【公开日】2011年I月5日)采用两步式化学发光酶联免疫检测体系，操作步骤繁多且复杂。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确、检测范围宽的己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。
[0006]本发明要解决的另一技术问题是提供一种特异性高、亲和力强的己烯雌酚单克隆抗体。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0008]己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法，包括以下步骤:
[0009]<1>处理待测样品；
[0010]〈2>将半抗原己烯雌酚与载体蛋白卵清蛋白的偶联物(DES-OVA)作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，依次加入系列标准样品或经前处理的待测样品、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚单克隆抗体(DES-McAb)进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值；
[0011]<3>以步骤〈2>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中己烯雌酚的含量。
[0012]步骤〈1>按以下操作进行:取5g组织样品加入IOmL叔丁基甲基醚，剧烈震荡5min后，超声提取IOmin, 3000g/min离心10min,移出上清液后,用IOmL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将两次的上清液合并，吹干，用ImL甲醇溶液溶解，再用3mL石油醚洗涤甲醇溶液；蒸发甲醇，用ImL 二氯甲烷溶解后，再用3mLlN NaOH溶液提取，最后，用300 μ L磷酸中和提取液，用于检测；[0013]步骤〈2>按以下操作进行:用包被液将抗原稀释成0.5 μ g/mL,每孔加入100 μ L,4°C孵育过夜，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350μ L封闭液，37°C孵育2h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37°C烘干后，用锡箔纸真空密封，4°C保存；将化学发光板从4°C中取出，待温度平衡至室温，按照每孔50 μ L将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后依次加入各50 μ L酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb，混匀，37°C孵育45min ;倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入100 μ L化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。
[0014]封闭液是5%的脱脂奶粉；DES_McAb稀释为0.2 μ g/mL ;系列标准样品溶液的浓度为 O μ g/L,0.001 μ g/L,0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;包被液是 ρΗ9.6
的碳酸盐缓冲液。
[0015]己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒，包括包被有DES-OVA的化学发光板、DES系列标准样品溶液、DES-McAb工作液、浓缩洗涤液、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液；包被抗原(DES-OVA)为DES与载体蛋白卵清蛋白的偶联物；DES系列标准样品溶液为7个浓度梯度，分别是O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;浓缩洗涤液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐温-200.50mL，加水定容至IOOmL制成；化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒 P0018 — BeyoECL Plus。
[0016]上述试剂盒在动物源性食品中己烯雌酚残留检测中的应用。
[0017]己烯雌酚单克隆抗体，按以下操作制备:以己烯雌酚与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物(DES-BSA)作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选，对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次，经过鉴定、冻存和建株后，进行腹水的制备，然后通过纯化腹水，获得能特异性识别己烯雌酚的单克隆抗体。
[0018]上述己烯雌酚单克隆抗体，按以下操作制备::
[0019]〈1>动物免疫
[0020]将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；
[0021]〈2>细胞融合和克隆筛选
[0022]冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，融合小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞，融合后的细胞悬液加至已铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；
[0023]待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100 μ L上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100 %时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；
[0024]<3>细胞冻存与复苏
[0025]用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中
培养；
[0026]〈4>腹水的制备与纯化
[0027]采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后，再用亲和层析法进一步纯化，即得DES-McAb。
[0028]本发明首次探讨了检测己烯雌酚残留的一步式化学发光酶免疫机理，发明人结合了免疫反应和化学发光技术，在不需要另外制备酶标单克隆抗体的情况下，将传统两步式化学发光酶免疫分 析法简化为一步，成功建立了一步式己烯雌酚化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。本发明“一步法”的线性检测范围(0.001~100 μ g/L)宽，最低检测限(0.006 μ g/L)低，试剂盒的 IC50 为 0.50 μ g/L,回收率为 72.43 ~113.62%，与英国 Randox雌酚类酶联免疫试剂盒(产品编号:SJ2152)的阴阳性符合率为100%，适合用于己烯雌酚的痕量分析与批量检测，特别适合应用于检测动物源性食品中己烯雌酚的残留。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为实施例2己烯雌酚残留一步式化学发光酶免疫分析检测法的标准曲线。
[0030]图中:X轴为己烯雌酚梯度浓度标准样品浓度的对数值；Y轴为各浓度己烯雌酚标准样品的发光值除以“O”浓度孔发光值(RLU/RULc^ )。
【具体实施方式】
[0031]实施例1己烯雌酚单克隆抗体(DES-McAb)的制备
[0032]1.1动物免疫
[0033]以己烯雌酚与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物(DES-BSA)作为免疫原，对健康的6周龄雌性BALB/c小鼠McAb进行基础免疫和5次加强免疫后，测定血清效价和IC5tl，选取效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫；
[0034]1.2细胞融合和克隆筛选
[0035]冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，融合小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞，融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞；
[0036]待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100 μ L上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，命名为3E8，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力；
[0037]1.3细胞冻存与复苏
[0038]用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中
培养；
[0039]1.4腹水的制备与纯化
[0040]采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7_14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水分别用饱和硫酸铵法和亲和层析法进行纯化，即得 DES-McAb。
[0041]1.5单克隆抗体的鉴定
[0042]1.5.1杂交瘤细胞培养上清及纯化后抗体效价的测定
[0043]采用间接ELISA方法，测定杂交瘤细胞培养上清中DES-McAb的效价为1:512，亲和层析纯化后的腹水效价达到1:1X 105，蛋白含量为10mg/mL。
[0044]1.5.2亲和力的测定
[0045]通过非竞争ELISA，分别以OD450值为纵坐标，以DES-MAb的浓度为横坐标，绘制亲和曲线，以公式I计算不同抗原包被浓度下的亲和常数，取平均值得出DES-McAb的亲和常数(Ka)为 1.2 X109L/moI .
【权利要求】
1.一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于包括以下步骤: <1>处理待测样品； <2>将半抗原己烯雌酚与载体蛋白卵清蛋白的偶联物DES-OVA作为抗原包被于发光固相载体，封闭后，依次加入系列标准样品或经前处理的待测样品、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚单克隆抗体DES-McAb进行反应，然后再加入化学发光液，测定系列标准样品和待测样品的发光值； <3>以步骤〈2>测得的发光值计算抑制率，绘制标准曲线，并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中己烯雌酚的含量。
2.根据权利要求1所述的己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于: 步骤〈1>按以下操作进行:取5g组织样品加入IOmL叔丁基甲基醚，剧烈震荡5min后，超声提取IOmin, 3000g/min离心10min,移出上清液后，用IOmL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将两次的上清液合并，吹干，用ImL甲醇溶液溶解，再用3mL石油醚洗涤甲醇溶液；蒸发甲醇，用ImL 二氯甲烷溶解后，再用3mLlN NaOH溶液提取，最后，用300 μ L磷酸中和提取液，用于检测； 步骤〈2>按以下操作进行:用包被液将抗原稀释成0.5 μ 8/!111^每孔加入10(^ L,4°C孵育过夜，倾去包被液，用洗板机洗涤化学发光板3次，拍干；然后，每孔加入350 μ L封闭液，37°C孵育2h，倾去封闭液，用洗板机洗涤3次，拍干；37°C烘干后，用锡箔纸真空密封，4°C保存；将化学发光板从4°C中取出，待温度平衡至室温，按照每孔50 μ L将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板，各设3孔重复，然后依次加入各50 μ L酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb，混匀，37°C孵育45min ;倾去液体，用洗板机洗涤5次，拍干；每孔中加入IOOyL化学发光液，混匀，尽快测定各孔发光值。
3.根据权利要求2所述的己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法，其特征在于:所述封闭液是5%的脱脂奶粉；所述DES-McAb稀释为0.2 μ g/mL ;所述系列标准样品溶液的浓度为 0μ g/L、0.001μ g/L、0.01μ g/L、0.1μ g/L、ly g/L、10y g/L、100y g/L ;所述包被液是PH9.6的碳酸盐缓冲液。
4.一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒，其特征在于包括包被有DES-OVA的化学发光板、DES系列标准样品溶液、DES-McAb工作液、浓缩洗涤液、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液；所述包被抗原DES-OVA为DES与载体蛋白卵清蛋白的偶联物；所述DES系列标准样品溶液为7个浓度梯度，分别是O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;所述浓缩洗涤液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐温-200.50mL，加水定容至 IOOmL 制成；所述化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018— BeyoECL Plus。
5.权利要求4所述试剂盒在动物源性食品中己烯雌酚残留检测中的应用。
6.一种己烯雌酚单克隆抗体，其特征在于按以下操作制备:以己烯雌酚与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物DES-BSA作为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选，对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次，经过鉴定、冻存和建株后，进行腹水的制备，然后通过纯化腹水，获得能特异性识别己烯雌酚的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的己烯雌酚单克隆抗体，其特征在于按以下操作制备:: 〈1>动物免疫将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后，对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫； <2>细胞融合和克隆筛选 冲击免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后处死，收集血液、无菌取脾脏，融合小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞，融合后的细胞悬液加至已铺有饲养细胞的96孔板中，采用HAT选择培养基筛选融合细胞； 待细胞生长至培养孔面积1/10时，无菌准确吸取100 μ L上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶标板内；以间接ELISA法测细胞培养上清效价，采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次，直至阳性率为100%时，对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株，对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上，每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力； <3>细胞冻存与复苏 用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液，分装于冻存管，置于液氮中保存；复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液，移入细胞瓶中培养; <4>腹水的制备与纯化 采用体内诱生法，将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入杂交瘤细胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后，再用亲和层析法进一步纯化，即得DES-McAb。
【文档编号】C07K16/44GK103954780SQ201410180431
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】吴健敏, 马玲, 张启模, 韦建兴, 张怡轩, 白安斌, 陈凤莲, 覃绍敏, 林俊, 刘金凤, 饶桂波 申请人:广西壮族自治区兽医研究所