一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法
【专利摘要】一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法，属于生物化工【技术领域】。本发明中合成了由多菌灵的类似物2-氯苯并咪唑和6-氨基己酸反应得到的具有羧基的半抗原H1，与载体蛋白偶联制备免疫原；基于异源包被可以进一步提高抗体的灵敏度，所以在ELISA操作中，用多菌灵的类似物氨基氯苯并咪唑和6-氨基己酸反应得到半抗原H2与OVA偶联得到偶联物作为包被原。本发明制备的完全抗原呈现出特异性的多菌灵抗原决定簇，使得筛选出高特异性的多菌灵单克隆抗体成为可能。产生的抗体特异性高、灵敏度高，可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的多菌灵残留。
【专利说明】一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高灵敏度的多菌灵完全抗原的合成方法，属于生物化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]多菌灵是一种广谱、高效、低毒内吸性苯并咪唑类杀菌剂。其化学结构式如下:
【权利要求】
1.一种多菌灵完全抗原的合成方法，其特征在于步骤如下: (1)前体261的合成:将氨基己酸甲酯盐酸盐与等摩尔量的2-氯苯并咪唑混合，于二异丙基乙基胺中微波150°C过夜反应13h，得到产物，经纯化，即得到前体261，产率为10% ； (2)多菌灵半抗原Hl的合成:将步骤(1)制备的前体261溶于四氢呋喃中，室温搅拌反应过夜，60°C旋蒸除去四氢呋喃，以lmol/L的HCl溶液调节pH至6~7，制备色谱纯化得多菌灵半抗原Hl ； (3)多菌灵完全抗原的制备:将多菌灵半抗原Hl与载体蛋白上的氨基进行偶联，即得到多菌灵完全抗原。
2.根据权利要求1所述多菌灵完全抗原的合成方法，其特征在于步骤(1)所述的氨基己酸甲酯盐酸盐由氨基己酸和氯化亚砜在甲醇中回流制得。
3.根据权利要求1所述多菌灵完全抗原的合成方法，其特征在于:步骤(2)所述多菌灵半抗原Hl，其结构简式如下所示:
4.根据权利要求1所述多菌灵完全抗原的合成方法，其特征在于:步骤(3) 所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一种。
5.根据权利要求1所述多菌灵完全抗原的合成方法，其特征在于步骤(3)多菌灵完全抗原的制备具体步骤为: O半抗原Hl溶液的活化:取多菌灵半抗原Hl 35mg，加入2mL DMF溶解，再分别加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC，其中多菌灵半抗原Hl: NHS: EDC的摩尔比为1: 1.5: 2，室温搅拌反应12h，即得活化的半抗原Hl溶液； 2)蛋白溶液的制备:取160mg载体蛋白，再加入1mL0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液，即得蛋白溶液； 3)反应:将步骤I)制备的活化的半抗原Hl溶液慢速滴加到步骤2)制备的蛋白溶液中，室温下反应8h ;用PBS缓冲液透析3天，期间换水6次，即得到多菌灵完全抗原。
6.用权利要求5所述方法制备的多菌灵完全抗原的应用，其特征在于:采用多菌灵半抗原Hl制备的完全抗原免疫动物得到多克隆抗体或单克隆抗体，并应用于快速检测食品中的多菌灵残留。
【文档编号】C07K1/107GK104017070SQ201410291378
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】徐丽广, 胥传来, 严会娟, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学