调节性t细胞的亚磷蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种靶向扩增Foxp3+调节性T细胞的亚磷蛋白(Subpld2)及其在抗哮喘、自身免疫疾病中的应用。用亚磷蛋白体外诱导外周T细胞及体内干预哮喘小鼠，结果显示亚磷蛋白在体内外均可显著增加Foxp3+Treg，并且可以有效减轻哮喘炎症和病理反应，因此亚磷蛋白在重建免疫耐受，应用于哮喘、自身免疫疾病等高免疫反应状态方面具有广阔的前景。
【专利说明】靶向扩增Foxp3+调节性T细胞的亚磷蛋白及其应用 本发明属于免疫学领域，具体涉及可以祀向扩增Foxp3+调节性T细胞的亚磷蛋白 (Subpld2)及其在抗哮喘、自身免疫疾病中的应用。用亚磷蛋白体外诱导外周NaiVe T细胞 及体内干预哮喘小鼠，结果显示亚磷蛋白在体内外均可显著增加 F〇Xp3+Treg，并且可以有 效减轻哮喘炎症和病理反应，因此亚磷蛋白在重建免疫耐受，应用于哮喘、自身免疫疾病等 高免疫反应状态方面具有广阔的前景。
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学领域，具体涉及可以靶向扩增Foxp3+调节性T细胞的亚磷蛋白 在抗哮喘、自身免疫疾病中的应用。
【背景技术】
[0002] 哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等多种 细胞及其分泌的细胞因子参与的气道炎症疾病。哮喘以呼吸急促、咳嗽、哮鸣、气道高反应 作为特征。哮喘发病机制目前尚不完全清楚，多认为与变态反应、气道炎症、气道反应性增 高及内外环境、遗传因素等相互作用有关 [2]。目前，对于哮喘的治疗仅能做到治标而不能治 本，从理论上说，重建免疫耐受是治疗过敏性哮喘的最佳策略，Treg的发现使得防治过敏性 哮喘及其他自身免疫性疾病等高免疫反应状态成为可能。
[0003] 大量的研究表明，磷脂酶D(phospholipase D，PLD)尤其是PLD2对淋巴细胞的增 殖分化、趋化和转移起着重要的作用。PLD2的酶促产物PA及DAG可以使PKC活化，同时伴 随胞内Ca 2+的上调，调控细胞的分泌活动和影响参与哮喘发病炎症因子的表达。此外，PLD2 可以通过调节MPK等信号转导途径而调节淋巴细胞的增殖分化。故本发明应用自主研发 的重组人憐脂酶D2(recombinant human phospholipase D2，rhPLD2)进行系列变构的蛋 白：亚磷蛋白，一种较前公开的rhPLD2蛋白（GenBank登录号：AY178289)具有更小分子量 和更高生物学活性的多肽，在体内外对哮喘小鼠的T细胞进行诱导，发现这种rhPLD2变构 蛋白能显著增加 Foxp3+调节性T细胞（Foxp3+Treg)的百分率。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种能在体内外诱导扩增Foxp3+调节性T细胞的蛋白的制备方 法。
[0005] 本发明所说的能诱导扩增F〇Xp3+调节性T细胞的蛋白，是应用自主研发的 rhPLD2进行系列变构的蛋白：亚磷蛋白，一种较前公开的rhPLD2蛋白（GenBank登录号： AY178289)具有更小分子量和更高生物学活性的多肽，其编码基因序列为可编码176个氨 基酸的PLD2cDNA序列，全长528bp。详见SEQ ID NO: 1。（注：若加上6个氨基酸和1个 终止密码子则为183个氨基酸，cDNA序列则全长549bp)。
[0006] 本发明所说的能诱导扩增Foxp3+调节性T细胞的亚磷蛋白，其氨基酸多肽序列全 长176个氨基酸。详见SEQ ID N0:2。
[0007] 本发明所说的能诱导扩增Foxp3+调节性T细胞的亚磷蛋白分子量为20. 4kDa，融 合蛋白水解活性为：〇. 016-136. 60 (U/mg)，转酰基活性0. 452-683. 12nM/mg. min ;其生物学 活性有效范围约在体外〇· 〇2ng/ml_0. 5μ g/ml。最佳范围：0· 7ng/ml_100ng/ml ;体内：0· 3 mg/kg-20mg/kg,最佳范围：1. 0mg/kg-12mg/kg。
[0008] 本发明所说的亚磷蛋白，主要通过以下四个途径增加 F〇Xp3+Treg，从而调节机体 免疫力：
[0009] 1.上述所说的亚磷蛋白可以诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+Treg。
[0010] 2.上述所说的亚磷蛋白能直接扩增⑶4+⑶25+T细胞表达Foxp3+增高。
[0011] 3.上述所说的亚磷蛋白能直接诱导⑶4+CD25-T细胞表达Foxp3+增高，即 CD4+CD25Toxp3+Treg的细胞百分率升高。
[0012] 4.上述所说的亚磷蛋白能稳定诱导⑶4+⑶25+T细胞Foxp3+的表达。
[0013] 本发明旨在提供一种能在体内外诱导扩增F〇Xp3+Tr eg的亚磷蛋白作为免疫调节 齐U，在抗哮喘、自身免疫疾病等高免疫反应状态或免疫失调性疾病等方面的应用。
[0014] 本发明公布了亚磷蛋白干预哮喘模型后，具有抑制炎症病理症状，在治疗哮喘等 自身免疫疾病方面具有巨大的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明亚磷蛋白的检测。
[0016] A为分离的亚磷蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（SDS - PAGE)。
[0017] B为分离的亚磷蛋白的western blotting检测图。20. 4kDa为蛋白质的分子量。
[0018] 图2是本发明亚磷蛋白体外增加 CD4+CD25+Foxp3+Treg的数量。
[0019] A.为用亚磷蛋白体外处理小鼠 T细胞，流式检测各干预因素组 CD4+CD25+Foxp3+Treg 百分率变化。
[0020] B.为用亚磷蛋白体外处理小鼠 T细胞，经分析，各干预因素组中亚磷蛋白 (Subpld2)CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞数明显增加。
[0021] C.为用亚磷蛋白体外处理小鼠 T细胞，经分析0. 5-30ng/ml Subpld2均明显提高 CD4+CD25+Foxp3+Treg 的百分率。
[0022] D.为用亚磷蛋白体外处理小鼠 T细胞，流式检测不同浓度Subpld2对 CD4+CD25+Foxp3+Treg 数的影响。
[0023] 图3为用亚磷蛋白体内干预哮喘动物模型，各组小鼠脾脏、淋巴结 CD4+CD25+Foxp3+Treg 百分率。
[0024] A.为用亚磷蛋白体内干预哮喘动物模型，流式检测各组小鼠脾脏、淋巴结 CD4+CD25+Foxp3+Treg 百分率变化。
[0025] B.为用亚磷蛋白体内干预哮喘动物模型，经分析各干预因素组中Subpld2使小鼠 脾脏、淋巴结中⑶4+⑶25+Foxp3+Treg细胞数明显增加。
[0026] 图4为用亚磷蛋白体内干预哮喘小鼠，PT-PCR/blotting检测脾脏、淋巴结 CD4+CD25+Foxp3+T 的表达情况。
[0027] A. C.为用亚磷蛋白体内干预哮喘小鼠，RT-PCR检测表明：Subpld2能明显增加哮 喘小鼠脾脏、淋巴结Foxp3基因的表达。
[0028] B.为用亚磷蛋白体内干预哮喘小鼠，Western Blot检测表明：Subpld2能明显增 加哮喘小鼠脾脏、淋巴结中Foxp3蛋白的含量。 图5为编码亚磷蛋白的基因序列，其cDNA的长度是：528bp ;和由该基因序列编码的亚 磷蛋白，其氨基酸序列长度是：176aa。
【具体实施方式】：
[0029] 下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如 J.E.科利根等编著，曹雪涛等译，精编免疫学实验指南（Hobokenjohn Wiley &. Son，Inc， 2005)中所述的条件，或参照试剂商所建议的条件。
[0030] 实施例一：融合蛋白pcDNA3. l-Subpld2_6His的表达分析 根据已知的rhPLD2的cDNA序列（登录号：AY178289)设计引物如序列表SEQ ID N0:3， SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6所示，通过PCR扩增Subpld2全长序列，经鉴定及 委托上海英骏生物工程技术服务有限公司进行测序，获得如SEQ ID NO: 1的528bp cDNA， 可编码176个氨基酸的蛋白，即亚磷蛋白（Subpld2)，如SEQ ID NO:2所示。
[0031] 实施例二：western blot 鉴定融合蛋白 pcDNA3. l-Subpld2_6His 的表达用 Thermo 的 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 对重组质粒 pcDNA3. l-Subpld2_6His 转染的CHO细胞，空质粒pcDNA3. I转染的CHO细胞以及未转染的CHO细胞的总蛋白进行抽 提，步骤如下： 移去细胞培养瓶的DMEM完全培养基。用0. lmol/L的4°C预冷的PBS洗涤细胞两次， 3ml/瓶。每瓶细胞加入200ul的M-PER试剂，轻轻摇匀，静置5min。收集细胞裂解液于EP 管中，4°C，HOOOrpm离心15min。吸取上清液于一新的EP管中，保存于-80°C。 制备PAGE胶进行SDS-PAGE电泳。在梳子下大约Icm处做标记，倒入分离胶至标记高 度处，快速加水赶走气泡并且压平胶面。室温下静置30min。直到凝胶相与水相之间可见 很明显的折射线时，说明分离胶已经完全凝固。倒去玻板中间的水，并用滤纸擦干玻板内 侧面，接着倒满浓缩胶，插入梳子，室温下静置30min。加样：将提取的蛋白1:1与2 X SDS 上样缓冲液均勻混合，沸水中加热8min。在加样孔中依次加入预染蛋白Marer 5ul+15ul IXSDS上样缓冲液pcDNA3. l-Subpld2-6His质粒稳转的CHO细胞总蛋白20ul ;pcDNA3. 1 质粒稳转的CHO细胞总蛋白20ul ;CH0细胞株裂解液20ul ;其他孔加入20ul IXSDS上样 缓冲液。浓缩胶稳压80V，条带进入分离胶后稳压120V直至溴酚蓝指示剂泳出分离胶，终 止电泳。转膜、封闭后加一抗与抗原结合，4°C孵育过夜。加二抗与一抗结合=IOmlTBST缓 冲液洗膜五次，每次lOmin。将膜置于羊抗小鼠 IgG (H+L)多克隆抗体（TBST缓冲液1:5000 稀释）中，摇床上37°C孵育2小时。显色，曝光。定影液中定影lmin，自来水冲洗。晾干， 扫描仪扫描，观察分析结果。如图1所示，pcDNA3. l-Subpld2-6His质粒稳转的CHO细胞株 既表达His-Tag，也表达亚磷蛋白（Subpld2)蛋白；pcDNA3. 1(+)质粒稳转的CHO细胞和空 CHO细胞株不表达His-Tag和亚磷蛋白（Subpld2)蛋白。
[0032] 实施例三：融合蛋白pcDNA3. l-Subpld2_6His的纯化、活性鉴定。 (1)亲合层析纯化： 将冻存的粗蛋白IOml于冰浴中缓慢冻融，加入层析柱中使Ni2+-NTA树脂混悬液与之 充分混勻，在冰浴中置lh。以Binding buffer40ml左右洗脱杂蛋白并分管收集，实时检 测每管洗脱液280nm处的吸光度，控制流速0.5ml/min。以Elution buffer 30ml左右洗 脱并分管收集，实时检测每管洗脱液280nm处的吸光度，控制流速0. 5ml/min。将Binding buffer与Elution buffer的实时吸光度分别绘制成动态曲线，观察曲线峰值和形态，根据 Elution buffer洗脱液的吸光度分布计算洗脱蛋白的纯度。 (2) 透析：处理透析袋：使用前，以含ImM/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液煮沸lOmin， 用去离子水漂洗冷却后，即可使用。对PBS透析：将通过吸光度检测含有目的的蛋白洗 脱液4ml加入一端用透析夹封闭好的透析袋，用透析夹封闭另一端，对0. 15M PBS (pH = 7. 4) 2000ml，4°C透析24h，中间换液一次。将透析产物从透析袋中移出，用EP管分装，一 80°C保存。 (3) SDS-PAGE电泳鉴定纯化产物的纯度：Braford法测定pcDNA3. l-Subpld2-6His纯化 蛋白的浓度，计算pEGPP-rhPLD2-6His稳转的CHO细胞总蛋白与pcDNA3. l-Subpld2-6His 纯化蛋白的含量，计算纯化得率：样品1孔和样品2孔取对应两孔的吸光度平均值，代入直 线回归方程，计算样品蛋白含量和纯化得率。 (4) 用GENMED细胞磷脂酶D2水解活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒检测 pcDNA3. l-Subpld2-6His 蛋白的水解活性。 (5) 用GENMED-PLD2转酰基活性检测试剂盒测定pEGFP-rhPLD2-6His蛋白的磷脂转移 活性。 较前公开的rhPLD2蛋白（GenBank登录号：AY178289)Subpld2具有更小分子量和更高 生物学活性的多肽，亚磷蛋白分子量为20. 4kDa，水解活性为：0.016-136. 60(U/mg)，转酰 基活性(λ 452-683. 12nM/mg. min ;其生物学活性有效范围约在体外(λ 02ng/ml-(X 5 μ g/ml。 最佳范围：0.7ng/ml-100ng/ml ;体内：0.3mg/kg-20mg/kg，最佳范围：1.0mg/kg-12mg/kg。
[0033] 实施例四：Subpld2体外干预Naive T细胞，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg 的数量。
[0034] L尼龙毛法分离正常ICR小鼠脾脏、淋巴结T细胞及APCs细胞（经灭活）混 合培养，培养第〇天接受OVA刺激，OVA作用24h后，添加 IL-2和（或）TGF-β诱导培 养48h，于接种第3天培养体系中添加 Subpld2,流式细胞仪检测Subpld2干预48h后 Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞的比例变化。
[0035] 2.结果如图2所示，体外培养第5天，流式细胞仪检测Subpld2干预48h后 ⑶4 +CD25+Foxp3+T细胞百分率：Nil组⑶4+⑶25+Foxp3+T细胞百分率为0. 1 %，OVA特异性 T细胞组和OVA特异性Treg细胞组⑶4+CD25+Foxp3+T细胞百分率分别为0. 3 %和0. 2 %。 Subpld2对维持Treg细胞数量的作用较DXM和PLD强，体外培养第5天，⑶4+⑶25+Foxp3+T 细胞能维持至2. 8 %，而DXM组和PLD组培养第5天已经分别降至0. 3 %和0. 2 %。
[0036] 实施例五：Subpld2体内干预哮喘小鼠，流式细胞术检测脾脏、淋巴结 CD4+CD25+Foxp3+T 的表达情况。
[0037] L 哮喘小鼠第 0、7、14 天予 i.p. (50yg OVA, Img Al(0H)3,0.2mL)致敏，第 21 ? 23 天连续予 Inhal (10mg/mL OVA, 1 % )。第 24、25、26 天雾化前 30min 予 i. P. saline、DXM、 Subpld2、Anti-PLDmAb、小鼠 IgG(与抗体用量相等）干预3天，末次干预24h后处死小鼠， 分离脾脏、淋巴结，制备成单淋巴细胞悬液；细胞计数后，对各组每只小鼠取I X IO6个细 胞，按 eBioscience Staining Intracellular Antigens for Flow Cytometry(Protocol B:0ne_step protocol for intracellular(nuclear)proteins)操作说明书进行淋巴细胞 的荧光抗体染色标记，在经流式细胞仪BD FACS Verse检测⑶4、⑶25、Foxp3表达。
[0038] 2.结果如图3和表1所示Subpld2能显著增加哮喘小鼠体内⑶4+⑶25+及 ⑶4+CD25 +Foxp3+T细胞的百分含量。
[0039] 3.表1各组小鼠脾脏、淋巴结CD4+CD25+Foxp3+百分率比较
【权利要求】
1. 一种由重组人磷脂酶D2变构的亚磷蛋白（Subpld2)及其编码该蛋白多肽的多核 苷酸序列。它包含：由各种表达载体表达的pcDNA3. l-Subpld2-6His融合蛋白，亚磷蛋白 (Subpld2)，或其保守性变体、生物活性片段、类似物或衍生物。也包含具有SEQ ID NO. 2氨 基酸序列的多肽。
2. 能编码该多肽的多核苷酸，具有SEQ ID NO. 1多核苷酸序列。它也包含选自能编码 下组氨基酸的一种核苷酸序列或其变体。 (a)编码具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸（a)互补的 多核苷酸；(c)与（a)或（b)的多核苷酸序列具有至少88%相同性的多核苷酸；更佳地，该 多核苷酸的序列是能编码选自下组的一种：（a)具有SEQ ID NO. 2中22- 37位的序列；和 (b)具有SEQ ID NO. 2中99-116位的序列。
3. 如权利要求1或2所述的多核苷酸的变异体，其编码与该有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片断、类似物和衍生物；此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体；这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体；如 本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取 代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
4. 一种新的多肽一亚磷蛋白（Subpld2)，其基本上是由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列组成的；该多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或 真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生；根据重组生产方案 所用的宿主，该的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；该多肽还可包括或不包括起 始的甲硫氨酸残基。含有编码权利要求2所述的亚磷蛋白（Subpld2)的多核苷酸的重组 载体，特别是表达载体；含有编码亚磷蛋白（Subpld2)的多核苷酸的基因工程化宿主细胞； 编码亚磷蛋白（Subpld2)的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有该所述多核苷酸的 重组载体；包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病 毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体；亚磷蛋白（Subpld2)的多核苷酸或含有该多核苷酸 的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿 主细胞；术语"宿主细胞"指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是 高等真核细胞，如哺乳动物细胞；代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒 沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CHOXOS或 Bowes黑素瘤细胞等。
5. -种亚磷蛋白（Subpld2)的抗体，及涉及一种能与该多肽特异性结合的抗体。
6. 如权利要求1或2所述的蛋白多肽，其分子量为20. 4kDa，是由528bp编码的176aa 的亚磷蛋白（Subpld2)。
7. 如权利要求1或2所述的多肽或多核苷酸可以靶向扩增Foxp3+调节性T细 胞，从而调节机体免疫力：1)上述所说的亚磷蛋白可以诱导CD4+CD251细胞转化 为⑶4+CD25 +Foxp3+Treg。2)上述所说的亚磷蛋白能直接扩增⑶4+⑶25+T细胞表达 Foxp3++增高。3)上述所说的亚磷蛋白能直接诱导⑶4+⑶25_T细胞表达Foxp3+增高，即 ⑶4+CD25_F 〇Xp3+Treg的细胞百分率升高。4)上述所说的亚磷蛋白能稳定诱导⑶4+⑶25+T 细胞F 〇Xp3+的表达。
8. 如权利要求1或2所述的多肽或多核苷酸作为免疫调节剂，在抗哮喘、自身免疫疾 病等高免疫反应状态或免疫失调性疾病等方面的应用。 其特征在于：融合蛋白水解活性为：〇. 016-136. 60 (U/mg)，转酰基活性 0? 452-683. 12nM/mg. min ;其生物学活性有效范围约在体外0? 02ng/ml-0. 5 ii g/ml。最佳范 围：0? 7ng/ml_100ng/ml ;体内：0? 3mg/kg_20mg/kg，最佳范围：1. 0mg/kg_12mg/kg。
9. 如权利要求1或2所述的多肽或多核苷酸在制备免疫调节剂中的应用。其特征在 于：亚磷蛋白的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可 治疗治疗哮喘、自身免疫疾病等高免疫反应状态或免疫失调性疾病等；包括将该的多肽、多 核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用；这些载体可以 是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合；组合物包含安全有效量的多肽或 拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。
10. 根据权利要求7、8、9所述用途，其特征在于：将亚磷蛋白或由其制备的活性短肽 的不同比例混合物，添加适当的药用辅料，按常规的制剂工艺，即可制成片齐IJ、胶囊齐IJ、颗粒 齐U、滴丸剂、口服液等口服药物制剂和冻干粉剂、水剂的注射药物制剂等。
【文档编号】C07K16/40GK104312994SQ201410436527
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年8月31日 优先权日:2014年8月31日
【发明者】朱玲 申请人:福建医科大学