一种甘油磷脂酰肌醇的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘油磷脂酰肌醇的制备方法，属于脂质开发应用【技术领域】。本发明以粗PI作为催化底物，采用碱性催化剂如甲醇钠为催化剂醇解制备GPI，该方法具有催化效率高、产品纯度高、成本低等优点，解决了直接以粉末磷脂为催化底物的反应效率低、后续分离纯化操作复杂、产品回收率低等问题。本发明操作简便，纯化步骤简单，催化效率高，得到的GPI纯度达到98％以上，是一种方便、经济、环保的制备方法，能够为未来商业生产高纯度GPI提供技术参考。
【专利说明】一种甘油磷脂酰肌醇的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甘油磷脂酰肌醇(Glycerylphosphoinositol，GPI)的制备方法，属于脂质开发应用【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甘油磷脂酰肌醇(Glycerylphosphoinositol，GPI)普遍存在于真核生物中，GPI和有关的糖结合物可对宿主的先天和获得性免疫系统起到调节作用，对血栓、肝硬化及癫痫的发作等起到预防作用。同时，GPI在人体内的生物合成与维持血液凝固和保证神经系统的正常息息相关。因此，GPI的研宄对于保健和医药等行业具有重要的价值。
[0003]目前，GPI合成方法的报道很少，而关于磷脂衍生物甘油磷脂酰胆碱(Glycery Iphosphory I choline, GPC)和甘油磷脂酰乙醇胺(glycerylphosphorylcholine，GPE)的研宄较多，主要方法有化学水解法、非水相酶法、化学合成法等。近年来，一些学者对化学水解制备GPC的方法研宄较多。已有研宄以氢氧化四丁基铵为催化剂，甲醇为溶剂，催化制备GPC，产物收率可达89.20%。化学水解法常以大豆粉末磷脂为原料，要得到较高纯度的产品需对反应物进行后续分离和纯化，工艺步骤复杂。
[0004]本发明提供了一种化学法制备GPI方法，以粗磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol, PI)作为催化底物，采用甲醇钠为催化剂醇解制备GPI，该方法具有催化效率高、产品纯度高、成本低等优点，解决了直接以粉末磷脂为催化底物的反应效率低、后续分离纯化操作复杂、产品回收率低等问题。本发明操作简便，纯化步骤简单，催化效率高，是一种方便、经济、环保的制备方法，能够为未来商业生产高纯度GPI提供技术参考。
【发明内容】
[0005]本发明提供的制备甘油磷脂酰肌醇的方法，是利用甲醇钠对PI进行醇解反应，在甲醇钠的作用下PI上的两个脂肪酰基被醇解后生成GPI，然后用阳离子交换树脂除去反应液中的阳离子，再用硅胶柱色谱对GPI进行纯化，去除PI和其他杂质，真空浓缩，得到GPI
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[0006]本发明提供了一种甘油磷脂酰肌醇的制备方法，是将磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol, PI)质量分数在50%以上的粗PI溶解于甲醇中，再添加甲醇钠进行反应，得到醇解反应液，然后去除醇解反应液中的阳离子，再进行纯化即得到GPI产品。
[0007]所述方法包括:⑴制备PI质量分数在50%以上的粗PI ；⑵将粗PI按照质量与体积比1:1?1:7溶解于甲醇中，然后添加每10mL溶液中添加0.49-2.15g甲醇钠或者含有0.49-2.15g甲醇钠的甲醇钠甲醇溶液，反应60?480min，得到醇解反应液；(3)去除醇解反应液中的阳离子后采用硅胶柱色谱纯化，即得到GPI产品。
[0008]所述粗PI的制备方法，在本发明的一种实施方式中是:以PI纯度在25%以上的磷脂混合物为原料，加入到碱性乙醇中混合，搅拌，离心分离上清液，将不溶物干燥即得到粗PI产品。
[0009]所述粗PI的制备方法，在本发明的一种实施方式中，具体是:以PI纯度在25%以上的磷脂混合物为原料，加入到5?10倍体积的碱性乙醇中混合，搅拌，离心分离上清液，将不溶物干燥即得到粗PI产品。
[0010]所述磷脂混合物，在本发明的一种实施方式中，为大豆粉末磷脂。
[0011]所述粗PI，在本发明的一种实施方式中，PI的质量分数在50%以上。
[0012]所述碱性乙醇，在本发明的一种实施方式中，是无水乙醇与氨水按体积比100:1 ~ 100:5混合得到的O
[0013]所述甲醇钠甲醇溶液，在本发明的一种实施方式中，其甲醇钠的质量分数为25%?30%。
[0014]所述醇解反应的反应温度，在本发明的一种实施方式中，为30_50°C。
[0015]所述阳离子的去除，在本发明的一种实施方式是使用阳离子交换树脂，得到洗脱液先干燥再进行硅胶柱色谱纯化。
[0016]所述硅胶柱色谱，是以硅胶为固定相，醇溶液为洗脱剂，洗脱剂流速为0.8?3mL/min，收集洗脱有GPI的组分，经浓缩、干燥即得到GPI产品。
[0017]所述硅胶柱色谱中的洗脱剂为任意一种:甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、戊醇、己醇。
[0018]所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括:
[0019](I)粗PI制备:以PI纯度在25%以上的磷脂混合物为原料，加入到5?10倍体积的碱性乙醇中混合，搅拌，离心分离上清液，将不溶物干燥即得到粗PI产品；所述碱性乙醇是无水乙醇与氨水按体积比100:1?100:5混合得到的；
[0020](2)醇解粗PI得到GP1:将粗PI按照质量与体积比1:1?1:7溶解于甲醇中，然后添加甲醇钠溶液1.5?5.5mL/100mL，反应60?480min，得到醇解反应液；
[0021](3)去除阳离子:采用阳离子交换树脂去除醇解反应液中的阳离子，流速为I?3mL/min ；
[0022](4)硅胶柱色谱纯化，即得到GPI产品。
[0023]所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括:(I)制备PI含量在50%以上的粗PI ; (2)将粗PI按照质量与体积比1:1?1:7溶于甲醇中，搅拌，每10mL溶液中加入1.5?5.5mL的甲醇钠质量分数为25-30%的甲醇钠甲醇溶液，反应温度为30?50°C，反应60?480min即得到醇解反应液；(3)采用阳离子交换树脂去除醇解反应液中的钠离子，并将洗脱液干燥得到粗GPI样品；(4)将硅胶装柱后，将粗GPI样品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脱，收集含有GPI的洗脱液，将洗脱液真空浓缩干燥，即得到GPI产品。
[0024]所述阳离子交换树脂，在本发明的一种实施方式中，是H型强酸性阳离子树脂。
[0025]所述反应时间，在本发明的一种实施方式中，为60-480min。
[0026]本发明提供的甲醇钠催化粗PI和树脂硅胶柱色谱纯化制备GPI的方法，工艺简单，得到的GPI产品纯度为98%以上，能够为未来商业生产高纯度GPI提供技术参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是粉末磷脂和粗PI的色谱图(a粉末磷脂，其中，P1、PE、PC、LPC分别代表磷脂酰肌
[0028]醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱；b粗PI);
[0029]图2 是纯化后 GPI 的 HPLC-ELSD ；
[0030]图3是纯化后GPI的核磁碳谱图。
【具体实施方式】
[0031 ] GPI 的 HPLC-ELSD 检测方法:
[0032]取待测样品溶于2mL氯仿:甲醇(2:l，v:v)中，经涡旋振荡器混匀，在lOOOOr/min下离心5min，然后取上清液存放在冰箱中，待HPLC-ELSD分析检测。具体色谱条件为:硅胶柱，Z0RBAXRX-SIL(4.6X250mm，5 μπι)，柱温 35°C，漂移管温度 30°C ;进样量 20 μ L ;检测方法:采用二元梯度洗脱，流动相A (甲醇:水=8:1，V/V)，流动相B(甲醇)，流速1.0mL/min ；A相的梯度，开始lOmin，以40%梯度增加到60%，保持5min，之后3min，以60%梯度降低到40%。
[0033]实施例1按以下步骤制备甘油磷脂酰肌醇
[0034]所用的原料为大豆粉末磷脂(纯度多96 %;磷脂酰胆碱30 %、磷脂酰乙醇胺25 %、磷脂酰肌醇25%、溶血磷脂酰乙醇胺0.5%)。其色谱图如图1(a)所示。
[0035]粗PI的制备:称取一定量粉末磷脂，加入到40°C，10倍体积的碱性乙醇(无水乙醇:氨水=100:3，V/V)中，搅拌60min，离心分离上清液，将沉淀与碱性乙醇再混合，重复同样操作2次。将不溶物在60°C下真空干燥可得到粗PI。得到的粗PI的色谱图如图1(b)所示。
[0036]醇解反应:称取15.0g粗PI溶于10mL甲醇，在室温水浴中均质，35°C水浴中搅拌，添加3.5mL 30%甲醇钠甲醇溶液，反应240min，得到醇解反应液。
[0037]树脂柱色谱出去反应液中阳离子:采用001X7强酸H型阳离子交换树脂装柱，醇解反应液过柱除去Na+，600C，真空浓缩，离子交换树脂再生。
[0038]硅胶柱色谱纯化GP1:通过硅胶柱色谱将GPI与其他产物及杂质分开，称取GPI
0.3g，溶于甲醇，将活化后的硅胶15g溶于甲醇，匀浆、过夜、装柱、压实、上样，用甲醇进行洗脱，流速2mL/min，每30mL洗脱馏分进行收集，用HPLC-ELSD进行检测，直到没有GPI的响应值为止，将同类型的馏分进行合并，60°C，真空浓缩，得到GPI纯度为98.71%。纯化后GPI的HPLC-ELSD图如图2所示。回收硅胶，在120°C活化180min进行硅胶再生。
[0039]实施例2按以下步骤制备甘油磷脂酰肌醇
[0040](I)称取磷脂酰肌醇PI纯度在50%以上的粗PI ;
[0041](2)将粗PI按照质量与体积比1:7溶于甲醇中，搅拌，每10mL中加入1.5mL的28%甲醇钠甲醇溶液，反应温度为30?50°C，反应480min即得到醇解反应液；
[0042](3)采用阳离子树脂去除醇解反应液中的钠离子，并将洗脱液干燥得到粗GPI样品;
[0043](4)将硅胶装柱后，将粗GPI样品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脱，收集含有GPI的洗脱液，将洗脱液真空浓缩干燥，即得到GPI产品。
[0044]制备得到的GPI纯度为99.01%，其核磁碳谱图见图3。
[0045]实施例3按以下步骤制备甘油磷脂酰肌醇
[0046](I)称取磷脂酰肌醇PI纯度在65%以上的粗PI ;
[0047](2)将粗PI按照质量与体积比1:3溶于甲醇中，搅拌，每10mL中加入5.5mL的25%的甲醇钠甲醇溶液，反应温度为50°C，反应60min即得到醇解反应液；
[0048](3)采用阳离子树脂去除醇解反应液中的阳离子，并将洗脱液干燥得到粗GPI样品;
[0049](4)将硅胶装柱后，将粗GPI样品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脱，收集含有GPI的洗脱液，将洗脱液真空浓缩干燥，即得到GPI产品。
[0050]制备得到的GPI纯度为98.23%。
[0051 ] 实施例4粗GPI样品的色谱纯化
[0052]将活化后的硅胶溶于甲醇，匀浆、过夜、装柱、压实、GPI甲醇溶液上样，用甲醇进行洗脱，流速0.8?3mL/min，每10?50mL洗脱馏分进行收集，用HPLC-ELSD进行检测，直到没有GPI的响应值为止，将同类型的馏分进行合并，60°C，真空浓缩、干燥，得到产品。硅胶再生条件:在100?150°C活化120?360min，再生次数I?8次。
[0053]所述硅胶，使用前可以经预处理，预处理方法为:取适量硅胶置于120°C烘箱中活化 40_60min。
[0054]所述硅胶柱色谱中的洗脱剂可以是以下任意一种:甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、戊醇、己醇。
[0055]实施例5粗PI的制备
[0056]以PI纯度在25%以上的磷脂混合物为原料，加入到30?45°C，5?10倍体积的碱性乙醇(无水乙醇:氨水=100:1?100:5，V/V)中，搅拌30?60min，离心分离上清液，将沉淀与碱性乙醇再混合，重复同样操作2次。将不溶物在60°C下真空干燥可得到粗PI。
[0057]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种甘油磷脂酰肌醇(Glycerylphosphoinositol，GPI)的制备方法，其特征在于，所述方法是将磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol，PI)质量分数在50%以上的粗PI溶解于甲醇中，再添加甲醇钠进行反应，得到醇解反应液，然后去除醇解反应液中的阳离子，再进行纯化即得到GPI产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)制备PI质量分数在50%以上的粗PI; (2)将粗PI按照质量与体积比1:1?1:7溶解于甲醇中，然后每100mL溶液中添加0.49-2.15g甲醇钠或者含有0.49-2.15g甲醇钠的甲醇钠甲醇溶液，反应60?480min，得到醇解反应液； (3)去除醇解反应液中的阳离子，然后采用硅胶柱色谱纯化，即得到GPI产品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3是使用阳离子交换树脂去除阳离子，得到洗脱液先干燥再进行硅胶柱色谱纯化。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中醇解反应的反应温度为30-50。。。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甲醇钠甲醇溶液中甲醇钠的质量分数为25%?30%。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中粗ΡΙ的制备方法是:以ΡΙ纯度在25%以上的磷脂混合物为原料，加入到一定体积的碱性乙醇中混合，搅拌，离心分离上清液，将不溶物干燥即得到粗ΡΙ产品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述原料是加入到5-10倍体积的碱性乙醇中；所述碱性乙醇是无水乙醇与氨水按体积比100:1?100:5混合得到的。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的硅胶色谱纯化，是以硅胶为固定相，醇溶液为洗脱剂，洗脱剂流速为0.8?3mL/min，收集洗脱有GPI的组分，经浓缩、干燥即得到GPI产品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗脱剂为以下低碳链醇中的任意一种:甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、戊醇、己醇。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括:(1)制备PI含量在50%以上的粗PI ； (2)将粗PI按照质量与体积比1:1?1:7溶于甲醇中，搅拌，每100mL溶液中加入1.5?5.5mL的甲醇钠质量分数为25-30%的甲醇钠甲醇溶液，反应温度为30?50°C，反应60?480min即得到醇解反应液；(3)采用阳离子交换树脂去除醇解反应液中的钠离子，并将洗脱液干燥得到粗GPI样品；(4)将硅胶装柱后，将粗GPI样品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脱，收集含有GPI的洗脱液，将洗脱液真空浓缩干燥，即得到GPI产品。
【文档编号】C07F9/117GK104447856SQ201410764836
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】张康逸, 宋范范, 何梦影, 张薇薇 申请人:河南省农科院农副产品加工研究所