专利名称：维出那亭衍生的合成肽和含有这些合成肽的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含维出那亭(vitronectin)衍生的合成肽的药物组合物，维出那亭能够调节血浆酶原激活因子抑制剂-1(PAI-1)的生物活性，本发明还涉及某些此类新的合成肽。
止血，阻止血液从受伤的血管中流出的过程，是以与血管、血小板和血浆因子及限制血管壁受伤区域血小板及纤维蛋白聚集的平衡机制的结合活性为特征的。
血凝反应形成了止血封闭-纤维蛋白凝块的主要因素。通过向外扩散及固定血小板栓塞，纤维蛋白凝块增至止血封闭所需大小。
一般存在调节机理以防止血凝反应，该反应一旦被激发，若不加以抑制，则会产生病理症状，如局部血栓形成或播散性血管内凝血(DIC)。这些调节机理包括细胞内清除激活的凝血因子，特别是流经肝脏的血液，以及血液自身内部中和被激活的凝血酶和被激活的凝血辅助因子机理。
随着纤维蛋白的沉积，纤维蛋白溶解系统被激活。通过溶解纤维蛋白，该系统协助保持受伤的血管腔的通畅。在修复受伤的血管壁所需的数天内，纤维蛋白的沉积和溶解保持平衡并再造止血封闭。
当纤维蛋白原经凝血酶转化为纤维蛋白时，血浆酶原，一种惰性的血浆酶前体被其天然的激活因子，如组织血浆酶原激活因子(tPA)激活，并转化为有效的蛋白水解酶-血浆酶，它可以将纤维蛋白降解为可溶性片段(称作纤维蛋白降解产物)，这些片段可被带入循环。
阻止过度纤维蛋白水解的几种因素包括血浆酶原与纤维蛋白而不是纤维蛋白原结合的亲合力增加，及当组织血浆酶原激活因子与纤维蛋白结合时，它激活血浆酶原的能力增加。纤维蛋白水解的主要抑制剂是血浆酶原激活因子抑制剂-1(PAI-1)。更进一步地，血浆含有一种称为α2-抗血浆酶的蛋白酶抑制剂，该抑制剂能迅速使防止纤维蛋白凝块形成的血浆酶失活。
为了阻止血浆酶的作用，仅通过α2-抗血浆酶使已经形成的过量的血浆酶失活是不够的(Collen，1976)。防止血浆酶原进一步产生血浆酶也是必要的。这可以通过运用PAI-1对血浆酶原激活因子的抑制来实现，表明PAI-1与维出那亭结合(Loskutoff et al.，1988;Sprengers and Kluft，1987)，如此，PAI-1变成了以其活性形式稳定存在于循环血液及细胞外基质(ECM)中(Declerck et al.，1988;Salonen et al.，1989;Mimuro and Loskutoff，1989;Preissner et al.，1990)。
Vitronectir最初作为细胞扩散因子被发现，现在则认为它是一种多功能的调节蛋白，它被包括在各种细胞外过程中，如正常细胞和瘤细胞的附着及扩散，以及在补体及凝血途径中发挥作用。在循环血液中，维出那亭有两种分子形式单链75KDa多肽(V75)和切口多肽(V65+10)，切口多肽的两条链(65KDa和10KDa)通过链间的二硫桥连结。运用血小板释放的蛋白激酶A(PKA)在维出那亭的Ser378处的特定磷酸化反应(korc-Grodzicki et al.，1988a;Korc-Grodzicki et al.，1988b;Chain et al.，1990Korc-Grodzicki et al.，1990;Chain et al.，1991a)，我们最近才看到血浆酶在Arg361-Ser362键特异地切割了维出那亭，该键位于距导致该蛋白产生两条链形式(V65+10)的内源性切割部位的上游18个氨基酸处。我们还报告了血浆酶切割的结果，维出那亭和PAI-1间的亲合力明显降低(Chain et al.，1991b)，且固定维出那亭于ECM的氨基葡聚糖激发了这一切割，发现这有利于基质中的维出那亭切割。
图1描述了我们基于这一发现设想的机理，通过这一机理，血浆酶能够通过传送反馈信号来抑阻它自身的产生。
在纤维蛋白溶解的开始阶段，血浆酶原激活因子将血浆酶原转化为血浆酶。这是可能的，因为PAI-1然后被维出那亭分子固定(捕获)，维出那亭分子假想是通过氨基葡聚糖预先固定于ECM(Pollanen et al.，1988)。PAI-1的固定通过阻止其到达并抑制血浆酶原激活因子而局部减少了该抑制剂。当血浆酶的水平过高时，过量的血浆酶则优选地阻断固定于内皮下膜的维出那亭分子。结果，固定的PAI-1和分离(移动)的PAI-1间的平衡被转移，这样，在血浆中被转化为可溶(移动)的维出那亭分子的释放的PAI-1而后能到达并抑制血浆酶原激活因子从而阻止血浆酶的产生。这种释放实际上代表着改变位置，固定于ECM-结合(血浆酶夹住)的维出那亭的PAI-1转变为可溶的没有为血浆酶束缚的维出那亭分子，这表明了对PAI-1的高度亲合性。
对血浆酶产生的调控机理的破坏广泛应用于临床。几个方面的发现表明通过天然激活因子(如tPA、链激酶、尿激酶)对血浆酶原的激活构成了用于经血浆酶作用蛋白溶解屏障的多目的生物手段。在有血凝块的情况下，无论是偶然形成的还是不再需要，它们的溶解恢复了自由通畅而有生机的血流。然而，渗透组织和形成转移(Danoet al.，1985;Mignatti et al.，1989;Cajot et al.，1990)的恶性细胞，神经再生中的神经细胞，和血管生成中的血管(Mignatti et al.，1989)显然利用了非常相同的机理。在炎症、排卵、组织再造和发展中也显示包含了血浆酶原/血浆酶系统。
基于功能不同的观点，显然血浆酶活性必须处在严格的调节控制下以保证一个局部的、位点-限制的作用并限制其使用时间。
PAI-1在调节血浆酶原的激活中起着重要作用，如此，它也涉及通过血浆酶调节生物屏障的溶解。结果，通过与PAI-1的功能性相互作用，维出那亭涉及纤维蛋白溶解、炎症、排卵、组织再造和发展、血管生成、神经再生、恶性及肿瘤细胞侵入过程(Dano et al.，1985，Mignatti et al.，1989，Cajot et al.，1990)。
某些源于结合维出那亭位点的肝素的肽类最近也显示了介导维出那亭-凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物与人内皮细胞的结合(de Boer et al.，1992)公开的肽相应序列为A341-R355，K348-R361，R357-R370，H366-R379，和N371-L383。这些相同的肽也用于在制图研究中确定肝素、PAI-1和血浆酶原在维出那亭的羧基端部分的结合位点(Kost et al.，1992)。这些出版物没有描述或建议将这些肽用于医药用途。
本发明现在已经发现从维出那亭分子衍生的合成肽能调节PAI-1的生物活性。这样，这些肽可以阻止PAI-1到达并抑制血浆酶原激活因子，或者它们可以允许PAI-1到达并抑制血浆酶原激活因子。
本发明的肽(在此，设定为BP肽)由氨基酸序列组成，该序列全部或部分地与对应于维出那亭分子348-380位的基本氨基酸序列相对应。
本发明因此还涉及含有合成肽作为活性组份的药物组合物，该合成肽含有部分或全部包括具有下列分子式的维出那亭的氨基酸残基K348-A380的序列348KKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR380PSRA和其盐，功能性衍生物及类似物，所述类似物是通过一个或多个氨基酸取代、增加或缺失得到的，这样，该类肽与其高正电荷密度及总体亲水特性有关的整体性质得以保持，上述肽和其盐，功能性衍生物及其类似物能够调节PAI-1的生物活性，该组合物还含有可药用载体。
本发明还涉及如上述限定的包括维出那亭氨基酸残基K348-A380的部分或全部序列的合成肽和其盐、功能性衍生物及其类似物，但不包括肽A341-R355、K348-R361、R357-R370、H366-R379、和N371-L383。
在本文表Ⅰ和Ⅱ中给出了本发明肽的说明性实施例。本文中所用的氨基酸残基的数目是指由Jenne和Stanley于1985年推断的维出那亭的序列。表Ⅰ中的第一个序列描述了维出那亭(VN)的K348-W382序列。这些肽可以含有全部光学活性的L构型或D构型或其中部分为L构型、其它为D构型的氨基酸(表Ⅱ中下面划线的为D构型氨基酸残基)。
表Ⅰ
表Ⅱ348 363BP6 K K Q R F R H R N R K G Y R S QBP7 K K Q R F R H R N R K G Y R S QBP8 K K Q R F R H R N R K G Y R S QBP14 N R K G Y R S Q阻止PAI-1到达并抑制血浆酶原激活因子的肽将增进血浆酶原激活为血浆酶，并导致纤维蛋白溶解。这是一类含有包含维出那亭的K348-R370位最优选K348-Q363位的全部或部分序列的肽，它们将适于用作前纤维蛋白溶解剂，用于治疗心肌梗塞、深层静脉血栓形成如腿静脉血栓形成、播散性血管内凝血、肺栓塞及其他疾病。它们可以单独施用以增进内源性蛋白溶解过程，或与血浆酶原激活因子(如tPA、链激酶或尿激酶)联合施用。
这样，在优选的具体方案中，本发明的肽将含有包含维出那亭的K348-370位的全部或部分的序列，例如，本文称为BP5(K358-R370)和BP6(K348-Q363)的肽。在这一序列中，更优选的具体方案是该肽含有部分光学活性的氨基酸残基，或最优选全部为D构型光学活性氨基酸残基，例如本文称为BP7、BP8和BP14的肽。肽BP7具有与BP6(K348-Q363)相同的序列，但表Ⅱ中下面划线的残基以D构型替代了L构型。肽BP8与BP6有着相同的序列但其全部的光学活性氨基酸为D构型。肽BP14(N358-Q363)含有BP8的C-端部分，且其全部光学活性氨基酸为D构型。具有部分或全部D型光学活性氨基酸的肽通过止血和纤维蛋白溶解过程涉及的蛋白酶将更强地或完全地抵抗酶的切割作用。
允许PAI-1到达并抑制血浆酶原激活因子的肽阻止了由血浆酶原生成血浆酶。这类肽含有包括维出那亭S362-A380位的全部或部分的序列，它将适于用作抗纤维蛋白溶解剂，用于治疗如在出血性疾病中与由血浆酶引起的过度(失控)蛋白水解有关的疾病。此类抗纤维蛋白溶解剂的一个例子是BP4肽。
这样，另一个优选的具体方案是本发明的肽含有包括维出那亭的S362-A380位的全部或部分的序列，例如，本文称为BP4(S362-A380)、BP4-1(S362-A370)、和BP4-2(S362-A368)。
本发明的肽和药物组合物将适用于治疗涉及调节PAI-1的疾病，例如，心肌梗塞、深层静脉血栓形成如腿静脉血栓形成、肺栓塞、播散性血管内凝血、肿瘤细胞侵入和转移、炎症如胰腺炎、肝病、细菌性血液感染、妊娠中毒、和与血管生成的调控或神经再生或过量tPA介导的蛋白水解(例如在肿瘤迁移过程中)有关的病理症状。附图的简要说明。
图1为显示纤维蛋白溶解中涉及的分子活动顺序图，其中血浆酶能通过反馈信息的传递来阻止它自身的产生，在细胞外基质中发现从固定的维出那亭基质中释放了PAI-1，它出现于止血处。PA，血浆酶原激活因子;PAI-1，血浆酶原激活因子抑制剂-1;Vn，维出那亭;Vn′，血浆酶束缚的维出那亭;(s)，溶解的;(i)，不溶的;+，激发;-，抑制。
图2为显示含有正电荷的碱性氨基酸序列的维出那亭的部分序列(残基348-380)图，并说明了PKA的磷酸化位点(Ser378)，内源性切割位点(Arg379-Ala380)，血浆酶切割位点(Arg361-Ser362)及肝素结合位点(348-359位)间的关系。
图3A-D显示了从对应于维出那亭348-380位的BP系列合成的肽对维出那亭结合于固定的PAI-1的影响。A组-肽BP1(方块)，BP2(三角)，和未加样(园圈);B组-BP3(方块)，BP4(三角)，和未加样(园圈);C组-BP(4-1)(方块)，BP(4-2)(三角)，和未加样(园圈);D组-BP(4-1)(方块)，BP5(三角)，BP6(实心园圈)，和未加样(空心园圈)。图中的多个点代表三次测定的平均值。培养混合物中最终的肽浓度为25μM。
图4A-B显示了等摩尔浓度(25μM)的肽BP4-1(三角)与BP5(方块)(A组)和肽BP5(实心园圈)与BP6(实心园圈)(B组)在阻碍维出那亭与固定的PAI-1结合的相对功效。未加样空圈。
图5A-C显示了不同浓度的BP4(A组)，BP5(B组)和BP6(C组)对维出那亭与固定的PAI-1结合的影响。A组-2.5μM(空方块)，5μM(空三角)，12μM(实心园圈)，25μM BP4(实心方块)，未加样(空圈);B组-2.5μM(空方块)，10μM(空三角)，25μM(实心园圈)，100μm(实心方块)，250μm BP5(实心三角)，未加样(空圈);C组-2.5μM(空方块)，5μM(空三角)，10μM(实心园圈)，25μM BP6(实心方块)，未加样(空圈)。
图6显示了低浓度BP6对维出那亭与固定的PAI-1结合的影响。未加样空圈，0.1μM BP6(三角)，0.5μM BP6(方块)。
图7说明了BP4(空圈)，BP5(空方块)和BP6(实心园圈)阻碍维出那亭与PAI-1接触效果的比较。维出那亭的终浓度是不变的(0.5μg/ml)，而肽的浓度按照指示发生变化。
图8A-C显示了含有D构型氨基酸的不同浓度的肽BP7(A组)、BP8(B组)和BP14(C组)对维出那亭结合于固定的PAI-1的影响。A组-1μM(空方块)，5μM(空三角)，10μM BP7(实心园圈)，未加样(空圈);B组-1μM(空方块)，5μM(空三角)，10μM BP8(实心园圈)，未加样(空圈);C组-1μM(空方块)，5μM(空三角)，10μM BP14(实心园圈)，未加样(空圈)。
图9显示了全部D型肽BP8的前纤维蛋白溶解活性，通过用D-二聚体形成测定纤维蛋白凝块溶解来检测纤维蛋白溶解的促进。
图10A-E描述了评价BP8的前纤维蛋白活性的实验，该活性是通过以50μg/Kg剂量给药后，由鼠的搏动血压的恢复来评价。A组-对照，无血流阻塞的动物;B组-有血流阻塞的动物;C组-BP-8处理过的动物，处理后13分钟;D组-BP-8处理过的动物，处理后15分钟;E组-BP-8处理过的动物，处理后18分钟。
优选具体方案的描述。
本发明的肽对PAI-1有高度亲合力，且能从维出那亭上替换这一抑制剂。它们可以从内皮下膜或聚集的血小板的表面以抑制的形式(结合于可溶的维出那亭)释放PAI-1，因而阻断血浆酶生成和纤维蛋白溶解，或从维出那亭上释放PAI-1，使它转变为一个潜在的(失活的)形式，因而阻止对血浆酶原激活因子的抑制并促进纤维蛋白溶解。
在体外通过例如纤维蛋白D-二聚体的形成和在培养物中由内皮细胞释放PAI-1的方法，或在体内通过动物体内搏动血流的恢复可以评价该类肽调节纤维蛋白溶解的功效。也可以使用其他经常使用的临床血液测试，包括测定凝血酶时间、优球蛋白溶解时间、稀释的全血凝块溶解时间、血块凝缩以及培养物中经内皮细胞释放tPA。
本文使用的术语肽和其功能性衍生物及其类似物的“盐”包含氨基酸残基的游离羧基与有机或无机碱的盐及游离氨基的酸加成盐。术语“功能性衍生物”包含游离的-OH、-NH2-和-COOH基衍生物，例如酯，如S、T和Y残基的磷酸酯、醚、胺等，术语“类似物”包含通过氨基酸部分的取代、增加或缺失得到的肽，并包括环肽。本发明包括该肽的盐，功能性衍生物及类似物，只要它们能够调节PAI-1的生物活性。
按本发明的要求，肽的总体高正电荷密度和亲水特性应得以保持，这样被加入或用于取代维出那亭分子中的残基的氨基酸应与此要求相适应。应避免负电荷的氨基酸(E、D)和过量的高度疏水性氨基酸(W、F、Y、L、I)。推荐使用正电荷的氨基酸(R、K、H)。这样，例如，R、K和H残基间的互换是可能的。
本发明的药物组合物含有本发明的肽、其功能性衍生物、类似物或其盐，以及可药用载体。可以使用任何合适的组合物给药方式，包括口服、局部给药、注射、或静脉注射。可提供多种赋形剂，例如普通盐水、葡萄糖或其他载体，含或不含其他的治疗物质。剂量比率可以根据病人的情况或进行的特殊治疗发生变化。例如能够溶解身体不同区域的血凝块，包括脑、深层静脉、冠状动脉等。
当组合物含有前纤维蛋白溶解性肽时，它们可以单独或与血浆酶原激活因子一起施用，如天然的或重组的组织血浆酶原激活因子(tPA)，尿激酶或链激酶。
运用已知的药学方法和过程来配制用于本发明的剂量形式。它们可以是粉剂或液体悬浮液。
本发明还涉及使用含有包括维出那亭的氨基酸残基K348-A380的部分或全部序列的合成肽、和其盐，功能性衍生物及其类似物来制备药物组合物的应用，所说的类似物是通过一个或多个氨基酸的取代、增加或缺失得到的，这样，有关高正电荷密度和总体亲水特性的该肽的总体性质得以保持，所说的肽和盐、其功能性衍生物及其类似物能够调节PAI-1的生物活性，所制备的药物组合物用于治疗各种疾病，包括急性心肌梗塞、深层静脉血栓形成、肺栓塞、播散性血管内凝血、肿瘤细胞侵入和转移、炎症、肝病、细菌性血液感染、妊娠中毒、和与血管生成的调控、或神经再生、或过度tPA-介导的蛋白水解有关的病理症状，如(肿瘤)转移。
进一步的具体方案中，本发明涉及病人的治疗方法，病人所患的疾病选自急性心肌梗塞、深层静脉血栓形成、肺栓塞、播散性血管内凝血、肿瘤细胞侵入和转移、炎症、肝病、细菌性血液感染、妊娠中毒、和与血管生成的调控、或神经再生、或过度tPA-介导的蛋白水解有关的病理症状，所说的治疗方法包括给此类病人施用治疗有效量的本文所定义的作为本发明药物组合物的活性成分的肽。
下列非限定性实施例将对本发明进行说明。
实施例材料与方法a)购得材料从Tel-Hashomer Medical Center，Ramat-Gan，Israel购得新鲜冷冻的人血浆。免抗人维出那亭多克隆抗体由Calbiochem获得。β-半乳糖苷酶连接的蛋白A和邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)从Amersham U.K.购得。PAI-1从American Diagnostica，New York得到。其余化学品为商业来源可得到的最高级品。
b)维出那亭由新鲜冷冻的人血浆通过Korc-Grodzicki等人(1990)描述的纯化方法制备维出那亭。该制备法通常得到两种分子形式的该蛋白单链V75形式并且蛋白水解性剪夹，以二硫桥连接的双链V65+10形式(Dah/back和Podack，1985;Jenne和Stanley，1985)。
c)如文献中所述进行的方法用Bradford(1976)描述的方法测定蛋白浓度。按Salonen等人(1989)的描述诱导维出那亭结合到固定的PAI-1上。如Katagiri等人(1988)的描述用十二烷基硫酸钠激活PAI-1。用应用生物系统475A(Applied Biosystem 475A)定序器排定氨基酸序列。
实施例1.肽的合成本发明的肽可以用本领域熟知的方法通过化学合成或基因工程技术来制得。
在氯甲基化的聚苯乙烯-1%二乙烯基苯树脂(Chemalog，South Plainfield，N.J.)上使用固相操作法(Barany和Merrified，1980)于机械摇床上进行肽合成操作。用叔-丁氧羰基(t-BOC)来保护α-氨基。侧链基团用如下的保护基进行保护丝氨酸(S)和苏氨酸(T)以苄基保护用2，6-二氯苄基保护酪氨酸(Y)，用2-氯苄氧羰基保护赖氨酸(K);以对甲苯磺酰基保护精氨酸(R)以苄氧羰基保护组氨酸(H)。该合成以C-端氨基酸与树脂的偶合开始。以3倍摩尔过量的被保护的氨基酸及N，N′-二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑的等摩尔混合物为偶合试剂进行肽延伸(偶合)。用无水HF进行脱保护并将肽从聚合物载体上分离。使用线性梯度(0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液至0.1%TFA的75%乙腈/水溶液)经制备HPLC(Lichrosorb RP-8;7μm;250×10mmMerck，Darmstadt，Germany)将粗品肽精制为纯品。
为描绘PAI-1在维出那亭上的结合位点，合成了一系列肽，该类肽的结构衍生于围绕其血浆酶切割位点(R361-S362)的氨基酸序列(Chain等，1991b)。上文表Ⅰ和Ⅱ给出了所制备肽的序列。通过测定其氨基酸的组成和序列证实了每种肽的结构。表1表示了肽BP4、BP4-1、BP5、BP6和BP7的氨基酸分析。表2显示了肽BP4、BP5和BP6的序列分析。
表1BP系列中主要肽的氨基酸组成＊肽 A R N Q G H K F P S YBP4 0.85 5.32 1.98 2.14 2.0 0.98 - - 1.0 2.4 -(1) (6) (2) (2) (2) (1) (1) (4)BP4-1 - 2.95 - 1.06 2.0 1.12 - - - 1.32 -(3) (1) (2) (1) (2)BP5 - 4.1 - 1.10 3.0 1.02 0.86 - - 1.56 1.05(4) (1) (3) (1) (1) (2) (1)BP6 - 5.0 1.02 2.18 1.0 0.97 3.38 0.90 - 0.81 1.10(5) (1) (2) (1) (1) (3) (1) (1) (1)BP7 - 5.18 0.99 2.11 1.10 0.84 2.86 1.0 - 0.86 0.92(5) (1) (2) (1) (1) (3) (1) (1) (1)＊给出值为分析得到的纳摩尔数，而括号中的值表示正确结构中期望的整数。
表2BP4、BP5和BP6的序列分析BP4 BP5 BP6环序号. 序列 测定 环序号. 序列 测定 环序号. 序列 测定残基 (收率*) 残基 (收率*) 残基 (收率*)1 S (58) 1 K (64) 1 K (62)2 Q (97) 2 G (47) 2 K (67)3 R ** 3 Y (61) 3 Q (68)4 G (48) 4 R ** 4 R (13)5 H (45) 5 S (20) 5 F (69)6 S (37) 6 Q (44) 6 R (19)7 R ** 7 R ** 7 H (14)8 G (34) 8 G (26) 8 R (22)9 R ** 9 H (16) 9 N (52)10 N (28) 10 S (8) 10 R (24)11 Q (20) 11 R ** 11 K (40)12 N (15) 12 G (16) 12 G (34)13 S (15) 13 R ** 13 Y (44)14 R ** 14 R (24)15 R ** 15 S (13)16 P (25) 16 Q (17)17 S (9)18 R **19 A (12)＊回收的衍生物中氨基酸苯基乙内酰硫脲的pmoles＊＊定性检测(对定量测定，收率过低)实施例2.BP系列的合成肽对维出那亭结合于固定的PAI-1上的影响通过对每种合成肽抑制维出那亭结合于固定PAI-1的能力进行竞争性ELISA分析，测试表1所示的每种合成肽和含有D构型氨基酸的每种肽(BP7、BP8和BP14)。用相同摩尔浓度(25μM)的肽进行首次筛选(图3)。考虑到试验中可能的变化性(主要因培养板上涂覆的激活的PAI-1中的某些变化性)。在每块培养板旁用单独的维出那亭对照作为参考。
将各种合成肽(均为50μM)溶于50μl的缓冲液中，该缓冲液由PBS、Tween20(0.01%)、聚乙二醇(平均分子量为8KDa)(4%W/V)组成。将每份样品加到涂覆有SDS-激活的PAI-1(如Katagiri等(1988年)所述制备)的微量滴定池中。在22℃培养30分钟后，在每个池中加入等份(50μl)的在相同缓冲液中的维出那亭溶液(以不同浓度)。随后在37℃培养2小时。用特定的免抗人Vn抗体(1∶1000稀释液)、然后用β-半乳糖苷酶连接的蛋白A，并使用邻硝基苄基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作为底物测定结合的维出那亭的量。进行酶促反应并测定405+450nm处的吸光度。图3显示了结果。图中的每个点代表三次测定的平均值。培养混合物中最终的肽浓度为25μM并指示了维出那亭的浓度。
如图3所示，所有包含在血浆酶切割位点(R361-S362)和内源性切割位点(R379-A380)之间的维出那亭序列的肽BP1、BP2、BP3、和BP4(A和B组)在某种程度上抑制了维出那亭与PAI-1的结合。这一抑制主要是由于BP4的N-端部分，因为BP4-1(S362-R370)是一种相当有效的抑制剂(图3，C组)，而BP1(N371-A380)即使有抑制作用，也只显示出较弱的抑制作用(图3，A组)。应该注意的是仅比BP4-1少两个氨基酸的BP4-2(S362-R368)是一种不太有效的抑制剂。(图3，C组)，表明G367和/或R370可能含有一个重要的生物识别元素。进一步地，不同种类肽的抑制力不能仅归因于它们的正电荷，因为人们发现BP4-1(净电荷+4)比BP3(净电荷+6)或BP4(净电荷+7)更有效(图3，B和C组)。
人们发现肽BP5(K358-R370)作为抑制剂比BP4-1更为有效，BP5包含全部BP4-1并且进一步延伸到血浆酶切割位点(图3，D组)。更进一步地，肽BP6(K348-Q363)看来是这一系列中最为有效的(图3，D组)。
然后通过测量抑制作用的浓度依赖性来评价肽BP4、BP5和BP6的相对抑制能力。
如图4所示，在等摩尔条件下，(每种肽25μM)，BP5超过了BP4-1(A组)，且BP6比BP5更为有效(B组)。
如图5所示，BP4、BP5和BP6三种肽随浓度增加都获得了最大的抑制作用。然后，当BP4在25μM浓度下有最大抑制作用(图5，A组)时，BP5则在100μM浓度下达最大抑制(图5，B组)，肽BP6在2.5μM浓度时就已经达最大效果(图5，C组)。
这在图6中得到进一步说明，用浓度为0.1μM(0.15μg/ml)的肽BP6就得到了最大PAI-1结合的抑制作用，并且在图7中，比较了在一定的维出那亭浓度(0.5μg/ml)力增长的肽浓度下这些肽的相对抑制效果。从该图中可以明显看出，全部三种肽有着相同的水平的抑制作用(约65%)。然而BP6获得该水平抑制作用的浓度比BP4或BP5低200～500倍。
上述结果表明当PAI-1结合位点残基的某些高亲合性要素位于K348-R357区域时，完整的PAI-1结合位点包括K348-R270序列。这一PAI-1结合位点的位置能够解释我们先前的发现(Chain等，1991b)，即血浆酶上位切割R361-S362键，维出那亭和PAI-1之间的亲合性减弱，释放了抑制因子，因为PAI-1结合位点被这一切开分为两个部分。
关于含有D构型氨基酸的肽，图8显示了三种肽BP7(A组)、BP8(B组)和BP14(C组)全部结合于固定的PAI-1上，但BP8看来比BP7和BP14有更牢固的结合。
实施例3.BP系列的合成肽对调节纤维蛋白溶解的影响通常使用临床血液试验来评价本发明的合成肽对纤维蛋白溶解的调节效果，主要以纤维蛋白D-二聚体形成和经培养物中内皮细胞释放PAI-1来调节纤维蛋白凝块溶解。其他可以使用的试验包括测量凝血酶时间、优球蛋白溶解时间，稀释全血凝块溶解时间，血块凝缩，和培养物中经内皮细胞的tPA释放。
3.1 通过D-二聚体形成调节纤维蛋白凝块溶解为测定加或不加tPA的情况下肽对纤维蛋白凝块溶解的调节能力，使用人的纤维蛋白原(含一些血浆酶原)和凝血酶，在接种于浓密层的人的内皮细胞(从人脐带得到)上生成纤维蛋白凝块胶。这样，在预先涂覆或不加细胞外基质的24孔组织培养板中以半融合方式培养人内皮细胞(HUVEC)。洗涤细胞，并将0.4ml纤维蛋白凝胶叠加于细胞上，该纤维蛋白凝胶由3mg/ml人纤维蛋白原和1单位凝血酶混合而成(Kabi，Sweden)。使纤维蛋白在37℃凝结1小时，且将含有试验肽的0.4ml培养基(含10%胎牛血清(FCS)的M-199)加到纤维蛋白凝胶上。将上清液中加或不加试验物质的tPA稀释。并与细胞一起培养6小时。在D-二聚体EIA上测试取自上清液的样品。使用得自Agen Biomedical Ltd，(Brisbane，Austrilia)的药盒，通过Rylatt等人(1983)酶免疫测定法测试上清液中的D-二聚体含量。在有或没有IPA(0.09U/ml)存在时，经与试验肽一起培养6小时后，测定两个池上清液中D-二聚体的形成。在凝结后1小时向纤维蛋白凝胶中加入不同的肽溶液。在未加肽及使用的试验条件下，这样的凝块在约24小时时溶解，这是因为血浆酶原被细胞释放的tPA激活。也可以加入外源性tPA以加速此过程并模拟tPA治疗作用。表3列出了这一结果。
表3肽的生物活性，通过其调节纤维蛋白凝块溶解的能力测量肽 终浓度(M) 加入tPA 通过D-二聚体生成测量的凝块溶解(%)*(平均)BP4 1.5×10-9+ 764.5×10-9+ 571.5×10-8+ 484.5×10-6+ 60BP5 4.5×10-9+ 1831.5×10-8+ 1744.5×10-7+ 1444.5×10-6+ 132BP5 1×10-8- 1831×10-6- 191BP6 1×10-6+ 121BP6 1×10-9- 1521×10-8- 1351×10-6- 187＊采用对照为100%。因此，超过100%的值表明促进了纤维蛋白溶解，而低于100%的值表明减弱了纤维蛋白的溶解。
测定值超过100%的前纤维蛋白溶解肽例如BP5和BP6加速了这一过程，而测定值低于100%的抗纤维蛋白溶解肽例如BP4则抑制该过程。
在上述提及的肽中，BP6为所试验的最为有效的前纤维蛋白溶解肽，这能从以不同浓度的BP6进行的另一系列试验中看出。表4概述了该结果。
表4肽BP6的生物活性，通过其调节纤维蛋白凝块溶解的能力测量BP6的终浓度(M) 通过D-二聚体生 试验数成测量的凝块溶解(%)*(平均)1×10-5145 41×10-6162 43.3×10-7163 41×10-7120 83.3×10-8147 41×10-8168 23.3×10-9125 2＊采用对照为100%大于100%的值表明促进纤维蛋白溶解。
正如本文图3～7所示，该结果与BP6相对于其它肽的阻碍维出那亭结合于固定的PAI-1上的相对能力是一致的。
在进一步的实验中，测定了全D构型肽BP8(K348-Q363)的前纤维蛋白溶解活性。用相同的血浆库(取自健康捐献者)重复六次进行(hexaplicates)这些测试。将柠檬酸化的血浆覆盖于人的内皮细胞上，并以1U/ml凝血酶凝结。将试验物稀释在250μl含1%FCS的HBSS(Hank′s平衡盐溶液)中并覆盖于血浆凝块上。6小时后取样，用于D-二聚体分析。如图9所示，BP8明显促进纤维蛋白溶解，与对照组(极右端，未加肽)相比(该促进作用)达2.5倍。
3.2 对动物体内纤维蛋白溶解的影响对该肽对动物(如鼠、兔、豚鼠)体内纤维蛋白溶解的影响进行评价给动物注射试验肽。该试验体系包括测量试验血浆中的血浆酶原，α-2抗血浆酶和加或不加IPA的D-二聚体。在该体系中，tPA可与肽一起注射，用以测定它们对纤维蛋白溶解的附加调节作用。
使用如下试验方法来评价BP8在鼠中的前纤维蛋白的溶解效果。
3.2.a 动物。从Harlan Olac，U.K.购得雄性Wistar SPF鼠，并使其适应Sackler School of Medicine，(Tel-Aviv，Isreal)的动物房。所用动物为5-6月龄的成年鼠，且重量为400～500克。
3.2.b 动物的准备。测试清醒鼠的血压及心率。用三溴乙醇(2，2，2-三溴乙醇在稀释于盐水中的2-甲基-2-丁醇中)轻度麻醉试验动物，并在尾动脉处植入长期固定的导管用于血压的测量，并在颈静脉处植入长期固定的导管用于静脉给药。使动物术后恢复并麻醉，至少在植入导管24小时以后进行试验。植入导管是为了能够测试鼠笼中鼠的血压，而不需其他任何处理和操作。为避免过夜时凝血在导管中注满肝素化的盐水(500单位/毫升)，并在试验期间用肝素化的盐水(50单位/毫升)冲洗。
3.2.c 血压和心率记录及数据分析。将动脉导管与Statham血压换能器连接，并在Graass多途径多种波动描记器上记录血压。从多种波动描记器记录的信号中取样并且IBM兼容PC机分析及用DAS8A/D转换器使其数字化。通过在250Hz的频率处取样10秒进行数据处理。通过峰的检测对信号进行分析。该过程摘录了收缩压，舒张压和平均血压，以及预先设定时间间隔的心率。
3.2.d 给药。尽管导管固定术后施以肝素，但在术后3-4天动脉导管发生凝结，此时注射纤维蛋白溶解肽BP8。给这些鼠经动脉导管注射生理盐水，但不能使血液流出，且没有脉搏及血压记录。通过该药物恢复脉动血压记录的能力及动脉导管中血液流出的难易评价其功效。动脉内给药进入动脉导管的药物浓度为50μg/Kg。
图10显示了此类结果的一个实施例，其中A组和B组分别描述了健康鼠(对照，没有血流阻塞)和有血流阻塞鼠的脉动血压。经后来的BP8治疗后，可以看到(E组)18分钟后脉动血压明显恢复。
3.3 培养基中经内皮细胞释放PAI-1按Chmielewske等人(1983)的方法测定HUVEC细胞的上清液中的PAI-1。简要地说，以半融合方式(加或不加ECM)培养细胞。将培养基改为含2%FCS的Hank′s平衡盐溶液。且将加或不加血浆酶(5μg/ml)的试验物质稀释于该缓冲液中并与细胞一起培养6小时。分析取自细胞上清液的样品的PAI-1活性。
为分析PAI-1，将细胞上清液与定量的tPA(40U/ml)一起培养，并通过底物测定tPA的残留活性，该底物由血浆酶原(0.1μg/ml)、产色物质(S-2251)和刺激物(Kabi，Sweden)组成。与底物一起培养后，在405nm处测定O.D.并经标定曲线计算抑制剂的含量。也可用购买的药盒来测定PAI-1抗原。
用不同浓度的BP6和BP4进行测试。表5和6概述了这一结果。
表5在模型人内皮细胞体系中测量的BP6对PAI-1活性的影BP6终浓度(M) PAl活性(低于 试验数对照的%)*(平均)1×10-519.5 81×10-636.5 83.3×10-739 51×10-719 21×10-819 2＊采用的对照为100%。
表6在模型人内皮细胞体系中测量的BP4对PAI-1活性的影响BP4终浓度(M) PAl活性(超出对 试验数照的(%)*(平均)1×10-529 31×10-647 33.3×10-717 31×10-70 2＊采用的对照为100%。
BP6的前纤维蛋白溶解功效(表5)是通过其降低人内皮细胞体系中PAI-1的活性的能力来表达的，这样便提高了血浆酶原激活因子(tPA)的活性并导致血浆酶活性的增加和加速纤维蛋白溶解，而BP4的抗纤维蛋白溶解功效(表6)是通过其提高相同体系中的PAI-1活性的能力来表达的，这样便降低了血浆酶原激活因子(tPA)的活性并导致血浆酶活性降低和减慢纤维蛋白溶解。
3.4 优球蛋白溶解时间用冷乙酸(0.016M)稀释柠檬酸血浆，并在10分钟后通过离心分离沉淀，沉淀溶于硼酸盐缓冲液，并通过用CaCl2(0.025M)再钙化使其凝结。在37℃下培养该凝块。一般在2～3小时期间凝块发生溶解。在沉淀步骤以前将试验物质加到血浆中。
3.5 稀释的全血凝块溶解时间用佛罗那缓冲液以1∶10的比例稀释1ml全血。加入100μl培养过的凝血酶(40U/ml)形成血栓。凝固的血在37℃培养48小时。通常血凝块将会溶解或在48小时后继续存在。前纤维蛋白溶解剂的加入将缩短血凝块溶解时间。
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权利要求
1.含有包括对应于具有下式的维出那亭K348-A380位的氨基酸的部分或全部序列的合成肽348KKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR380PSRA和该肽的盐，其功能性衍生物及其类似物，上述类似物可以通过一种或多种氨基酸的取代、增加或缺失得到的，这样，便保持了该肽的与其高正电荷密度和总体亲水特性有关的整体性质，上述肽和其盐，功能性衍生物及其类似物能够调节血浆酶原激活因子抑制剂-1(本文后称PAl-l)的生物活性，但不包括肽A341-R355K348-R361，R357-R370，H366-R379，和N371-L383。
2.根据权利要求1的肽，通过阻止PAI-1到达和抑制血浆酶原激活因子来调节PAI-1的生物活性。
3.根据权利要求1的肽，通过使PAI-1到达并抑制血浆酶原激活因子来调节PAI-1的生物活性。
4.根据权利要求1到3中任何一项的肽，其中全部氨基酸残基具有L构型。
5.根据权利要求4的肽，在此称为BP4，其氨基酸序列对应于维出那亭的S362-A380位
6.根据权利要求4的肽，在此称为BP4-1，其氨基酸序列对应于维出那亭的S362-R370位。
7.根据权利要求4的肽，在此称为BP5，其氨基酸序列对应于维出那亭的K358-R370位。
8.根据权利要求4的肽，在此称为BP6，其氨基酸序列对应于维出那亭的K348-Q263位
9.根据权利要求1到3中任何一项的肽，其中某些氨基酸残基具有D构型。
10.根据权利要求9的肽，在此称为BP7，其氨基酸序列对应于维出那亭的K348-Q363位，且在下面划线的氨基酸具有D构型348 363KKQRFRHRNRKGYRSQ
11.根据权利要求1到3中任何的一项的肽，其中全部光学活性的氨基酸具有D构型。
12.根据权利要求11的肽，在此称为BP8，其氨基酸序列对应于维出那亭的K348-Q363位
13.根据权利要求11的肽，在此称为BP14，其氨基酸序列对应于维出那亭的N356-Q363位
14.根据权利要求1或2的肽用于制备前纤维蛋白溶解的药物组合物的用途。
15.根据权利要求14的、对应于维出那亭K348-R370位的肽的用途。
16.根据权利要求7、8、10、12或13中任何一项的肽根据权利要求15的用途。
17.根据权利要求1或3的肽用于制备抗纤维蛋白溶解的药物组合物的用途。
18.根据权利要求17的、对应于维出那亭S362-A380位的肽的用途。
19.根据权利要求5或6中任何一项的肽根据权利要求17的用途。
20.根据权利要求17到19的用于制备治疗与过度纤维蛋白溶解有关的疾病如出血性疾病的药物组合物的用途。
21.根据权利要求1的肽用于制备药物组合物的用途，该药物组合物用于治疗急性心肌梗塞、深层静脉血栓形成、肺栓塞、播散性血管内凝血、肿瘤细胞侵入和迁移、炎症、肝病、细菌性血液感染、妊娠中毒，以及与血管生成的调控、或神经再生或过度tPA介导的蛋白水解有关的病理症状。
22.药物组合，该药物组合物含有合成肽，该合成肽含有包括对应于具有下式的维出那亭K348-A380位的氨基酸的部分或全部序列348KKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRR380PSRA该药物组合物含有该合成肽的盐，功能性衍生物及其类似物，上述类似物可以通过一种或多种氨基酸的取代、增加或缺失得到，这样便保持了该肽的与其高正电荷密度及总体亲水特性有关的整体性质，上述肽和其盐，功能性衍生物及其类似物能够调节PAI-1的生物活性，并且该药物含有可药用载体。
23.根据权利要求22的药物组合物，该组合物用于治疗急性心肌梗塞、深层静脉血栓形成、肺栓塞、播散性血管内凝血、肿瘤细胞侵入和迁移、炎症、肝病、细菌性血液感染、妊娠中毒，和与血管生成的调控或神经再生或过度tPA介导的蛋白水解有关的病理症状。
24.根据权利要求22的前纤维蛋白溶解药物组合物。
25.根据权利要求22的抗纤维蛋白溶解药物组合物。
全文摘要
本发明涉及维出那亭(Witronectin)分子的K
文档编号C07K7/08GK1091746SQ93116860
公开日1994年9月7日 申请日期1993年7月30日 优先权日1992年7月30日
发明者S·沙尔蒂埃尔 申请人:耶达研究及发展有限公司