用于丙型肝炎病毒分类的抗原肽,含有所述肽的药盒及用所述肽进行分类的方法

专利名称：用于丙型肝炎病毒分类的抗原肽,含有所述肽的药盒及用所述肽进行分类的方法
技术领域：
本发明涉及用于丙型肝炎病毒分类的抗原肽，含有这种肽的药盒，以及用这种肽进行分类的方法。
非甲非乙型肝炎一般叫做丙型肝炎，是一种由一种特定病毒而不是甲型或乙肝炎病毒引起的传染性肝炎，并且经常导致慢性肝炎，而随后，又以高比率发生肝硬变成肝癌，因此，这种疾病已成为严重的社会问题。由于在患者或健康携带者体内，病毒的表达量极少，并且由于不知道引起肝炎的病毒是否是以一种类型是两种或更多的类型存在。因此，它的可辨认的诊断是很困难的。直到最近，仍用所谓的“排除诊断”进行非甲非乙型肝炎的诊断，该方法包括，确定丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的增加水平;确定肝炎是否是由已知病毒如(可引起肝失调的)CMV和EBV引起的甲型肝炎，乙型肝炎或其它肝炎;最后，如果不是上述的疾病，则诊断为非甲非乙型肝炎。然而，由于其临床印象与其它病毒性肝炎相似并且与没有不正常ALT水平的健康带菌者的鉴别相象，所以很难用排除诊断法，将非甲非乙型肝炎与其它病毒性肝炎区分开。由于这些原因，很难预防通过输入健康带菌者血液引起的病毒感染，因此，可以想象，非甲非乙型肝炎占肝炎的90%以上。在日本，其患者数量达每年1百万。
为了改善这种情况，许多研究人员进行了用于诊断非甲非乙型肝炎的材料的研制。而许多研制的材料只有较低的可靠性。在这些材料中，被认为具有最高可靠性的一种材料是由在Chiron Corporation(USA)的M.Houghton等人(PCT专利申请No.WO89/04669;PCT/JP90/500880)研制的材料。Chiron Corporation已经有效地克隆了有用的病毒基因，以便了解丙型肝炎病毒(HCV，Chiron Corporation定义的)的几乎全部基因组结构，并研制出一种诊断用药盒，它含有通过表达部分HCV基因得到的抗原蛋白质。
从那时以来，在日本，用免疫筛选已经分离了许多非甲非乙型肝炎特异性的HCV基因。结果发现可以将HCV分类为HCV Ⅰ类，它与Chiron Corporation分离的HCV的核苷酸和氨基酸序列具有高度同源性;HCV Ⅱ类，具有其较低的同源性并由此认为是与HCV Ⅰ类不同的一种病毒(日本专利申请No.3-189268)。当用来自日本非甲非乙型肝炎患者的血清检测时，已证实由Chiron Corporation销售的药盒以50到70%的纸阳性率反应。因此，在流行病学方面，已经迫切需要研制具有较高精确度的诊断用试剂。
可以将上文所述的HCV分为(Chiron Corporation克隆的)Ⅰ类和(本发明人克隆的)Ⅱ类，Ⅰ类和Ⅱ类均是肝炎的传染性病原体。许多研究已经针对在病毒学和临床病理学方面两个类型的HCV在临床上彼此有怎样的连系。其实例之一是非甲非乙型肝炎的干扰素(IFN)治疗。IFN是一种抗病毒剂，据信它通过阻断HCV的后期感染可以防止肝炎的慢性症状，但已经知道，IFN对渐进性疾病如慢性肝炎和肝硬变的治疗效果只有约30%这样低，而对急性肝炎的效果较高。Miyazaki等人(The 28th Congress of the Japanese Liver Society，General Lecture No.4，Abstuact P.75，1992)用PCR技术已发现，患有丙型肝炎并IFN治疗明显有效的患者已经感染了HCV Ⅱ类。虽然使用少量的感染血清通过PCR技术可以扩增和检测HCV基因，但由于这种技术的处理很复杂，所以不能用于检测许多样品。如果研究出一种用于筛选特异性感染上HCV Ⅰ类或HCV Ⅱ类-感染的患者就可能接受早期有效的IFN治疗。上述方法可用检测感染上HCV Ⅰ类和Ⅱ类的混合感染患者。
因此，本发明一方面是提供用于分辨丙型肝炎病毒类型的抗原肽。
本发明另一方面是提供用这种肽分辨丙型肝炎病毒的方法。
本发明另一方面是提供一种用于分辨丙型肝炎病毒类型的药盒，它含有两个结合在一起的抗原肽，它们分别与HCV Ⅰ类和HCV Ⅱ类抗体发生特异性反应。
本发明另一方面是提供一种用该药盒分辨丙型肝炎病毒类型的方法。


图1表明该抗原肽C14-1，C14-1-2，C14-2和C14-2-2的氨基酸序列，以及用于检测(在HCV分类中所用的)肽片段(用实线表示)的抗原决定簇图，其中星号(★)表示C14-1和C14-1-2或C14-2和C14-2-2间的同源氨基酸。
图2表示构建C14-2-表达载体PAT、trp、trpE、C14-2的过程。
图3表示一个Western印迹图片，它表明了表达的肽trpE C14-2与丙型肝炎患者血清的抗原-抗体反应(见第二道)。对照是来自健康人的血清(见第1道)。如上文所述，通过比较其氨基酸序列间的同源性，将丙型肝炎病毒(即，HCV)大致分成Ⅰ类和Ⅱ类。在与Chiron Corporation克隆的HCV Ⅰ(参见PCT专利申请No.WO 90/11089，PCT/JP90/500880)比较的基础上，可以测定同源性，并由此将HCV分成同源性大于约80%的一类和同源性低于约80%的一类。前者称为Ⅰ类，后者称为Ⅱ类。本文中，Ⅰ类和Ⅱ类有上述定义。本文所用的术语“分类”是指将Ⅰ类和Ⅱ类区分开，或划分成Ⅰ类和Ⅱ类，并鉴别或识别是Ⅰ类还是Ⅱ类。
在过去几年间，已经分离了全长的HCV克隆并已确定了其核苷酸和氨基酸序列。结果发现可以将Ⅰ类划分成Ⅰ型和Ⅱ型，而将Ⅱ类分为Ⅲ型和Ⅳ型。例如，HCV Ⅰ型是由Chiron Corporation分离的“HCVⅠ”(参见PCT专利申请No 90/11089，PCT/JP90/500880)，HCV Ⅱ型是由Shimotono等人分离的“J”(参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA87)，9524-9528(1990))，HCV Ⅲ型是由Okamoto等人分离的“J6”(参见J.Gen.Virol.72∶2697-2704(1991))，HCV Ⅲ型是由Okamoto等人分离的“J8”(参见Virology 188∶331-341(1992))。在Ⅰ型和Ⅱ型之间或Ⅲ型和Ⅳ型之间，以氨基酸序列为基础的同源性大约是85%。
本发明人已经发现，从丙型肝炎患者的血清中克隆HCV基因，扩增所获得的DNA片段并大量表达DNA片段得到的各种肽中，存在着能与带HCV Ⅰ类或Ⅱ类的丙型肝炎患者血清发生特异性反应的抗原肽。因此，已经发现，在区别两大类时所用的肽存在于相当于在PCT/JP90/500880中所述的HCV Ⅰ-编码的多肽的，氨基酸1674到1760区域，该肽区域由沿HCV基因组的NS4区域编码。更具体地说，所发现的鉴别HCV Ⅰ类时有用的抗原肽是具有SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列的C14-1肽和具有SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列的C14-1-2肽，后面的肽与C14-1肽有关;并且所发现的鉴别HCV Ⅱ类时有用的抗原肽是具有SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列的C14-2肽和具有SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列的C14-2-2肽，后面的肽与C14-2肽有关。这些序列也相当于(Okamoto等人分离的)J6和J8基因组(Okamoto et al.，同上文)所编码多肽的氨基酸1680到1764区域。在分类中，其它有用的多肽可以是上述4种肽的片段。
因此，本发明提供了一种具有SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶2所示的氨基的序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅰ类的抗体发生特异性反应的抗原肽;和一种具有SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶4所示的氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅱ类的抗体发生特异性反应的抗原肽。
用上述肽作为抗原，可以将样品(如，血)中的HCV分为HCV Ⅰ类或HCV Ⅱ类。
根据本发明，可以将分别与HCV Ⅰ类和Ⅱ类抗体能发生特异性反应的两种抗原肽组合在一起以形成一个药盒，且这样的药盒可用于检测感染上HCV Ⅰ类和Ⅱ类的混合感染患者。
因此，本发明提供了一种用于鉴别丙型肝炎病毒Ⅰ类或Ⅱ类的药盒，它在其分开的几个部分含有至少一种第一抗原肽，该肽选自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列的肽并且能够与抗丙型肝炎病毒Ⅰ类的抗体发生特异性反应，以及与所述肽具有相同功能的肽的变异体;和至少一种第二抗原肽，该肽选自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列的肽并且能够与抗丙型肝炎病毒Ⅱ类的抗体发生特异性反应，以及与所述肽具有相同功能的肽的变异体。
本文所用的术语“具有相同功能的肽变异体”是指肽，它有至少一个不同氨基酸取代了SEQ ID NO∶1，2，3或4所示氨基酸序列或其部分序列中的组成氨基酸，提供的变异体可以与上文定义的HCV Ⅰ类或Ⅱ类抗体发生特异性反应。如在图1中C14-1和C14-1-2之间或C14-2和C14-2-2之间进行比较所见到的，氨基酸取代的实例包括具有相似化学性质的氨基酸如Ile-Val，Leu-Ile，Val-Ala，Met-Ile，Lys-Arg，Asp-Gln，等之间的取代。
可以将本发明所用的抗原肽与另一个其它的不影响与病毒抗体发生抗原-抗体反应的惰性肽融合，或将它们进行化学修饰(如，肽的N-末端的酰化作用)。抗原肽的另一实例是其抗个体基因型抗体。
有效的肽片段实例(但不限于下述的)包括具有下列序列的片段SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列中的20到44位氨基酸(在图1中称为“1-Y”)，37到62(1-2)位氨基酸或它们的组合;SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列中的20到44(1-Y)，37到62(1-Z)，53到74(1-B)，64-87(1-A)位氨基酸或其组合;SEQ ID NO∶3所示氨基酸序列中的20到44(Z-Y)，37到62(2-Z)或其组合;以及SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列中的20到44(2-Y)，37到62(2-Z)，53到74(2-B)，64-87(2-A)或其组合。本文中，术语“组合”是指至少两个片段序列如20-62，20-74导的结合。
用重组DNA技术或肽合成技术可以制备该抗原肽。
用经典的重组DNA技术制备该抗原肽的方法包括下列步骤构建一个携带DNA片段的可复制表达载体，该DNA片段编码具有SEQ ID NO∶1，2，3或4所示氨基酸序列或其部分序列的肽;
将表达载体掺入宿主细胞以得到转化细胞;
在适合于表达DNA片段的条件下培养转化细胞;和回收所需的肽。
下面是构建表达载体的实例将编码所需肽的DNA片段连接到常规质粒(如，PUC119)中，然后扩增。用两种限制内切酶双重消化所得质粒后，分离得到的DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳纯化。另一方面，用相同的内切酶双重消化适宜的表达载体如PAT.trp.trpE(参见JP-A-1-215，289)，然后用相似的方法纯化所得的载体片段。将该载体片段与上述DNA片段连接起来，得到所需的表达载体，它可以表达HCV Ⅰ类或Ⅱ类特异性抗原(参见下文陈述的实施例)。
可用的表达启动子可以来自大肠杆菌，噬菌体，病毒等，如色氨酸合成酶操纵子(trp)启动子，乳糖操纵子(lac)启动子，入噬菌体PL或PR启动子，醇脱氢酶启动子，和SV40启动子。在表达载体的DNA中可存在选择标记序列如抗生素抗性基因;复制起点;转录终止因子;核糖体结合位;等。
可使用的转化宿主细胞的实例包括一般的微生物如大肠杆菌，枯草杆菌和酵母;昆虫细胞;植物细胞;和哺乳动物细胞。优选的宿主细胞是原核生物，特别是大肠杆菌。用将表达载体掺入宿主细胞的常规方法可以完成转化。若用细菌细胞(如，大肠杆菌)作为宿主细胞，使用氯化铷(Hanhan，DNA CloningA practical approach，IRC ress(1985)或氯化钙(Mandel，M and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53∶159.162(1970))的直接掺入法是优选的。若使用高等生物细胞作为宿主细胞，则使用病毒载体的插入法是优选的。
接着，在适宜的培养基中培养携带表达载体的宿主细胞细便生产所需的肽。来自宿主细胞的抽需肽可以如下纯化声处理破碎宿主细胞后，离心分离不溶的部分，该部分含有丙型肝炎病毒cDNA编码的肽或含其它肽(如，trpE)与它的融合肽，用含脲缓冲液从该部分中溶解重组肽，然后使该肽经离了交换柱层析(如，Q-Sepharose)进行部分纯化。为了进一步纯化该…重组肽，可以使用如凝胶过滤(如;HiLoad Superdex)这样的步骤。
另外，可以用包括液相法和固相法的常规肽合成技术(参见Lectures on Biochemical Experiment I，“Protein Chemistry IVChemical modifications and Peptide syntheses，”pp.207-495，1977，ed.by the Japanese Biochemical Society)制备本发明的肽。通常，如果所需的肽是长肽，则首先在合成树脂相上合成约5到10个氨基酸组成的小肽。然后按顺序或一步一步的方式彼此连接，并在去保护作用后，得到所需的肽。
按上述方法制备的本发明肽一般在真空或冻干法干燥后以固体形式贮存在黑暗寒冷的房间中。若以药盒形式包装，则将对HCV Ⅰ类抗体特异性的抗原肽和对HCV Ⅱ类抗体特异性的抗原肽各自放在药盒的分开的部分。这些分开部分的例子是玻璃或树脂制造的带盖小瓶和安瓶，微滴定盘，等。优选的分开部分形式是将每种肽吸附(或结合)到可以通过适宜的方法冷冻而稳定的，用于ELISA的微滴定盘上的小孔上，以便使肽保持与HCV抗体的结合能力。可以用用于聚集作用的试管，小珠和支持物(如红细胞)代替微滴定盘。在本发明的药盒中，可以含有免疫分析必需的下列试剂缓冲液;酶-标记的或放射性标记的第二抗体;显色剂;免疫反应终止剂;等。表1到4表明下列多肽与临床上已诊断为丙型肝炎的患者的血清的免疫反应的EIA结果trpE.C14-1，trpE C14-1-2，trpE C14-2，trpE.C14-2-1(由SEQ ID NO∶3中的氨基酸残基23到63组成)或trpE C14-2-2，结果说明，trpE.C14-1和trpE C14-1-2可以特异性地鉴别HCV Ⅰ类，而trpE.C14-2，trpE C14-2-1，trpE和C14-2-2可特异性地鉴别HCV Ⅱ类。
表5，6和7表示能与HCV Ⅰ或Ⅱ类特异性反应的本发明肽片段与各种丙型肝炎患者血清发生免疫反应的EIA结果。表5、6和7的结果说明患者只感染上了HCV Ⅰ类，或HCV Ⅱ类，或HCV Ⅰ和Ⅱ类均感染。市场上可购买到的丙型肝炎诊断试剂，Immucheck-HCV(ex International Reagents Corporation，Hyogo，Japan)作为比较试剂不能将HCV Ⅰ类与HCV Ⅱ类区分开。因此，本发明提供一种区别丙型肝炎病毒类型的方法，它包括将具有SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列的抗原肽与假定含抗HCV抗体的样品接触以便进行免疫反应;和检测作为阳性的属Ⅰ类的抗HCV抗体。若使用具有SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列的抗原肽，则抗HCV Ⅱ类抗体可作为阳性被检测，因此，这种分类方法也包括在本发明范围内。
本发明还涉及上述药盒的使用。因此，本发明提供一种区分丙型肝炎病毒类型的方法，该方法包括将至少一种(选自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅰ类的抗体发生特异性反应的第一肽，和与所述肽具有相同功能的肽变异体，以及至少一种(选自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅱ类的抗体发生特异性反应的)第二肽，和与所述肽具有相同功能的肽变异体，逐一与假定含丙型肝炎病毒抗体的样品接触，通过免疫反应定量或定性地确定抗体的第一和第二肽包含在上面所定义的药盒中;和检测丙型肝炎病毒Ⅰ或Ⅱ类抗体。
可用的免疫检测法是本领域常规使用的适当技术，如Western印迹分析，酶免疫检测，免疫沉淀，和放射性免疫检测。根据所用检测方法的类型来适当选择测量条件(见下文所述的实施例)。样品一般是血液，特别是血清。
实施例1构建C14-1和C14-1-2表达质粒用RT-PCR方法克隆HCV抗原-编码的DNA为了从慢性丙型肝炎患者的血清中克隆HCV基因，使用RT(反转录酶)-PCR技术，其中仅用少量血浆就可以完成克隆。
首先将100μl丙型肝炎患者的血清加到200μl 6MGTC溶液(6M 硫氰酸胍，37.5mM柠檬酸钠，0.75%Sarkosyl，0.2Mβ-巯基乙醇)和1μl酵母t-RNA(10mg/ml)中并搅拌。将20μl 3M乙酸钠(pH 5.2)，30μlTE-饱和的苯酚(pH 7.5-8.0)和70μl氯仿/异戊醇(49∶1)迅速加到所得的混合物中，搅拌10秒钟，并在冰上放15分钟。在4℃以15，000离心20分钟后，移出含水层，并将其与等体积异丙醇混合，在20℃放置至少1小时。在相同条件下进一步离心后，回收沉淀，然后将其溶解在100μl 4MGTC(用无菌水稀释6MGTC)中，与等体积异丙醇混合并在20℃放置至少1小时。在4℃以15，000离心20分钟后，回收RNA沉淀用70%乙醇(1ml)洗涤，室温下空气干燥，并将其溶解在10μl无菌水中。以后将使用该RNA溶液。
按下列步骤完成HCV cDNA合成将10μl RNA溶液放在硅酮处理的试管(0.5ml)中，在70℃加热3分钟，并在冰上猝冷。然后，将1μl RNase抑制剂(50单位/μl);ex Takara Shuzo)，1μl dNTPs(各20mM)，100mM DTT，4ml 5XRT缓冲液(250mM Tris-HCl(pH85，375mM kCl，15mM MgCl2)，1μl随机的寡门聚引物(100皮摩尔/μl)和反转录酶(BRL)(200单位/μl)加到溶液中，并将灭菌水加到混合物中以达到20μl的总体积。在42℃用2小时完成HCV cDNA合成。然后在94℃，将混合物加热5分钟以使酶失活。
按下列步骤用得到的cDNA完成PCR所用的PCR是一个两步法，其中首先用两个引物完成第一步PCR，然后，用存在于第一个PCR产物DNA序列中的两个引物完成第二步PCR。用这种方法，可以提高所检测DNA的扩增敏感性和特异性。
为了扩增C14-1区域，参阅已知序列(Pro.Natl.Acad.Sci.USA 87，9524-9528，1990)合成下列引物第1步PCR中所用的引物5S15′-AGGTCGTCACTAGCACCTGGGTGC-3′(SEQ ID NO∶10);和5A15′-TGTATCCCGCTGATGAAGTTCCAC-3′(SEQ ID NO∶11);
第2步PCR中所用的引物5S25′-GAATTCACGACAGGCAGCGTGGTC-3′(SEQ ID NO∶12);和5A25′-CTATTACAGCAATCCGAGCGCCCT-3′(SEQ ID NO∶13)。
在一个0.5ml试管中，放入用于合成cDNA的20μl反应溶液，8μl10×PC缓冲液(100mM.Tris-HCl(pH 8.3)，500mMKCl，15mM MgCl2，0.1%明胶)，两种第1步引物(各75皮摩尔(pmole))和8μl 2mM dNTPs。然后将灭菌水加到该混合物中以达到100μl的总体积。在94℃加热10分钟后，将1μl AmpliTaq(5单位;ex Perkin-Elmer-cetus)边搅拌边加到混合物中，在粗离心前，将矿物油覆盖在混合物溶液上。PCR的条件是变性94℃1分钟;退火55℃ 1分钟;延伸72℃，2分钟;以及30个循环。在清洁的0 5ml试管中，放入10μl PCR反应混合物9μl10×PCR缓冲液，两种第2步PCR引物(各75皮摩尔)和9μl 1mM dNTPs，并将灭菌水加到该混合物中以达到100μl的总体积。在94℃加热10分钟后，将1μl Ampli Taq(5个单位)边搅拌边加到该混合物中，并在粗离心前将矿物油覆盖在混合溶液上。在与第一步PCR相同的条件下，完成第二步PC。反应后，用琼脂糖凝胶电泳，分析反应混合物，用该方法也可以检测特异性扩增的DNA片段。
用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离径PCR扩增的C14-1 DNA片段(约200bp)。在68℃，将含该DNA片段的凝胶在200μl的灭菌水中溶解15分钟。用TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)-饱和的苯酚将溶液提取两次以便分离含DNA片段的含水层。使含水层经乙醇沉淀以得到DNA片段沉淀，然后将2μl10×激酶缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH 7.6，0.1M MgCl2，50mM DTT，1mM亚精胺，1mM EDTA pH 8.0)，1μl 10mMATP.和1μl T4激酶(10个单位/μl;ex Takara Shuzl)加入其中，随后加入无菌水以得到20μl的总体积。使混合物在37℃反应1小时，进行5′末端磷酸化。在68℃加热10分钟使激酶失活后，将反应混合的与pUC119(Vieira，J.and Messing，J.，Methods in Enzymolgy，153，3-11(1987))连接。将pUC119(1μg)于37℃，在20μl限制反应溶液(10mM Tris-HCl pH 8.0，7mM MgCl2，20mM KCl，10个单位的SmaI酶(ex Takara Shuzo))中预先消化1小时，然后，加80μl灭菌水后，将反应混合物在68℃加热10分钟，以便得到SmaI克隆载体溶液。在2μl10×缓冲液(0.66M Tris-HCl pH 7.6，50mM Mgcl2，50mM DTT)，1μl 10mM ATT，1μl T4激酶(350个单位/μl;ex Takara Shuzo)和4μl灭菌水中，于16℃过夜完成10μl磷酸化DNA片段与2μl SmaI载体的连接反应。
将10μl的连接反应混合物转化到大肠杆菌菌株JM109中。预先用氯化钙方法(Madel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.53，159-162(1970))制备感受态大肠杆菌菌株。
然后将转化的大肠杆菌在37℃，在加入了50μ12%X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)和10μl 100mM IPTG(异丙基-β-D_硫代吡喃半乳糖苷)的LB-Amp盘(1%胰胨，0 5%酵母提取物，0.5%NaCl，1 5%琼脂，氨苄青霉素(20μg/ml)上培养过夜。挑取-铂环在盘上产生的白色菌落，并将其在含25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl)中在37℃振荡培养过夜。将1 5ml培养物离心，收集细胞菌细胞，使它随后按碱溶解法(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，1982)小量制备以得到质粒DNA。将1μg得到的质粒DNA在37℃用30μl限制反应溶液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，7mM MgCl.2，各10个单位的EcoRI和Hind Ⅲ(ex Takara Shuzo)消化1小时，使消化物用琼脂糖凝胶电泳经大小分析以确定约250bp的插入DNA片段。将含该插入DNA片段的克隆命名为pUC.C14-1。用Sanger′s双脱氧链末端方法(Sanger，F.，Sciencl，214，1205-1210(1981))测定C14-1 DNA片段的核苷酸序列，用这种方法也可确定推测的氨基酸序列。在SEQ ID NO∶1和5中分别列出了确定的氨基酸与核苷酸序列。
为了从NS3的后半部到NS5的前半部中分离基因组HCV RNA区域(称为C6.2)，除使用下列引物外，按与上述相同的方法完成RT-PCR在第一步PCR中所用的引物KK15′-GGCTATACCGGTGACTTTGA-3′(SEQ ID NO∶14);
和A65′-GTCTCAGCTCCCTTCCGATC-3′(SEQ ID NO∶15);
在第二步PCR中所用的引物KK5-GATCTACTGCTAACACATGTGTCA-3′(SEQ ID NO∶16);和A6(见上文)反应后，回收扩增的片段，然后，按上述方法插入到PBM载体(见下文)中以生产C6-2。
在50μl的总体积中，将1ng作为模板的C6-2与各50皮摩尔的引物(5′-GCGAATTCACAACAGGCAGTGTGGTCATT-3′(SEQ ID NO∶17)和5′-GCTCATTAGAAGGTCTCAAGGGCT-CGCCA-3′(SEQ ID NO′18))，67mMTris-HCl(pH 8.8)，16.6mM(NH4)2SO4，0.2mM dNTPs，2mM MgCl2，0.2mg/ml明胶，0.05%Triton X.100混合，再将2.5单位的Taq DNA聚合酶加到混合物中。覆盖了石蜡油后，进行C6-2片段的PCR(94℃ 30秒，55℃ 60秒，72℃ 120秒，30个循环)。反应混合物经琼脂糖凝胶电泳以分离约260bp的片段，随后用Glass粉方法(Gene Clean Ⅱ;ex BIO101)将其回收到50μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，(pH 7.5)，1mM EDTA)中。将3μl 10×T4缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，100mM DTT)，3μl 2mM dNTPs，3μl ATP，加到所回收的DNA溶液(25μl)中。然后再将5单位的DNA聚合酶I(ex New England Biolab)和10个单位的T4多核苷酸激酶(ex Takar a Shuzo)加到混合物中以便在37℃反应1小时。用Glass粉方法，将所需的DNA片段回收到25μl TE溶液中。
另一方面，在20μl的限制系统(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，7mM MgCl
2，20mM KCl，10个单位的smaI)中，经限制反应，将1μg的PTTT3 19U(exPharmacia)在37℃裂解1小时。将10μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)，70μl灭菌水，2个单位的细菌碱性磷酸酶(ex Takara Shuzo)加到反应混合物中以便在68℃反应30分钟。反应后，用苯酚/氯仿提取溶液中的DNA，然后用乙醇沉淀。将回收的DNA(10μl)溶解在10ml TE缓冲液后，将1μl该溶液与10μl上述的PCR DNA片段混合，然后加入50μl的Ligation液A和10μl Liagtion液B(DNA Ligation kit;ex Takara Shuzo)，混合均匀以便在16℃反应1小时。将10μl得到的DNA溶液按Hanahan′s方法(DNA cloningA practical approach(D.M.Glover编著)，vol.1，9，109，IRC印刷(1985)转化到大肠杆菌菌株XL1-blue(ex Stratagene)中。所得的克隆是质粒DNA的，该质粒DNA来自可用EcoRI和SalI裂解以产生一个约290bp片段的转化细胞。已发现，分离的DNA片段具有SEQ ID NO∶6所示的核苷酸序列，并编码具有SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列的肽(即，C14-1-2)。
构建表达载体
1μl pUC.C14-1 DNa在20μl限制溶液(100mM Tris-HCl(pH 7.5)，50mM NaCl，7mM MgCl2，各10个单位的EcoRI和BamHI(ex Takara Shuzo))中，于37℃消化1小时，并使其经低熔点琼脂糖凝胶电泳以制备约200bp纯化的DNA片段。另一方面，在相同条件下处理1μg的表达载体pAt.trp.trpE DNA(JP-A-1-215，289)以得到载体DNA片段。在含350单位T4连接酶(ex Takara Shuzo)的5μl 10X连接酶缓冲液(660mM Tris-HCl(pH 7.5)，66mM MgCl2，100mM二硫苏糖醇(DTT)，10mM ATP)加水到50μl的总体积中，将所得的EcoRI-BamHI处理的载体DNA(1μg)与上述制备的C14-1 DNA片段在16℃过夜连接。
将所得的10μl反应混合物转化到大肠杆菌菌株C600中。用氯化钙(Mandel，M.and Higa，A.J.Mol.Biol.(53，159-162(1970))制备用于转化的感受态大肠杆菌菌株。将转化细胞放大含25μg/ml氨苄青霉素的LB-盘(1胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%琼脂)上，并在37℃贮存过夜。挑取1铂环平盘上产生的菌落，并在含25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。将所得的培养物(1.5ml)离心以便收集细胞细胞用碱溶解方法(Maniatis et al.，上文)小量制备质粒DNA。
用EcoR I和BamHI双重消化所得的DNA(1μg)，在消化产物中筛选表达质粒pAT.trp.trp.trpE C14-1，从中得到约200bp的EcoRI-BamHI片段。
用相似的方法，从中可得到约290bp EcoRI-SalI片段的表达质粒pAT.trp.trpE C14-1-2，可以从pUC.C14-1-2 DNA构建。
实施例2构建C14-2表达载体克隆编码HCV抗原的DNA按下列步骤，用PCR引物5′-GAATTCGCGACCGGCTGCATTTCC-3′(SEQ ID NO∶19)CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT-3′(SEQ ID NO∶20)完成被认为是HCV Ⅱ类的克隆C10-14(FERM P-3426;Japanese Patent Application No.3-189，268)的PCR。将C10-14克隆DNA(1ng)加到10μl 10×PCR缓冲液(0.1M Tris-HCl(pH 8.3)，0.5M KCl)，两处引物(各75皮摩尔)和10μl 2mM dNTPs中，并再将灭菌水加到混合物中以达到100μl的总体积。在94℃加热10分钟后，将1μl AmpliTaq(5个单位/μl;ex Perkin-Elmer-Cetus)加到混合物中，接着将两滴矿物油覆盖在混合物上。PCR条件是变性94℃1分钟;退火55℃ 1分钟;延伸72℃ 2分钟;30个循环。
用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增的C14-2片段(约200bp)，将含DNA片段的凝胶在200μl灭菌水中在68℃溶解15分钟。用TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)-饱和的苯酚将溶液提取两次以分离含DNA片段的含水层。使含水层经乙醇沉淀以得到DNA片段沉淀，然后加入2μl的10×激酶缓冲液(0.5M Tris-HCl pH 7.6，0.1M MgCl2，50mM Dtt，1mM亚精胺，1mM EDTA pH 8.0)，1μl 10mM ATP和1μl T4激酶(10个单位/μl;ex Takara Shuzo)，随后，再向其中加入灭菌水以达到20μl的总体积。将混合物在37℃反应1小时进行5′末端磷酸化。在68℃加热10分钟使激酶失活后，将反应混合物与pUC119(Vieira，J.and Messing，J.，Methods in Enzymology，153，3-11(1987))连接。将pUC119(1μg)，20μl限制反应溶液(10mM Tris-HCl pH 8.0，7mM MgCl2，20mM KCl，10个单位的Sma I酶(ex Takara Shuzo))中于37℃预先消化1小时，加入80μl灭菌水后，将反应混合物在68℃加热10分钟，以便得到SmaI克隆载体溶液。在2μl10×缓冲液(0.66M Tris-HCl pH 7.6，50mM MgCl2，50mM DTT)，1μl 10mM ATT，1μl T4连接酶(350单位/μl;ex Takara Shuzo)和4μl灭菌水中，于16℃使10μl磷酸化DNA片段与2μl SmaI载体的连接反应进行过夜。
将10μl的连接反应混合物转化到大肠杆菌菌株JM109中。用氯化钙方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.53，159-0162(1970))预先制备感受态大肠杆菌菌株。
然后将转化的大肠杆菌，在加上50μl 2% X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)和10μl 100mM IPTG(异丙异-β-D_硫代吡喃半乳糖苷的LB-Amp盘(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%琼脂，氨苄青霉素(25μg/ml))上在37℃培养过夜。挑取1铂环盘上产生的白色菌落，并含25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl)上于37℃振荡培养。将1.5ml培养物离心，以收集细胞细胞，然后使其按碱溶解法(Maniatis et al.，上文)小量制备，从而得到质粒DNA。将得到的1μg质粒DNA在30μl限制反应溶液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM Nacl，7mM MgCl2，各10单位的EcoRI和Hind Ⅲ(ex Takara Shuzo))中于37℃消化1小时，并将消化物用琼脂糖凝胶电泳进行大小分析以确定约250bp的插入DNA片段。含插入DNA片段的克隆被称为pUC.C14-2。用Sanger′s双脱氧链末端法(Sanger，F.，上文)测定C14-2 DNA片段的核苷酸序列，用该方法，也可确定其推测的氨基酸序列。SEQ ID NO∶3和7分别表示了确定的氨基酸和核苷酸序列。
除用5′-GAATTCCCTGATAAGGAAATTTTA-3′(SEQ ID NO∶21)和5′-CTATTATAAGAGGCCTTGATATTTT-3′(SEQ ID NO∶22)作引物外，按上文描述的克隆方法制备含约140 bp C14-2-1 DNA片段的克隆，该克隆命名为pUC.C14-2-1。该C14-2-1 DNA片段编码具有SEQ ID NO∶3所示氨基酸序列中23到63位序列的肽。
构建表达质粒用与实施例1中相似的方法，用pUC.C14-2 DNA作为起始材料构建从中可制备约200bp EcoRI-BamHI DNA片段的表达质粒pAT.trp.trpE.C14-2。图2中列出了构建过程。用相似的方法，从pUC.C14-2-1 DNA也可构建表达质粒pAT.trp.trpEC14-2-1。
实施例3构建C14-2-2表达质粒克隆编码HCV抗原的DNA使用RT-PCR技术从慢性丙型肝炎患者的血清中克隆HCV基因。
首先将100μl丙型肝炎患者的血清加到200μl 6M GTC溶液(6M 硫氰酸胍，37.5mM柠檬酸钠，0.75% Sarkosyl，0.2Mβ-巯基乙醇)和1μl酵母t-RNA(10mg/ml)中并搅拌。将20μl 3M 乙酸钠(pH5.2)，30μl TE-饱和的苯酚(pH 7.5-8.0)和70μl氯仿/异戊醇(49∶1)迅速加到所得的混合物中，搅拌10秒钟，并在冰上放置15分钟。4℃以15，000rpm离心20分钟后，移出含水层，与等体积的丙异醇混合，并在-20℃放置至少1小时，在相同的条件下再次离心后，回收沉淀，然后将其溶解在100μl 4M GTC(用灭菌水稀释6M GTC)中，与等体异丙醇混合，并在-20℃放置至少1小时。4℃以15，000rpm离心20分钟后，回收RNA沉淀，用70%乙醇(1ml)洗涤，室温下空气干燥，并溶解在10μl灭菌水中。该RNA溶液待用。
按下列步骤完成HCV cDNA合成将10μl RNA溶液放在硅酮处理的试管(0.5ml)中，在70℃加热3分钟，并在冰上猝冷。然后对该溶液加入1μl RNase抑制剂(50单位/μl;ex Takara Shuzo)，1μl dNTPs(各20mM)，100mM DTT，4μl 5×RT缓冲液(250mM Tris-HCl(pH 8.5)，375mM KCl，15mM MgCl2)，1μl随机的寡六聚引物(100皮摩尔/μl)和反转录酶(BRL)(200单位/μl)，并将灭菌水加到混合物中以达到20μl的总体积。在42℃经2小时完成HCV cDNA合成。然后将反应混合物在94℃加热5分钟以便使酶失活。
用如实施例1中所述的两步法进行PCR。
为了扩增含C14-2-2区域的HCV NS4区域，参考已知序列(J.Gen.Virol.72∶2697 2704(1991))合成下列引物在第一步PCR中所用的引物5′-GGATCACCGGTGACTTTGA-3′(SEQ ID NO∶23);和5′-CCCCAAAATGTTGAGAAGGATA-3′(SEQ ID NO∶24);
在第二步PCR中所用的引物5′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3′(SEQ ID NO∶);和5′-GTGCTAGTTGACAACGGACTGGT-3′(SEQID NO∶26)。
在一个0.5ml试管中，放入用于cDNA合成的20μl反应溶液。8μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2，0 1%明胶)，两种第一步引物(各75皮摩尔)和8μl 2mM dNTPs，然后将灭菌水加到混合物中以达到100μl的总体积。在94℃加热10分钟后，将1μl Ampli Taq(5单位;ex Perkin-Elmer-Cetus)边搅拌边加到混合物中，在粗离心，前将矿物油覆盖在混合溶液上。PCR的条件是变性94℃1分钟;退火55℃1分钟;延伸72℃，2分钟;30个循环。在一个清洁的0.5ml试管中，放入10μl PCR反应混合物，9μl 10×PCR缓冲液，两种第2步PCR引物(各75皮摩尔)和9μl 1mM dNTPs，并将灭菌水加到混合物中以达到100μl的总体积。在94℃加热10分钟后将1μl AmpliTaq(5单位)随搅拌加到混合物中，在粗离心前，将矿物油覆盖在混合溶液上。在与第一步PCR相同的条件下完成第二步PC。反应后，用琼脂糖凝胶电泳分析10μl反应混合物，用该方法也可检测特异性扩增的DNA片段。
用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离经PCR扩增的C14-8 DNA片段(约700bp)，在68℃，将含DNA片段的凝胶在200μl灭菌水中溶解15分钟。用TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)-饱和的苯酚将该溶液提取两次以分离含DNA片段的含水层。经乙醇沉淀含水层以得到DNA片段沉淀，然后在沉淀中加入2μl 10×激酶缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH 7.6，0.1M MgCl2，50mM DTT，1mM亚精胺，1mM DETA pH 8.0)，1μl 10mM ATP和1μl T4激酶(10单位/μl;ex Takara Shuzo)，随后向其中加入灭菌水以达到20μl的总体积。将混合物在37℃反应1小时进行5′末端磷酸化。在68℃加热10分钟使激酶失活后，反应混合物与pBM(参见下文;Japanses Patent Application No.4.207，391申请日1992，7，10)连接。将pBM(1μg)在20μl限制反应溶液(10mM Tris-HCl pH 8.0，7mM MgCl2，20mM KCl，10个单位的SmaI酶(ex Takara Shuzo))中于37℃预先消化1小时，在加入80μl灭菌水后，将反应混合物在68℃加热10分钟以得到SmaI克隆载体溶液。在2μl 10×缓冲液(0.66M Tris-HCl pH 7.6，50mM MgCl2，50mM DTT)，1μl 10mM ATT，1μl T4连接酶(350单位/μl;ex Takara Shuzo)和4μl灭菌水中，于16℃过夜完成10μl磷酸化DNA片段与2μl SmaI载体的连接反应。
可以按下列步骤构建pBM载体用EcoRV和BalI从pB322(Sutchliffe，J.G.，Cold Spring Harbor Symposium，43，77-90(1979))中删除EcoRV-BalI｜列(1259bp)。将pUC119多克隆位点(Vieria，J.and Messing，J.，Methods in Enzymology，153，3.11(1987))的EcoRI-Hind Ⅲ掺入pBR322片段的EcoRI-Hind Ⅲ中以产生质粒△pBR Mcs，其中，具有Pst Ⅰ缺失的pUC 119的VspI-ScaI序列取代了pBR322的VspI-ScaI序列，以便产生所需的pBM载体(3122bp)，所述的PstI存在于pBR322的VspI-ScaI中。在pBM中，存在限制位点PstI36，Hind Ⅲ49，Vsp I2298，ScaI2605和EcoRI3120，带有一个氨苄青霉素抗性序列(Amp)和一个复制起点(Ori)。
然后，将所得的10μl连接反应混合物转化到大肠杆菌菌株JM109中。用氯化铵法(Hanahan，DNA CloningA Practical approch，IRC Press(1985))预先制备感受整大肠杆菌菌株。
然后在LB-Amp平盘(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%琼脂，氨苄青霉素(50μg/ml)上将转化的大肠杆菌于37℃培养过夜。挑取一铂环盘上产生的白色菌落，并在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl)上于37℃振荡培养过夜。将1.5ml的培养物离心以便收集细菌细胞，按碱溶解法(Maniatis et al.，上文)小量制备，得到质粒DNA。将1μg得到的质粒DNA在30μl反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，7mM MgCl2，各10个单位的EcoRI和Hind Ⅲ(ex Takara Shuzo))中于37℃消化1小时，将消化物用琼脂糖凝胶电泳进行大小分析以确定约700bp的插入DNA片段。将含插入DNA片段的克隆命名为p C14-8。用Sanger′s双脱氧链末端方测定C14-8 DNA片段的核苷酸序列，用该方法也可以确定其推测的氨基酸序列。在SEQ ID NO∶9中列出了确定的氨基酸和核苷酸序列。
为了从C14-8 DNA制备C14-2-2DNA片段，除使用下列引物外，按与上述相同的方法完成PCR5′-GCGAATTCGCGACCGGGTGTGTTTCCAT-3′(SEQ ID NO∶27);和5′-TCATTAGAACTGCTCCACCTTGGGCCA-3′(SEQ ID NO∶28)。
在50μl的总体积中，将1ng作为模板的Cl4-8 DNA与各50皮摩尔的上述引物、67mM Tris-HCl(pH 8.8)、16.6mM(NH4)2SO4、0.2mM dNTPs;2mM MgCl2;0.2mg/ml明胶;及0.05%Triton x-100混合，然后再将25单位的Taq DNA聚合酶加到混合物中。覆盖了石蜡油后，进行PCR(94℃30秒，55℃60秒，72℃120秒，30个循环)。将反应混合物经琼脂糖凝胶电泳以分离一个约260bp片段，随后用Glass粉法(Gene Clean Ⅱ;ex BIO101将该片段回收到TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA)中。将3μl 10×T4缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 7.5)，100mM MgCl2，100mM DTT)，3μl 2mM dNTPs，和3μl ATP加到回收的DNA溶液(25μl)中，然后，再将5个单位的DNA聚合酶Ⅰ(ex New England Biolab)和10个单位的T4多核苷酸激酶(ex Takara Shuzo)加到混合物中以便在37℃反应1小时。用Glass粉法将所需的DNA片段回收到25μl TE溶液中。
另一方面，将1μg pUC118(Vieira，J.，上文)在20μl限制系统(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，7mM MgCl2，20mM KCl，10个单位的SmaI)中，于37℃通过限制反应进行裂解1小时。将10μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)，70μl灭菌水和2个单位细胞碱性磷酸酶(ex Takara Shuzo)加到反应混合物中以便在68℃反应30分钟。反应后，用酚/氯仿提取溶液中的DNA，然后用乙醇沉淀。将回收的DNA(10μl)溶解在10ml TE缓冲液后，将1μl溶液与10μl上述的PCR DNA片段混合，然后向其中加入50μl Ligation液A和10μl Ligation液B(DNA Ligation Kit;ex Takara Shuzo)，混合均匀以便在16℃反应1小时。按Hanahan′s方法(Hanahan，同上文)，将10μl所得的DNA溶液转化到大肠杆菌菌株XL1-blue(ex Stratagene)中。
从所得的克隆中回收重组质粒DNA。然后，按循环定序法(参见Technical manual made by Applied Biosystems)，使1.5μg质粒DNA在M13RP1引物(ex Applied Biosystems)或-21M13引物(ex Ammlied Biosystems)存在的情况下反应。在DNA Sequencer Meddl 370A(versionl.30;ex Applied Biosystems)上分析反应产物以确定其SEQ ID NO∶8所示的核苷酸序列。该DNA片段(C14-2-2)编码具有SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列的肽。
构建表达载体
在20μl限制溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM NaCL，7mM MgCl2，各10个单位的EcoRI和SalI(ex Takara SHuzo))中，将1μg pUC.C14-2-2 DNA在37℃消化1小时，随后进行琼脂糖凝胶电泳和Glass粉法以纯化所需的DNA。另一方面，在相同的条件下处理1μg的表达载体pAT.trp.trpE DNA(JP-A-1-215，289)以得到载体DNA片段。将所得的EcoRI-SalI处理的载体DNA(1μg)与上述制备的C14-2-2 DNA片段用DNA连接药盒(ex Takara Shuzo)按制造商说明的方法，在16℃连接1小时。
将所得的10μl反应混合物转化到大肠杆菌菌株C600中。用Hanahan′s方法(Hanahan，同上文)制备用于转化的感受大肠杆菌菌株。将转化细胞放在含50μg/ml氨苄青霉素的LB盘(1%胰胨，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl，1.5%琼脂)上，在37℃过夜贮存。挑取-铂环盘上产生的菌落并在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上在37℃培养过夜。将所得的培养物(1.5ml)离心以收集细菌细胞，并用碱溶解法(Maniatis et al.，上文)小量制备质粒DNA。
用EcoRI和SalI双重消化所得的DNA(1μg)。并在消化物中筛选可产生一个约260bp EclRI-SalI片段的表达质粒pAT.trp.trpE C14-2-2。
实施例4表达并纯化由C14-1，C14-1-2，C14-2，C14-2-1，和C14-2-2DNA片段编码的肽将携带各5个在实施例1到3中构建的表达质粒的大肠杆菌C600细胞接种到含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上，并在其中，于37℃进行次培养过夜。将该培养物再接种到4升的M9-CA培养基(0.6% Na2HPO4，0.5%KH2PO4，0.5%NaCl，0.1%NH4Cl，0.1mM CaCl2，2mM MgSO4，0.5%酪蛋白氨基酸，0.2%葡萄糖)上并于37℃培养。当OD600达到0.3时，将吲哚丙烯酸加到培养中以达到40ml/l的最终浓度，并再继续培养16小时，离心该培养的收集12克菌细胞。将60ml的溶解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，30mM NaCl，5mM EDTA)加到细胞中，然后将12mg的溶菌酶(ex Seikagaku Kogyo KK)加到混合物中以便在37℃反应1小时。声处理150秒破碎了大肠杆菌细胞后，在4℃，以15，000rpm经15分钟完成离心以分离含融合肽的不可溶部分，所述融合肽由所需DNA和trepE编码的肽组成。将55ml溶解缓冲液(4M脲，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1%NP-40)加到该部分，以便提取融合肽。
将脲和DTT加到提取物中，使其分别达到6M和50mM的最终浓度。在4℃放置至少1小时后，将混合物用于，用含6M脲和5mM DTT的50mM Tris-HCl(pH 8.5)平衡的Mono柱(ex Pharmacia)。然后用OM到0.2M的梯度NaCl从柱上洗脱所需的肽。收集洗脱的部分，并将其用于用含6M脲，0.15M NaCl和5mM DTT的50mM Tris-HCl(pH 85)平衡的HiLoad Superdex75pg柱(ex Pharmacia)以纯化融合肽。
用上述方法，可得到下列物质trp.C14-1(Mr.约8KDa);trpE.C14-1-2(Mr.约11KDa);trpE.C14-2(Mr.约10KDa);trpE.C14-2-1(Mr.约6KDa);和trpE.C14-2-2(Mr.约11KDa)实施例5制备C14-1，C14-1-2，C14-2和
C14-2-2肽片段按Fast Moc系统的附加说明，用Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A(ex Applied Biosystems)合成肽片段。合成结束时，用常规方法完成去保护作用和去树脂，接着用HPLC纯化肽片段。
收集所需的峰值部分，并用氨基酸分析仪JLC-300(ex JEOL LTD)分析其氨基酸内含物或用蛋白质测序仪Model 477A(ex Applied Biosystems)分析氨基酸序列以便确认是所需的肽。
实施例6检测丙型肝炎患者血清中的HCV抗体(ⅰ)用Western印迹分析检测HCV抗体使表达的肽trpE.C14-2(1μg)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Laemmli，Nature 227，680(1970))，并转移到硝化纤维素滤器(ex Bio-Rad)上。将滤器在阻断溶液(4% Block-Ace(ex Snow Brand Nilk Products Co.)，2%BSA，0.1M磷酸钠(PH7.4))中室温下浸1小时。此后，将滤器上的肽与健康人和丙型肝炎患者的血清(以1/100稀释的)在室温下反应1小时。用洗涤溶液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，500mM NaCl，0.05% Tween-20)洗涤滤器后，使滤器与过氧化物酶标记的山羊抗-人IgG(以1/1000稀释的)在室温反应30分钟。再次洗涤后，将滤器浸在二氨基联苯胺(作为底物)溶液中。一旦发生了颜色显色，将滤器浸在纯水中停止反应。
如图3所示，表达的肽与患者的血清强烈反应，但与健康人的血清不反应，因此，在Western印迹滤器上可将肽检测为特异性的带。
(ⅱ)用酶-免疫检测(ELISA)(A)鉴别HCV类型通过使用融合肽trpE.C14-1，trpE.C14-1-2，trpE.C14-2，trpE.C14-2-1和trpE.C14-2-2进行ELISA来检测日本慢性丙型肝炎患者各种血清的HCV类型。以常规方法按如下步骤完成ELISA用含8M脲的0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)稀释纯化的抗原使成为5μg/ml的最终浓度。然后在4℃或室温，将其固定在微量培养板上。用洗涤溶液洗涤数次后，将检测的血清放在盘上的孔中，并在30℃或室温培养1小时。洗涤后，将过氧化物酶标记的抗一人IgG(小鼠单克隆抗体)加到每个孔中以便在30℃或室温下反应。将盘洗涤数次，接着加入50μl的正苯二胺溶液使其在37℃发生变色反应。随后加入2M H2SO4停止颜色的加深并用比色器确定其在492nm的吸收值。同时，用相同方法测定作为对照的健康人血清，并用市场上可购到的Chiron药盒C10-3(ex Ortho)作对比。在表1，2，3和4中列出了结果。
表1，2，3和4表明，融合肽trpE.C14-1和trpE.C14-1-2都可以特异性地认别HCV Ⅰ类的抗体，而融合肽trpE.C14-2，trpE.C14-2-1和trpE.C14-2-2可特异性认别HCV Ⅱ类抗体。另外，结果说明，若C14-1和/或C14-1-2肽与C14-2和/或C142-1和/或C14-2-2肽结合在一起使用时，在确定丙型肝炎患者是否仅仅感染上HCV Ⅰ类或HCV Ⅱ类还是HCV Ⅰ和Ⅱ类均被感染时，所用的肽是很有用的。
表1样品NO. trpE. C14-2 Chiron Kit(C100-3)(Ⅱ类) (Ⅰ类)1 + -2 + -3 + -4 + -5 - +6 + -7 - +8 + -9 - +10 + -11 + -12 - +13 - +14 - +15 - +阴性对照 - -
表2样品NO. trpE. C14-2-1 trpE. C14-2(Ⅱ类) (Ⅱ类)16 + +17 - -18 + +19 - -20 - -21 + +22 - -23 - -24 - -25 - -26 + +27 - -阴性对照 - -
表3样品NO. trpE. C14-1 trpE. C14-2(Ⅰ类) (Ⅱ类)28 - +29 + -30 + -31 + -32 + -33 + -34 + -35 + -36 + -37 - +38 + -39 + -40 - +41 + -42 - +43 + -44 + -45 + -46 + +47 - -阴性对照 - -
(ⅲ)用ELISA(B)鉴别HCV类型通过使用trpE.C14-1，trpE.C14-2-2，和(实施例5中制备的)C14-1，C14-1-2，C14-2和C14-2-2肽片段(1-Y，1-Z，1-B，2-B和2-Z)进行ELISA，检测日本慢性丙型肝炎患者各种血清的HCV类型。
用与上文相同的方法，将trpE.C14-1-2或trpE.C14-2-2预先固定在微量培养板的小孔中。将20μl样品与20μl实施例5中合成的各种肽(0 1mg/ml)混合，在室温放1小时。将200μl稀释的样品加到肽溶液中，然后放置在盘的小孔中。于30℃反应1小时，接着洗涤后，将盘与过氧化物酶标记的抗一人IgG(小鼠单克隆抗体)在30℃反应1小时。洗涤后，将正-苯二胺溶液加到反应混合物中，在30℃反应1小时。加入1M硫酸停止反应，用比色器，在492nm确定颜色显现的吸收值。在免疫反应中，使用市场上可购买的HCV诊断剂“Immucheck-HCV”(ex International Reageuts Corporation)作为对比。
在表5、6和7中列出了结果。
从与trpE.C14-1-2的反应结果，可以看出表5中所述的全部样品属于HCV Ⅰ类这一事实，表5也说明，加入在实施例5中制备的具有HCV Ⅰ类序列的肽可以抑制样品与trpE.C14-1-2的反应。从与trpE.C14-2-2的反应结果，可以看出表7中所述的全部样品属于HCV Ⅱ类这一事实，表7也说明加入在实施例5中制备的具有HCV Ⅱ类序列的肽可以抑制样品与trpE.C14-2-2的反应，此外，从与trpE.C14-1-2或trpE C14-2-2的反应结果可以看出表6中所述的全部样品属于HCV Ⅰ类和Ⅱ类这一事实，且表6也说明，加入在实施例5中制备的具有HCV Ⅰ类或Ⅱ类序列的肽可抑制样品与trpE.C14-1-2或C14-2-2的反应。
因此，发现trpE.C14-1-2或trpE.C14-2-2可特异性地与抗-HCV抗体反应，还发现用实施例5中制备的肽片段，通过检测trpE C14-1-2或trpE.C14-2-2与抗-HCV抗体免疫反应的抑制，人们可以确定患者是否只感染上HCV Ⅰ类或HCV Ⅱ类还是已HCV Ⅰ类和Ⅱ类均已感染。因此，该肽片段也可用于鉴别HCV类型。相反，象在表5、6和7中所见到的，用Immucheck-HCV鉴别这些类型很困难。
1)COI中断指示(Cur off ind ex) 2)1-Y＝Z1-Y和1-Z抑制抗-HCV抗体与trpE.C14-1-2的反应到相同的程度。
3)1-Z＞B＞Y1-Z，1-B和1-Y按1-Z1-B＞1-Y的顺序抑制反应。
4)1-Z＝B∶1-Z和1-B抑制所述反应到相同的程度。
表6COI1)在492nm的吸收值样品No. ImmuchektrpE. trpE.
HCV 抑制肽 抑制肽C14-1-2 C14-2-2CH11 7.72< 3.000< (1-Z) 3.000< (2-B>Y)3)CH36 7.72< 3.000< (1-Y) 3.000< (2-Y)LC66 7.72< 2.995 (1-Z) 2.559 (2-Y)HCC88 7.72< 1.088 (1-Z) 0.833 (2-Y>Z>X)4)LC13 7.72< 2.800 (1-Z=Y)2)2.081 (2-Y)CH82 7.72< 2.961 (1-Y) 0.761 (2-Y=B)HCC71 7.72< 2.559 (1-Z) 0.748 (2-B)HCC93 7.72< 3.000< (1-Y) 0.495 (2-B)LC71 7.72< 1.967 (1-Y) 2.363 (2-Y=B)
1)COI中断指示2)2-Z＝B2-Z和2-B抑制抗-HCV抗体与trpE C14-1-2的反应到相同的程度。
3)Z-B＞YZ-B和Z-Y按2-B＞2-Y的顺序抑制抗-HCV抗体与trpE.C14-2-2的反应。
4)2-Y＞Z＞X2-Y，2-Z和2-X按2-Y＞2-Z＞2-X的顺序抑制所述反应。
5)2-Y＝B2-Y和2-B抑制所述反应到相同的程度。
表7COI1)在492nm的吸收值样品No. Immuchek trpE.
trpE. C14-2-2 抑制肽HCV C14-2-2CH20 7.72< 0.128 3.000< (2-Z=B)2)IC69 7.72< 0.098 3.000< (2-B)HCC51 7.72< 0.027 2.978 (2-Y)1)COI中断指示2)2-Z＝B2-Z和2-B抑制抗-HCV抗体与trpE.C14-2-2的反应到相同的程度。
(ⅳ)用ELISA(C)鉴别HCV类型将实施例5中制备的肽片段(1-Z，1-Y)固定在微量培养板的小孔中。将丙型肝炎患者的血清加到每个孔中。用与(ⅱ)中相同的方法反应后，测定在492nm的吸收值。在表8中列出了结果。如在表中见到的，用肽片段如1-Z和1-Y可以完成HCV的分类。然而，只与“Z”或“Y”反应的样品说明，肽片段最好是一种至少两种肽已被组合或与另一种结合的肽。
表8血清No 抑制肽 反应肽 C14-1-220 1-Z 1-Y +25 1-Y 1-Y +26 1-Z 1-Y,1-Z +28 1-Z 1-Z +30 1-Y 1-Y +实施例7制备药盒用含8M脲的磷酸缓冲液逐一稀释纯化的抗原(如Ⅰ类和Ⅱ类)以达到5μg/ml的最终浓度。将各个稀释溶液以每孔100μl的量放在不同的板，并在4℃放置过夜。将溶液从板中轻轻倒出，并将阻断溶液(300μl/孔)放在板上的孔中，接着在室温放2小时。将溶液轻轻倒出后，洗涤小孔，然后冷冻干燥。将每个冷冻干燥的平板(如Ⅰ类和Ⅱ类)放在不同袋或盒中，密封，包装在盒中形成药盒，在4℃贮藏。在药盒中，在不同容器(如瓶或小瓶)放下列试剂预先确定的能与HCV Ⅰ类和Ⅱ类分别发生特异性反应的阳性血清;稀释检测样品血清的稀释液;洗涤液;酶标记的抗人IgG小鼠单克隆抗体;和显色液。
实施例8干扰素(IFN)-治疗效果与用RT-PCR鉴别HCV类型的关系用一组可特异性分别检测HCV Ⅰ类和Ⅱ类的引物，分析IFN-治疗效果与用RT-PCR鉴别HCV类型的关系，如下将100μl丙型肝炎患者的血清与300μl6M GTC溶液(6M，硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5%Sarkosgl，0.2Mβ-巯基乙醇)混合。再将40μl 2M乙酸钠(pH 5.2)，400μl苯酚和80μl氯仿/异戊醇(49∶1)边搅拌边加到混合物中。移出含水层，然后向其中加入异丙醇，并离心以产生用于cDNA合成的RNA沉淀。在含RNA沉淀的反应混合物(10mM Tris-HCl，0.01%明胶，1mM DTT，100皮摩尔引物)中，RNase抑制剂和反转录酶存在的条件下，在37℃经2小时完成cDNA合成。得到的cDNA用于两步PCR。
按下列步骤进行PCR将10mM Tris-HCl，0.01%明胶，各2mM dNTPs，1.5mM MgCl2和引物(各50皮摩尔;见下文)加到上述制备的100μl反应混合物(含cDNA)中。所用的PCR条件是变性94℃，1.5分钟;退火50℃，2分钟;延伸70℃，2分钟;35个循环。至于检测用引物，下列四种引物能检测HCV Ⅱ类特异性的20bp DNA片段第1步PCR中所用的引物KK215′-GGATACACCGGTGACTTTGA-3′(SEQ ID NO∶29);和KK225′-TGCATGCACGTGGCGATGTA-3′(SEQ ID NO∶30);
第2步PCR中所用的引物KK265′-GATGCCCACTTCCTCTCCCA-3′(SEQ ID NO∶31);和KK27∶5′-GTCAGGGTAACCTCGTTGGT-3′(SEQ ID NO∶32)。
另一方面，可以用下列四种引物检测HCV Ⅰ类特异性的153bp DNA片段
第1步中所用的引物KK15′-GGCTATACCGGCGACTTCGA-3′(SEQ ID NO∶33);和KK25′-GACATGCATGTCATGATGTA-3′(SEQ ID NO∶34);
第2步中所用的引物KK55′-GATCGACTGTAACACATGTG-3′(SEQ ID NO∶35);和KK85′-CACATTTGATCCCACGATGG-3′(SEQ ID NO∶36)。
在表9中列出了结果。该表说明，占78%的9个患者的血清属于Ⅱ类，这些患者有惊人的IFN效果，而另外22%属于Ⅰ类，因此，有IFN治疗效果的大部分患者已感染上HCV Ⅱ类。
如在上述实施例中所见到的，可用抗原肽或含本发明抗原肽的药盒确定丙型肝炎患者是否仅感染HCV Ⅰ灯或HCV Ⅱ类还是HCV Ⅰ类和Ⅱ类均已感染了(即混合感染)。如果发现患者感染HCV Ⅱ类，则以IFN治疗对抗HCV Ⅱ类特别有效这一事实为基础，患者可以有效地接受早期的IFN治疗。本发明的肽和药盒也可用于诊断HCV感染。
表9丙型肝炎 IRN治疗 分类结果患者No 效果1 ME) I2 ME II3 ME I4 ME II5 ME II6 ME II7 暂时的 I8 暂时的 I9 暂时的 II10 暂时的 I11 暂时的 I12 无效 I13 无效 I14 无效 I15 无效 I16 无效 I17 暂时的 I18 无效 I19 无效 I20 ME II21 无效 I22 无效 I23 ME II24 ME II25 暂时的 I1)ME惊人的效果序列目录
SEQ ID NO∶1序列长度63序列类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽
SEQ ID NO∶2序列长度87序列类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽
SEQ ID NO∶3序列长度63序列类型氨基酸拓扑结果线性分子类型肽
SEQ ID NO∶4序列长度87序列类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽
SEQ ID NO∶5序列长度189序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA到基因组RNA
SEQ ID NO∶6序列长度267序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA到基因组RNA
SEQ ID NO∶7序列长度189序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA到基因组RNA
SEQ ID NO∶8序列长度261序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA到基因组RNA
SEQ ID NO∶9序列长度667序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA到基因组RNA
SEQ ID NO∶10序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型AGGTCGTCACTAGCACCTGGGTGC 24SEQ ID NO∶11序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型TGTATCCCGCTGATGAAGTTCCAC 24SEQ ID NO∶12序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GAATTCACGACAGGCAGCGTGGTC 24SEQ ID NO∶13序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型CTATTACAGCAATCCGAGCGCCCT 24SEQ ID NO∶14序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GGCTATACCGGTGACTTTGA 20SEQ ID NO∶15序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线笥分子类型GTCTCAGCTCCCTTCCGATC 20SEQ ID NO∶16序列长度24序列类型核酸链型单链扑结构线性分子类型GATCTACTGCTAACACATGTGTCA 24SEQ ID NO∶17序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GCGAATTCACAACAGGCAGTGTGGTCATT 29SEQ ID NO∶18序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GCTCATTAGAAGGTCTCAAGGGCTCGCCA 29SEQ ID NO∶19序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GAATTCGCGACCGGCTGCATTTCC 24SEQ ID NO∶20序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT 24SEQ ID NO∶21
序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GAATTCCCTGATAAGGAAATTTTA 24SEQ ID NO∶22序列长度24序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型CTATTATAAGAGGCCTTGTATTTT 24SEQ ID NO∶23序列长度19序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GGATCACCGGTGACTTTGA 19
SEQ ID NO∶24序列长度22序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型CCCCAAAATGTTGAGAAGGATA 22SEQ ID NO∶25序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GATGCCCACTTCCTCTCCCA 20SEQ ID NO∶26序列长度23序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GTGCTAGTTGACAACGGACTGGT 23
SEQ ID NO∶27序列长度28序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GCGAATTCGCGACCGGGTGTGTTTCCAT 28SEQ ID NO∶28序列长度28序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型TCATTAGAACTGCTCCACCTTGGGCCA 28SEQ ID NO∶29序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型
GGATACACCGGTGACTTTGA 20SEQ ID NO∶30序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型TGCATGCACGTGGCGATGAT 20SEQ ID NO∶31序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GATGCCCACTTCCTCTCCCA 20SEQ ID NO∶32序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GTCAGGGTAACCTCGTTGGT 20
SEQ ID NO∶33序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GGCTATACCGGCGACTTCGA 20SEQ ID NO∶34序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GACATGCATGTCATGATGTA 20SEQ ID NO∶35序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型GATCGACTGTAACACATGTG 20
SEQ ID NO∶36序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型CACATTTGATCCCACGATGG 20
权利要求
1.一种具有SEQIDNO∶1或SEQIDNO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并与抗丙型肝炎病毒Ⅰ类抗体能发生特异性反应的抗原肽。
2.根据权利要求1的抗原肽，其中，部分序列选自SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸和其组合，或SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74粒氨基酸和其组合。
3.一种具有SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并与抗丙型肝炎病毒Ⅱ类抗体能发生特异性反应的抗原肽。
4.根据权利要求3的抗原肽，其中，部分序列选自SEQ ID NO3所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸及其组合，或SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74位氨基酸及其组合。
5.一种鉴别丙型肝炎病毒类型的方法，包括将权利要求1的抗原肽与假设含丙型肝炎病毒抗体的样品接触，以完成免疫反应;和检测为阳性的抗属于Ⅰ类的丙型肝炎病毒抗体。
6.一种鉴别丙型肝炎病毒类型的方法，包括将权利要求3的抗原肽与假设含丙型肝炎病毒抗体的样品接触，以完成免疫反应;和检测作为阳性的抗属于Ⅱ类的丙型肝炎病毒抗体。
7.一种鉴别丙型肝炎病毒Ⅰ类或Ⅱ类的药盒，它含有在分开的部分内的至少一种第一抗原肽，和与所述肽有相同功能的肽变异体，所述肽选自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅰ类抗体发生特异性反应的肽;以及至少一种第二抗原肽和与所述肽有相同功能的肽变异体，所述肽选自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅱ类发生特异性反应的肽。
8.根据权利要求7的药盒，其中，部分序列选自SEQ ID NO∶1所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸和其组合;SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74位氨基酸和其组合;SEQ ID NO∶3所示氨基酸序列中的20到44，37到62位氨基酸和其组合;SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列中的20到44，37到62，53到74位氨基酸和其组合。
9.一种鉴别丙型肝炎病毒类型的方法，包括将至少一种第一肽和与所述第一肽有相同功能的肽变异体以及至少一种第二肽和与所述第二肽有相同功能的肽变异体与假设含丙型肝炎病毒抗体的样品接触，以便用免疫反应，在权利要求7中所定义的药盒中包括的第一和第二肽定量或定性地确定抗体;所述的第一肽选自具有SEQ ID NO∶1和SEQ ID NO∶2所示氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅰ类的抗体发生特异性反应的肽，所述第二肽选自具有SEQ ID NO∶3和SEQ ID NO∶4所示氨基酸序列或其部分序列并能与抗丙型肝炎病毒Ⅱ类的抗体发生特异性反应的肽;和检测丙型肝炎病毒Ⅰ类或Ⅱ类的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种NS4-相关的，与抗丙型肝炎病毒HCVI类的抗体能发生特异性反应的抗原肽；涉及一种NS4-相关的，与抗HCVII类的抗体能发生特异性反应的抗原肽；涉及一种在分开的部分含所述肽的，用于鉴别HCVI类或II类的药盒；涉及鉴别HCV类型的方法。本发明的肽可用于特异性检测HCVI类或II类以及检测混合感染的患者。用这种方法，可以使HCVII类——感染的患者得到早期有效的干扰素治疗。所述肽也可用于诊断HCV感染。
文档编号C07K14/18GK1087915SQ9311689
公开日1994年6月15日 申请日期1993年7月16日 优先权日1992年7月16日
发明者长谷川明, 槙升, 八木慎太郎, 柏熊富子, 山口健次郎, 池口尚子, 小林伦子, 妹尾千晶 申请人:东燃株式会社