肿瘤坏死因子突变蛋白的制作方法

专利名称：肿瘤坏死因子突变蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤坏死因子突变蛋白。
肿瘤坏死因子，或者更确切地讲称为肿瘤坏死因子α(为参照方便起见，除非有其它说明，本文所用的“肿瘤坏死因子”或“TNF”是指TNF-α)，是一种细胞激活素，主要由被刺激的巨噬细胞产生，它不仅显示出对抗各种肿瘤细胞的显著细胞毒性[Carswell et al.，Procd.Nat.Acad.Sci.，USA 72，3666-3670，(1975)]，而且还作为炎症和免疫反应的介质发挥多种作用[Beutler and Cerami，Ann.Rev.Immunol.7，625-655(1989);Bonavista and Granger(eds.)“Tumor Necrosis FactorStructure，Mechanism of Action，Role in Disease and Therapy，Karger，Basel(1990)]。根据已在E.coli中克隆和表达的人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)的cDNA的核苷酸顺序，人们已推测出hTNF-α的基本结构[Pennica et al.，Nature 312，724-729(1984);Marmenout et al.，Europ.J.Biochem.152，515-522(1985);Wang er al.，Science 288，149-154(1985);Shirai et al.，Nature 313，803-806(1985)]。已发现在hTNF-α与人淋巴毒素的氨基酸顺序之间存在着惊人的同源性(30%)，后者常被称为人肿瘤坏死因子-β(hTNF-β)，是一种主要由被激活的淋巴细胞产生的一种细胞激活素[Grayet al.，Nature 312，721-724(1984);Fiers etal.，Cold Spring Harbour Symp.51，587-595(1986)]。
所谓TNF-α突变蛋白，是具有修饰了氨基酸顺序的hTNF-α，各种出版物已对此进行过描述例如Yamagishi et al.，protein Engineering 3，713-719，(1990);Fiers，“Tumor Necrosis FactorsStructure，Function and Mechanism of Action”;Fiers et al.，Bonavista and Granger，PP.77-81(同上);Goh et al.，(1991)，“Structural and functional domains in human tumor necrosis factors”.Prot.Engineering 4385-389;Kircheis et al.，(1992)“Biological activity of mutants of human tumor necrosis factor-alpha，”Immunology 76433-438;Van Ostade et al.，(1991)“Localization of the active site of human tumor necrosis factor(hTNF)by mutational analyses，”EMBO J.10827-836;Van Ostade et al.，(1993)“Humman TNF mutants with selective activity on the p55 receptor，”Nature 361266-269;Zhang et al.，(1992)“Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-α receptor binding site and structure-functional relationship，”J.Biol.Chem.26724069-24075;和Ito et al.，(1991)，“Novel muteins of human tumor necrosis factor alpha，”Biochim.Biophys.Acta 1096245-252。此外，TNF-α突变蛋白曾是多件专利申请的主题，例如WO 86/02381、WO 86/04606、WO 88/06625和EP155，549、EP158，286、EP168，214、EP251，037、EP340，333以及DE3843534。
现有技术中也曾公开过淋巴毒素的突变蛋白，例如，EP250，000、EP314，094和E336，383以及下面两篇文献Goh et al.，(1991)“Aspartic acid 50 and tyrosine 108 are essential for receptor binding and cytotoxic activity of tumor necrosis factor beta(lymphotoxin)，”prot.Engineering 4785-791;和Wakabayashi et al.，(1990)“Deletion of lysine 89 enhances the cytotoxicity and the receptor binding affinity of human lymphotoxin，”J.Biol Chem.2657604-7609。
TNF的生物作用是通过特异性受体介导的，所说受体即指一种在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上表观分子量为55KD的受体(p55-TNF-R)和一种在SDS-PAGE上表观分子量为75KD的受体(p75-TNF-R)。这两种形式的TNF受体都已被克隆，也就是分别由Loetscher等人[Cell 61，351-359，(1990)]描述的p55-TNF-R和例如由Dembic等人[Cytokine 2，53-58，(1990)]描述的p75-TNF-R(对于两种受体也可参见欧洲专利申请90116707.2)。新近发现，这两种受体不仅结合TNF-α，而且还以高亲和力与TNF-β结合[Schoenfeld et al.，J.Biol.Chem.266，3863-3869(1991)]。
现有技术已清楚地了解到，基于TNF-α的生物活性，它可成为用于治疗各种疾病的有价值的化合物，例如，TNF-α本身或与干扰素联合可作为有效的抗肿瘤剂[Brouckaert et al.，Int.J.Cancer 38，763-769(1986)]。然而，TNF-α的全身性毒性是其被广泛用于治疗的主要限制因素[Taguchi T.and Sohmura Y.，Biotherapy 3，177，186(1991)]。
hTNF-α和mTNF-α几乎以同等亲和力与人p55-TNF-R和人p75-TNF-R相结合，但是，已经证明人TNF-α(hTNF-α)在小鼠中仅与较小的小鼠TNF受体(鼠p55-TNF-R)结合。在小鼠中，hTNF-α的毒性远低于鼠TNF-α(mTNF-α)，后者与鼠受体mp55-TNF-R和mp55-TNF-R都能结合。例如，在C57B16小鼠中，mTNF-α和hTNF-α的LD50分别为约10μg/小鼠和500μg/小鼠[Brouckaert et al.，Agents and Actions 26，196-198(1989);Everaerdt，B.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.163，378-385(1989);Lewis，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2830(1991);Brouckaert，P.，Libert，C.，Everaerdt，B，和Fiers，W.(1992)，“Selective species specificity of tumor necrosis factor for toxicity in the mouse.”Lymphokine Cytokine Res.11，193-196]。因此，人们认为p75-TNF-R在全身性毒性方面起着特别的作用。
据报道，增生信号可以由人T淋巴细胞中的hp75-TNF-R所介导(Gehr et al.，J.Immunol.149，911，1992;Tartaglia etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9292，1991)。
人肿瘤坏死因子突变蛋白在其与人p75-肿瘤坏死因子受体(hp75-TNF-R)和人p55-肿瘤坏死因子受体(hp55-TNF-R)的结合亲和力之间明显不同，这在EP486908中已经描述过，其中公开了维持与hp55-TNF-R的结合活性但几乎完全丧失了与hp75-TNF-R的结合活性的hTNF突变蛋白。
本发明提供了一种对人p75-TNF-R具有比对人p55-TNF-R更高结合亲和力的人肿瘤坏死因子突变蛋白(本文所用术语“人肿瘤坏死因子突变蛋白”包括药用的人肿瘤坏死因子突变蛋白盐)。
Pennica等人[参见上文]公开的(野生型)人TNF-α的氨基酸顺序如下1 10VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS20 30VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN40ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP50 60ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER70GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY CYS PRO SER THR HIS VAL LEU80 90LEU THR HIS THR ILE SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN THR LYS100VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER PRO CYS GLN ARG GLU THR110 120PRO GLU GLY ALA GLU ALA LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEU130GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP ARG LEU SER ALA GLU
140 150ILE ASN ARG PRO ASP TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL157TYR PHE GLY ILE ILE ALA LEU或者如Marmenout等人(参见上文)或王等人(参见上文)或Shirai等人所公开的顺序，或者更确切地说，如由质粒pDS56/RBSⅡ的插入段的核苷酸顺序，即编码成熟TNF-α的SphⅠ-TNFα(SEQ ID No.Ⅰ;参见

图1a和1b及实施例1;或参见EP486908的图3b1-3b3)顺序所编码的顺序。
在本发明之前从未有过能够制备选择性与hp75TNF-R结合的hTNF突变蛋白的说明。本发明的突变蛋白有利于用来描述hp75-TNF-R的特征，并且还具有潜在的诊断和治疗应用价值，这一点将在下文进行描述。
优选的突变蛋白相对于野生型人TNF-α而言，当相对于N末端氨基酸检测时，在对应于野生型顺序的33、34、65、67、75、143、145和/或147的位置上包括至少一个氨基酸的改变。本文所用术语“对应于”意指本发明的突变蛋白除了上面所指出的位置外不需与野生型人TNFα在位置上存在精确的同源性，因为在假定这些未特别指出的位置上(相对于野生型氨基酸顺序)发生缺失、插入或取代都对结合hP75-TNF-R的亲合力不产生实质性影响的情况下已对上述情况进行了反复研究。
现有技术已知并描述过在蛋白质和多肽中所发生的基本上不改变其生物活性的氨基酸取代，例如H.Neurath和R.L.Hill，“The Proteins”，Academic Rress，New York(1979)，尤其是在第14页的图6中，最常见的氨基酸取代的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Len/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，反之亦然。
优选的突变蛋白包括在对应于所指的野生型顺序的位置上有至少一个下列的氨基酸改变A33TK65AK65WQ67KQ67TQ67YL75HL75WD143ND143ED143FD143WD143YD143VD143V-F144L-A145SD143N-A145RD143V-A145SA145RA145DA145GA145HA145KA145FA145SA145TA145W
A145YA145VE146RS147L在上述命名中，所用字母是根据单字母氨基酸密码来表示氨基酸。短横线被用于分隔不止一个位置上发生的氨基酸改变。对于所示的每一种氨基酸改变而言，第一个字母表示野生型人TNF-α中的氨基酸，而第二个字母表示突变蛋白中对应的氨基酸，所用的数字表示野生型顺序中所示野生型顺序的氨基酸存在的位置。
在所说的变异体中，下面所列为优选的，已发现它们对hp75-TNF-R有良好的结合选择性K65WD143ND143ED143FD143WD143YD143VD143V-F144L-A145SD143N-A145RD143V-A145SA145RA145HA145KA145FA145WA145Y
特别优选的变异体如下所示D143ND143ED143FD143WD143YD143VD143V-F144L-A145SD143N-A145RD143V-A145SA145RA145KA145FA145WA145Y值得注意的是，所有这些优选的改变中都有对应于野生型顺序的143和/或145位置上的氨基酸改变，因此，发生在这两个位置上的改变是优选的。
本发明的hTNF突变蛋白另外还可以包括由“接头”顺序所编码的数个氨基酸的顺序。这些顺序是因用于表达上文所定义的hTNF突变蛋白的表达载体而产生的。
本发明的hTNF突变蛋白也能够含有以高选择性与一种亲和载体材料结合以有助于纯化的特异性顺序。所说顺序的例子有含有至少两个相邻组氨酸残基的顺序(参见EP282042的有关方面)。这类顺序能选择性地结合次氮基三乙酸镍螯合物树脂[Hochuli and Doebeli，Bilo.Chem.Hoppe-Seyler 368，748(1987);EP253303)，含有这类特异性顺序的hTNF突变蛋白能与hTNF突变蛋白氨基酸顺序的C端或N端或两端连接。
本发明的hTNF突变蛋白还能与不同的免疫球蛋白重链或轻链多肽结合。这将导致产生在体内半衰期延长的嵌合型hTNF突变蛋白免疫球蛋白多肽。例如，已经证明含有哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链不变区的头两个功能域的嵌合型多肽在体内的半衰期延长[参见Traunecker et al.，Nature 331，84-86(1988);EP394827]。hTNF突变蛋白与其它任何肽顺序融合产生嵌合型蛋白也是可行的。
hTNF突变蛋白还能与聚合物偶联，从而产生偶联的(pegylated)hTNF突变蛋白，所说的聚合物实例为如分子量为500-2000道尔顿的聚乙二醇或聚丙二醇。这样，可得到基本上不具免疫原性的被保护hTNF突变蛋白组合物。有多种聚合物与多肽的偶联方式可以利用，这在例如US4，179，337中有过描述。因此，聚合物偶联的hTNF突变蛋白或其药用盐也是本发明的一个目的。
可以用现有技术中已知并如Sambrook等人[Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour Laboratory Press，USA(1989)]或下文所描述的方法生产本发明的hTNF突变蛋白。如下文的实施例所述，可以测定这类hTNF突变蛋白是否仍然显示出对p75-TNF-R的选择性结合亲和力。此外，也可用现有技术中已知的标准方法化学合成本发明的hTNF突变蛋白，最好是用固态方法，例如Merrifield法(J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154)。而且，所说突变蛋白的药用盐也是本发明的目的之一。这类盐可用现有技术中已知的方法制备。
可以相信，利用能特异性地与一种或另一种TNF受体结合的化合物(例如本发明的hTNF突变蛋白)来对TNFα的有利及不利活性进行分析的方法可以广泛用于有TNF起作用的疾病状态中。
编码hTNF突变蛋白的DNA顺序(如上文所述)也是本发明的目的之一。除了具有作为获得本发明突变蛋白的中间体的功能外，这类顺序(或其片段)也能用于基团治疗，使现存的基因得以修饰，发挥有益作用。所说的顺序(或其片段)也可以用作反义DNA通过结合互补mRNA顺序调节基因表达。
利用已知的体外诱变法[参见例如Sambrook ed al.，1989]由如现有技术中已公开的编码hTNF的基因组或cDNA顺序(参见上文)构建本发明的DNA顺序，与本发明的DNA顺序互补的RNS顺序也在本发明的范围内，并且具有实用性，例如，用于制备cDNA顺序。
为了获得大量的突变体以备在适当的检测系统中测定其所需特性，或者为了在指定的DNA顺序中诱变特定的位点，通过所述位点直接诱变[参见例如Sambrook et al.，1989，15.51-15.113]或通过利用聚合酶链反应的诱变[参见例如White et al.，Trends in Genetics 5，185-189(1989)]，可以任意地(ad-random)进行上文所说的诱变。
一种常用于随意诱变的化学诱变剂是亚硫酸氢钠，它能使胞嘧啶残基转变成尿嘧啶残基，因而产生“C”向“T”(核苷酸的标准缩写)的转换[关于方法可以参见例如Shortle and Nathans，Procd.Nat.Acad.Sci.U.S.A.75，2170-2174(1978)或Pine and Huang Meth Enzym.154，451-430(1987)]。该突变剂仅作用单链DNA，而突变的靶DNA顺序的表达是借助双链质粒载体实现的。为了避免在诱变和表达载体中所需的再克隆，一种可能性是利用所谓的“质粒噬菌体”它们是不仅具有质粒的复制原点而后还携带来自丝状噬菌体的复制原点的载体。这类质粒噬菌体的例子包括如Stanssen等人[Nuclecic Acids Res.17，4441-4454，(1989)]所描述的pMa和pMc质粒噬菌体。人们利用这种表达系统可以构建所谓的“缺口-双螺旋”(gap-duplex)结构[参见Kramer et al.，Nucl.Acids.Res.12，9441-9456(1984)]，其中仅TNF编码顺序(参见上文)呈单链构型并因此而易受特异化学诱变剂的影响。将用于随意诱变中的“缺口-双螺旋可用Stanssen等人[参见上文]描述的位点特异性诱变法进行构建，所不同的是其中的负链包括作为正链的同一活性抗生素抗性基因。通过利用编码hTNFα的DNA顺序中不同的限制性位点，可以改变缺口的宽度。这类限制性位点的例子有CLal-SaL1位点(470核苷酸)、BstX1-BstX1位点(237核苷酸)或Sty1-Sty1位点(68核苷酸)。然后，根据Shortle和Nathans(参见上文)的描述用浓度渐增(最高达4M)的亚硫酸氢盐处理上述缺口-双螺旋-构建体，继而再采用多次的透析步骤。根据现有技术中已知并描述过的方法(例如Sambrook et al，参见上文)可用上述质粒构建体转化适宜的原核宿主细胞。在本文中，适宜的原核宿主细胞是指这种宿主细胞缺乏特异性修复功能，使得尿嘧啶残基在DNA复制过程中仍保留于DNA中，而且这种宿主细胞能够表达相应的突变TNF。这类特异性宿主菌株在现有技术中是已知的，例如，大肠杆菌菌株E.Coli BW 313[Kunkel，T.A.Procd Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492(1985)]。借助适当的检测系统能够筛选那些表达所需hTNF突变蛋白的所得克隆。例如，每一集落可在含有相关抗菌素的适宜培养基的微量滴定板中进行接种。加入溶菌酶裂解细胞，接着是相继的冻-融循环，核酸在经沉淀和离心后，每一集落的上清液可直接用于适宜的测定中，例如，用于本发明实施例Ⅲ中所述的测定中。
如果需要的话，可以用例如限制性片段分析法[参见如Sambrook et al.，见上文]测定突变的特异位点。通过测定这类片段的DNA顺序，可以确定确切的突变位置，并且，如果所说的突变产生了氨基酸替换，那么新的氨基酸可以来自被测定的DNA顺序。根据现有技术中已知的方法。例如借助商售测序药盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)利用作用于超螺旋DNA的T7聚合酶进行DNA测序。
如上文已述，另一种使一个给定的DNA顺序突变的可能的途径是用“位点特异性诱变”。最初由Hutchinson和Edgell[J.Viral.8，181(1971)]概括的这类诱变法的广泛应用的策略包括使携带所需核苷酸替换的合成寡核苷酸退火成单链DNA顺序的靶区域，其中应引入了突变[对于综述可参见Smith，Annual，Rev.Genet.19，423(1985)，对于改进的方法，可参见references 2-6 in Stanssen et al.，(1989)]。
一种这类优选的方法是Stanssen等人(1989)描述的方法之一，利用最初由Kramer等人(1984)所述的“缺口双螺旋DNA”[参见上文以及Kramer and Fritz，Methods in Enzymology，(1987)，Academic Press，Inc，USA]，但用抗生素抗性基因替代M13功能基因以筛选含单链的突变，并辅以同样由Stanssen等人(1989)[参见上文]描述的质粒噬菌体技术。该方法的优点还在于能够进行连续的诱变循环而不需将基因转移至新的诱变载体第二轮诱变的不同仅在于对另一种抗生素标志的筛选(Stranssen et al.，参见上文)。作为对照，可以应用突变体向野生型TNF的位点特异性回复诱变。此外，应用一种寡核苷酸，创建或消除TNF基因中的限制性位点，使得对突变体的控制不仅通过与用于位点特异性诱变的寡核苷酸杂交而且通过限制性位点的存在或缺失来进行。为了构建一批在其氨基酸顺序的指定位置上用任何天然存在的氨基酸取代野生型氨基酸的hTNF突变蛋白，应用了在指定位置上含所有可能密码子的一批寡核苷酸。
如上文已述，另外一种使给定的DNA顺序突变的可能途径是借助聚合酶链反应(PCR)进行诱变。例如，White等人(1989)已概述了该方法的原理，而改进的方法由Innis等人进行了描述[PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.(1990)]。
PCR是一种由小量模板DNA制备大量指定长度和顺序的特异性DNA片段的体外方法。因此，PCR是基于DNA片段的酶性扩增反应，所说DNA片段两侧是两个能与靶顺序的相反链杂交的寡核苷酸引物。引物以其3′末端相向而定位。重复进行模板的热变性、引物退火至其互补顺序上和加入DNA聚合物延伸退火的引物的循环，产生PCR引物5′端之间片段的扩增。因为每一引物的延伸产物都能作为另一次循环的模板，所以每次循环都在使前次循环中产生的DNA片段的数量加倍。又因引物是被物理性掺入到扩增的产物中，并且引物的5′端与模板之间的错配并不明显影响扩增的效率，因此，有可能改变扩增的顺序而向扩增的DNA中引入所需的突变。通过利用从嗜热菌水生嗜热菌中分离出的热稳定性Taq DNA聚合酶，有可能避免在每次热变性步骤之后必须补充的聚合酶的变性。这一改良实现了只需要多种简单的温度循环仪的PCR的自动化。此外，通过使用更高的引物退火及延伸反应温度，提高了扩增反应的特异性。通过最大限度地减小非靶片段对酶和引物的竞争，提高的特异性改善的扩增产物的总得率。
根据现有技术中已知的并曾描述过的方法[例如，Sambrook et al，(1989)，或上文所引关于位点特异性诱变的参考文献之一]能有效地设计和合成寡核苷酸。
一旦创建了编码本发明hTNF突变蛋白的DNA顺序，即可借助上文所述的质粒噬菌体技术或借助现有技术中熟知的适宜原核或真核表达系统[参见例如Sambrook et al，见上文]进行有效的表达。
有效表达最好是在原核细胞中，例如大肠杆菌、枯草杆菌等，而E.coli，特别是E.coli K12菌株，如M15[DZ 291，Villarejo et al.，J.Bacteriol.120，466-474(1974)]、HB101[ATCC 33694]、WK6[Stranssens et al，参见上文]或E.coli SG13009[Gottesman et al.，J.Bacteriol 148，265-273(1981)]是优选的。也可以在低等或高等真核细胞中有效地表达本发明的hTNF突变蛋白，例如酵母细胞(象啤酒酵母、毕赤氏酵母等)、丝状真菌(象曲霉属等)或细胞系(象中国仓鼠卵巢细胞系等)，而在酵母细胞中的表达是优选的[参见Sreekrishna et al.，Biochem.28，4117-4125，(1989);Hitzemean et al.，Nature 293，717-722(1981);EP263311]。表达本发明的hTNF突变蛋白可以在胞内系统中进行，或者于适当地改变基因后在胞外系统中进行(参见Leemans et al.，Gene 85，99-108，1989)。
用于在E.coli中进行表达的适宜载体例如已由Sambrook等人[参见上文]或由Fiers等人[in“Procd.8th Inc.Biotechnology Symposium”Soc.Franc.de Microbiol.，Paris，(Durand et al.，eds)，p680-697(1988)]介绍过，更特异地还有pDS族载体[Bujard et al.，Methods in Enzymology，eds.Wn and Grossmann，Academic Press，Inc.Vol.155，416-433(1987);Stübcr et al.，Immunological Methods，eds.Lefkovits and Pernis，Academic Press，Inc.，Vol IV，121-152(1990)]例如pDS/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(D143N，A145R)(参见实施例1)或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(突变蛋白)(参见实施例2)，其中的术语“突变蛋白”代表列于表Ⅰ中的突变蛋白。既然应用了这些特异性pDS56/RBSⅡ质粒，由于其特异性可调节启动子/操纵基因元件和核糖体结合位点，所以可获得高水平的表达。仅当启动子/操纵基因的活性受到由Lac阻遏子与操纵基因结合所致的抑制时，该质粒在E.coli中一直维持。启动子的活性可以在所需的细胞密度时通过加入IPTG而恢复，这可以灭活阻遏子并使启动子去阻。因为大多数E.coli菌株不提供足够量的阻遏子分子以完全阻遏存在于这些高拷贝数质粒中的启动子顺序的功能，因此，E.coli菌株在被本发明的特异性pDS56/RBSⅡ质粒转化之前首先被编码Lac阻遏子的质粒(如pREP4，参见图2a和b)所转化，而所说的pDS56/RBSⅡ质粒随后能稳定地存在于E.coli细胞中，除了编码Lac阻遏子外，pRER4还含有质粒pACYC184的区域[Chang and Cohen，J.Bacteriol.134，1141-1156(1978)]，它包括了复制及向子细胞稳定遗传所需的全部信息[附加的信息还可参见“System for high level production in E.coli and rapid purification of recombinant proteinsapplication to epitope mapping，preparation of antibodies and structure function analysis”，Stber et al.，Immunological Methods，Vol.IV，pp121-152，Lefkovits and Pernis(eds.)，Academic Press，New York(1990)]。
用任何常规方法[参见例如Sambrook et al.，(参见上文)]都能完成如上所述的载体向宿主细胞的转化，所用宿主细胞若是原核细胞，如E.coli，可从经指数生长期后收获并用已知的CaCl2法处理过的细胞制得能够摄取DNA的感受态细胞。也可以在宿主细胞形成原生质体后或利用现有技术中已知的其它方法，如Sambrook等人描述的方法[参见上文]进行转化。因此，本发明的目的之一也包括载体和由所说载体转化的宿主细胞，特别是用于在原核或低等真核宿主细胞中进行表达，含有编码如上所述hTNF突变蛋白的DNA顺序的载体，以及原核宿主细胞(如E.coli)或低等真核宿主细胞。
通常，含有所需表达载体的宿主生物是在适于其生长的条件下进行培养。假使原核宿主处于指数生长末期，每单位时间内细胞数目的增长下降，那么表明诱导了所需hTNF突变蛋白的表达，即编码所需hTNF突变蛋白的DNA被转录，被转录的mRNA被翻译。诱导过程可通过向生长培养基中加入诱导剂或去阻遏剂进行，或者通过改变物理参数，如改变温度来进行，在用于本发明的优选实施例方案的表达载体中，由Lac阻遏子控制表达。通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，表达调控顺序去阻遏，因而诱导了所需hTNF突变蛋白的合成。
由如上所述的转化细胞生产的本发明hTNF突变蛋白可从培养物的培养基中回收，或者在裂解细胞/或抽提后回收。回收可采用任何蛋白质和肽化学中已知的适当方法进行，例如硫酸铵沉淀法、透析、超滤、凝胶过滤或离子交换层析、凝胶电泳、等电点聚焦、亲和层析如免疫亲和层析、HPLC等。特别优选的方法是硫酸铵和/或聚氮丙啶沉淀法、透析、亲和层析如苯基-琼脂糖，特别是苯基-琼脂糖凝胶，或离子交换层析，特别是用MONO-Q-和/或MONO-S-基质(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，或更确切地说，回收方法是由Tavernier等人[J.Mol.Biol.211，493-501(1990)所描述的和本发明实施例Ⅳ所公开的。
因此，本发明的目的还在于提供一种制备上述hTNF突变蛋白的方法，它包括在适宜的培养基中培养上述转化的宿主细胞，特别是原核细胞(如E.coli)或真核细胞，并从培养物上清液或宿主细胞本身中分离突变蛋白，如果需要的话，用现有技术中已知的方法可以与聚合物偶联所说的突变蛋白或制备其药用盐，按照所说方法制备的化合物也都是本发明的目的之一。
本发明的hTNF突变蛋白的特征在于显示出对人p75-TNF-R的选择性结合亲和力。该特性可用现有技术中已知用于测定结合亲合力的方法进行测定。例如，用不同程度地表达两类TNF受体的细胞的培养物检测TNF本身及本发明的突变蛋白的结合力，例如Hep-2细胞只表达人p55-TNF-R，而U937或HL60细胞此外还表达人p75-TNF-R[参见Brockhaus et al.，Procd.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87，3127-3131，(1990);Hohmann et al.，J.Biol.Chem.264，14927-14934，(1989);Loetscher et al.，(1990);Dembic et al.，(1990)]。当然，也可直接用纯化的天然或重组p55-TNF-R和p75-TNF-R(如实施例中所特别描述的)或直接用这类受体相应的可溶性类似物测定结合亲和力。
术语“对人p75-TNF-R的选择性结合亲合力”在本发明中是指在对两类TNF受体结合亲和力方面存在差异，关于本发明实施例中所述的测定系统最好地是，本发明的突变蛋白选择性地结合hp75-TNF-R(所需要的是以与野生型TNF类似的程度)但基本丧失与hp55-TNF-R的结合力。在本发明实施例的测定系统中，本发明的特异性hTNF突变蛋白的KD值至少是10或大于10的系数，更合乎需要的至少是102的系数，其值大于用重组的可溶性hp55-TNF-R在体外结合力测定中对野生型TNF-α所测得的KD值，而用重组的可溶性hp75-TNF-R在体外结合力测定中对同样的突变蛋白测得的KD值与对野生型TNF-α测得的KD值相差不超过20。然而，所给出的这些特定KD值应被理解为是为了进行说明，而不应认为是以任何方式进行限制。
本发明的hTNF突变蛋白可以单独或与一种或多种本发明的其它化合物一起以药用口服组合物、注射组合物或局部组合物及相应的方式施用。施用的剂量应该是病人所用组合物的量能有效地调节与hTNF突变蛋白功能相关的生物功能。
因此，本发明更进一步的目的是包括含有hTNF突变蛋白及药用的可容性载体材料的药物组合物。任何常规载体材料都可使用。载体材料可以是适于肠道、透皮或肠外给药的有机物或无机物。适宜的载体包括水、明胶、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚二醇、凡士林等。而且，药物制剂可含有其它的药物活性剂。其它的添加剂如调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等可根据被公认的药物混合实践被加入本发明的组合物中。
药物制剂可以任何常规形式配制，包括a)口服的固态，如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒等;b)口服的液态，如溶液、糖浆、悬液、酏剂等;c)肠外用制剂，如无菌溶液、悬液或乳剂;以及d)局部用制剂，如溶液、悬液、软膏、霜剂、凝胶、微粒粉、气溶胶等。药物制剂可经灭菌和/或可含有佐剂，如防腐剂、稳定剂、增湿剂、乳化剂、用于改变渗透压的盐和/或缓冲剂。
非肠道剂型可以是能经静脉内或肌内注射的输注液或注射液。这些制剂还可含有其它的医用活性物质。可以根据公认的药物混合实践加入其它的添加剂如防腐剂、稳定剂、乳化剂和缓冲液等。
因此，本发明的目的还在于提供一种制备药物组合物的方法，该方法的特征在于将本发明方法得到的一种化合物，如果需要的话，还有其它的药用活性物质与无毒的惰性药用载体材料混合，所得的混合物制成草本制剂的应用形式。
此外，根据本发明上述用于制备药物组合物的方式制备的混合物的用途也是本发明的目的。
最后，可以生产抗本发明hTNF突变蛋白的抗体。这些抗体可以熟知的方式用于诊断或治疗以及纯化过程中。通过给哺乳动物或鸟纲动物注射足量含有本发明hTNF突变蛋白和药用载体的疫苗制剂以诱生抗所说hTNF突变蛋白的抗体。所需hTNF突变蛋白的适当用量是现有技术中技术人员已知的，或者能够用常规的实验确定。本发明所用的术语“药物载体”是指适于人类施用的标准组合物或指动物接种中所用的典型佐剂。
正如上文已指出，TNF是一种有效的多效性细胞激活素。其多种不同的活性，如对免疫细胞的生长因子活性、炎症介质或内皮中特定基因的诱导剂，都可见于宿主抵抗感染和损伤的过程中，TNF也有高度的全身性毒性，菌血症和败血症休克或细菌性脑膜炎的有害作用在很大程度上是由内源性细胞激活素所介导的，其中，TNF起着早期的和重要的作用，而且，许多细胞和细胞系都对TNF的直接毒性敏感。在动物研究中观察到各种全身性作用和细胞毒性以及可能还有的抗肿瘤活性。
上述事实构成了利用本发明的hTNF突变蛋白开发新的治疗对策的理性基础，特别地是，应充分开发区分hTNF多种不同活性所具有的潜力，以便通过仅选择性激活两种hTNF受体类型之一(相对于能结合和激活两种受体型的野生型hTNF)而将不需要的活性与所需活性分开。本发明hTNF突变蛋白的潜在用途并不限于癌症治疗。75KDa TNF受体型特异性药物，如本发明的hTNF突变蛋白对任何TNF在其中作为宿主抗细菌感染的防御因子[例如Kindler，V.et al.，CELL56，731-740(1989)Nakano，Y.et al.，J.Immunol.144，1935，(1990)]或作为炎症介质起有益作用的疾病都有利。而且，已经证明TNFα对脂肪细胞和整体动物有一定的分解代谢作用，并在恶病质中起作用[例如Beutler，B.and Cerami，(参见上文);Hotamisligil et al.，Science 259，87(1993)]，因此本发明的TNF突变蛋白可用于治疗肥胖。业已证明，TNFα对胰岛素刺激的外周血糖利用率有中和作用[Hotamisligil et al.，参见上文]。这种推测的TNFα在肥胖相关的胰岛素抗性方面的作用与其在恶病质中可能有的作用是相一致的，这是由TNFα在生物效应中剂量依赖性差异以及两种TNF受体系统不同的作用而知的，TNF的两种受体系统的不同作用可在野生型TNF抑制剂存在或缺乏时应用受体型特异性激动剂而知。即使是以过量的TNF释放而产生毒性为特征的疾病状态(如败血症休克或细菌性脑炎)也可以得益于TNF受体特异性激动剂本身，如本发明的突变蛋白;或是得益于所说激动剂与野生型TNF拮抗剂的合用。已有出版物总结了TNF所出现的作用以用于新的治疗[Tumor Necrosis Factors，The Molecules and their Emerging Role in Medicine，B.Beutle，ed.，Raven Press，1992，ISBN 0-88167-852-X]，其中，仅选择性地启动TNF多种不同活性中一些活性的TNF受体型特异性激动剂是所希望的，它与野生型TNF相比具有显著的优点。上文的总结包括TNF在如下方面的活性调节内皮细胞自稳特性和对中性粒细胞粘附、组织缺血、再灌注损伤的活性，对骨吸收中成骨细胞和破骨细胞的活性，它作为生长因子对整体上和造血中的许多细胞的活性，以及在代谢和营养作用中的活性。TNF作为生成淋巴激活素激活的杀伤(LAK)细胞的生长/分化因子显示了TNF抗肿瘤活性。因此，本发明hTNF突变蛋白或其药用盐的应用也是本发明的目的。
上述所有活性可在因联用其它的重组细胞激活素如γ干扰素而得到增强或调节。
下面将结合附图通过实施例的方式描述本发明。
所用缩写和符号的含义是B、E、H、S、Xb和X分别表示限制性酶BglⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ的裂解位点。
表示可调节的启动子/操纵基因元件N250PSN250P29， 表示合成的核糖体结合位点RBSⅡ，SphⅠ， 表示TNFα(TNFα)，β-内酰胺酶(bla)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、lac阻遏子(lacⅠ)和新霉素磷酸转移酶(neo)的基因， 表示λ噬菌体的转录终止子t0(t0)和E.coli rrnB操纵子的T1(T1)， 表示质粒pBR322和pREP4的复制区(repl.)， 表示在N250PSN250P29和RBSⅡ，SphⅠ调控下的编码区。
图1a是质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的示意图。
图1b显示了质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα完整的核苷酸顺序(SEQ ID No.1)，在该顺序中表明了图1a中所示的限制性酶识别顺序。所示氨基酸顺序以三字母密码表示成熟的人TNFα的顺序(157氨基酸;SEQ ID No.1和2)。
图2a是质粒pREP4的示意图。
图2b显示了质粒pREP4完整的核苷酸顺序(SEQ ID No.3)。在该顺序中表明了图2a中所示的限制性酶识别顺序(也参见EP 486908的图2b1-2b3)。
图3概括了编码TNFα突变蛋白TNFα(D143N，A145R)的EcoRⅠ-HindⅢ片段的制备。
图4说明了人野生型TNFα及D143N、A145R、D143N-A145R突变蛋白与人TNFR-p75及TNFR-p55的竞争性结合。用重组的人TNFR-p75-hγ3融合蛋白(上图)和重组的人TNF-R-p75-hγ3融合蛋白(下图)包被的96孔微量滴定板在存在不同浓度的未标记野生型TNFα、D143N、A145R或D143N-A145R突变蛋白的情况下一起保温。于室温下3小时后用γ计数器计算被结合的放射活性。
除非有其它特别说明，下文所给出固体在固体混合物中、液体在液体中及固体在液体中的百分比分别指wt/wt、vol/vol和wt/vol。
实施例1制备TNFα(D143N-A145R)质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα人TNFα的表达质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(参见图1)是用于制备本发明各种TNFα突变蛋白的TNFα基因的来源。根据用于专利目的的布达佩斯条约已在Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH(DSM)in Braunschweig，BRD于1991年9月8日保藏了被转化的E.coli M15[pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα]，保藏号为DSM6713。
利用PCR诱变TNFα基因应用带有AmpliTaqTM重组Taq DNA聚合酶的Perkin-Elmer Cetus GeneAmpTMDNA扩增试剂盒、以质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(图1)作模板DNA进行两次PCR反应[参见图3]反应Ⅰ用引物17/F[5'-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3,(SEQ ID No.4);引物17/F含有质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的3949-3970核苷酸]和引物46/M12[5'-GCGAAAGTTGAGATAGTCGGGCCGATTG-3'(SEQ ID No.5);引物46/M12含有的核苷酸与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的552-525核苷酸互补，被画线的是突变的碱基]。
反应Ⅱ用引物29/MR2[5'-GAGTCTGGGCAGGTCTACTTTG-3,(SEQ ID No.6);引物29/MR2含有质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的553-574核苷酸]和引物17/O[5'-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3'(SEQ ID NO.7);引物17/O含有的核苷酸与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα，的748-727核苷酸互补]。
在一个典型的实验中，将10μl模板DNA(10ng)、两种引物各5μl(各100pmol)、16μl dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP和dTTP 1.25mM)、10μl10×反应缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.3，500mM KCl15mM MgCl2和0.1%明胶)、1μl(5单位)AmpliTaqTMDNA聚合酶和53μl H2O在Eppendorf管中混合，并用80μl矿物油(Perkin-Elmer Cetus)覆盖。将上述小离心管转移至DNA热循环仪(TRIO-Thermoblock，Biometra)并于94℃维持1分钟，然后进行35次循环的DNA融化(94℃，1分钟)、引物退火(50℃，1分钟)和引物延伸(72℃，3分钟)。用乙醇沉淀水相中的DNA，然后在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳[Sambrook et al.，1989]。DNA用溴化乙锭染色后，从凝胶中分离和纯化片段Ⅰ和Ⅱ(参见图3)[Sambrook et al.，1989]。
制备编码TNFα(D143N-A145R)的DNA片段片段Ⅰ和Ⅱ在相互连接前先用酶处理进行磷酸化[Sambrook et al.，1989]。在热天活连接酶和用EcoRⅠ与HindⅢ进行消化后，DNA在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。DNA用溴化乙锭染色后，从凝胶中分离和纯化EcoRⅠ与HindⅢ片段A(参见图3)[参见上文]。
制备编码TNFα(D143N-A145R)的质粒根据标准方法[Sambrook et al.，1989]将EcoRⅠ与HindⅢ片段A插入经EcoRⅠ-AindⅢ裂解的质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα，产生质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(D143N-A145R)。制备质粒DNA[Birnboim et al.，1979]通过对双链DNA测序来证实对TNFα突变蛋白编码区鉴定[Sambrook et al.，1989]。
生产TNFα(D143N-A145R)用标准方法[参见上文]将质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(D143A-A145R)转化已含有质粒pREP4的E.coli MIS。转化细胞在含100mg/l氨苄青霉素和25mg/l卡那霉素的LB培养基中于37℃生长。当OD600约为0.7-1.0时，加入终浓度为2mM的IPTG。于37℃再谁持2.5-5小时，经离心收集细胞。
实施例Ⅱ制备其它的TNFα突变蛋白根据实施例Ⅰ中关于制备TNFα(D143N-A145R)的详述方法制备列于表Ⅰ中的其它TNFα突变蛋白。所得的表达质粒被命名为pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(突变蛋白)，它们是质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(D143N-A145R)的类似物。其中，命名中的术语“突变蛋白”表示列于表Ⅰ中的TNFα突变蛋白。这些质粒含有编码TNFα突变蛋白的区域，其中，质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα中的密码子被编码子所说突变蛋白(参见表Ⅰ)的密码子所替代。
实施例Ⅲ分析E.Coli裂解物中人TNFα突变蛋白的受体型特异性结合活性制备E.coli裂解物将如实施例Ⅰ和Ⅱ所述转化和诱导的E.coli细胞的10ml悬液以4000rpm离心10分钟，然后重悬于0.9ml裂解缓冲液中(10mM Tris-HCl pH8.0，5mM EDTA，2mM PMSF，10mM苯甲脒，2.00U/ml 抑肽酶和0.1mg/ml溶菌酶)。于室温下保温20分钟后，加入50μl 1M MgCl2，20μl 5mg/ml DNase I，50μl 5M NaCl和50μl 10% NP-40，所得混合物在室温再保温15分钟。以13000rpm离心5分钟澄清的0.5ml裂解物进行硫酸铵沉淀(25%-70% cut)。将70%硫酸铵团丸溶解于0.2ml PBS中，△十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析以证实重组蛋白的存在和粗略含量。
固相放射配基竞争性结合测定用溶于磷酸盐缓冲液(PBS，100μl/孔)中，浓度分别为0.3μg/ml和0.1μg/ml和重组人TNFR-p75-hr3和TNFR-p55-hr3融合蛋白(受体的胞外部分与人IgG3的Fc部分融合)于4℃包被96孔微量滴定板过夜[Loetscher，H.et al.，J.Biol.Chem 266，18324-18329(1991);Lesslauer，W.et al.，∑ur.J.Immunol.21，2883-2886(1991)]。用封闭缓冲液(50mM Tris pH7.4，140mM NaCl，5mM EDTA，0.02%NaN3，1%脱脂奶粉)封闭后，用PBS洗涤培养板，在含0.1%脱脂奶粉的封闭缓冲液中与1ong/ml人野生型125I-TNFα和10-2-10-7(10倍系列稀释各种稀释度的E.coli裂解物一起保温。用Iodogen法(Pierce Chemical Company)标记TNFα，比活性约为10-30μCi/μg。每孔体积为100μl，每一种稀释度的裂解物分二份或三份侧定。于室温下3小时后，用PBS充分洗涤所有门孔，再用γ计数器计数。含有表2中所示突变蛋白的裂解物的结果列于表2中。
实施例Ⅳ纯化人TNFα突变蛋白离心收集如实施例Ⅰ和Ⅱ所述转化和诱导的E.coli细胞的1升过夜培养物，交重悬于20ml 50mM Tris pH7.2，200mM KCl，50mM MgCl2，5%甘油中。以20000帕压力用French压机破碎细胞，或用Branson超声仪经超声处理破碎细胞(450型，2×2分钟，最大输出，在冰上进行)。样品经离心(7000xg，30分钟，4℃)澄清后，对20mM Tris-HCl pH9.0于4℃透析过夜，然后上样于经同样缓冲液平衡过的Q-琼脂糖凝胶柱(Parmacia，2.6×15cm)。用线性NaCl梯度(0-400mM于20mM Tris pH9.0)以1ml/分的流速洗脱蛋白质。收集每5ml的馏分，用SDS-PAGE分析TNFα突变蛋白的存在。收集阳性馏分，并对20mM 2-吗啉代-乙烷磺酸(MES)pH6.0透析，再上样于用20mM MES pH6.0平衡过的Mono S柱(HR5/5，LKB-Pharmacia)。用线性NaCl梯度(0-400mM于20mM MES pH6.0)以0.5ml/分的流速洗脱蛋白质。在250mM-350mM NaCl之间洗脱出作为电泳纯蛋白的各种TNFα突变蛋白。在对PBS透析后，利用BCA蛋白测定(Pierce Chemical Company)以野生型人TNFα作标准物测定蛋白质浓度，或者检测280nm的吸光度。
实施例Ⅴ纯化的人野生型TNFα和突变蛋白竞争性结合重组的人TNFR-p75和TNFR-p55为了用纯化的突变蛋白进行竞争性结合测定用如实施例Ⅲ所述的重组人TNFR-p75-hr3和TNFR-p55-hr3融合蛋白包被微量滴定板。在用封闭液(50mM Tris pH7.4，140mM NaCl，5m MEDTA.0.02% NaN3，1%脱脂奶粉)封闭后，用PBS洗微量滴定板，再在含0.1%脱脂奶粉的封闭液中与10ng/ml人野生型125I-TNFα和各种浓度的末标记野生型TNFα或102-10-5μg/ml(10倍系列稀释)突变蛋白一起保温。用Iodogen法(Pierce Chemical Compang)标记TNFα，比活性约为10-30μCi/μg。每孔的体积这100μl，以二份或三份试样测定每种浓度的样品，置室温3小时后，用PBS充分洗涤各个孔，并用γ计数器计数。
所得结果示于表3中，并在图4中对所说的突变蛋白进行了说明。
表1用于编码存在于突变蛋白中的新氨基酸的密码子突变蛋白 新密码子N19D GACQ21S TCTL29SaTCCL29S-R32W TCC-TGGL29S-R32W-S86T TCC-TGG-ACCL29S-S86T TCC-ACCN30T ACCR31E GAGR31K AAGR31N-R32T AAC-ACTR31N-R32T-N34S AAC-ACT-AGTR31N-R32T-S86T AAC-ACT-ACCR31E-S86T GAG-ACCR32WaTGGR32W-S86T TGG-ACCA33D GAC
A33T ACCN34R CGTN34D GACN34C TGTN34Q CAAN34E GAAN34G GGTN34H CACN34I ATTN34M ATGN34F TTTN34P CCTN34T ACTN34Y TATN34Y TACN34V GTTK65A GCAK65W TGGQ67K AAAQ67T ACAQ67Y TACH73Q CAAH73T ACTL75R CGTL75H CAC
L75W TGGS86D GACS86T ACCY87Q CAGY87Q-Q88△ CAG-Y87E GAAY87G GGTY87L CTGY87K AAAY87F TTCY87T ACCY87T-E104G ACC-GGGN92R CGTI97K AAGI97Y TACS99A GCAS99Y TACY115W TGGD143N AACD143E GAAD143F TTCD143W TGG
D143Y TACD143V GTCD143V-F144L-A145S GTC-CTG-TCCD143N-A145R AAC-CGCD143V-A145S GTC-TCCF144R CGTF144D GATF144G GGTF144L TTGF144W TGGF144Y TACA145R CGCA145D GATA145G GGTA145H CACA145K AAAA145F TTTA145S TCCA145T ACAA145W TGGA145Y TACA145V GTTE146R CGTS147N AACS147L CTG
α已在Ghent大学W.Fiers博士的实验室中构建了L29S和R32W突变蛋白(也可参见EP486908)。
表2人TNFα突变蛋白与TNFR-P55和TNFR-p75的结合突变蛋白 E.coli裂解物对125I-TNFa TD50 TNFR-p55b)的结合力产生50%抑制作用 ID50 TNFR-P75的稀释度,ID50aTNFR-P55 TNFR-P75倍数 倍数野生型c)14'260 14'140 1N19D 5'000 5'000 1Q21S 2'500 2'500 1L29Sc)e)2'980 <100 >29.8L29S-R32W 5'000 <<100 >>50L29S-R32W-S86T 2'500 <<100 >>25L29S-S86T 200 <<100 >>2N30T 2'860 2'500 1.1
R31Ec)3'470 180 19.3R31K 3'330 3'330 1R31N-R32Tc)3'260 <100 >32.6R31N-R32T-N34S <<100 <<100 1R31N-R32T-S86T 500 <100 >5R31E-S86T 2'000 <<100 >>20R32Wc)e)8'780 <100 >87.8R32W-S86T 3'330 <<100 >>33.3A33D <100 <<100 >1A33T 1'110 1'250 0.9N34Rd)<100 <<100 >1N34D 250 <100 >2.5N34C 250 <100 >2.5N34Q <100 <<100 >1N34E 330 <<100 >>3.3N34G 330 <100 >3.3N34H 670 <100 >6.7N34Id)200 <100 >2N34Md)<100 <<100 >1N34Fd)100 <100 >1N34P <100 <<100 >1
N34T 1'000 <100 >10N34Yd)<100 <<100 >1N34Yd)<100 <<100 >1N34Vd)<100 <<100 >1K65A 20'000 33'330 0.6K65Wd)500 3'330 0.2Q67K 25'000 50'000 0.5Q67T 25'000 33'330 0.75Q67Y 20'000 33'330 0.6H73Q 10'000 10'000 1H73T 2'000 2'000 1L75R <100 <100 1L75H 1'670 2'500 0.7L75W 220 330 0.7S86D 6'670 1'000 6.7S86T 10'000 <100 >100Y87Q <<100 <<100 1Y87Q-Q88△ <<100 <<100 1Y87E <100 <<100 >1
Y87G <<100 <<100 1Y87L <<100 <<100 1Y87K <<100 <<100 1Y87F 200 <100 >2Y87T <<100 <<100 1Y87T-E104G <100 <100 1N92R 5'000 1'250 4I97K 143 <100 >1.4I97Y 2'500 330 7.6S99A 6'670 6'670 1S99Y <100 <100 1Y115W 2'220 2'220 1D143Nc)<<100 330 <<0.3D143E <100 330 <0.3D143F <<100 250 <<0.4D143W <<100 100 <<1D143Yc)<<100 1'330 <<0.08D143V <<100 <100 <1D143V-F144L-A145S <<100 <100 <1
D143N-A145Rd)<<100 125 <<0.8D143V-A145Sc)<<100 200 <<0.5F144R 2'500 330 7.6F144D 5'000 330 15.2F144G 2'500 2'000 1.2F144L 5'000 5'000 1F144W 400 180 2.2F144Y 2'860 2'860 1A145R <100 3'330 <0.03A145D 5'000 6'670 0.7A145G 2'500 6'670 0.4A145H 330 1'670 0.2A145K <100 1'820 <0.05A145Fc)240 6'000 0.04A145S 14'290 25'000 0.6A145T 5'000 6'670 0.7A145Wd)<<100 <100 <1A145Y 1'670 11'110 0.1A145V 1'000 2'000 0.5E146R 6'670 <100 >67S147N 10'000 10'000 1S147L 2'000 3'000 0.6
人野生型TNFα和突变蛋白在E.coli中表达，并经过裂解细菌而被提取。用固相放射配基结合测定检测了被提取的野生型和突变型TNFα的选择性受体结合活性。检测了10-2-10-7(10倍系列稀释)不同稀释度的E.coli裂解物对人野生型125I-TNFα与固定的人TNFR-p75和TNFR-p55的竞争性结合抑制作用。通过用结合抑制作用对裂解物稀释度作图来确定ID50(50%抑制作用的稀释度)。因为重组蛋白的浓度如由SDS-PAGE分析所估计的是在0.05-1mg/ml之间变化，因此ID50的绝对值不应看作是贴切的。通过直接比较特定突变蛋白对TNFR-p75和TNFR-p55的ID50值表明了受体选择性。
a)“＜”表示小于所给出的数值(此时存在对125I-TNFα结合的可测抑制作用，但在所测的最低稀释度1∶100时未达到50%抑制)。
“＜＜”表示极大地小于所给出的数值(此时在所测的最低稀释度1∶100不存在可测的抑制作用)。
b)比值为1，无受体选择性;
比值＞1，TNFR-p55选择性;
比值＜1，TNFR-p75选择性;
本发明的突变蛋白应具备 (ID50TNFR-p55)/(ID50TNFR-p75) ＜1。
该比值可小于0.5，但优选小于或等于0.2(参见权利要求5的突变蛋白)，更优选小于或等于0.1(参见权利要求6的突变蛋白)。表1中应用了“＜”或“＜＜”符号，有关的突变蛋白将任意选择地被考虑为在此范围内。
c)对于这些突变蛋白，至少制备和测定了三种不同的裂解物，所列出的是ID50平均值。
d)在用于制备E.coli裂解物的条件下这些突变蛋白仅部分可溶(尽管值得注意的是可用不同的纯化方法产生不同的溶解度);用SDS-PAGE分析评估这些裂解物中可溶性蛋白的浓度为小于0.05mg/ml。
e)已在Ghent大学W.Fiers博士的实验室中构建了L29S和R32W突变蛋白(也可参见EP486908)。
表3被选择的人TNFα突变蛋白与人TNFR-p75和TNFR-p55的结合突变蛋白 对125I-TNFa结合产生50% 相对于野生型而言结合抑制作用的突变蛋白浓度 亲和力的降低b)IC50aTNFR-p55 TNFR-p75 TNFR-p55 TNFR-p75ng/ml ng/ml 倍数 倍数D143N >100'000 300 >2'500 6.7D143Y >100'000 350 >6'660 17.5A145F 500 30 33 1.5A145R 100'000 35 2'500 0.8A145W 10'000 100 250 2.5D143N- >>100'000 300 >>2'500 6.7A145R选择优选结合人TNFR-p75的突变蛋白(参见表2)，并用连续的离子交换层析法纯化至明显匀质。用固相放射配基结合测定检测纯化的突变蛋白的选择性受体结合活性。检测了102-10-5μg/ml(10倍系列稀释)不同突变蛋白的浓度对人野生型125I-TNFα(10ng/ml)与固定的人TNFR-p75和TNFR-p55的竞争性结合抑制作用。用结合抑制作用对浓度作图来确定IC50(50%抑制作用的浓度)(示于图1)。
a)＞，表示可测的结合竞争作用，但在100μg/ml时未达到50%;
＞＞，表示在所测最高浓度(100μg/ml)时无可测的结合竞争作用，b)用突变蛋白获得的IC50值除用野生型TNFα获得的IC50值来计算亲和力的降低。在各组实验中测定了野生型TNFα的IC50值，发现其IC50值依赖于放射碘标的TNFα的总量而在15-45ng/ml之间变化。
权利要求
1.一种对人p75-TNF受体比对人p55-TNF受体具有更高结合亲和力的人TNFα突变蛋白或其药用盐。
2.根据权利要求1的化合物，在相应于野生型人TNFα的33、65、67、75、143、145和/或147位上含有至少一个不同于野生型人TNFα的氨基酸。
3.根据权利要求2的化合物，其中的突变蛋白在相应于野生型人TNFα的143和/或145位上含有至少一个不同的氨基酸。
4.根据权利要求2的化合物，其中的突变蛋白在所示野生型顺序的相应位置上含有至少一个下列氨基酸变化A33TK65AK65WQ67KQ67TQ67YL75HL75WD143ND143ED143FD143WD143YD143VD143V-F144L-A145SD143N-A145RD143V-A145SA145RA145DA145GA145HA145KA145FA145SA145TA145WA145YA145VE146RS147L
5.根据权利要求4的化合物，其中的突变蛋白在所示野生型顺序的相应位置上含有至少一个下列氨基酸变化K65WD143ND143ED143FD143WD143YD143VD143V-F144L-A145SD143N-A145RD143V-A145SA145RA145HA145KA145FA145WA145Y
6.根据权利要求5的化合物，其中的突变蛋白在所示的野生型顺序的相应位置上含有至少一个下列氨基酸变化D143ND143ED143FD143WD143YD143VD143V-F144L-A145SD143N-A145RD143V-A145SA145RA145KA145FA145WA145Y
7.根据权利要求1-6中任一权项的化合物，其中的突变蛋白在所示的野生型顺序的相应位置上含有至少一个下列的氨基酸改变D143ND143YA145FA145RA145WD143N-A145R
8.权利要求1-7中任一权项的化合物与聚合物的偶联形式。
9.编码权利要求1-7中任一项的突变蛋白的DNA顺序。
10.含有权利要求9的DNA顺序的载体。
11.含有权利要求10的载体的宿主细胞。
12.与权利要求10的DNA顺序互补的RNA顺序。
13.用于经外科或内科疗法对人体或动物体进行治疗中，或用于诊断方法中的权利要求1-8中任一权利要求的化合物。
14.制备权利要求1-8中任一权利要求的化合物的方法，它包括在适宜培养基中培养权利要求11的宿主细胞，然后纯化突变蛋白，并可任意选择地与聚合物偶联所纯化的突变蛋白或用现有技术已知的方法制备其盐。
15.含有权利要求1-8中任一权项的化合物以及可药用载体的药物组合物。
16.权利要求1-8中任一权项的化合物在经外科或内科疗法对人体或动物进行治疗中、或在诊断方法中的应用。
全文摘要
对人P75-TNF受体比对人P55-TNF受体具有更高结合亲和力的人TNF突变蛋白包括在相应于野生型氨基酸顺序的33、65、67、75、87、143、145或147位上具有至少一个不同于野生型人TNF的氨基酸。这类突变蛋白被用于描述人P75受体的特征，并与于对人P55-TNF受体具有选择性结合亲和力的已知突变蛋白一起有助于区分通过结合人P75受体所介导的TNF功能与通过结合人P55受体所介导的TNF功能的不同。
文档编号C07H21/02GK1099802SQ9410379
公开日1995年3月8日 申请日期1994年3月28日 优先权日1993年3月29日
发明者D·班纳, W·列斯劳尔, H·勒舍, D·施图伯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司