专利名称：编码肿瘤排斥抗原前体mage-3及其应用的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及免疫遗传学应用于肿瘤学研究的领域。准确地讲，是涉及通过对有机体免疫系统识别肿瘤的机理方面的研究和分析，这个系统的识别经由所谓肿瘤排斥抗原(tumor rejection antigens)提呈以及本文中将描述的“肿瘤排斥抗原前体”简称为“TRAPs”(Tumor rejection antigon precursors)的表达来实现。更准确地讲，本发明涉及编码这种肿瘤排斥抗原前体TRAP的核酸分子即MAGE-3，该前体加工成的肿瘤排斥抗原“TRA”可被HLA-A1分子提呈。
通过宿主研究肿瘤的识别和非识别已在不同的方向开展过。了解这一领域即意味着对基础免疫学和肿瘤学要有一些了解。
对小鼠肿瘤的早期研究显示这些已知的分子当被移植到相同基因型的动物体内时会导致对肿瘤细胞产生排斥。这些分子被受体动物体内的T-细胞“识别”，并诱发溶细胞性T细胞的应答，并伴随着移植细胞的溶解。这个证据首先是从经化学致癌剂，如甲基胆蒽(methylcholanthrenc)体外诱导肿瘤中获得的。人们发现肿瘤表达的并能激发T细胞反应的抗原对于每种肿瘤都不相同。参见Prehn，et al，J，Natl.Canc.Inst.18∶769-778(1957);Klein et al.，Cancer Res.20∶1561-1572(1960);Gross，Cancer Res.326-333(1943)，Basombrio，Cancer Res.30∶2458-2462(1970)，其中讲述了关于用化学致癌剂诱导肿瘤及在细胞表面抗原上的差异。这一类的抗原被命名为“肿瘤特异性移植抗原”(Tumor specific transplantation antigen)简称为“TSTAs”。当用化学致癌物诱导的抗原被观察到可以提呈后，在体外用紫外线照射诱导肿瘤也曾得到相似的结果。参见Kripke，J.Natl.Canc.Inst.53∶333-1336(1974)。
前述观察到的各种肿瘤的T细胞介导的免疫反应时，其中讲到自发性肿瘤一般无免疫原性。因此被认为不能提呈能引发肿瘤携带者中的肿瘤反应的抗原。参见Hewitt，et al.，Brit.J.Cancer 33∶241-259(1976)。
表现细胞系的tum-抗原族(family)是具有免疫原性的变种，它们可以经小鼠肿瘤细胞或细胞系的致突变作用获得，这些在Boon et al.，J.Exp.Med.152∶1184-1193(1980)中已述。进一步地讲，可使那些在同基因型的小鼠中不产生免疫反应的肿瘤细胞的突变获得tum-抗原，这种突变的肿瘤细胞会发展成肿瘤(即，“tum+”细胞)。当把这些tum+细胞突变后，同基因型小鼠(Syngeneic mice)即可排斥它们且这些细胞不能形成肿瘤(因此为“tum-”)。参见Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶272(1977)，还有许多类型的肿瘤都显示这一现象，见Frost et al.，Cancer Res.43∶125(1983)。
tum-变种似乎不能形成进行性肿瘤(Progressive tumors)，因为它们引发一个免疫排斥反应。这个假说的证据包括“tum-”肿瘤变种能用亚致死剂量辐照后可抑制小鼠的免疫系统，而“tum-”肿瘤变种通常不形成肿瘤。参见Van Pel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76∶5282-5285(1989);并观察腹腔内注射的tum-的肥大细胞瘤P815细胞在12-15天可呈指数增殖，然而仅仅在淋巴细胞和巨噬细胞流入中期的那几天内就可消除该瘤细胞(Uyttenhove et al.，J.Exp.Med.152∶1175-1183(1980))。进一步的证据还包括小鼠获得了免疫记忆，这种记忆允许小鼠抵抗后来对相同的tum-变种的再次进入，即使是当辐射的免疫抑制量同随后的细胞的再次进入一并进行时也会如此(Boon et al.，Proc.Natl，Acad，Sci.USA 74∶272-275(1977));Van Pel et al.，Supra;Uyttenhove et al.，Supra)。后来的研究发现当自发性肿瘤产生突变时，会产生致免疫原性变种，并的确会引起免疫反应。因此，这种变种能够引发抵抗原发肿瘤的免疫保持反应，见Van Pel et al.，J.Exp.Med.157∶1992-2001(1983)。可见有可能在一个对同源排斥应答作为靶子的肿瘤中引发所谓的“肿瘤排斥抗原”的提呈作用。当外源基因转染到自发性肿瘤内时，也能得到相同的结果。
已证实有一类抗原已被提呈到肿瘤细胞的表面上，可被细胞毒性T细胞识别，并使肿瘤细胞溶解。这类抗原被称之为“肿瘤排斥抗原”或下文中简称为“TRAs”。TRAs可以或者不可能引发抗体应答。这些抗原通过在体外溶细胞性T细胞的特征性研究已经进行了相当程度的研究，即用特定的溶细胞性T细胞亚群(Cytolytic T cell)，下文称“CTL”，进行鉴别抗原的研究。根据对提呈的肿瘤排斥抗原的识别过程，所述的亚群(subset)即可增殖。提呈这类抗原的细胞也随之溶解。CTL克隆经研究证实可特异地溶解那些表达该抗原的细胞。该项工作的情况可见Levy et al.，Adv.Cancer Res.24∶1-59(1977);Boon et al.，J.Exp.Med.152∶1184-1193(1980);Brunner et al.，J.Immunol.124∶1627～1634(1980);Maryanski et al，Eur.J.Immunol.124∶1627-1634(1980);Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.12∶406～412(1982)，Palladino et al.;Canc.Res.47∶5074～5079(1987)。对于由CTLs识别的其他类型的抗原也要求进行这类分析，它们包括次要组织相溶性抗原(Minor histocompatibility antigens)，雄性特异性H-Y抗原(Male slecific H-Y antigens)，以及本文中所述的一类称之为“tum-”的肿瘤抗原。
前述记载中的肿瘤称之为P815。参见DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶2274-2278(1988);Szikora et al.，EMBO J 9∶1041～1050(1990)，和Sibille et al.，J.Exp.Med.172∶35～45(1990)。P815肿瘤是一种肥大细胞瘤(mastocytoma)，其是用甲基胆蒽在DBA/2系小鼠体上诱导出来的，并作为体外肿瘤和细胞系来培养的。P815细胞系随着突变已产生出许多tum-变种，它们包括P91A变种(DePlaen，前已述)，35B(Szikora，前已述)和P198(Sibille，前已述)。与肿瘤排斥抗原相反，这是一个关键区别，tum-抗原只有在肿瘤细胞致突变后才出现。肿瘤排斥抗原呈现在没有致突变给定的肿瘤细胞的表面上。因此，参考有关文献，细胞系可以是tum+的，如称之为“P1”的细胞系，被可诱发成产生tum-变种。由于tum-表型不同于亲代细胞系的表型，人们希望同它们的tum+亲代细胞系相比，tum-细胞系的DNA中也存在差别。这种差别可以被利用于定位tum-细胞中的相关的目的基因(gene of interest)。结果也发现诸如P91A，35B，和P198等的tum-变种的基因，也与在由基因编码区中的点突变后的原等位位点的基因有差别。参见前述的Szikora和Sibille，以及Lurquin et al.，Cell 58∶293-303(1989)。已经证实，这种情况不是本发明TRAs的情况。这些文献已经证实，这种情况不是本发明TRAs的情况。这些文献已经记载了由tum-抗原衍生出的多肽由CTLs识别的Ld分子提呈。Ld提呈P91A，Dd提呈P35而Kd提呈P198。
在先前专利申请PCT/US92/04354和USS.N.807，043;764，364;728，838和707，702和参考文献描述的所有内容都指出其发明涉及编码各种TRAPs的基因和其他核酸分子，TRAPs反过来可被处理成肿瘤排斥抗原，即“TRAs”。
基因作为分离纯化后的肿瘤排斥抗原前体和TRA的来源是非常有用的。两者中任何一种都能单独用作治疗癌症的制剂，所述的抗原是一个“标记物”，同时，也能用作肿瘤的各种诊断制剂和用于肿瘤的监测，这一点前面有所讨论。已知tum-细胞可被用于产生溶解提呈不同tum-抗原的细胞以及tum+细胞。参见Maryanski et al.，Eur.J.Immunol 12∶401(1982);Vanden Eynde.et al.，Modern Trends in Leukemia IX(June 1990)。在基因转染的细胞内可以表达肿瘤排斥抗原前体，然后再用于产生对目的肿瘤(tumor of interest)的免疫反应。
在另一个同等的人肿瘤的实例中已观察到自体混合的淋巴细胞-肿瘤细胞培养物(下文称“MLTC”)常产生应答淋巴细胞(responder lymp hocyte)，它可溶解自体肿瘤细胞(antologous tumor cells)，但不溶解自然杀伤细胞的靶子，自体EBV-转化的B细胞，或者自体成纤维细胞(参见Anichini et al.，Immunol.Today 8∶385-389(1987))。这一应答已特别用于黑色素瘤的研究，用外周血细胞或者肿瘤浸润淋巴细胞制备MLTC培养物。这一领域的文献参见Knuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86∶2804-2802(1984);Mukherji et al.，J.Exp.Med.158∶240(1983);Herin et al.，Int.J.Canc.39∶390-396(1987);Topalian et al.，J.Clin.Oncol.6∶839-853(1988)。稳定细胞毒性T细胞克隆(下文称“CTLs”)来自MLTC应答细胞，这些克隆对肿瘤细胞是特异性的。见Mukherji et al.，如前述;Her in et al.，如前述Knuth et al.，如前述。由这些自身的CTLs在肿瘤细胞上识别的抗原似乎并不代表一种培养后的产物，因为在新制备的肿瘤细胞表面上也发现了这些抗原。参见前述Topalian et al.，;Degiovanni et al.，Eur.J.Immunot.20∶1865-1868(1990)。这些观察结果连同本文用于分离特异性小鼠肿瘤排斥抗原前体基因的技术一道，被用来分离被提呈TRAs的在人类肿瘤上的编码肿瘤排斥抗原前体的核酸序列。现在已能够分离编码肿瘤排斥抗原前体的核酸序列，但并非限于一特定肿瘤的最大特征的那些。它还包括前述记载的结果。
另外的工作已经把重点放在由一类称之为人类白细胞抗原，即“HLAs”的分子提呈TRAs的内容上。这一工作在该领域中得到了一些意想不到的发现。特别是在USS.N.938，334申请中记载的内容可参考，该文献中披露由HLA-A1分子提呈的九肽(nonapetides)分子。假定特定肽分子对于特定的HLA分子已知具有特异性，将希望以一个特定的肽结合一个HLA分子，而不是其他的分子。这一点很重要，因为，不同的个体具有不同的HLA表型。其结果是，一旦鉴定出一个特定肽作为一个特异性HLA分子而匹配对具有诊断和治疗作用时，这个仅表明与那个特定HLA表型相关的个体有关。该领域还需要进一步研究，因为细胞的异常并不限于在一个特殊HLA表型，定向疗法需要在该问题上有关的异常细胞表型方面的知识。
在1993年1月22日提交的USS.N.008，446申请中披露MAGE-1表达产品被处理成次级TRA。这个次级TRA由HLA-C10-分子提呈。该文献指出所述的TRAP能产出大量的TRAs。
在1992年12月22日提交的USS.N.994，928号申请中，酪氨酸酶被描述成肿瘤排斥抗原前体。该文献记载着由某些正常细胞(例如产黑素的细胞)产生的分子在肿瘤细胞中被处理成肿瘤排斥抗原，该抗原由HLA-A2分子提呈。
如前述提到的那样，不同的个体具有不同的HLA型。也发现特定的MAGE基因表达并不常常与特定的HLA型的个体或者特定的疾病相关联。因此，不能确切地讲所有黑色素瘤患者都将表达MAGE-1 TRAP，也不能从分类学角度讲MAGE-1表达仅限于HLA-A1型的黑色素瘤患者。进一步地，仍不能讲在特定的HLA型的个体中仅仅表达一种类型的TRAP。因此应当指出在协调任何这些因素的时候还没有任何规定或原则可以遵守。
因此人们并不希望一个次级TRAP被处理成由HLA-A1分子提呈的TRAP。现已发现除了MAGE-1之外，源自MAGE-3 TRAP的TRA由HLA-A1分子提呈。这一点会在实施例37至40中介绍并共同加以讨论这一发现的结果。
本发明的这些或其他方面将在下文中详细讨论。
附图简要说明
图1为检测表达抗原P815A的转染子(transfectants)的结果。
图2为P1.HTR，PO.HTR克隆，基因组转染子(genomic transfectant)P1A.T2和粘粒转染子P1A.TC3.1由各种CTLs细胞作用至溶解的敏感性测定，该实验由铬释放分析法操作。
图3是粘粒C1A·3.1的限制性酶切图谱(restriction map)。
图4是表达基因P1A的Northern印迹分析图。
图5表示基因P1A的结构及其限制性酶切位点。
图6示出当用采自P1A的基因转染后，再从P815或通常细胞中分离出，然后用CTL溶解试验而得出的结果。
图7表示用肥大细胞(mast cell)系L138.8A进行溶解试验研究结果。
图8所示表达2.4kb抗原的E片段序列的亚片段图谱。
图9表示来自MAGE 1，2和3基因的外显子区段的同源性。
图10是在各种组织上MAGE基因的Northern印迹实验的结果。
图11以表格形式表示了图13的结果。
图12是本发明中采用各种人黑色素瘤细胞系进行Southern印迹试验的结果。
图13是用肿瘤和正常组织表达MAGE 1，2和3的总图谱。
图14表示在各种细胞系上用CTL克隆20/38进行铬释放测定(chormium release assay)的结果。
图15表示为测定CTL克隆20/38抗原特异性所进行的试验的结果。
图16是在各种转染细胞上进行的TNF释放测定(TNF release assay)获得的结果。
序列概述
SEQ ID NO1 为基因P1A部分的cDNA。
SEQ ID NO2 表示基因P1A cDNA的编码区。
SEQ ID NO3 表示P1A cDNA非编码DNA，该P1A cDNA从3'至SEQ ID NO∶2的编码区。
SEQ ID NO4 是P1A的cDNA的全序列。
SEQ ID NO5 是P1A的基因组DNA序列。
SEQ ID NO6 表示P1 TRA的抗原肽的氨基酸序列。该序列是A+B+细胞，即同时表达A和B抗原。
SEQ ID NO7 是编码抗原E的核酸序列。
SEQ ID NO8 是编码MAGE-1的核酸序列。
SEQ ID NO9 是MAGE-2基因。
SEQ ID NO10 是MAGE-21基因。
SEQ ID NO11 是MAGE-3的cDNA。
SEQ ID NO12 是MAGE-31基因。
SEQ ID NO13 是MAGE-4基因。
SEQ ID NO14 是MAGE-41基因。
SEQ ID NO15 是MAGE-4的cDNA。
SEQ ID NO16 是MAGE-5的cDNA。
SEQ ID NO17 是MAGE-51的基因组DNA。
SEQ ID NO18 是MAGE-6的cDNA。
SEQ ID NO19 是MAGE-7的基因组DNA。
SEQ ID NO20 是MAGE-8的基因组DNA。
SEQ ID NO21 是MAGE-9的基因组DNA。
SEQ ID NO22 是MAGE-10的基因组DNA。
SEQ ID NO23 是MAGE-11的基因组DNA。
SEQ ID NO24 是s mage-Ⅰ的基因组DNA。
SEQ ID NO25 是s mage-Ⅱ的基因组DNA。
有许多不同的“MAGE”基因已经鉴定出来，本文中即可见到这些序列。如下的实施例中描述的方案用来分离这些基因和cDNA序列。
本文中所用的术语“MAGE”是一种从人细胞中分离出来的核酸序列。首字母缩略词“smage”用来描述鼠源的序列。
当本文讨论的“TRAP”或“TRAs”对一种类型肿瘤具有特异性时，则意味着所考虑的分子与该类肿瘤相关，尽管不需要排除其他的肿瘤类型。
实施例1为了鉴定和分离编码抗原P815A的基因，采用了基因转染技术。该方法既需要基因源又需要一受体细胞系。具有高转染率的细胞系P1·HTR是受体的最初材料，但如不进行进一步处理则不能用。因为它携带有“抗原A”，这是四种可识别的P815肿瘤抗原中的一种。参见Van Pel et al.，Molecular Genetics 11∶467-475(1985)。因此，进行筛选实验以分离不表达所述抗原的细胞系，并且该细胞具有P1·HTR的期望特性。
为完成这个实验，用对肿瘤抗原A、B、C和D的每一种特异的CTLs筛选P1.HTR。Uyttenhove等人在J.Exp.Med.157∶1040-1052(1983)中描述了这种CTLs。
为了进行筛选，将106个P1.HTR细胞同2～4×106个CTL克隆细胞在装有2ml的培养基中的圆底试管内混合，并以150×g离心3分钟，37℃4小时培养后，洗涤所述的细胞，按Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.12∶406-412(1980)中所述的方法在10ml培养基中重新悬浮。关于CTL分析和筛选方案的其他资料可参见Boon et al.，J.Exp.Med.152∶1184-1193(1980)和Maryanski et al.，Eur.J.Immanol.12∶406-412(1982)。
当进行这些筛选时，发现一个既不表达抗原A又不表达抗原B的细胞系变种(variant)。另外用对抗原C特异的CTLs筛选中产生一个缺失抗原C的变种。请参见图2对这些筛选结果的汇总。变种PO.HTR对抗原A、B和C均为阴性，因此也被选出做为转染试验。
细胞系PO.HTR按布达佩斯条约的要求保藏在法国巴斯德研究所国家衍生物保藏中心(the Institute Pasteur Collection Nationale De Cultures De Microorganismes)，该中心位于28，Rue de Docteur Roux，75724 Paris Francs，其编号是I-1117。
采用这一方法学适应于保护其他的细胞系，这些细胞系通常至少可提呈四种可识别P815肿瘤抗原，即抗原A、B、C和D中的任何一种的细胞类型的变种。而这其中也包括不提呈抗原A、B和C三种抗原的变种。P1.HTR是肥大细胞瘤细胞系，于是看出这种方案使分离生物纯的肥大细胞瘤细胞系成为可能，该细胞系不表达P815抗原A、B和C中的任何一种，但都可高度转染。用这种方式也可以筛选其他类型肿瘤以保护所需的、生物纯的细胞系。获得的细胞系应当至少是可用外源DNA转染的，如P1.HTR，应该选择这种细胞系以便不表达一种特异的抗原。
实施例2采用粘粒文库转染以恢复编码tum-抗原基因的效果参见De Plaen等人的先前报道，DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶2274-2278(1988)。
按Woelfel et al.，Immunogenetics 26∶178-187(1987)中报道的方法制备选择性质粒和P1.HTR的基因组DNA。转染步骤经适当修改后按Corsaro等人的方法进行(Corsaro et al.，Somatic Cell Molec.Genet 7∶603-616(1981)。简单地讲，按Bernard等人所述(Bernard et al.，Exp.Cell.Biol.158∶237-243(1985)，将60μg细胞DNA与3μg质粒PHMR272 DNA混合。这一质粒使受体细胞产生抗潮霉素的抗性(hygromycin resistance upon recipient cells)，从而提供一条筛选转染子的方便之路。混合后的DNA中加入940μl 1mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA和310μlM CaCl2。所述的溶液在正常的搅拌下慢慢地加入到1.25ml 5mM的Hepes，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4中，然后用NaOH将其pH值调至7.1。室温放置30-45分钟使得磷酸钙-DNA沉淀形成。随后，每组5×106PO.HTR，共15组在400g离心10分钟。去除上清液，其沉淀物(pellets)再悬浮在含DNA沉淀的培养基中。该混合物37℃孵育20分钟，而后转至80cm2的组织培养瓶中，该瓶中含有22.5ml含10%的胎牛血清的DMEM。24小时后，更换培养基。转染后的48小时，收集细胞并计数。用补加潮霉素(hygromycin)B(350μg/ml)的培养基在大批培养物中筛选转染细胞。这种处理会筛出对潮霉素有抗性的细胞。
对于每一组来说，制备两个培养瓶，每瓶40ml培养基中含有8×106个细胞。为了估计转染子的数量，来自每一组的1×106个细胞被平铺在装有5ml的DMEM平板上，该DMEM含10%的胎牛血清(FCS)，0.4%细菌球脂(Bactoagar)和300μg/ml潮霉素B。12天后计算菌落数，两个瓶的细胞独立的确定菌落数，取其平均值。获得的数据乘5来估计所对应组的转染子数。必须修正P815细胞的克隆效果，修正系数已知约为0.3。
实施例3按前所述，如实施例样2中记载的转染后的第8天，用Ficoll-Paque密度离心技术从死亡细胞中分离出抗生素抗性的转染子。这些细胞被保存在非选择性培养基中1或2天。将这些细胞分注于96孔的圆底培养板中，每孔加入200μl含有30个细胞的培养基中。制备100-400个微孔，这当然要取决于制备出的转染子的数量。琼脂菌落试验(colony tests)估计为500-3000。5天后，孔中含有约6×104个细胞，将微孔中的十分之一转移到培养板上(microplates)，制备出复板(replicate plates)然后30℃孵育。一天后，离心原主板(master plate)。除去培养基，抗P815抗原A(CTL-P1∶5)的750个CTLs加入到每个板孔，并将在上述CTL培养基中含40u/ml重组人IL-2和106辐照后的同基因型的饲养脾细胞(syngeneic feeder spleen cells)和HAT培养基加入其中以杀灭刺激者细胞(stimulat or cells)。6天之后，肉眼检查培养板确定板孔中CTLs是否有增殖。当培养板显示出有增殖的微培养物(mi croculture)后，从板孔中移出100μl转移到另一个培养板中，该培养板含有51Cr标记的P1·HTR靶细胞(2×103-4×103/每孔)，4小时后检测铬释放。对显示高CTL活性的板孔所对应的复板中的微量培养物在含10%FCS的DMEM中用有限稀释法进行扩增和克隆。5天后，收集到约200个克隆，并用前述肉眼溶解实验采用CTL.P1∶5细胞系筛选这些克隆。参见图1中所示的结果。
在这些实验中，15组转染子中有3组得到了几个阳性微培养物(mi crocultures)。按前述检测这些微培养物对P1.HTR溶细胞活性。这一活性已在背景技术部分很好地加以叙述，如图1B所示。该图汇总了有关数据，其中两组细胞(第“5”和“14”组)用30株抗潮霉素转染细胞接种400-300个微孔。加入抗-A CTL P1∶5后可见微培养物的扩增和复制。6天后，检测对P1.HTR的溶细胞活性。图中每一点均表示单一的微培养物的溶细胞活性。
对应于几个阳性板孔的双份微培养物进行亚克隆，发现1%以上的亚克隆被抗-A CTL溶解。因此从33，000抗潮霉素转染子中得到三个单独的表达P815A的转染子。这些细胞系的其中之一，下文中称为P1A.T2被进一步测定。
有关P1A·T2的抗原谱见图2，该图是经过前面描述那种类型的抗-CTL测定获得的。
实施例4对P1A.T2进行的CTL分析显示它提呈抗原A(“P815A”)。因此，它已接受了P1.HTR的基因。这一细胞系用来做为以下实验的抗原前体的基因来源。
早期工作已表明编码tum-抗原的基因可直接从粘粒文库得到的转染细胞中恢复。参见DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶2274-2278(1988)。这一步骤用来恢复P815基因。
用限制性内切酶Sau 3A1部分消化P1A.TT2全基因组DNA，并用NaCl密度梯度超离心技术将其分离开，富集出35～50kb的DNA片段。参见Grosveld et al.，Gene 10∶6715-6732(1982)。这些片段被连接到C2RB粘粒臂上，参见Bates et al.，Gene.26∶137-146(1983)。用SmaI剪断法和小牛肠磷酸酶处理，再用Ba mHI消化，可获得这种粘粒臂(cos mi d ar ms)。按前述记载的方法，连接的DNA被包装入λ噬菌体的组分，用大肠杆菌ED8767滴定。见前述Grosveld等。每微克DNA插入片段中可得到的约9×105个抗氨苄青霉素的菌落。
经在10mM Mg Cl2中混合3000个单个的粘粒和2ml的ED8767来扩增粘粒组，37℃孵育20分钟，孵育后再用20ml Luria Bertani(“LB”)培养基稀释该粘粒组，再孵育一小时。滴定该悬液，并将其接种入1升含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基内。当细菌浓度达到2×108细胞/ml(OD600＝0.8)时，冷冻10ml的等分试样(aliquot)，将200μg/ml氯霉素加入培养物过夜培养。用碱性溶解法分离出全部粘粒DNA，并用CsCl梯度纯化。
在这些实验中，制备了一个650，000粘粒文库。扩增方案涉及使用21组约30，000个粘粒。
实施例5取前述提到的粘粒21组60μg和前述的p HMR272 4μg，以多组5×106PO.HTR细胞作为转染子宿主。按前述实验中描述的相同方法进行转染。再用所述的CTL分析法测定法检测每组平均有3000个转染子对抗原的提呈。有一组粘粒重复产出阳性转染子，其频率约为五千分之一抗药性转染子。例如P1A.T2转染子也显示都表达抗原A和B。转染子P1A.TC3.1的表达模式见图2。
实施例6如前述实施例5所示，分离出了三个独立的提呈P815A抗原的粘粒转染细胞。按De Plaen等人的方法分离这些转染子DNA，将之直接用λ噬菌体提取物包装。(De Plaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶2274-2278(1988)。以实施例5中相同的氨苄青霉素选择法用大肠杆菌ED 8767滴定终产物，以实施例5的同样方式，扩增粘粒，并用PO.HTR再次转染。
可观察到转染频率很高，见下表1。
表1由直接包装得到的经粘粒转移表达抗原P815A用粘粒文库 直接包装0.5μgDNA 表达P815A转染子数/获得的转染子得到的粘粒数量 HmBr转染子数TC3.1 32 87/192TC3.2 32000 49/384TC3.3 44 25/72用限制性内切酶分析粘粒，可以发现直接包装的转染子P1A.TC3.1含有32个粘粒，其中7个是不同的。这7个粘粒当中每一个粘粒以前述的方式，被转染进入PO.HTR。再一次按上述的方案，研究对于P815A的转染子。有4个粘粒转染子表明提呈P815A，同所有本文中描述的实验一样，P815B是共表达的(co-expressed)。
在4个表明能提呈两个抗原的粘粒当中。粘粒C1A.3.1仅仅是16.7千碱基长(kilobases long)，被选择按下面所述的方法做进一步分析。
将所述的粘粒C1A.3.1用于限制性内切酶分析，生成的图谱见图3。
再次用上述的方案转染所有EcoRI片段，只有7.4千碱基片段产生抗-A CTLs能溶解的转染子。采用相同方法对PstI片段进行实验，只有一个全部包含在7.4kb EcoRI片段内的4.1kb片段可产生能溶解的转染子。
用SmaI消化这一片段(即4.1kb PstI片段)，得到一个2.3kb片段，经转染后也产生提呈抗原A和B的宿主细胞。最后，用SmaI/XbaI保护过的900碱基长度的片段也转移后可表达这两种抗原的前体，所述的转染宿主细胞既提呈抗原A对提呈抗原B。
实验例7上述的900个碱基的片段做为探针来探测亲代细胞系P1.HTR中P815A基因的表达。为了完成这一目的，首先用Davis等人的胍-异硫氰酸盐法分离出全细胞RNA，见Davis et al.，Basic Methods In Molevular Biology(Elseview Science Publishing Co.，New York)(1986)。该书中披露的方法采用寡聚-dT纤维素柱层析(oligodT cellulose column chromatography)也可同样用于分离和纯化聚A+的mRNA。
然后用Northern印迹分析法分析样品。在含0.66M甲醛的1%琼脂糖明胶上分离RNA样品。在过夜印迹硝酸纤维素膜之前，用10×SSC处理所述的胶(gels)30分钟(SSC0.15MNaCl，0.015M枸掾酸钠，pH7.0，再在80℃焙烤2小时，此后该膜用含10%硫酸葡聚糖，1%的SDS和1M NaCl的溶液60℃预杂交15分钟。然后，用变性探针(900个碱基的片段)连同100μg/ml鲑鱼精子DNA进行杂交。
当用P1.HTRA+RNA实施这一方案时，可鉴定出两条微弱的带和一条1.2kb的带，见图4中的第1道(6μg的RNA)。
同样的探针用于筛选由相同细胞系的聚-A+RNA制备成的cDNA文库。这样产生了个具有5'-端缺失的1kb的插入片段的克隆。对于cDNA的Northern印迹试验未有图示。
对每个实例在60℃过夜进行杂交试验。用2×SSC室温洗涤印迹斑两次，并用加入1%SDS的2×SS60℃洗涤两次。
采用已知的Sanger双脱氧链终止法(Sanger dideoxychain termina tion method)，表明上述的实验对表达P815A抗原前体DNA是可以进行序列分析的。采用各种限制性内切酶并用合成的寡聚核苷酸引物的特定引发，在克隆上进行这一实验。基因外显子的结果见Seqence ID NO4。
实施例8前述的Northern分析提示了cDNA的5'末端缺失。为得到这一序列，用对应于320-303位的引物从P1.HTA RNA中制备cDNA。然后，用聚合酶链反应和采用Frohman等人描述的5’引物以及对应于286-266位的3'引物扩增该序列(Frohmar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶8998-9002(1988))。发现一期望大小的带(270碱基)，该带可与如前所述的Southern印迹实验中的900bp SmaI/XbaI片段杂交。小小的270bp片段随着克隆到m13tg 130λ tg 131后进行了序列分析。该序列见SEQ ID NO1。
实施例9在实施例7和8以及SEQ ID NO4所示的序列获得后，对粘粒C1A.3∶1的5.7kb区段进行测序。该片段已知含有在转染子中表达P815A的900碱基片段。这一实验使得描述外显子和内含子，因为粘粒原本是基因组的。
所描述的基因结构见图5，其与SEQ ID NO4一起显示出下文中称“P1A”的抗原前体基因其约5千碱基长，并含有3个外显子。对于224个氨基酸的蛋白的ORF(敞开阅读框架)在外显子1处起始，终止于外显子2处。转移表达抗原A和B的前体的900个碱基对的片段仅仅含有外显子1。启动子区段含有如SEQ ID NO1所示的CAAT盒，和一片强子序列(enhancer sequence)。在大多数的MHC I类抗原基因的启动子中已经观察到后者的特征。见Geraghty et al.，J.Exp.Med 171∶1-18(1990);Kimura et al.，Cell 44∶261-272(1988)。
采用Lipman等人(Lipman et al.，Science 227∶1435-1441(1985)建议的K-triple参数为3和6的FASTA程序和用Genbank database release 65(1990年10月)数据库，进行计算机同源性搜索，除了查到对应于由外显子1(524-618位)编码的一部分酸性区段的95个碱基延伸部分之外，未发现有任何同源性。上述的碱基延伸段与编码小鼠核仁蛋白NO38/B23中的氨基酸区段的序列相同，参见Bourbon et al.，Mol.Biol.200∶627-638(1988)，和Schmidt-Zachmann et al.，Chromosoma 96∶417-426(1988)。95个碱基中有56个是相同的。为了测试这些相同的碱基是否是交叉杂交的原因，用900碱基片段筛选的小鼠脾cDNA文库进行实验。获得了密切对应于交叉杂交带大小的cDNA克隆。这些克隆被部分测序，发现2.6kb cDNA能准确地对应于已报道出的小鼠核仁蛋白的cDNA序列，而1.5kb cDNA对应于小鼠核仁蛋白NO38/B23。
下文中简称为“P1A”的基因核苷酸序列的分析提示它的编码产物具有25kd分子量(molecular mass)。SEQ ID NO4分析显示在5-9残基处有潜在的核靶信号(potential nuclear targeting signal)(Dingwall et al.，Ann.Rev.Cell Biol.2∶367-390(1986)和在83-118位点处一个大的酸性区。如前所述，在P1A和两个核仁蛋白之间含有这部分同源区段。125位处丝氨酸可以找到一个假定的磷酸化位点。当然还发现一个次级酸性功能区紧靠近C-末端作为一个由14个谷氨酸残基非阻断的延伸部分。Kessel等人在具有核定位的小鼠hemodomain蛋白中已发现相同的C-未端结构(Kessel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84∶5310(1987))。
在P1A基因序列与P91A，35B和P198序列的比较研究中，未发现同源性，并表明P1A是不同类型的基因和抗原的指示标示。
实施例10用手中现有的P1A探针和序列进行研究，以判断在通常组织中存在的基因是否与肿瘤表达的基因相同。为完成这一任务，用λZapⅡ10和小鼠肾细胞DBA2基因组DNA制备噬菌体文库。P1A做探针。杂交条件如前所述，发现一个杂交克隆。所述克隆含有P1A基因外显子，一和二，并对应于图5所示的-0.7至3.8位点间。这个序列定位之后，进行PCR扩增以得到对应于图5中所示的3.8至4.5位的序列。
进行序列分析，在正常肾基因和从P815肿瘤细胞得到的P1A基因之间未发现差异。
在进一步的实验中，象在前所述DBA2肾细胞中发现的基因被转染到PO.HTR内。如图7所示，这些实验表明抗原A和抗原B被从正常肾细胞中分离出的肾基因和从正常肾细胞分离出的P1A基因有效地表达。
这些实验得出的结论即编码肿瘤排斥抗原前体的基因不是由突变得到的基因，而且，这一基因很明显与存在于正常细胞中并不表达的基因相同。这一发现的结果如下所述非常重要。
在本文中未仔细描述的研究中发现该基因的变种是可以利用的。有些细胞是“P1A-B+”而不是正常的“P1A”。在这些方面之间唯一的不同是外显子1中的点突变，即用Val.替代突变体中第18位编码Ala的三联密码子(triplet)。
实施例11用其他类型细胞进行附加实验。在前述的Northern印迹杂交方案下，测定正常肝和脾细胞的RNA以判断是否能发现P1A基因的转录体。Northern印迹实验数据见图4，其中，可见无表达之证据。
小鼠P815细胞系是肥大细胞瘤，从该细胞系中可分离出PlA。因此，研究肥大细胞系以判断它们是否也表达所述的基因。按前述Northen印迹分析方法测定了Nabel等人描述的(Nabel et al.，Cell 23∶19-28(1981))肥大细胞系MC/9以及源于骨髓的肥大细胞短期培养物，但是未发现转录体。相反当测定一个源于Balb/C的IL-3依赖的细胞系L138.8A(Hultner et al.，J.Immunol.142∶3440-3446(1989))时，却发现了很强的信号。关于肥大细胞的研究工作结果见图4。
已知BALB/C和DBA/2品种小鼠共享(share)H-2d单倍型(haplotype)，因此采用前述的CTLs有可能测出对细胞溶解的敏感性。图8示出这些结果，它基本上可以证明抗-A和抗-B CTLs强有力地溶解细胞，而抗-C和抗-D细胞系则不然。
在其他小鼠肿瘤细胞系，例如畸胎癌(teratocarcinoma)细胞系PCC4(Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶272-275(1977)和白血病细胞LEC和WEH1-3B上进行进一步的测定。在这些样品中未能检测到任何表达。
实施例12由MHC分子真正提呈P1A抗原是很有兴趣的，为测出这一情况，将粘粒C1A.3.1转染到一株成纤维细胞系DAP，它显示表型为H-2k。用表达kd、Dd或者Ld抗原基因转染所述的细胞系。用粘粒和MHC基因同时转染后，再次按前述方法研究使用CTLs的细胞溶解情况。该研究结果汇总在表2中，可见为提呈P1A抗原A和B需要Ld。
表2 抗原P815A和P815B的H-2-限制受体细胞* CTL溶解的克隆数/ HmBr克隆数*CTL抗-A CTL抗-BDAP (H-2k) 0/208 0/194DAP +Kd0/165 0/162DAP +Dd0/157 0/129DAP +Ld25/33 15/20＊含有全P1A基因的粘粒C1A.3.1转染到早先已由H-2dI类抗原基因转染过的DAP细胞中。
＊单个抗药菌落用一个肉眼观察的方法中检定由抗-A和抗-B CTL诱导的溶细胞反应。
如下所述，用人细胞和HLA分子实验中可确定一个克隆可能与用特定的MHC分子提呈肿瘤排斥抗原相关。
实施例13用P1A基因序列以及由引获得的氨基酸序列，可鉴定出表现为A+B+和A-B+的抗原多肽，(其中A+B+细胞特征既表达A又表达B)。所述的多肽见图10。当把这种多肽给入PO.HTR细胞样品中并且对提呈该多肽特异的CTL细胞系存在下时，将会导致所述的PO.HTR细胞溶解，并支持这样一种观点基于由该基因表达的这种产物的多肽可以被用于疫苗。
实施例14以下简称MZ2-MEL的人黑色素瘤细胞系不是克隆细胞系。它表达4个稳定的、并由同源CTLs识别的抗原，分别称之为“D、E、F和A”抗原。另外，某些肿瘤亚细胞系表达另外两个抗原“B”和“C”。Van den Eynder等人已描述了对这6个抗原特异的CTL克隆，(Van den Eynder et al.，Int.J.Canc.44∶634-640(1989))。已知的MZ2-MEL亚克隆为MEL43、EML3.0和MEL3.1(前述的Van den Eynde等人)。细胞系MEL3.1表达抗原E，该抗原的确定就好象前述P815变种株中所述的用CTL研究法那样。因此，它被选作表达该抗原前体的核酸序列的来源。
在分离肿瘤排斥抗原前体的相关核酸序列中，前述建立的技术显示所需的受体细胞应满足以下两个标准(ⅰ)受体细胞在正常情况下不能表达目的TRAP;(ⅱ)它必须表达相关I类HLA分子。受体细胞也必须有高转染频率，即它必须是一个“良好”受体。
为了制备这样一种细胞系，按前述Van den Eynde用的方法，用抗-E CTL 82/30反复选择，克隆亚细胞系MEL3.1。反复选择的过程导致分离出亚克隆MZ2-MEL-2.2 isc E-。这个亚克隆也是HPRT-(即，对HAT培养基内成分，如10-4M次黄嘌呤，3.8×10-7氨基蝶呤，1.6×10-5M2-脱氧胸苷敏感)。下文中对这一亚克隆简称为“MEL-2.2”。
实施例15参照Woelfel等人的方法制备MEL3.0的基因组DNA，(Woelfel et al.，I mmugenetics 26∶178-187(1987)。质粒pSVtkneoβ具有Geneticin抗性(Geneticin为一种氨基糖苷类抗生素)，参见Nicolas et al.，Cold Spring Harb.Conf.Cell Prolif.10∶469-485中所述，因此该质粒可按本实验的方法用于共转染(Cotrans fection)的检测标记。
按类似于Corsao等人提出的但不完全相同的方法，(Corsao et al.，Somatic Cell Molec.Genet.7∶603-616(1981))共转染全部基因组DNA和质粒。将所述的基因组DNA(60μg)和质粒DNA(60μg)在940μl的1mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mMEb TA中混合，随后加入310μl的1M CaCl2。
在常规搅拌下，将该溶液缓慢加入1.25ml的2×HBS(50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4)中，用NaOH 调至pH7.1。室温下30-45分钟便形成磷酸钙DNA沉淀，随后它们被加入预先用3×106MEL2.2细胞已接种24小时的80cm2组织培养瓶中，该瓶已装有含10%胎牛血清的22.5ml的黑色素瘤细胞的培养基(Dulbecco's Modified Easgle's Medium)。24小时，更换培养基。转染后48小时，收集细胞，接种4×106个细胞于含2mg/ml Geneticin的黑色素瘤细胞培养基的80cm2培养瓶中，Gereticin做为选择标记物。
实施例16转染后13天，计数geneticin抗性克隆，收集后在无选择培养基中培养2或3天。然后，将转染细胞置入96孔培养板，每孔200个细胞在200μl培养基中，200μl的培养基中含有20% FCS，目的是每孔获得约30个生长克隆。加入这么多数量的微培养物，其目的是达到足够多以使每个独立的转染子至少再现四次。
10天后，板孔含有约6×104个细胞。脱壁分散这些细胞，每一微培养物的3分之一被转移到双培养板。6小时后，即在重新贴壁(readherence)后，除掉培养基，将1500个抗-E CTL(CTL 82/30)加入含有35u/ml IL-2的100μl CTL培养基的每个板孔中去。一天后，收集上清(50μl)，检测TNF浓度，这样做的原因见如下实施例。
实施例17哺乳动物基因组的大小为6×106kb。由于整合到每个抗药性的转染子内的DNA平均量估计为约200kb，所以需要对最少为30，000个转染子检测来判断抗原E是否已被转染。先前对小鼠细胞的研究工作已经显示当采用CTL刺激检测实验时，可以鉴定出仅含有30%的表达目的抗原的组。这将减少系数约为30的(by a factor of 30)分析检测数量。如前所述，虽然在混合后的E+/E-细胞中的抗-E CTL分析很有帮助，但是仍然不够，因为还不能获得一致性结果。
其结果是设计出一个替换试验。采用此处不必重复的公知技术，通过测定肿瘤坏死因子释放(TNF)来研究CTLs的刺激情况。如实施例15所示，每个共有转染子的板孔内已经加入1500个CTL的82/30细胞。刺激后第6天收集这些CTLs。如前所述，移去每个孔中的三分之一的细胞之后，剩余的三分之二(4×104)已重新贴壁，并加入CTLs和IL-2。24小时后移出50μl的上清，将上清转移到培养板内，该培养板内含有3×104W13细胞(WEHI-164克隆13;Espevik et al.，J.Immunol.Meth.95∶90-105(1986))。该细胞培养物内已含有50μl的W13培养基[(RPMI-1640，并补充有L-精氨酸(116mg/L)，L-天冬酰胺(36mg/L)、L-谷氨酸(2.6mg/2)]，此外，还含有2μg放线菌素B(在37%浓度下)的10%FCS并在8%CO2条件下培养。细胞系W13是对TNF敏感的小鼠纤维肉瘤细胞系。用RPMI1640将重组TNF-β稀释成不同浓度梯度再加入对照靶细胞。
孵育20小时后，评估W13培养物，用Hansen等人报道的色度分析法的改进法(adaptation of the colorimetric assay)测定死细胞的百分率(Hansen et al.，J.Immunol.Meth.119∶203-210(1989))。该方法涉及在PSS中以2.5mg/ml的浓度，加入50ml(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(3-(4，5-dimethythiazo1-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide)，随后37℃孵育2小时。加入100μl的细胞裂解液溶解深兰色的甲
(formazan crystal)结晶。该细胞裂解液配方为一体积的N，N-二甲基甲酰胺，在37℃和二体积的含30%(w/v)十二烷基硫酸钠水溶液混合制成，然后用1.6%的乙酸和2.5%1NHCl将该溶液pH调节至4.7。37℃过夜孵育培养板，用650nm做对照，取570nm测定的ODs值。死亡细胞百分率用以下公式算出100× (100-(OD570样品孔))/(OD570孔＋培养基) 按Esperik等人提出的方法操作(Espevik et al.，J.Immunol.Meth，P5∶99-105(1986))。其结果表明既使当E+/E-细胞比例低到1/45，也能观察到明显的TNF产生，这示为活性CTLs。这样可得出测定30组内的抗药性转染子的决定。
实施例18以前述实施例17中的方法测定细胞TNF的产生情况。转染后，测定全部100个组的E-细胞(4×106细胞/组)，得到7×104各自Geneticin抗性的转染细胞，平均每组有700株。只有一组转染细胞使微培养物引起抗-E抗原CTL克隆82/30产生TNF。受检的300克隆当中，有8株呈阳性。然后用标准51Cr释放分析法检测这些克隆被抗-E CTL溶解情况，发现它们均被溶解了，其效果同原来的E+细胞系相同。本文的转染子E.R1具有和MEL2.2株CTLs对抗原B.C.D和F相同的溶解谱。
事实上，在7000个Geneticin抗性转染子中只有一个转染子提呈这种抗原，这一事实起初似乎非常低，但并非没有。如前所述对于P815的研究显示平均频率为1/13，000，人DNA受体MEL2.2比P1.HTR整合DNA少5倍。
实施例19一旦发现了转染子E.T1，分析时不得不强调几个问题，包括是否细胞群(cell population)有E+污染细胞。前述的抗原提呈分析表明E.T1是B-和C-，很象受体细胞MEL2.2。用标准筛选也发现它是HPRT-。本文中采用的所有E+细胞是HPRT+。
MEL2.2的回复子E+可能是E.T1的来源。为了测试这个结论，采用Perucho等人的观察方法(Perucho et al.，Cell 22∶309-317(1980))，共转染的序列常常是在受体基因组的单一位置共同整合。假如由于用PSVtkneoβ共转染得到转染子的抗原E，那么应该连接上这些序列，当删去该抗原序列时也可能删缺邻近的pSVtkneoβ序列。前述的Woelfel等人已经证实了这一事实。假如用pSvtkneoβ转染正常的E-细胞，也应该连接这些序列并且抗原缺失也可能表示缺失邻近的pSVtkneoβ序列。假如用pSVtkneoβ转染的正常的E+细胞是E.T1，则不应该发生“共缺失”(co-deletion)。为了测定这一情况，如前所述用82/30对转染子E.T.进行免疫筛选。用对这种由CTLs所致细胞溶解产生的抵抗作用得到了两个抗原缺失变种。这两个变种株都没有失去对Gereticin的抗性，然而，Southern印迹分析实验表明所述的变异细胞中缺少几个neor序列，这可说明在E.T1中的E基因和neor基因之间紧密连锁，从而得出E.T1是转染子。
实施例20采用E+亚克隆MZ2-MEL 4B作为制备粘粒文库的DNA来源。这个近700，000粘粒的文库被转染入MA2-MEL 2.2细胞，转染按前述的粘粒转染方法进行。
经过把粘粒转染子的DNA直接包装到λ噬菌体的组份中，有时很可能回收含有目的序列的粘粒。该方法在此是不成功的，因此我们通过把转染子DNA连接到粘粒载体pTL6的适当限制酶切片段上来挽救所述的转染序列。我们用两个转染子进行尝试，其中之一获得成功。称做B3粘粒是被从这个实验中得到的，再用XmaI进行限制性内切酶消化或用BamHI消化一段大的12kb XmaI转染片段。这些片段被克隆到载体pTZ 18R，然后转染到MEL2.2中去。再次检测TNF产生情况以确定转染是否成功。这些实验能决定一个基因序列能够在12kbXmaI片段上、然后在BamHI消化12kb片段得到的2.4kb片段上转染抗原E。
如Southern印迹(Bam HI/SmaI消化的DNA)实验所确定的这个2.4kb片段可以和MZ2-MEL的2.4kb片段和患者MZ-2的T细胞克隆的片段杂交。如图12所示未见有MZ2-MEL的E-抗原缺失变异株的这条泳带。
E抗原前体基因序列已确定，该序列如下
实施例21鉴定出2.4kb基因组片段后，进一步研究确定“E+”亚细胞系是否表达任何同源DNA。以细胞系MZ2-MEL 3.0为来源，用公知技术从mRNA中制备cDNA文库。采用2.4kb片段作为探针，采用Northen印迹分析法鉴定出约1.8kb的mRNA为同源。当筛选cDNA时，得到的克隆显示对于2.4kb片段部分几乎全部相同。鉴定出两个外显子。经过对在2.4kb BamHI片段前定位的粘粒B3片段的测序，另外一个外显子位于这些片段的上游。如图8所示的该基因扩大了约4.5kb。采用对cDNA5'-末端的PCR，确定了转录区段的启始点。那三个外显子包括65，73和1551个碱基对。ATG位于外显子3的66位，828碱基对读框就从此开始。
实施例22为了确定是否较小的2.4kb片段能够转移抗原E的表达，采用公知技术制备出与那些较大基因对应的较小片段(pieces)，并将其转入E-细胞。图8示出所述三个片段的界线。
以这种方式转移抗原表达，很显然该基因编码着该抗原前体，而不是编码激活抗原的蛋白。
实施例23前述的cDNA探测令人吃惊地表示出是两个不同的却紧密相关的cDNA。当测定这些cDNAs时，它们不转移抗原E的表达，但它们的确显示出与第一个cDNA片段绝大部分的同源性。这三个片段很明显是一新识别的族基因，称作“黑色素瘤抗原”的“MAGE”。图9中，“MAGE-1”直接表达MZ2细胞抗原。每个基因的第三外显子部分见于图9。第二和第三序列之间比第一序列更加密切相关(同第一序列相比分别存在18.1%和18.9%的差异;而第二和第三序列之间相比只有12%的差异)。除了获得的9个cDNA克隆之外，每个类型又得到三个克隆，暗示它们表达都相同。下文中使用的“MAGE”是指一族分子(a family of molecules)和编码这些分子的核酸。这些核酸共享某种程度的同源性，并在包括几种类型的人肿瘤细胞以及人肿瘤的肿瘤细胞上表达。所述的族分子被称做“MAGE”其原因是其是在人黑色素瘤细胞中鉴定出来的第一组成员。如下述实验所示，“MAGE”族成员(members)不只是被限定于黑色素瘤，然而MAGE涉及一族肿瘤排斥抗原前体和编码这些前体的核酸序列。从中获得的抗原本文中称之为“MAGE TRAs”或者“黑色素瘤抗原肿瘤排斥抗原”。
实施例24用小鼠肿瘤的实验已显示由T细胞识别的新抗原可能来自于点突变。这种点突变在编码该新抗原多肽一个区段内修饰活性基因。新抗原也可能源于那些在绝大多数正常细胞中不表达的基因的激活。为了弄清关于抗原MZ2-E的问题，对出现在黑色素瘤细胞内的Mage-1基因同患者MZ2的正常细胞内存在的Mage-1基因进行比较。采用覆盖所述2.4kb片段前半段的约1300bp伸长部分作为引物，并对植物血凝素活的血淋巴细胞的DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增。如希望的那样，得到-PCR产物，而未得到E-突变体的DNA的产物。这一PCR产物的序列被证明与E+黑色素瘤细胞携带的对应基因序列相同。然而，发现用克隆的PCR产物转染过的细胞表达抗原MZ2-E。这一结果提示一个正常为静止的基因在被激活后可能会呈现肿瘤排斥抗原MZ2-E。
实施例25为了评价由各种正常和肿瘤细胞表达的基因mage-1，用含有第三外显子大多数序列的探针杂交Northern印迹带。同用人肿瘤细胞系MZ2-MEL3.0观察得到的结果相反，没有发现任何与患者MZ2的CTL克隆中和同一患者的植物血凝素激活的血淋巴细胞中分离得到的RNA相关的泳带。其他个体(图10和图11)的几种正常组织也显示阴性。测定其他患者的14黑色素瘤细胞系。11个呈阳性，泳带呈不同密度。除了这些培养的细胞系之外，还分析了4个黑色素瘤组织样品。两个样品，包括一个有转移的患者MZ2，被证明呈阳性，排除了基因表达代表人组织培养人工产物的可能性。检测几个其他组织学类型的，包括肺肿瘤。大多数这些肿瘤呈阳性(见图10和11)。这些结果表明许多黑色素瘤以及其他肿瘤都表达MAGE基因族产品。然而，这些细胞表达空间是基因Mage-1，2或3中的那一个不太十分清楚，因为对应于这三个基因的DNA探针在相当的程度上能交叉杂交。为了使这一分析更加特异性，采用PCR扩增和与高度特异的寡聚核苷酸探针杂交。用与外显子3的序列相对应的寡聚核苷酸引物扩增得到的cDNA。该外显子序列对于三个本文中讨论的MAGE基因来说均相同。然后测定PCR产物是否能与对三个基因(图9)各自具有完全特异性的三个寡聚核苷酸杂交。用阴性细胞RNA稀释黑色素瘤MZ2-MEL3.0的RNA进行的对照实验显示按本文中使用的条件，在稀释浓度为1/300时，还能测出按稀释比例信号强度依次降低。那些用PCR检测的正常淋巴细胞被证实为阴性表达三个MAGE基因，提示表达水平要比MZ2黑色素瘤细胞系(图11)的1/300还要少。对于一组黑色素瘤细胞系而言，其结果清楚地表明有些黑色素瘤表达MAGE基因mage 1，2和3，而其他黑色素瘤只表达mage-2和3(见图11和10)。有些其他肿瘤也表达所有三个基因，而其他肿瘤只表达mage2和3或只表达mage-3。正常情况下不可能排除某些阳性PCR结果不反映三个特征的MAGE基因中任何一个基因的表达，但是也不反映表达其它密切相关的可能与引导和杂交寡聚核苷酸共享部分的基因。可以得出这样的结论，即一大批不同肿瘤可表达MAGE基因族，以及这些基因在正常受检的细胞中呈静止状态。
实施例26高效转染及高效表达TRAP序列的可利用性使得寻找相关的主要组织相容复合体(MHC)I类分子成为可能。患者MZ2的I类特异性是HLA-A1，A29，B37，B44和C6。用2.4kb片段和pSVtkneoβ共转染四个另外具有与MZ2共同的A1患者的黑色素瘤。三个黑色素瘤产生neor转染子，该转染子可刺激由抗-E CTL克隆82/30作用释放TNF，该克隆是图10中的CD8+。用4个其他黑色素瘤，其中有些与MZ2共享A29、B44或C6，没有获得E-转染子。提示提呈抗原MZ2-E的分子是HLA-A1。实证过程中发现，来自HLA-A1患者肿瘤的6个黑色素瘤细胞系中，有两个可刺激患者MZ2的抗-E CTL克隆82/30作用释放TNF。在这些肿瘤细胞系中有一个细胞系，MI 13443-MEL也显示对这些抗-E CTL溶细胞的高度敏感性。这两个是表达mage-1基因的黑色素瘤(图13)。对具有HLA单倍型(haplotype)并不包括A1患者的8个黑色素瘤进行检测，以确定其对由CTL介导的细胞溶解敏感性，以及刺激TNF释放。未发现阳性。Darrow等人已经报道了有些人抗-肿瘤CTL能溶解与原发肿瘤共享的适当的HLA特异性的同种异体基因型的肿瘤(Darrow，et al.，Immunol.142∶3329∶(1989))。由基因mage 2和3编码的抗原多肽也完全可能由HLA-A1或者其他I类分子提呈给自身的CTL，特别是如前所述在小鼠肿瘤中发现这一相似的结果。
实施例27如前所述，黑色素瘤MZ2除了表达抗原E之外，也表达其抗原F、D和A’。在分离编码抗原E核酸序列之后，进行同样实验分离编码抗原F的核酸序列。
为达到这一点，采用抗-F CTL克隆76/6处理细胞系MZ2-MEL2.2即前述的E-细胞系的培养物。其方法与用抗-E CTL克隆进行处理方法相同。这可以分离出一个F抗原缺失的突变体，然后再对其进行几轮的筛选。得到的细胞系“MZ2-MEL2.25”绝对抵抗-F CTL的溶解，但对抗-D CTLs可被溶解。
在该方案揭示出分离抗-E前体DNA后，再用F+细胞系MZ2-MEL3.0的基因组DNA转染F-突变体。该实验产生出90，000个抗药转染子。检测这些转染子的MZ2-F的表达，采用有30株细胞的库按前述的TNF测定方法进行上述试验。有一个库的细胞可由抗-F CTLs作用刺激TNF释放，并被克隆化。发现145个克隆中有5个刺激抗-F CTLs。按前述方案进行的溶解分析可确定(ⅰ)编码抗原F基因已表达，(ⅱ)抗原F自身进行提呈。
实施例28在鉴定出F+细胞系之后，用从中获得的DNA转染细胞。为了完成这一步骤，用前述方法制备F+细胞系MZ2-MEL.43的粘粒文库。该文库被分成14个组群，每组约50，000个粘粒，将每组中获得的DNA转染到MZ2-MEL2.2.5。然后检测转染子能否刺激由抗-FCTL克隆76/6作用的TNF释放。14组粘粒中，有一组产生两个独立表达抗原F的转染子;在17.500Geniticin抗性转染子中有两个阳性表达株可生产出抗原。
实施例29通过观察Southern印迹谱(图12)，提示基因族的存在。为了证实这个结果，用32P标记2.4kb BamHI片段，该片段转移表达抗原MZ2-E，并把标记片段用做探针检查E+克隆化的亚克隆MZ2-MEL2.2 BamHI消化后的Southern印迹。杂交条件包括50μl/cm2的3.5×SSC，1×Denhardt's溶液;25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，0.5%的SDS，2mM EDTA，其中所述的2.4kb探针已被浓度为3×106cpm/ml[α32P]dCTP(2-3000Ci/mole)标记。65℃杂交18小时。此后，在65℃下用2×SSC，0.1%SDS洗膜四次，每次1小时，最后一次用0.1×SSC，0.1%SDS洗30分钟。为鉴定杂交结果，用Kodak X-AR胶片和Kodak X-Omatic精细明暗度屏板(fine intensifing screen)进行放射自显影。
在下述实施例中，当使用“杂交”这一技术时，其所采用的严格条件均与前述相同。此处采用的“严格条件”是指上述的条件;途径以及常规技术中认定的改良法。
实施例30从人肉瘤细胞系LB23-SAR的样品中鉴定出编码mage 4的cDNA。发现这一细胞系不表达mage 1，2或3，但是该细胞系中mRNA的确与mage 1的2.4kb序列能够杂交。为了进一步研究这一结果，从LB23-SAR总mRNA中制备-cDNA文库，然后将其与2.4kb片段杂交。与这一探针杂交后鉴定出一段cDNA序列。鉴定出的片段下文中称作mage 4。
实施例31用患者“MZ2”的PHA激活的淋巴细胞进行实验，“MZ”作为细胞源在前面已讨论过。用来自PHA激活的细胞中的粘粒文库杂交一个寡聚核苷酸探针，该探针与mage 1同源但不与mage 2或3同源。杂交BamHI粘粒片段的大小是4.5kb，因此这种材料不是mage 1;而根据对mage 1到4的同源性，这一片段可被称做“mage 5”。MAGE 5的序列见SEQ ID NO16。
实施例32检测黑色素瘤细胞系LB-33-MEL。从该细胞系制备总mRNA再用于制备cDNA，然后用寡聚物CH09(ACTCAGCTCCTCCCAGATTT)和CHO 10(GAAGAGGAGGGGCCAAG)进行扩增。这些寡聚物(Oligos)对应于外显子3的区段，外显子3是前述的mage1，2和3共同部分。
为了完成这一方法，稀释1μgRNA至总体积为20μl，使用的溶液中含有2μl的10xPCR缓冲液，2μl 10mM dNTP，1.2μl 25mM MgCl2，1μl 80mM的前述的CHO9溶液，20单位的RNAsin以及200单位的M-MLV反向转录酶。随后42℃孵育该溶液40分钟。再用8μl 10×PCR缓冲液，4.8μl 25mM MgCl2，1μl CHO10，2.5单位的抵抗热变性DNA聚合酶又称“Taq”聚合酶以及水制成总体积为100μl的溶液中进行PCR扩增。然后循环扩增30次(94℃ 1分钟;52℃2分钟，72℃3分钟)然后对每次反应后取10μl反应物在琼脂糖明胶上进行大小片段分离，再进行硝酸纤维素膜印迹。发现其产物与寡聚核苷酸探针CHO18(TCTTGTATCCTGGAGTCC)可以杂交。鉴定出该探针是mage 1，不是mage 2或3。然而，该产物不与探针SEQ 4(TTGCCAAGATCTCAGGAA)杂交。该探针结合mage 1，但不结合mage 2和3。这说明该PCR产物中含有一段不同于mage 1，2和3的序列。对这一片段进行测序也显示与有关mage 4和5的差异。这些结果表明不同于选前鉴定出的mage 1、2、3、4和5的序列而被命名为mage 6。
实施例33用来自PHA-激活的MZ2淋巴细胞粘粒文库进行附加实验中，2.4kb mage 1片段被用做探针，并分离出一互补片段。该克隆却不结合与mage 1、2、3和4特异的寡聚核苷酸。获得的这一序列表明与mage 1，的外显子有一些同源性，但与mage 1至6不同。下文中称它为mage 7。另外也筛选出mage 8至11。
实施例34以下实施例说明TRAPs以及从中得到的TRAs的应用。
mage 1的外显子3已表明转移表达抗原E。其结果是决定测定来自该外显子3的合成多肽是否能被用于产生对抗-E CTL的敏感性。
为此，采用标准方法，用来自外显子3.1的合成多肽孵育对那些抗-E/CTLs正常情况下不敏感的细胞。用前述的CTL溶解试验和在3mM多肽浓度下对P815A进行测定，多肽Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr表明为最佳。该分析表明溶细胞程度为30%、指出产生了对抗-E CTL的敏感性。
实施例35从小鼠细胞中分离称做“s mage”的核酸序列。采用前述的方法，再用粘粒载体C2RB从正常的DBA/2肾细胞的DNA中制备粘粒文库。MGAE-1的2.4kb BamHI片段用做探针。将该DNA印迹到尼龙滤膜上，在65℃用2×SSC洗涤这些DNA以鉴定smage材料。
实施例36用前述的方法进一步测定组织样品中是否存在MAGE基因。得出如下结果。
在脑或肾肿瘤组织中没有MAGE基因的表达。虽然不是所有受测肿瘤表达全部MAGE基因但大肠肿瘤组织表达MAGE 1、2、3和4。其中胰腺肿瘤(MAGE 1);非小细胞肺(MAGE 1、2、3和4)，前列腺(MAGE 1)，肉瘤(MAGE 1、2、3和4)，乳腺(MAGE 1、2和3)以及喉(MAGE 1和4)都表达。
实施例37从黑色素瘤患者MZ2的外周血淋巴细胞中获得溶细胞性CTL克隆“20/38”。该克隆参见Van den Eyned et al.，Int.，J.Cancer 44∶634-640(1989)中的报道。CTL克隆的分离参见Herin et al.，J.Cancer 39∶390-396(1987)。然而本文中描述了这种分析法。体外生长的自体黑色素瘤细胞，然后，在DMEM中以107细胞/ml再悬浮，其中，DMEM中含有10%的HEPES和30%FCS，然而且200μCi/ml的Na(51Cr)O4条件下37℃孵育45分钟。用含有10mM HEPES的DMEM三次洗涤标记后的细胞。然后，在加有10mM龋牛校牛雍停保埃
FCSDMEM中重新悬浮这些细胞。此后将100μl含有103细胞液分配到96孔的培养板内。向100μl的同样的培养基中加入CTL克隆的样品，重复分析两次。培养板以100g离心4分钟，并在5.5% CO2的条件下37℃孵育4小时。
再离心培养板，收集100μl上清，并计数。按下述公开式计算51Cr释放百分率
51Cr释放%＝ ((ER-SR))/((MR-SR)) ×100其中，ER是观察到的实验51Cr释放量，SR是200μl培养基中孵育103标记后细胞测到的自发释放量，MR是向靶细胞加入100μl 0.3% Triton X-100后得到的最大释放量。
扩增表现出高CTL活性的单核细胞血样并用有限稀释法进一步克隆，再次筛选。
相同方法被用于测试K562靶细胞。当使用EBV-B细胞时，仅有的变化是用含有5%FCS的Hank's培养基替换DMEM培养基。
这些实验最后可分离出CTL克隆20/38。
图1示出这些分析的结果。特别是可见CTL克隆溶解了自体的黑色素瘤细胞系MZ2-MEL.3.0，但没有溶解EBV-B细胞系，成纤维细胞，K562或非自体的黑色素瘤细胞系SK-MEL-29。
实施例38一旦所述的CTL克隆被认为是对自体细胞系特异时，应测试它的抗原特异性。为了解决这个问题，用前述相同类型的铬释放分析法测试来自患者MZ2的抗原缺失变种。这些靶细胞系是D+，E+，F+，A+，MZ2-MEL.3.0，D-MZ2-MEL.61，E-MZ2-MEL.2.2，和F-MZ2-MEL.4。除了CTL克隆20/38，对那些已知是抗-A(CTL28/336)，抗-F(CTL76/6)和抗-E(CTL22/13)的克隆也进行了测定。
这些结果见图15。将会看到CTL克隆20/38可溶解所有的导致铬释放的细胞系，D-细胞系MZ2-MEL.61除外，因此表明CTL克隆是抗-D的。由本文中未示出的实验中证实只有在提呈抗原D的黑色素瘤细胞系存在时才观察到由CTL克隆导致的TNF释放。
实施例39一旦鉴定出抗原D是靶分子时，进行的研究确定提呈该分子的HLA型。如实施例中描述的实验显示MZ2-MEL提呈抗原D，已知该细胞系的HLA的特异性还包括A1、A29、B37，B44，Cw6、C.cl.10，然而已知已缺失HLA分子A29，B44，和C.cl.10的MZ2-MEL变种仍表达抗原D，因此它们可以不必考虑。对表达B37的细胞系未进行研究，因此未能得到任何结果。
总共测试了13个表达成HLA-A1(13个中有10个)，或者Cw6(13个中有3个)同种异型基因细胞系。测试细胞系以观察它们刺激由CTL克隆20/38作用的TNF释放的能力，采用方法是Traversari等人的方法，参见Traversari et al.，Immunogenetics 35∶145-152(1992)。该分析方法可对WEHI 64-13细胞上清的毒性进行测定来确定TNF的释放情况。
在这些分析过程中，来自同种异型基因(allogeneic)细胞系的细胞样品(3000，10000或30000个细胞)在1500个CTL克隆细胞和25u/ml的IL-2的存在下进行培养。24小时后，测试培养物上清抵抗对WEHI细胞的毒性。其结果见下面的表3。
发现有8个细胞系刺激CTL克隆20/38的TNF释放。所有这些细胞系均是HLA-A1。Cw6提呈的细胞系未发现这种情况。
也分析了这些细胞系以确定MAGE的表达。所有8个刺激TNF释放的细胞系都表达MAGE-3，而两个呈阴性的HLA-A1细胞系不表达MAGE-3。
实施例40以实例得到的结果之观点，进行实验以判断抗原D是否是来自MAGE-3的肿瘤排斥抗原。为了进行这一实验，采用100ng的克隆入pcDNA I/Amp的HLA-A1基因，以及(a)克隆入pcDNA I/Amp的MAGE-1 cDNA，(b)克隆入pcDSRα的MAGE-2的cDNA，或者(c)克隆入pcDSRα的MAGE-3的cDNA中的任何一种的100ng cDNA转染受体COS7细胞。按使用说明书的要求，将转染序列连接到质粒上。以每个板孔15，000个细胞的量将COS-7细胞样品接种到组织培养平底板孔中，该板孔中含有10%FCS的Dulbeco's modified Eagles Medium(“DMEM”)。37℃过夜孵育该细胞，移去培养基，然后换入含10%Nu血清，400μg/ml DEAE-dextran，100nM氯喹和上述质粒的DMEM培养基，每孔30μl。37℃孵育4小时后，吸去培养基，再换入50μl含10%DMSO的PBS。2分钟后吸去这种培养基，再换入200μl的含10%FCS的DMEM。
更换培养基后，37℃孵育COS细胞24小时。然后弃去培养基，在100μl的含10%混合人血清和25u/ml的IL-2的培养基中加入1500个CTL克隆20/38细胞。24小时移出上清，WEIH细胞上测定其中TNF含量，其方法采用Traversari等人的方法。参见Traversari et al.，Immunogenetics 35∶145-152(1992)。其结果见图16。
可见用HLA-A1和MAGE-3转染后的COS7细胞强烈刺激CTL克隆，而用其他mage基因转染后的细胞没有这种作用。因此可以得出抗原D是源自基因MAGE-3编码的肿瘤排斥抗原前体的肿瘤排斥抗原，同时该TRA由HLA-A1分子提呈。
前述公开内容，包括实施例，对于本领域技术人员来说至关重要。开始时，这些实施例鉴定并提供了分离编码肿瘤排斥抗原核酸分子以及与此互补的核酸分子的方法。已知DNA以双链形式存在。双链中的每条链都相互互补。核酸杂交技术已经发展到这样一种地步，即若给出单股DNA链，那些熟练的技术人员就能分离出它的互补链，或者合成之。
本文中所述的“核酸分子”是指具有前述特性的所有种类的DNA和RNA。基因组和互补DNA或“cDNA”都编码特定蛋白，正如针对关于分离编码MAGE序列的实施例中所示的那样，本发明使本领域技术人员懂得如何去得到它们。
同样，也能获得如mRNA的RNA分子。对于技术人员来说，只要手中具有一编码序列，即能分离或合成mRNA。
不编码TRAP，例如“反义(antisense)DNA”或mRNA的互补序列是非常有用的，既能用来探测编码序列又可作为阻断其表达的手段。
实施例也十分清楚的表示出生物纯细胞系培养物的制造方法，这些细胞系已用编码或表达TRAP分子的核酸序列转染过。这种培养物能被用作肿瘤排斥抗原的来源，或者作为治疗剂。这一方面在本发明前面已讨论过。
TRAP编码序列转染过的细胞也可以用其他编码序列转染。所述的其他编码序列包括细胞活性因子基因(cytokine genes)，例如白细胞介素(如IL-2或IL-4)，或主要组织相容性复合体(MHC)，或者人白细胞抗原(HLA)分子。细胞活性因子基因转染非常有价值。因为期望它们的表达将增强体内生物纯细胞的治疗效果，现有技术已经很好地意识到它们的治疗作用，如白细胞介素转染细胞已输入给患者以治疗其癌症。在特别优选的实施方案中，推荐用编码(ⅰ)TRAP分子，(ⅱ)HLA/MHC分子和(ⅲ)细胞活性因子中的一种分子之序列转染细胞。
用MHC/HLA编码序列转染是理想的，因此只有特定的MHC/HLA分子特异性地或者优选提呈某些TRAs。因此，只要受体细胞已经表达了与TRA提呈相关的MHC/HLA分子，虽然可用进一步转化引起抗原的过量表达，但是不必进行另外的转染。另一方面，当受体细胞不正常表达相关的MHC/HLA分子时一个很理想的办法就是用一个次级序列进行转染。当然可以理解，用一个另外序列进行转染不排除用其他序列进一步转染。
本文中使用的与细胞系相关的术语“生物纯”仅仅意味是基本上不混有或无其他细胞污染的细胞系。严格地讲，“细胞系”的定义是“生物纯”的，但是，描述上将建立起这一完整的概念。
细胞转染要求使用适当的载体。本发明包括表达载体，在该载体由编码目的TRAP的序列可经操作直接连接到一个启动子上。该启动子可以是一个强启动子，例如现有技术中已知的那些，或分化启动子，即，只在特殊类型的细胞中才能操作的启动子。表达载体也可以含有所有的或部分病毒或细菌基因组，如痘苗病毒(Vaccinia virus)或BCG。这种载体在制备疫苗中特别有用。
该表达载体可以与几个编码序列结合，只要TRAP序列包含在其中即可。具有TRAP序列的单一载体也可以包含有前述的细胞活性因子和/或MHC/HLA基因。如果这样做不甚理想，也可以提供一表达体系，其中采用两个或多个各自的载体，在载体中将直接将每一编码序列连接到启动子上。该启动子可以是一个强启动子或者分化启动子(differential promoter)。共转染是公知技术，因此本领域技术人员有能力采用这种技术。也可以构建载体直接编码TRA分子，而不是编码TRAP分子。这样则减少对翻译后加工处理的需要。
前述的讨论已很清楚，编码“肿瘤排斥抗原前体”的序列随后被加工成肿瘤排斥抗原。本文中描述了这两类的分离形式，也包括每个特殊的实施例。也许最值得注意的方面是用疫苗治疗各种癌症。有证据指出TRAs在肿瘤细胞上一提呈，就引起免疫应答从而导致这类细胞缺失。实施例表明当各种TRAs被注入细胞时，就发生CTL反应同时缺失提呈细胞。这就是疫苗的行为特征，因此当TRAP被加工成TRAs，TRAs本身可以单独使用，或作为药物适当的成分，如疫苗来加以使用。同样，以相同的方式提呈细胞也可单独使用或和其他组分结合制成药物组合物。可以用做疫苗的其他物质包括能在其表面上提呈TRA分子的分离的细胞，以及TRAP片段，突变的病毒，特别是黄化(etiolated)形式，和转染细菌。此处采用的“片段”一词表示比所述的TRA小，但具有前述疫苗所要求的特性的多肽。另外的疫苗包括TRA和HLA分子的复合体，或是由TRA和HLA分子的复合体组成。此处描述的疫苗类型可预防性使用，即，将以足够的量供给接受者以预防癌症的发生。
产生与T细胞或B细胞相关的免疫应答，其特征是提呈肿瘤排斥抗原的效应作用。关于B细胞应答，涉及产生TRA的抗体，即抗体能特异性地与TRA结合。另外，TRAP分子足够大时也可引发它们的免疫原性，与其能特异性结合的抗体是本发明的一部分。这些抗体可以是多克隆或者单克隆的，用公知方法能制备后者，因此本文不必在此重复。例如，用动物模型，如Balb/C小鼠制备mAbs，或者用EBC转化细胞株在试管内制备。另外，从某些细胞提呈TRA的癌症患者分离抗血清。这种抗体也可以由针对TRA和HLA/MHC分子互相作用所限定的表位抗原决定簇(epitopes)来生产。
综观前述公开的部分，表明在大量的事实来说明可以称之为“肿瘤排斥抗原是提呈和识别”系统。识别这些现象具有诊断意义。如，对TRA特异CTL克隆或抗体的存在使得诊断或监测癌症的发生(如前述)成为可能，其方法为监测受检者样品中的CTLs，将抗体结合TRAs，或者与受检者样品相关的抗-TRA CTLs的活性。同样，经过扩增，(如PCR)反义核酸杂交，探针技术等等能监测TRAPs核酸分子的表达。也可分析受检者的各种样品，它们包括体液(如血、血清、或其他渗出物等等)、组织和肿瘤。
诊断的特殊方式即采用目前用于诊断结核病的“结核菌素试验”标准方法(Tuberculin test)的改良法。这一标准的皮肤试验是注入一稳定形式的“纯化蛋白衍生物”即“PPO”的辅助诊断。以同样方式，按本发明TRAs也可以用于这种皮肤试验，作为诊断或监测用的辅助方法。
本文所用的术语“癌症(cancorous condition)”包括癌症的发病以及最终出现临床表面的所有生理状况。肿瘤从一开始并不是肉眼可见的，而是有使正常细胞转化成为恶性病变相关的各种状况，随后发展成为一堆生物堆积物在生长，如肿瘤，转移等。此外，也可以设想缓解作为癌症的部分，因为肿瘤很少自发性地消失。本发明诊断方面包括涉及肿瘤发生过程中的所有状况即单细胞从首次转化到恶变，再经过肿瘤发展和转移以及缓解等。所有这些状况都包含在本发明中。
本发明在本文中采用“受治疗者”(或称受检者)(Subject)包括可能与癌症状态有关的任何种类，它包含人或者非人类，例如家畜，种畜等等。
本发明也具有治疗方面的意义。前述已讨论了使用有效剂量的TRAPs和TRAs作为疫苗的效果。同样，人们可以在体外制备出特异性CTLs，然后将它供给被治疗者。也可以给予抗体，它可以是多克隆或单克隆抗体，它们可特异性地与提呈日的TRA的细胞结合。这些抗体还可偶连特异的抗肿瘤剂，包括，但非限定性的，氨甲蝶呤放射性碘标记的化合物，例如蓖麻毒素类毒素，其他抑制细胞的或者溶细胞性药物等等。因此“靶定向”抗体疗法也被包括在本文中，并用CTLs消除癌细胞也是本发明的应用。
实施例37至40的数据表明来自MAGE-3的肿瘤排斥抗原由HLA-A1分子提呈。就此，除了编码TRAP的核酸分子，由该序列编码的TRAP本身，以及掺入TRAP核酸的载体，以及细胞系等许多材料外，本发明也包括编码MAGE-3 TRAP和HLA-A1分子的组合。因此，共转染子，用于两个编码序列的载体以及诸如试剂盒类表达系统也都被包括在本发明内。同样，前述讨论的疫苗能用采自MAGE-3的TRAP和佐剂的掺合来制成。
可以理解，一个已知的TRAP可以产生多个TRA。以MAGE-3为例，已经看出抗原也象术语所说从MAGE-3中得来。本发明的一个方面是这种分离出的肿瘤排斥抗原，另一方面是分离出的TRA和其提呈分子HLA-A1的复合体。
鉴定由HLA-A1分子提呈源自MAGE-3的TRAs提示出各种治疗和诊断方法。在治疗部分中，例如可以用多种方式治疗由MAGE-3表达为特征的疾病。这里所能涉及的“疾病”一词(disorder)表示任何由MAGE-3 TRAP表达所造成的病理情况，例如癌症(如黑色素瘤)。
根据本发明公开内容可以导出治疗方法是基于被治疗者免疫系统的应答，这将会导致TRA提呈细胞如HLA-A1细胞的溶解。方法之一是给在这个问题上具有异常细胞类型的受治疗者施用对复合体特异的CTL。对在本领域技术人员熟知的是可以在体外制备出这种CTLs。特别是，将例如血细胞类细胞样品与提呈该复合体的细胞接触，并能引发特异的CTL增殖。靶细胞可以是转染细胞，如前述的COS型细胞。这些转染子在其表面上提呈所需的复合体，当与目的CTL结合时，刺激它的增殖。本文中所采用那种COS细胞正如其他适合的宿主细胞一样被广泛使用。
为了详述这些称之为接受性转移治疗方法，(Grreenberg，J.Immunol.136(5)∶1917(1986);Reddel et al.，Science 257∶238(7-10-92);Lynch et al.，Eur.J.Immunol.21∶1403-1410(1991);Kast et al.，Cell 59∶603～614(11-17-89))，将CTLs与提呈所需复合体混合，这将导致对其特异的CTLs增殖。然后将增殖后的CTL细胞注入细胞异常的被治疗者，其特征为某些异常细胞提呈特定的复合体。然后CTLs溶解异常细胞，从而达到理想的治疗目的。
前述的治疗说明至少某些受治疗者的异常细胞提呈HLA/TRA复合体。这一点很容易判断，因为现有技术人员对用以鉴定提呈特定的HLA分子的细胞的方法，以及如何鉴定表达含有所示序列的DNA的细胞技术非常熟悉。一旦分离之后，用受治疗者的异常细胞样品与这种细胞一道来判断体外细胞溶解情况。假如出现溶解，在这一疗法中使用特异的CTLs可以缓解与异常细胞关联的病状。用较少使用的标准分析法来检查异常细胞并对其HLA的类型进行配型测定，用PCR扩增来确定表达。
接受性转移并不是本发明采用的唯一疗法。许多其他方法也可以激发体内的CTLs。其中之一是前述的采用非增殖性细胞表达该复合体。这种方法中采用的细胞可以是正常表达该复合体的细胞，例如，辐照后的黑色素瘤或者用一或两个基因(提呈该复合体必需的基因)转染后的细胞。Chen等人示出了这一方法(Chen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88∶110～114 January 1991)，其中提出在治疗方案中采用表达HPVE7多肽的转染细胞。可以用各种类型的细胞，同样，也可以使用携带一或两个目的基因的载体。优选是使用病毒或细菌载体。在这些系统中，痘苗病毒或细菌BCG携带目的基因，事实上这些材料可“感染”宿主细胞，并由自体的CTLs识别那些提呈过的复合体的细胞，然后增殖。肿瘤排斥抗原或其前体本身与佐剂结合，以促进结合到提呈HLA目的分子的HLA-A1提呈细胞上，也能达到相似的效果。加工TRAP产生HLA分子的多肽配对体(peptide partner)，而TRA则不需要进一步处理就提呈。因此，可以治疗由HLA-A1分子或由任何HLA分子提呈的源于MAGE-3的TRA紊乱引起的疾病(disorder)。
在诊断方面，经过分析TRAP的表达，可以判断的本文中使用的术语“疾病”(disorder)。用TRAP序列进行的PCR检测法可直接地，或用源自MAGE-3的TRA测定法间接地达到这一目的，因为所述的TRA的存在意味着TRAP被表达或被表达过。
值得注意的是，本文中所示的MAGE-3和MAG-31两个核酸分子，它们中任何一个都编码TRAP MAGE-3。可以理解当用“编码MAGE-3 TRAP核酸分子”表达时，它包括所有能在表达时生产出这种分子的所有分子。本发明也包括那些各种变种，诸如编码区内出现密码子简并性的变种，或者在内含子内变种。
本发明中使用的术语和表达用于描述性术语，不起限制作用，并无任何意图用这些术语和表达方式来排除任何说明书部分或描述的特征性等同词汇，因此可以认识到在本发明的范围内可以做出各种修改。
表3黑色素瘤 TNFpg/ml 表达 HLA-AlMage-3 表达细胞数 试验1 试验2+CTL +CTL20/38 20/38MZ2-MEL.61.2 50000 1 4 +++ +MZ2-MEL-ET1 50000 >120 >120 +++ +1666 66 >120LY-1-MEL 30000 1 >120 1 >120 +++ +10000 1 >120 1 >1203000 <1 114 2 >120MI-10221 30000 <1 >120 +++ +10000 <1 713000 <1 74LY-2-MEL 30000 1 57 +++ +10000 1 863000 1 91LY-4-MEL 30000 1 >120 +++ +10000 1 >1203000 1 >120
续表3黑色素瘤 TNFpg/ml 表达 HLA-AlMage-3 表达细胞数 试验1 试验2+CTL +CTL20/38 20/38SK23-MEL 30000 1 112 ++++ +10000 1 1163000 1 105MI-665/2-MEL 30000 1 3 2 4 - +10000 1 2 2 53000 1 5.2 1 5LB34-MEL 30000 1 >120 ++++ +10000 1 >1203000 1 >120LB45-MEL 30000 1 11 1 30 - +10000 1 6 1 123000 1 2 <1 7NA-6-MEL 30000 1 77 5 98 +++ +10000 1 104 5 >1203000 1 110 4 >120MI-13443-MEL 30000 1 >120 ++++ +10000 1 >120
续表3黑色素瘤 TNFpg/ml 表达 HLA-AlMage-3 表达细胞数 试验1 试验2+CTL +CTL20/38 20/383000 1 >120LB5-MEL 30000 1 8 4 9 + -10000 <1 5 4 113000 <1 5 1 5SK64-MEL 30000 1 4 2 5 -10000 1 2 1 53000 1 1 1 4LB33-MEL 30000 1 3.5 +++ -10000 1 43000 1 3LB73-MEL 50000 16 - -按照表中给出的不同的异源黑色素瘤细胞数，将其与1500CTL20/38和25μ/ml IL-2混合。24小时后，通过测定其对WEHI-164-13细胞的细胞毒性，测定上清液的TNF量。
(2)SEQUENCE ID NO1的数据(ⅰ)序列特征(A)长度462个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)序列名称SEQ ID NO1
(2)SEQUENCE ID NO2的数据(ⅰ)序列特征(A)长度675个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO2
(2)SEQUENCE ID NO3的数据(ⅰ)序列特征(A)长度228个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO3
(2)SEQUENCE ID NO4的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1365个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO4
(2)SEQUENCE ID NO5的数据(ⅰ)序列特征(A)长度4698个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO5
(2)SEQUENCE ID NO6的数据(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO6Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe
(2)SEQUENCE ID NO7的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2418个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO7
(2)SEQUENCE ID NO8的数据(ⅰ)序列特征(A)长度5724个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-1 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO8
(2)SEQUENCE ID NO9的数据(ⅰ)序列特征(A)长度4157个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-2 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO9
(2)SEQUENCE ID NO10的数据(ⅰ)序列特征(A)长度662个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-21 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO10
(2)SEQUENCE ID NO11的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1640个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型cDNA至mRNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词cDNA MAGE-3(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO11
(2)SEQUENCE ID NO12的数据(ⅰ)序列特征(A)长度943个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-31 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO12
(2)SEQUENCE ID NO13的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2531个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-31 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO13
(2)SEQUENCE ID NO14的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2531个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-41 gene
(2)SEQUENCE ID NO15的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1086个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型cDNA至mRNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词cDNA MAGE-4(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO15
(2)SEQUENCE ID NO16的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2226个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-5 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO16
(2)SEQUENCE ID NO17的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2305个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-51 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO17
(2)SEQUENCE ID NO18的数据(ⅰ)序列特征(A)长度225个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组cDNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-6 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO18
(2)SEQUENCE ID NO19的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1947个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-7 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO19
(2)SEQUENCE ID NO20的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1810个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-8 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO20
(2)SEQUENCE ID NO21的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1412个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-9 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO21
(2)SEQUENCE ID NO22的数据(ⅰ)序列特征(A)长度920个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-10 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO22
(2)SEQUENCE ID NO23的数据(ⅰ)序列特征(A)长度1107个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词MAGE-11 gene(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO23
(2)SEQUENCE ID NO24的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2150个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词smage-I(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO24
(2)SEQUENCE ID NO25的数据(ⅰ)序列特征(A)长度2099个碱基对(B)类型核酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型基因组DNA(ⅸ)特性(A)名称/关键词smage-Ⅱ(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO25
(2)SEQUENCE ID NO26的数据(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅹⅰ)序列名称SEQ ID NO26Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr
权利要求
1.编码或者与编码肿瘤排斥抗原前体MAGE-3的核酸分子互补的分离出的核酸分子。
2.如权利要求1所述的分离出的核酸分子，它编码肿瘤排斥抗原前体MEGE-3。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其中所述的分子是cDNA。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其中所述的分子具有SEQ ID NO∶1(MAGE-3)或者SEQ ID NO2(MEGE-31)所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求2所述的核酸分子的、并在操作上与一启动子联接的表达载体。
6.如权利要求5所述的表达载体，进一步包括编码HLA-A1的核酸分子。
7.用权利要求2所述的核酸分子转染过的细胞系。
8.如权利要求7所述的细胞系，其中所述的细胞系表达HLA-A1。
9.如权利要求7所述的细胞系，其中采用编码HLA-A1的核酸分子进一步转染所述的细胞系。
10.由权利要求2所述的核酸分子编码的分离出的肿瘤排斥抗原前体。
11.包含如权利要求10所述的分离出的肿瘤排斥抗原前体和佐剂的疫苗。
12.源自权利要求10所述的肿瘤排斥抗原前体的分离出的肿瘤排斥抗原，其中所述的肿瘤排斥抗原是抗原D。
13.分离出的如权利要求12的肿瘤排斥抗原和HLA-A1的复合体。
14.判断肿瘤排斥抗原前体MAGE-3的表达为特征的疾病的方法，包括将受检者的样品与鉴定所述肿瘤排斥抗原前体的试剂相接触，以判断所述肿瘤排斥抗原前体的表达来判断所述的疾病。
15.判断以肿瘤排斥抗原前体MAGE-3表达和由源于细胞的肿瘤排斥抗原的提呈为特征的疾病的方法，包括将受检者的样品与鉴定所述肿瘤排斥抗原的试剂相接触，以判断所述肿瘤排斥抗原来判断所述的疾病。
全文摘要
本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体MAGE-3的核酸分子。也公开了载体，细胞系等，它们利用上述核酸分子，并选择性利用了编码人白细胞抗原HLA-A1的核酸分子。在治疗和诊断方面采用这些物质也是本发明的一部分。
文档编号C07K16/00GK1093751SQ94103919
公开日1994年10月19日 申请日期1994年3月26日 优先权日1993年3月26日
发明者贝努瓦·范登艾恩德, 蒂尔瑞·布恩-法勒尔, 比阿特丽斯·高格勒, 皮埃尔·范德布鲁根 申请人:路德维格癌症研究所