专利名称：新的pka-结合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及到结合蛋白激酶A的蛋白。更特别地，本发明涉及新的蛋白和编码那些仅限于细胞内蛋白激酶的蛋白的核苷酸序列。
背景技术：
细胞外信号如激素和细胞因子，通过激活腺苷酸环化酶、增加细胞内的cAMP水平并最终激活cAMP-依赖的激酶(PKA)来调节许多细胞过程。PKA是一普遍存在的酶，它在许多细胞内通路起作用，例如，通过糖源磷酸化酶的可逆磷酸化作用[Walsh等，J.Biol.Chem.，2433763-3765(1969)]，调节糖原代谢，以及通过抑制Ras对Raf-1的激活[Vojtek et al.，Cell，74205-214(1993)and Hafner et al.，Mol.Cell Biol.，146696-6703(1994)]来调节MAP激酶信号。无活性的PKA以四聚体存在，其中两个相同的催化亚基结合在两个调节亚基的二聚体上。cAMP引起的PKA激活是通过cAMP分子结合到每个调节亚基(R)上，使激活的催化亚基(C)释放而起作用的。虽然已鉴定仅一种形式的C亚基，但存在两类R亚基，RI和RII，具有明显不同的亚细胞分布。据报道RI同型(RIα和RIβ)主要是胞浆的，并在核外，而RII同I型(RIIα和RIIβ)的75％为颗粒的，并与质膜、细胞骨架成分、分泌颗粒、高尔基器、中心体或可能细胞核结合[Scott，Pharmac.Ther.50123-145(1991)]。不同R亚基的差异(物理的或生理的)大概提供了一种使细胞能限制C亚基活性向所期望通路的方法。
最近的证据表明细胞能通过在可能的底物附近定位无活性酶以把PKA活性作为目标，从而通过cAMP结合到R亚基，限制释放后的C亚基活性。此“隔室化”将PKA与信号通路中的参加者隔离，并有助于PKA对不同细胞外刺激反应的专一性。PKA的隔室化至少部分通过R亚基与特异蛋白的相互作用或束缚而发生，该特异蛋白将无活性的全酶定位或锚着在细胞内的特异部位。特异地隔离PKA的蛋白被叫做激酶A锚着蛋白或AKAPs[Hirsch et al.，J.Biol.Chem.，2672131-2134(1992)]。鉴于一些AKAP显示除与PKA外还结合和锚着其它蛋白这一事实，该蛋白家族被统称为锚着蛋白。
现在已经鉴定了许多锚着蛋白[下面讨论]它们明显地通过包含一个两亲性螺旋区域的普通羧基末端二级结构基元来结合PKA[Scott andMcCartney，Mol.Endo.，85-11(1994)]。PKA与大多数，假如不是全部的话，鉴定的锚着蛋白的结合能被模拟该普通二级螺旋结构的肽(Ht31)阻断，而突变Ht31肽对PKA/锚着蛋白结合没有影响，该肽含有一个破坏肽的螺旋性质的单个氨基酸替换[Carr et al.，J.Biol.Chem.，26614188-14192(1991)]。即使PKA/锚着蛋白相互作用受一种普通二级结构的影响，但锚着蛋白(或在不同种属中发现的同源锚着蛋白)一般具有独特的一级结构，如已在多种生物体中鉴定的数目不断增加的锚着蛋白所证实的。大概这种独特的氨基酸结构，最值得注意的是蛋白的氨基末端区域，是针对多种特定细胞类型鉴定为唯一的锚着蛋白以及已观察到PKA定位的多种特定细胞内隔室的部分原因。
比如，主要在哺乳动物脑中表达的锚着蛋白已在大鼠(AKAP150)和牛(AKAP 75)中[Bergman，et al.，J.Biol.Chem.，2667207-7213(1991)]以及人(AKAP 79)中[Carr et al.，J.Biol.Chem.，26716816-16823(1992)]鉴定。这些神经元特异的蛋白之间氨基酸同一性和免疫交叉反应性暗示它们表现为种间同系物。另一个例子，(AKAP100)似乎对人和大鼠的心肌和骨骼肌是特异的，而在这些哺乳动物的脑细胞中表达为较低程度。还有一个例子，AKAP Ht31[Carr et al.，J.Biol.Chem.，26713376-13382(1992)]似乎对甲状腺细胞是特异的。相反地，AKAP95已显示在多种细胞类型中表达，表明无显著的组织或细胞类型特异性。
关于在特异的细胞内隔室的定位，AKAP75，微管结合蛋白(MAP-2)[Threurkauf and Valee，J.Biol.Chem.，2573284-3290(1982)和DeCamilli et al.，J.Cell.Biol.，103189-203(1986)]，AKAP 79[Glantzet al.，J.Biol.Chem.，26812796-12804(1993)]和AKAP 150[Glantz etal.，Mol..Biol.Cell，31215-1228(1992)]与细胞骨架结构蛋白紧密连接，AKAP 75更特异地与突触后密度相关[Carr et al.，J.Biol.Chem.，26716816-16823(1992)]。还有其它的锚着蛋白显示定位在较少分布的细胞结构，包括AKAP350与中心粒结合[Keryer et al.，Exp.Cell Res.，204230-240(1993)]，AKAP100与大鼠心脏组织的肌浆网结合[McCartney，et al.，J.Bio.Chem.2709327-9333(1995)]以及一种85kDaAKAP，它连接PKA到高尔基体上[Rios et al.，EMBO J.，111723-1731(1992)]。
具有明显锌指DNA结合区的AKAP95似乎存在于核的外面[Coghlan et al.，J.Biol.Chem.，2697658-7665(1994)]。AKAP95的DNA结合域使PKA直接参与基因转录，可能通过PKA的定位于转录因子磷酸化。受锚着蛋白/PKA结合影响的其它各种各样的细胞活性已通过破坏相互作用而被证明，如在T细胞中破坏PKA/锚着蛋白结合已显示逆转cAMP诱导的白介素2表达的抑制[Lockerbie et al.，J.Cell Bio Chem.，Suppl.12A76，Abstract D2155(1995)]，并且在海马神经元中PKA/锚着蛋白结合的破坏已显示减弱通过α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸/kainate谷氨酸受体的整个细胞过程[Rosenmund et al.，supra.]。锚着蛋白调节IL-2表达及调节谷氨酸受体活性的能力，同前面证明的锚着蛋白可结合神经钙蛋白提示锚着蛋白和调节锚着蛋白结合到细胞成分上的分子的多种治疗应用。
鉴于细胞表达类型，亚细胞定位和已鉴定的锚着蛋白的生理活性的差异，技术上需要继续鉴定新的锚着蛋白和编码它们的核酸。锚着蛋白一级结构的独特性为特异地调节PKA定位及其在特定细胞过程起作用提供了靶点。
发明概述本发明提供了编码具有结合PKA生物性质及亚细胞隔室化的蛋白纯化和分离的多核苷酸序列。现在优选的多核苷酸在SEQ ID NO5中列出。本发明的多核苷酸还包含在对SEQ ID NO5的多核苷酸严格的杂交条件下杂交的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA，可与DNA分子的正义链或反义链杂交。该DNA可是cDNA，基因组DNA或化学合成的DNA。本发明的多核苷酸可以通过标准技术如互补，低严格杂交以及用根据本发明多核苷酸序列的了解所产生引物的PCR来鉴定。
本发明还提供重组表达构建物，包含将本发明的多核苷酸可操作地连接到转录调节元件如启动子和转录终止子上。该转录调控元件可以是同源的或异源的。
本发明的另一方面是用本发明的多核苷酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可以是原核的或真核的。如此转化或转染的宿主细胞对本发明PKA结合多肽的表达特别有用，这些多肽可从细胞或其培养基中分离到。
本发明还有一个方面是由本发明的多核苷酸编码的PKA结合多肽。优选的PKA结合多肽由前面SEQ ID NO5的多核苷酸编码。本发明的多肽可从天然来源纯化或用本发明的宿主细胞通过重组方法生产。保留野生型多肽生物活性的变异体多肽也被考虑，包括其中已参入了增加、消除或保守氨基酸替换以调节PKA结合多肽的功能或免疫学特征的类似物。其它变异体多肽包括融合蛋白，其中参入增加的多肽序列以利于纯化或在试验支持物上固定。本发明的增加多肽可通过与SEQ IDNO5的多核苷酸编码的多肽免疫交叉反应性来鉴定。
本发明还提供特异地与上述PKA结合多肽结合的多肽及非多肽分子。优选的结合分子包括抗体(如多克隆，单克隆，重组抗体或其结合片段)。结合分子对于PKA结合多肽的纯化，表达PKA结合蛋白的细胞的鉴定以及调节PKA和PKA结合多肽在体内的相互作用是有用的。还提供了产生与本发明的PKA结合多肽特异性免疫反应的抗体的杂交瘤细胞株。这样的杂交瘤可通过技术上已知的技术生产及鉴定。
还提供了鉴定破坏PKA与本发明的PKA结合蛋白相互作用的分子的测定方法(如固定化结合试验，溶液结合试验，闪烁接近测定法，双杂交筛选试验等)。在一些情况下，可期望调节PKA和本发明间的结合。在其它情况下，有期望特异地调节PKA结合多肽和它所结合的细胞成分(不是PKA)之间的结合。在任何一种情况下，本发明的多肽为本发明的测定方法提供有用的筛选靶点。本发明的测定方法可以各种完成，包括基于细胞的试验如美国专利号5,283,173所述的双杂交筛选或专利合作协议(PCT)公布号WO91/16457所述的互补试验。这种类型的试验对评价化合物的细胞内效能特别有用。本发明不基于细胞的试验包括闪烁接近测定法，cAMP竞争试验，ELISA试验，放免试验，化学发光试验等。这些实验步骤为技术上已知的，而且被广泛描述，如在Boudet etal.，J.Immunol.Meth.，14273-82(1991)；Ngai et al.，J.Immunol.Meth.，158267-276(1993)；Pruslin et al.，J.Immunol.Meth.，13727-35(1991)；Udenfriend et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，828672-8678(1985)；Udenfriend et al.，Anal.Biochem.，161494-500(1987)；Bosworth andTowers，自然，341167-168(1989)；Gilman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，67305-312(1970)；and U.S.Patent No.4,568,649。调节锚着蛋白结合的化合物的用途是明显的。例如，小分子可能被发现抑制PKA/锚着蛋白结合或锚着蛋白与特异细胞成分相互作用。这种类型的调节子(modulator)可能使PKA的特异库移位，并只影响靶信号通路。与其它细胞成分结合的锚着蛋白的调节子的鉴定可能同样有益。例如，以与先前鉴定的免疫抑制剂相似的方式，但具有较少副作用的影响神经钙蛋白活性的因子对于治疗现在使用毒性更多免疫抑制剂的病症是有用的。此外，调节参与细胞活性的锚着蛋白的因子的鉴定对替代目前承认的治疗妨碍也许有用。例如调节IL-2表达的锚着蛋白调节的因子对替代外源性重组IL-2的服用可能是有用的。
发明详述下列实施例通过解释而非限制的方式提供。实施例1写有来自人cDNA库的T细胞特异的锚着蛋白的鉴定。实施例2描述鉴定的锚着蛋白的RII结合特异性。实施例3涉及锚着蛋白核苷酸序列的确定。实施例4写有锚着蛋白克隆的表达。实施例5涉及锚着蛋白的细胞及组织分布。实施例6描述锚着蛋白和调节锚着蛋白结合的分子的可能的治疗用途。
实施例1T细胞表达的锚着蛋白的鉴定为了鉴定新的T细胞锚着蛋白，亚克隆到ZAPII表达(Stratagene，LaJolla，CA)的人Jurkat T细胞cDNA文库经Carr et al.，J.Biol.Chem.，26716816-16823(1992)描述的RIIα涂盖技术筛选。
简要地，1ul文库噬菌体(5×104pfu)加入10mM MgSO4中生长至OD600＝0.5的600μl大肠杆菌株XL-1Blue MRF′(Stratagere)。细菌和噬菌体在37℃温育15分钟，然后7.5ml顶琼脂(NZY培养基(1％[w/v]N-Z-胺A型，1.5％[w/v]酵母提取物，86mM NaCl，8MMgSO4·7H2O，1.5％[w/v]细菌培养用琼脂，pH7.5)，0.7％琼脂糖)加入悬液中。得到的混合物立即在预热至37℃的NZY平板上铺板。平板冷至室温并在42℃温育4小时。预浸于10mM异丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)的硝酸纤维素膜置于平板上，该平板再在37℃保温4小时。移开滤膜在TBS(50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl)中洗3次，并在4℃封闭液(TBS，5％脱脂牛奶，0.1％BSA)中封闭过夜。第二套类似制备的硝酸纤维素膜铺在平板上，并在4℃保温过夜。该滤膜被洗涤(如上所述)并在室温封闭一小时(如上所述)。
约4μg(6μ1)重组鼠RIIα在含有2.5μl[32P]ATP(25μ Ci，3000Ci/mmole)和1μl缓冲液(含0.5μl MOPS，pH7.0，0.5M NaCl，20mM，MgCl2和10mM DTT)的反应中与2.35μg(0.5μl)重组牛PKA催化亚基混合。反应在30℃进行30分钟，然后用Execellulose GF-5柱(Pierce)除去未参入的标记物。滤膜用[32P]RIIα(100,000cpm/ml封闭液)在室温探测6小时。温育后该滤膜用含有1％Tween-20的TBS洗3次，并对X光片曝光16小时。
在筛选的大约1×106噬菌体中，一用阳性斑#11噬菌斑被确定与标记的RIIα结合。用开始筛选中所述的技术，在#11斑上进行第二次筛选，表明#11斑的子代也能与放射标记的RIIα结合。
实施例2RIIα与#11噬菌斑结合的特异性鉴于前面报告，即肽Ht31(SEQ ID NO1)一般地能阻止PKA与锚着蛋白结合，并且如上述Ht31的脯氨酸突变体(见下面SEQ ID NO2，其中脯氨酸替换以黑体和下划线表示出来)在平行实验中被确定不具有RIIα与#11斑结合的特异性，在来得实验中RIIα涂盖在一种Ht31肽存在下进行。
Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala(SEQ ID NO1)Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala(SEQ ID NO2)简要地，硝酸纤维素堆(lifts)如实施例1所述制备，只是得到的印迹噬菌斑堆(lifts)预先在室温于含1μM Ht31肽或脯氨酸突变Ht31肽的封闭液中孵育15分钟。预孵育后，滤膜如实施例1所述用[32P]RIIα探测，然后将滤膜进行放射自显影。
放射自显图显示#11斑预先与Ht31肽孵育阻碍[32P]RIIα的结合，而与脯氨酸突变的Ht31肽预孵无作用。这些结果表明RIIα与#11斑编码的多肽结合受#11斑二级结构的影响，与先前鉴定的锚着蛋白所使用的相似。
实施例3#11斑cDNA克隆为了确定插入噬菌斑#11的噬菌体的核苷酸序列并推断其编码蛋白的氨基酸顺序，根据制造商的指导用Exassist/XLOLR系统(Stratagene)将#11噬菌斑的cDNA插入在体内切除。
简要地，从NZY平板取出#11斑与500μl SM缓冲液(100mMNaCl，8mM MgSO4·7H2O，50mM Tris-Hcl pH7.5，0.1％w/v]明胶)和20μl氯仿混合。该混合物经混悬存于4℃(噬菌体休克)。XL-1 Blue MRF′和XLOLR细胞(均来自Stratagene)分别在30℃的补充以10mMMgSO4·7H2O、含0.2％(v/v)麦芽糖的LBM培养基中生长过夜。用0.5ml过夜培养物和50ml LBM培养基制备1/100稀释的XL-1 Blue MRF′细胞，该稀释物于37℃生长2-3小时至对数中期XL-1 Blue MRF′细胞为(OD600＝0.2-0.5，或XLOLR细胞为OD600＝0.5-1.0)。培养物在1500×g离心，得到的沉淀重悬于10mM MgSO4·7H2O至密度为OD600＝1.0。
200μl XL-1细胞，250μl上述噬菌体贮存悬液和1μl ExAssist辅助噬菌体(Stratagene)混合并在37℃孵育15分钟。加入3ml LBM培养基，培养物再在37℃振摇孵育2.5小时。孵育后，混合物在2000×g离心15分钟。回收上清，于70℃保温15分钟，再4000×g离心15分钟。得到的上清液含有将#11噬菌斑DNA包装入噬菌粒pBK-CMV的丝状噬菌体。该噬菌粒通过将10μl噬菌粒贮存液与200μl XLOLR细胞(如上述制备)混合，并在37℃孵育15分钟而获救。孵育后加入300μl LBM培养基，混合物再在37℃孵育45分钟。得到的细胞悬液在含50μg/ml卡那霉素的LBM上以200μl/平板铺板。
通过标准方法及包括使用Wizard Miniprep试剂盒(Promega)进行质粒制备。从#11斑分离的质粒DNA称作克隆#11。该cDNA插入片段通过用EcoRI和BanHI消化从载体上切下，得到的片段用琼脂糖凝胶电泳分离。克隆#11插入片段测得为2850bp长。克隆#11的嵌套缺失(nested deletion)在除去-一个-碱基系统(Promega，Madison，WI)生成，而且克隆#11用Universal T3(ATTAACCCTCACTAAAG[SEQ IDNO3])和T7(GATATCACTCAGCATAA[SEQ ID NO4])引物及一种Prism Ready ReactionDyeDeoxy Terminator Cycle试剂盒(Perkin Elmer)在ABI 373 DNA测序仪(Perkin Elmer，Foster City，CA)中被测序。
克隆#11的DNA序列在SEQ ID NO5中列出。因为在核苷酸序列中没能发现合适的起始密码子，所以不可能确定克隆#11的推断氨基酸序列和分子量。从T3引物得到的该序列核苷酸水平Blast Search(June16，1995，140137 EDT)显示与称做“Homo Sapiens cDNA 3′-end similarto none”(登记号#T32770)的克隆有同源性，而从T7引物得到的序列数据显示克隆#11以1905-2248的一段343个碱基与称做“HomoSapiens Partial cDNA 5′-end similar to none”(登记号#T3 1099)的克隆有98％同源性，此外，克隆#11在2308-2640核苷酸的一段332个碱基与称做“Homo Sapiens Pautial cDNA，Sequence，Clone，66D04(登记号#Z24883)的克隆具有98％同源性。
实施例4克隆#11的表达为了确定克隆#11基因产物的近似分子量，克隆#11在XLOLR细胞的过夜培养物(如实施例3制备)生长于LBM培养基/四环素(12.5μg/ml)，随后用于接种250ml相同的培养基。在37℃孵育至OD600＝1.2，然后细菌以600×g离心15分钟。沉淀称重并重悬于10倍体积(w/v)FP缓冲液(1％Triton X-100，150mM NaCl，1mMEGTA，1mM EDTA，10mM Tris，pH7.4，1％抑蛋白酶肽，0.2％NaN3)。细胞在French Press中破碎，裂解物通过40000×g离心30分钟澄清。裂解液然后用Centricon-10(Amicon)浓缩。一部分浓缩的裂解液上样到10％Tris-甘氨酸胶(Novex)上，电泳并转至Immobilon(Millipore)。该印迹用[32P]RIα探测。发现了一条约120KD的带，它部分被HT31肽竞争掉。这些结果表明克隆#11编码一种PKA-结合蛋白，它可被用于鉴定PKA结合多肽与PKA结合的抑制剂的测定方法中。
实施例5克隆#11的细胞和组织分布为了确定克隆#11表达的细胞和组织分布，反转录酶PCR(RT-PCR)被用来评价克隆#11mRNA水平。
简要地，根据实施例3确定的核酸序列，开始设计的引物跨越克隆#11序列的300bp。在克隆#11的序列(SEQ ID NO5)中，引物2T3对应于266-283核苷酸，引物M2T3对应于434-453核苷酸，引物R2T3对应于601-622核苷酸，引物R2T7对应于2229-2250核苷酸，引物M2T7对应于2337-2400核苷酸，引物2bT7对应于2256-2592核苷酸，RNA用RNA分离试剂盒(Stratagene)从不同类型的细胞和组织制备(在下面结果讨论中描述)。RT-PCR进行如下。RNA(10μl水中约1μg)首先在80℃保温3分钟变性，然后置于冰中至下面的逆转录酶反应进行。变性RNA与8μl 5×MMuLV-RT缓冲液(Boehringer)，8μl 2.5mM dNTP混合物，含有2T3和R2T3引物各0.5μg或2bT7和R2T7引物各0.5μg的1μl水，1μl RNAse抑制剂(Boehringer)，1μlMMuLV-RT(Boehringer)及11μl水混合，并在42℃孵育1小时。
PCRs执行如下。前面的逆转录酶反应2μl与3μl 2.5mM dNTP混合物，3μl10×Taq聚合酶缓冲液(Boehringer)，3μl(0.3μg)2T3引物与3μl(0.3μg)R2T3引物，或3μl(0.3μg)2bT7引物与3μl(0.3μg)R2T7引物，0.5μl Taq聚合酶及14.5μl水混合。该混合物94℃加热4分钟，然后完成30个循环(94℃1分钟，60℃1分钟及72℃1分钟)。
PCRs的扩增产物通过1％琼脂糖电泳分离，然后用标准方法转至Nytran Plus膜(s+s)上。PCR产物通过UV照射交联到膜上，随后该膜在42℃，5×SSPE，0.5％SDS，0.1mM Tris，pH7.5和2×Denhardt’s中预杂交3小时。
杂交探针用下面的末端标记制备。2μl(200ng)M2T3引物与2μlM2T7引物(200ng)，2μl 10×多核苷酸激酶缓冲液(Boehringer)，10μl32P-ATP(100μli，3000Ci/mmole)，2μl(20单位)T4多核苷酸激酶(Boehringer)和2μl水混合。反应在37℃进行30分钟，然后通过加入2μl 0.5M EDTA终止，未参入标记物通过用Centristep柱(Princeto Separation，Inc.)离心除去。膜然后在与预杂交液相同但加入400ng32P-标记的M2T3和M2T7引物(各200ng)的杂交液中，于42℃探测过夜。未交后膜室温下用0.5×SSC，0.2％SDS洗3次，每次10分钟，然后放射自显影。
基于细胞的结果表明，克隆#11被Ramos细胞(B细胞)，Jurkat细胞(T细胞)，U973细胞(单核细胞)，T84细胞(结肠癌)，HC60细胞(早幼粒白血病)，A549细胞(肺上皮)和Hela(上皮癌)表达。组织分析结果表明克隆#11在人睾丸、肝脏和大脑枕骨皮质表达。
实施例6可能的治疗应用鉴于神经钙蛋白是两种有效的临床上有用的免疫抑制剂环孢霉素及FK506的靶物，它们都抑制神经钙蛋白活性，前面证明的AKAP79与神经钙蛋白结合是有重大意义的。如下所述，环孢霉素和FK506均对治疗多种疾病有用，但具有明显的限制性副作用。大概调节锚着蛋白/神经钙蛋白结合的因子最终以类似于环孢霉素或FK506的活性的方式调节神经钙蛋白活性。这样调节子的鉴定，特别是比那些观察到的其它免疫抑制剂具有较少副作用的调节子，可能对现在用环孢霉素或FK506治疗的多种疾病具有广泛的治疗用途。
已报道了环孢霉素和FK506的许多临床指征。例如，环孢霉素已经为移植后免疫抑制及使肝、肺、肠和胰移植成为可能确定了标准，虽然一般认为FK506为较强的免疫抑制剂。不能耐受或用环孢霉素或FK506失败的移植病人有时成功地改用其它药物。
另一实施例，炎性肠疾病(IBO)是具有不同临床表征的两种疾病，Crohn’s病和溃疡性结肠炎(UC)的通称。环孢霉素已被成功地用于治疗Crohn’s病，已经在至少疾病活性的一个指标上证明具有治疗的统计学显著结果[Brynskov，Dan.Med.Bull.41332-344(1994)]。然而，其它与急性加重的缓解有最好的相关性的指标没有显示出针对改善的显著趋势。环孢霉素还对严重急性类固醇-抗性UC显示活性(因为试验由于伦理原因而停止，所以数据不重要)。其它患有硬化性胆管炎和UC的病人的试验证明对UC较轻过程的边界上的显著性。撤药后的复发是普遍的，而且治疗由于毒性而受限制[Choi and Targan，Dig.Dis.and Sci.391885-1892(1994)]。此外，其它免疫抑制剂已成功用于IBD，如氨甲喋呤，硫唑嘌呤和6-MP。
另一个实施例，环孢霉素当用作二线或三线的疾病疗法时，在一些试验中证明对治疗类风湿关节炎有效，即对治疗那些对其它疗法失败并具有严重疾病的病人。在这些实验中，环孢霉素被发现总的与其它二线药物，如金，抗疟药，硫唑嘌呤，D-青霉胺和氨甲喋呤一样有效和有毒[Wells and tugmell，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)51-56(1993)；Forre et al.，Arth.Rheum.，3088-92(1987)]。试验仅报道“非常严重的顽固性RA”的治疗，因为环孢霉素的“潜在的不可逆毒性”[dougados and Torley，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)57-59(1993)；肾毒性被认为主要通过加重NSAID肾中毒的肾血管收缩以及类风湿关节炎固有的肾病所介导[Leaker and Cairns，Br.J.Hosp.Med.，52520-534(1994)；Sturrodk et al.，Nephrol.Dial.Transplant，91149-1156(1994)；Ludwin and Alexopolulou，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)60-64(1993)]。用环孢霉素治疗的RA病人的大约10％肾活检显示环孢霉素毒性的形态学特征[International KidneyBiopsy Registry of Cyclosporin in Autoimmune Disease，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)65-71(1993)]。
另一个实施例，已报道环孢霉素对治疗类固醇依赖的哮喘病有效。在一个试验中，少量病人被随机分组服用环孢霉素或安慰剂，环孢霉素组展现气流和FVC增加，以及较少的氢化泼尼松获救病程。
另一个实施例，环孢霉素对治疗依赖于类固醇的基本变化疾病肾病综合症有效。该试验的病人显示在低剂量环孢霉素下具有较低的类固醇需求，但环孢霉素中断时全都复发。肾病综合症的抗类固醇形式对环孢霉素仅有20-30％的反应率，[Meyrier，Nephrol.Dial.Transplant，9596-598(1994)；Hulton et al.，Pediatr.Nephrol.，8401-403(1994)]。
关于治疗全身性红斑狼疮(SLE)，一项研究报道在预期的非随机、非对照研究中SLE活性指标的显著下降[Tokrda et al.，Arthr.Rheumat.，37551-558(1994)]。然而其它研究未证明对SLE的效能。
作为另一个实施例，环孢霉素当糖尿病最初呈现后早期用药，显示诱导胰岛素依赖的糖尿病的缓冲。虽然某些延长至850天，缓解平均约1年[Jenner et al.，Diabetologia，35884-888(1992)；Bougneres et al.，Diabetes，391264-1272(1990)]。在一项研究的后续阶段没有注意到环孢霉素的比期持续作用[Martin et al.，Diabetologia，34429-434(1991)]，然而在另一项研究中，在治疗12-18个月期间肾功能衰退，并未完全回到安慰剂水平，表明可能发生一些慢性肾损伤[Feldt-Rasmrssen et al.，Diabetes Medicine，7429-433(1990)]。对胰岛素依赖糖尿病的免疫抑制治疗可能需要早期干预以增强疗效。一些研究人员正在普查直系亲属并成功地预防性地治疗那些具有糖尿病指标的[Elliott and Chase，Diabetologia，34362-365(1991)]。
另一个实施例，环孢霉素已有效地治疗牛皮癣[Cuellar et al.，Balliere’s Clin.Rheum.，8483-498(1994)；Ellis et al.，JAMA 2563110-3116(1986)]。对于治疗牛皮癣关节炎，破坏性关节炎的一种特殊经历形式，高剂量疗法是有效的，并且治疗中断通常紧接着皮肤和关节疾病的加重。鉴于可能的副作用以及连续长期治疗的需要，环孢霉素仅对顽固性牛皮癣关节炎需要，该病通过其它方法不能充分治疗。
此外，在安慰剂对照及双盲试剂中已证明环孢霉素对治疗严重的特应性皮炎有效[Van Joost et al.，Br.J.Derm.，130634-640(1994)；Cooper，J.Invest.Derm.，102128-137(1994)]。药物的恶心、腹部不适、感觉异常、胆汁郁积及肾功能不全副作用宁可被病人们接受，也不愿忍受他们的未治之症。另一个随机双盲、安慰剂对照实验发现环孢霉素治疗明显增加了具有严重特应性皮炎病人的生活质量[Salek et al.，Br.J.Derm.，129422-430(1993)]。停止环孢霉素后皮肤损害马上复发，但生活质量仍保持改善。
另一个实施例，环孢霉素被用于治疗手的慢性皮炎，一种被报道4-22％流行的疾病，典型地用局部类固醇治疗，而许多病人没有反应。在一个开放试验中，低剂量环孢霉素已显示对6/7病人有效地治疗[Reitamo and Granlmd，Br.J.Derm.13075-78(1994)]。环孢霉素中断后大约一半病人复发。
另一个实施例，环孢霉素用于治疗荨麻疹和血管水肿，表现为荨麻疹和皮下水肿的先天性皮肤病。其病理学涉及肥大细胞，治疗常常无效。在一个实验中，具有顽固性荨麻疹和血管水肿的三位病人用环孢霉素治疗，在一周内所有症状消除[Fradin et al.，J.Am.Acad.Derm.，251065-1067(1991)]。由于副作用所有病人不得不停止治疗，治疗中断后症状又出现。
关于其它类风湿关节炎疾病，研究报道环孢霉素对其它不常见自身免疫疾病的有效治疗，包括贝切特氏病[Pacor et al.，Clin.Rheum.，13224-227(1994)]，韦格氏肉芽肿病[Allen et al.，Cyclosporin A Therapy forWegner’s Grannlomatosis in ANCA-Assoiated VascnliditesImmunologicaland Clinical Aspects，Gross ed.Plennm Press(1 993)]，和免疫介导的血小板减少症[Schultz et al.，Blood 851406-1408(1995)]。
在上述许多试验中，环孢霉素或FK506的使用与许多不期望的副作用相关。总的来说，感染和恶变危险的增加与普通性的免疫抑制有关，锚着蛋白相关的免疫抑制可能具有相似的危险。然而，通过锚着蛋白组织特异性可避免或减少其它副作用。环孢霉素和FK506的最常见的严重副作用是肾毒性，它至少在某种程度上是剂量相关的并在多数病人中出现，通常以治疗期间血管小球滤过率减少的形式。但这个副作用至少当中止给药时可部分逆转[leaker and Cairns，见上]。典型地，进行性肾机能不全不发展，虽然对最后的评价需要更多的对病人定期复查。在接受低剂量环孢霉素(3-4mg/kg/d)的病人中也观察到慢性损害，这些病人约40％活检显示间质纤维变性，管萎缩和小动脉病[Svarstad et al.，Nephrol.Dial.Transplant，91462-1467(1994)；Young et al.，KidneyInternational，461216-1222(1994)]。组织切片中内皮细胞之变化也是明显的[Kahan，N.Engl.J.Med.，3211725-1748(1989)]。虽然药物对管细胞和血管间质细胞也显示直接毒性[Platz et al.，Transplantation，58170-178(1994)]，但肾毒性被假定主要由小动脉血管收缩和慢性低度缺血所致[leaker and Cairns，见上]。一些报道表明，FK506的发生率及肾毒性严重性稍高[Platz et al.，见上]。
另一报道的环孢霉素与FK506的重要毒性是神经毒性，具有临床表现包括疾病突然发作，紊乱、失明、昏迷、头痛、运动失调，帕金森氏综合症、感觉异常，精神病，病灶性缺陷，运动不能哑症，震颤，神经病和睡眠紊乱[Shimizu et al.，Pediatr.Nephrol.，8483-385(1994)；Wilsonet al.，Muscle and Nerve，17528-532(1994)；Reece et al.，Bone MarrowTranspl.，8393-401(1991)；Eidelman et al.，Transpl.，Proc.，233175-3178(1991)；de Groen et al.，N Engl.J.Med.，317861-566(1987)]。肝移植后，严重神经毒的减轻显示在用FK506及环孢霉素治疗的病人比例分别为10-20％和3-12％神经毒性也与血清脂紊乱和肝机能障碍有关。
环孢霉素和/或FK506的其它副作用包括肝毒性葡萄糖不耐症，高血压，多毛症，胃肠症状，静脉血栓症，前列腺炎和齿龈增生[Morris，J.HeartLung Transplant，12S275-S286(1993)；Fung et al.，Transpl.，Proc.，233105-3108(1991)；Mason，Pharmacol.Rev.，42423-434(1989)；Kahan，N.Engl.J.Med.，3211725-1738(1989)；Thomason et al.，Renal Failure，16731-745(1994)]。因此，鉴于环孢霉素及FK506的广泛应用和其使用的固有副作用，开发其它免疫抑制剂特别有益。
例如，在T细胞活化中，钙调磷酸酶从推断的T细胞锚着蛋白移位可能抑制神经钙蛋白活性，因此提供一种具有环孢霉素或FK506用途但较少副作用的T细胞特异性免疫抑制剂。前面观察到PKA从T细胞锚着蛋白移位在被刺激细胞中增强IL-2表达，表明锚着蛋白定位的PKA在T细胞活化过程中，以某种方式对IL-2表达起调节作用。因此PKA的T细胞特异性定位可能提供一种体内增加IL-2分泌的手段，模仿重组IL-2给药并可能减少先前报道的如下所述IL-2治疗的毒性。
IL-2已被同意用于治疗转移性肾癌，大约15-20％的患转移性肾细胞癌或恶性黑色素瘤的病人对IL-2治疗有反应。某些反应是可持续的，持续多于66个月[Dillmen，Cancer Biotherapy，9183-209(1994)；Whittingto and Faulds，Drugs 46446-514(1993)]。虽然高剂量大丸剂疗法与一些严重副作用(如下所述)相关，但低剂量皮下或连续输注疗法在减少毒性时产生适中的反应率(12％)[Vogelzang et al.，J.Clin.Oncol.，111809-1816(1993)]。
IL-2疗法(与或不与干扰素-α及其它药剂)已被研究用于治疗其它恶性肿瘤。例如，胶质瘤切除后直接在肿瘤病灶处用IL-2，已得到持续的临床反应，但无治愈[Merchant et al.，J.Neuro.8173-188(1990)]。在其它试验中，对淋巴瘤[Dillman，见上]，结肠癌[Whittington and Faulds，见上]，限制性AML[Bruton and Koeller，Pharmacotherapy，14635-656(1994)]，卵巢癌和早期膀胱癌[Whittington and Faulds，见上]已报道有有限的效能。这些实验中每一个的参加者的数目都太小，不能针对效能得出重要结论。
IL-2还与采用的免疫疗法联合使用，并证明对治疗转移性肾癌有效[Pierce et al.，Sem.Oncol，2274-80(1995)；Belldegrun et al.，J.Uro.，1501384-1390(1993)]。此外，IL-2还对治疗某些感染性疾病有效，通过皮内注射后减少麻风病人皮肤细菌负载与抗原水平[Kaplan，J.Infeet.Dis.167(Sappl1)S18-22(1993)]。还观察到与PPD-阳性健康对照相比，结核病人的淋巴细胞产生低水平的IL-2[Sanchez et al.，Inf.Immun.，625673-5678(1994)]，提示IL-2疗法可能对治疗分枝杆菌感染有价值。
不管IL-2可能的治疗价值，该细胞因子也有明显毒性[除非另外注明，来源自Whittington and Faulds，Dillman and Bruton and Koeller，见上]。主要的限制治疗副作用是毛细血管渗漏综合症。IL-2给药增加引起间质和肺水肿的血管渗透性，使病人形成低血压及大量需要增压物质。强有力的液体复苏会导致有生命危险的肺水肿。高达20％的病人可能需要插管和机械通风。高剂量大丸剂给药比低剂量或连续地缓慢灌注引起更严重的渗漏，在一些编组中，100％病人在IL-2治疗期间需要ICU。也已观察到心肌炎，心肌病和心律失常。作为毛细血管渗漏综合症-诱导的低血压的结果，可能发生急性肾衰竭。
IL-2还能引起腹泻及电解质失衡，胆汁郁积、甲状腺异常和急性前列腺炎。在15-20％受治病人中出现需输血的贫血[Mac Farlane et al.，Cancer 751030-1037(1995)]。可发生出血性血小板减少，并且常常凝血通路缺陷。大约70％病人精神状况感受变化，包括妄想狂样妄想，错觉，无兴趣，睡眠紊乱，和呆滞。昏迷，视觉缺陷，短暂缺血发作及感觉异常也有报道。这些与外源性IL-2相关的缺点提示应开发作为可能治疗的替代品，其中如可调节内源性IL-2产生，因而消除需要外源性IL-2治疗。
除了提供鉴定免疫抑制药物的可能方法和IL-2产生的调节子，鉴于锚着蛋白自己显示参加不同的代谢途径，锚着蛋白的鉴定使调节其它细胞活性成为可能。例如，大概通过结合PKA，PKC和神经钙蛋白，AKAP79在调节神经元突触后密度的谷氨酸受体调节的离子通道中是重要的。PKA调节AMPA受体-调节的通道的活性，而且PKA的移位或抑制减弱AMPA离子通道活性。PKC调节NMDA受体调节的通道的活性，神经钙蛋白显示使NMIDA受体对外来刺激不敏感。这些观察表明定位的激酶(PKA和PKC)可能在神经元中调节谷氨酸受体的活性。神经钙蛋白的去磷酸化作用是NMDA受体的对抗调节机制。此模型生理上与环孢霉素或FK506诱导的发作的事实一致。
此外，谷氨酸受体已在许多神经疾病中有牵连。谷氨酸及其它兴奋性氨基酸可对神经元产生兴奋毒性，并且突触后谷氨酸受体的过度刺激已显示对神经元有毒，导致急性神经元变性。缺氧症(如中风或心肌梗塞后)和CNS外伤已表明引起显著的谷氨酸外排入细胞外空间，然后与谷氨酸受体相互作用开触发兴奋毒性的级联放大。抗兴奋性药物已显示在动物模型中保护大脑损伤[Olney，Neurobiolegy of Aging；15259-260(1994)]。有趣的是，NMDA拮抗剂对一些类型神经元有毒，表明谷氨酸在那些细胞中可能抑制其它的兴奋通路。大环内酯抗体，如FK506也显示抗NMDA的保护作用，但不对培养神经元抗钾盐镁矾兴奋毒性起保护作用[Manev，et al.，Brain Res.，624331-335(1993)]。
谷氨酸还与帕金森氏病有关。在接受MPTP的猴子中，NMDA拮抗剂保护物质黑质中的多巴胺能神经元，MPTP是一种在人及其它灵长目动物中诱导帕金森氏综合症的化学药品。金钢烷胺和memantine为NMDA拮抗剂，已在欧洲用于治疗帕金森氏病，但两者都显示在某些病人中引起精神病。还有一些证据，谷氨酸能神经元可能在帕金森氏病中极度活跃，抑制作用可能减少该病的运动症状[Lange and Riederer，LifeSciences，552067-2075(1994)]。
谷氨酸还在发作失调中起作用，参与发作活性的开始，传播及维持。NMDA和非NMDA拮抗剂是有效的抗痉剂[Meldrum，Neurology，44(suppl 8)S14-S23(1994)]。AMPA受体已与ALS有关系，现在正在进行受体拮抗剂的临床试验。49就所有这些观察而言，不奇怪其它许多免疫抑制剂正处于临床试验中。关于这些实验的下列信息来自Haydon and Haynes，Balliere’s Clin.Gastroentero.，8455-464(1994)；Thomason and Starzi，Immunol.Rev.1993，71-98(1993)；and Morris J.Heart Lung Transplant.，12S275-S286(1993)。例如，重氮螺烷是一种SKB化合物，它抑制移植物细胞渗液并诱导IL-2R，而且废除IL-2和IFN-γ产生。显然重氮螺烷诱导某些类型的抑制细胞，并与环孢霉素有协同作用的一些证据。
另一个实施例，mycophenolate mofetial是一种Syntex化合物，它抑制嘌呤合成，并具有T和B细胞选择性抗增殖作用。它减少抗体。Mycophenolate mofetial还可以耗尽细胞表面的粘附分子。虽然该药物明显低毒，但它可引起白血球减少，被用来治疗牛皮癣已20年。
另一个实施例，Sumitome化合物中的mizoribine，它抑制ONA合成。其作用机制与霉酚酯相同。
另一个实施例，brequinar是一种杜邦-默克化合物，它通过阻断二氢乳清酸脱氢酶抑制嘧啶合成。期待临床试验的全部报告。该药物已报道与环孢霉素协同作用，但可引起血小板减少，皮炎和粘膜炎。
另一个实施例，15-脱氧斯泼耐林是一种Nippon-Kayaku化合物，它主要影响单核细胞/巨噬细胞作用，包括抑制氧化代谢，溶酶体的酶合成，IL-1产生和II类MAC抗原的细胞表面表达。它对顽固性肾排斥70-90％有效，但在较高剂量可能出现骨髓毒性。
另一个实施例，leflumemide是一种Hoechst化合物，它抑制细胞因子作用，阻断T细胞活化及抗体合成。它对肾或骨髓无毒。
另一个实施例，雷帕霉素是与FK506有关的Wyeth-Ayerst化合物。它是一种前药，必须结合亲免素才有活性，并不抑制钙调磷酸酶和阻断T细胞细胞因子产生。雷帕霉素通过未知的机制阻断G1到S过渡。
对本发明如上所述解释的实施例中许多修改和变动对本领域技术人员是期望出现的。因而只有在附属的权利要求中出现的限制应放入本发明。
序列表(1)总说明(I)申请人Lockerbi，Robert O.(ii) Kashishian，Adam(iii)发明题目新的PKA-结合蛋白及其用途(iv)序列数目5(v)通讯地址(A)地址Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borum(B)街道233 South Wacker Drive，6300 Sears Tower(C)城市芝加哥(D)州 伊利诺斯(E)国家美国(F)邮政编码60606-6402(vi)计算机可读方式(A)介质类型磁带(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.25版(vi)目前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(viii)律师/代理人资料(A)姓名Williams Jr，Joseph A.
(B)注册号38，659(C)委托/摘要号27866(ix)电信资料(A)电话312-474-6300(B)传真312-474-0448(C)用户电报25-3856(2)SEQ ID NO1的说明(i)序列特征(A)长度23个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu1 5 10 15Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala20(2)SEQ ID NO2的说明(i)序列特征(A)长度23个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Pro Val Asp Ala Val Ile Glu1 5 10 15Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala20(2)SEQ ID NO3的说明(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATTAACCCTC ACTAAAG 17(2)SEQ ID NO4的说明(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GATATCACTC AGCATAA 17(2)SEQ ID NO5的说明(i)序列特征(A)长度2850碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCACGAGGA GCAGCAGGTG GAGGCTGGTG CTGTGCAGCT GAGGGCTGAC CCTGCCATCA 60AGGAACCTCT CCCCGTGGAA GACGTCTGTC CCAAAGTAGT GTCCACACCC CCCAGTGTCA 120CAGAGCCTCC AGAAAAGGAA CTGTCCACCG TGAGCAAGCT GCCTGCAGAG CCCCCAGCAT 180TGCTCCAGAC ACACCCACCT TGCCGAAGAT CAGAGTCCTC GGGCATTCTT CCTAACACCA 240CAGACATGAG ATTGCGACCA GGAACACGCA GAGACGACAG TACAAAGCTG GAGCTAGCCC 300TGACAGGTGG TGAAGCCAAA TCGATTCCTC TAGAGTGCCC CCTTTCATCC CCAAAGGGTG 360TACTATTCTC CAGCAAATCA GCTGAGGTGT GTAAGCAAGA TTCCCCCTTC AGCAGGGTGC 420CAAGGAAGGT CCAGCCAGGC TACCCCGTAG TCCCCGCAGA GAAGCGTAGC TCTGGGGAGA 480GGGCAAGAGA GACAGGTGGG GCCGAAGGGA CTGGTGATGC CGTGTTGGGG GAAAAGGTGC 540TTGAAGAAGC TCTGTTGTCT CGGGAGCATG TCTTGGAATT GGAGAACAGC AAGGGCCCCA 600GCCTGGCCTC TTTAGAGGGG GAAGAAGATA AGGGGAAGAG CAGCTCATCC CAGGTTGGTG 660GGGCCAGTGC AGGAGGAAGA GTATGTAGCA GAGAAGTTGC CAAGTAGGTT CATCGAGTCG 720GCTCACACAG AGCTGGCAAA GGACGATGCG GCGCCAGCAC CCCCAGTCGC AGACGCCAAA 780GCCCAGGACA GAGGTGTCGA GGGAGAACTG GGCAATGAGG AGAGCTTGGA TAGAAATGAG 840GAGGGCTTGG ATAGAAATGA GGAGGGCTTG GATAGAAATG AGGAGAGCTT GGATAGAAAT 900GAGGAGGGCT TGGATAGAAA TGAGGAGATT AAGCGGGCTG CCTTCCAGAT AATCTCCCAA 960GTGATCTCAG AAGCAACCGA ACAGGTGCTG GCCACCACGG TTGGCAAGGT TGCAGGTCGT1020GTGTGTCAGG CCAGTCAGCT CCAAGGGCAG AAGGAAGAGA GCTGTGTCCC AGTTCACCAG1080AAAACTGTCT TGGGCCCAGA CACTGCGGAG CCTGCCACAG CAGAGGCAGC TGTTGCCCCG1140CCGGATGCTG GCCTCCCCTT GCCAGGCCTA CCAGCAGAGG GCTCACCACC ACCAAAGACC1200TACGTGAGCT GCCTGAAGAG CCTTCTGTCC AGCCCCACCA AGGACAGTAA GCCAAATATC1260TCTGCACACC ACATCTCCCT GGCCTCCTGC CTGGCACTGA CCACCCCCAG TGAAGAGTTG1320CCGGACCGGG CAGGCATCCT GGTGGAAGAT GCCACCTGTG TCACCTGCAT GTCAGACAGC1380AGCCAAAGTG TCCCTTTGGT GGCTTCTCCA GGACACTGCT CAGATTCTTT CAGCACTTCA1440GGGCTTGAAG ACTCTTGCAC AGAGACCAGC TCGAGCCCCA GGGACAAGGC CATCACCCCG1500CCACTGCCAG AAAGTACTGT GCCCTTCAGC AATGGGGTGC TGAAGGGGGA GTTGTCAGAC1560TTGGGGGCTG AGGATGGATG GACCATGGAT GCGGAAGCAG ATCATTCAGG AGGTTCTGAC1620AGGAACAGCA TGGATTCCGT GGATAGCTGT TGCAGTCTCA AGAAGACTGA GAGCTTCCAA1680AATGCCCAGG CAGGCTCCAA CCCTAAGAAG GTCGACCTCA TCATCTGGGA GATCGAGGTG1740CCAAAGCACT TAGTCGGTCG GCTAATTGGC AAGCAGGGGC GCTATGTGAG TTTTCTGAAG1800CAAACATCTG GTGCCAAGAT CTACATTTCA ACCCTGCCTT ACACCCAGAG CGTCCAGATC1860TGCCACATAG AAGGCTCTCA ACATCATGTA GACAAAGCGC TGAACTTGAT TGGGAAGAAG1920TTCAAAGAGC TGAACCTCAC CAATATCTAC GCTCCCCCAT TGCCTTCACT GGCACTGCCT1980TCTCTGCCGA TGACATCCTG GCTCATGCTG CCTGATGGCA TCACCGTGGA GGTCATTGTG2040GTCAACCAGG TCAATGCCGG GCACCTGTTC GTGCAGCAGC ACACACACCC TACCTTCCAC2100GCGCTGCGCA GCCTCGACCA GCAGATGTAC CTCTGTTACT CTCAGCCTGG AATCCCCACC2160TTGCCCACCC CAGTGGAAAT AACGGTCATC TGTGCCGCCC CTGGTGCGGA CGGGGCCTGG2220TGGCGAGCCC AAGTGGTTGC CTCCTACGAG GAGACCAACG AAGTGGAGAT TCGATACGTG2280GACTACGGCG GATATAAGAG GGTGAAAGTA GACGTGCTCC GGCAAATCAG GTCTGACTTT2340GTCACCCTGC CGTTTCAGGG AGCAGAAGTC CTTCTGGACA GTGTGATGCC CCTGTCAGAC2400GATGACCAGT TTTCACCGGA AGCAGATGCC GCCATGAGCG AGATGACGGG GAATACAGCA2460CTGCTTGCTC AGGTGACAAG TTACAGTCCA ACTGGTCTTC CTCTGATTCA GCTGTGGAGT2520GTGGTTGGAG ATGAAGTGGT GTTGATAAAC CGGTCCCTGG TGGAGCGAGG CCTTGCCCAG2580TGGGTAGACA GCTACTACAC AAGCCTTTGA CCCCCATGCT GCTTCCTGAG AGTCTTTTTT2640GCACTGTTGA AATTGGGCTT GGCACTCAAG TCAAAGATGA ACATCGGAAT AACAAACATT2700GTCCTCTCCA GAAAGTCCTT TCTTTATCCA TACTGTAGTC CTATTGAGAA GACATTTCGT2760CTCTGAGAAA AAAGGATGGA ACTATGGGTT CTCTTCGCAA AGCCAAAGGA TAGTGTTTAA2820CAAGCCAGCT GGCTTATCCT GGCTCGTGCC 2850
权利要求
1.一种纯化和分离的聚核苷酸，它包含陈述于SEQ.ID.NO5的蛋白编码序列。
2.权利要求1的聚核苷酸，它是一个DNA分子。
3.权利要求2的DNA分子，它是一个cDNA分子。
4.权利要求2的DNA分子，它是一个基因组DNA分子。
5.权利要求2的DNA分子，它是一个全部或部分化学合成的DNA分子。
6.一种纯化和分离的聚核苷酸，它选自a)陈述于SEQ ID NO5的人类DNA序列，和b)在严格条件下与a)的DNA的非编码链杂交的DNA分子。
7.一种DNA表达构建物，它包含根据权利要求2的DNA分子。
8.一种用根据权利要求2的DNA分子转化的宿主细胞。
9.一种用于产生由陈述于SEQ.ID.NO5的聚核苷酸编码的人类多肽的方法，它包含在一合适培养基中生长根据权利要求8宿主细胞和从所说的宿主细胞或其生长培养基中分离多肽。
10.一种由陈述于SEQ.ID.NO5的聚核苷酸序列编码的纯化和分离的多肽。
11.一种能够特异地与权利要求10的多肽结合的多肽。
12.一种根据权利要求11的多肽，它是一个抗体。
13.一种根据权利要求12的抗体，它是一个单克隆抗体。
14.一种对权利要求13的抗体特异的抗个体基因型的抗体。
15.一种产生权利要求13的抗体的杂交瘤细胞株。
全文摘要
本发明提供了新的PKA-结合多肽，编码此多肽的核酸和与多肽有特异免疫活性的抗体。
文档编号C07K14/47GK1165537SQ96191059
公开日1997年11月19日 申请日期1996年7月17日 优先权日1995年7月17日
发明者罗伯特·欧文·洛克比, 亚当·卡西西恩 申请人:艾科斯有限公司