专利名称：苯基肽，该肽及含有所述肽的药物组合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及有机化学领域，更具体地涉及到治疗化学。
本发明的更特别的目的是含有苯丙氨酸(Phe)的新肽，其中亚甲基基团已被电子等排体硫，氧，氨基或亚砜取代。
特别地，本发明涉及到至少含有分子式Ile-Arg-Lys-Ile-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile的九个氨基酸的肽地合成，其中苯丙氨酸(Phe)分子带有的亚甲基基团已被一电子等排体取代，即根据本发明在结构上的变化可以下列方式表示
其中分子式X和Y是保护的或未保护的氨基酸残基，或肽
R是线性或支链烷基
R”是下列基团之一烷基，苯基，卤素，硝基，氨基，烷基胺，烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基酰氨基或腈基
Z是硫，氧，氨基或亚砜
并且n等于0，1，2或3
·专利WO-A-9110679描述了具有通式
A-X-Y-W-U
的肾素抑制肽，它在P3位的α位上具有一个含杂原子的氨基酸
其中A代表P4位，X代表P3位，Y代表P2位，以及W和U代表P1位和P’1位。
在本发明中描述的优选的化合物为
A是IVA(异戊酰基)或BOC(叔丁氧羰基)
X是-NHCH(SPh)CO-，-NHCH(OPh)CO-，-NHCH(NHPh)CO-，-NHCH(SCH(CH3)2)CO-，-NHCH(SO2CH(CH3)2)CO-，-NHCH(NPhCH3)CO-，
Y是HIS(L-组氨酸)或LEU(L-亮氨酸)
W是CAD(肽基氨基二醇)或STA(4(S)-氨基-3(S)-羟基-6-甲基-庚酸)
U是MBA(1-羟甲基-2-甲基-丁胺)，
并限定如果W是CAD，则U空缺。
这些肽是肾素抑制剂，用于治疗高血压症，心力衰竭，青光眼，醛甾酮过多症。
正象HIV蛋白酶，肾素是天冬氨酰蛋白酶，专利WO-A-9110679的化合物也被用于治疗包括HTLV-I，-II，-III在内的逆转录病毒引起的疾病。
·专利US-A-4,454,065描述了具有在α位被化疗残基W取代的寡肽链的前药。
这些前药具有以下通式
P-NHCH(R1)CO-NHCH(W)CO-Q
21
特别地P和Q可以是氨基酸
甘氨酰单元1是携带化疗残基W的单元。
此发明的优选化合物之一是L-丙氨酰-L-(α-苯硫代)甘氨酸。
这些前药被用于增加对感染细胞的穿透能力，相应的运送的化疗残基W对感染细胞是有效的。这些化疗残基(如苯硫酚)是抗微生物和抗寄生虫剂。
·参考文献J.MED.CHEM.(1992)，35(6)，1032-42，描述了肾素抑制肽，它含有一个在P2位的α位上有一杂原子的氨基酸。
肾素的抑制能对高血压提供有效的治疗。
所描述的衍生物特别地是
BNMA-NHCH(X)CO-STA-MBA
BNMA(位置P3)代表双(1-萘基甲基)乙酸，STA(位置P1)代表4(S)-氨基-3(S)-羟基-6-甲基庚酸，MBA(位置P’1)代表2(S)-甲基丁胺
如X可以是S-C6H5，O-C6H5，N-C6H5
然而，S-，O-，和N-芳基衍生物一般比其烷基化类似物活性低。
·参考文献INT.J.PEPT.PROTEIN RES.(1986).27(6).659-665，描述了α-苯硫基甘氨酸肽的合成，更特别地是如下二肽及两个三肽的合成
Ala-α-TPG
Ala-α-TPG-Ala
Ala-Ala-α-TPG
Ala代表丙氨酸
TPG代表苯硫基甘氨酸(-NHCH(SPh)CO-)
这些α-取代的甘氨酸肽用于把药物运输到微生物细胞。
这样，由于肽酶造成的裂解，它们释放α取代物，即苯硫酚到微生物细胞。
根据此发明的式I化合物可以以如下简单的方式更准确地写出
其中Ar是非取代的或取代的苯基。
Z是如前定义的电子等排体。
Ile是异亮氨酸
Arg是精氨酸
Lys是赖氨酸
Leu是亮氨酸
Asp是天冬氨酸
Gly是甘氨酸
在优选的方式中，此通式I中，Z是硫。通过作为专一切割编码病毒结构蛋白和组成酶的聚肽前体的小的天冬氨酰蛋白酶二聚体的抑制剂，式I的化合物是HIV复制的抑制剂(Martin S.A.，Recent Advances in theDesign of HIV proteinase inhibitors，Antiviral Res.17(1992)265-278)。
通式I的化合物用式II的合成子(synthon)[(Boc-Leu)-氨基]苯基Z乙酸制备
Boc＝叔丁氧羰基其中Y是苯基，非取代或被一个，两个或三个R”取代基取代Z是硫，氧，氨基和亚砜电子等排体式II用于在模板上进行的肽合成过程，以导入本发明依据的基本单元。附在此的表格1解释合成子II合成的不同阶段，对此Z是硫。此合成子II通过以下方法制备
Boc-亮氨酰胺(3)与水合乙醛酸烯丙酯(4)缩合产生相应的α-羟基化的衍生物，并因此得到Boc-Leu-Gly(5)烯丙基酯。羟基化官能团乙酰化后，为了获得化合物(7)生成的酯(6)被亲核试剂如苯硫酚取代。在三苯基膦存在下，用(双钯三苯基膦)配合物除去烯丙基酯，生成所期望的以非对映异构体混合物存在的合成子(II)。
应注意到使用其它的乙醛酸酯对在Boc-亮氨酰胺上的缩合是不太合适的。很有可能酯官能团的最终脱保护条件导致肽键的断裂。此外，乙醛酸和Boc-亮氨酸之间的直接缩合在试验的实验条件下证明是行不通的，因为肽(列于此后的表1)的固相合成(此后描述)需要克级的合成子(II)。
同样类型的合成可用于引入一个-O-或-NH-电子等排体。亚砜化合物用相应含硫衍生物的过氧化物通过氧化制备。
使用固相肽合成的方法，根据Nguyen等(J.Chem.Soc.，PerkinTransact.1(1987)1915-1919)描述的操作方法，从此合成子开始，将其偶联不同的氨基酸，这些氨基酸构成含有至少九个氨基酸的肽链。反应开始于每克含0.40mmol异亮氨酸的MBHA(对二苯甲基胺)树脂或CM树脂(1％交联的氯甲基化树脂)。用两倍当量的Boc氨基酸和两倍当量[苯并三唑氧基三-二甲基氨基磷鎓](BOP)(Novabiochem)的六氟代磷酸酯进行偶联。偶联后，用在50％二氯亚甲烷(DCM)中的50％三氟乙酸(TFA)完成脱保护。在苯甲醚存在下用氢氟酸，也可在同一个阶段完成链的脱保护和树脂的裂解。缩合造成的肽在乙腈水溶液中纯化。下列肽(给出序号)被成功地制备
(1)Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH
(8)Fmoc-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-NH2
(9)Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-NH2
(10)Fmoc-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH
(11)Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH
(2)BocNH-Leu-(S)PheOH
(7)BocNH-Leu-(S)PheOCH2-CH＝CH2在此列以及以后中，符号Fmoc指9-芴基甲氧基羰基优选的序列，Leu-(S)Phe，可以表示如下
这些肽的抗HIV-1活性表示于随后的表1中。
本发明的另一个主题是特别地打算使其成为治疗由HIV病毒引起的病毒感染的药物组合物，做为活性成分，它至少含有通式(I)的一个化合物
其中X和Y是保护的或未保护的氨基酸残基，或肽
R是线性或支链烷基
R”是下列基团之一烷基，苯基，卤素，硝基，氨基，烷基胺，烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基酰氨基或腈基
Z是硫，氧，氨基或亚砜
并且n等于0，1，2或3
与可药用的、无毒、惰性赋形剂结合或混合。
本发明也涉及药物组合物，特别地打算使其成为治疗由HIV病毒引起的病毒感染的药物组合物，做为活性成分，它至少含有简单通式(I)的一个化合物
其中Z为硫，氧，氨基或亚砜
Ar为非取代或取代的苯基
与可药用的、无毒、惰性赋形剂结合或混合。
在通式I的化合物中，将有优选地用做活性成分，其中Ar为苯基。也可使用化合物，其中Ar被选自低级烷基，低级烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，硝基，羧基酰氨基，腈基，卤素和苯基的一个，两个或三个基团取代。
AIDS病毒产生一个天冬氨酰-蛋白酶二聚体，它专一地断裂编码病毒结构蛋白和组成酶的聚合蛋白的前体。
此水解蛋白的活性对成熟的感染病毒颗粒的产生是必需的，因而是一令人感兴趣的治疗介入的靶点。
从事化疗工作的化学家已试图设计和合成此起决定作用的天冬氨酰蛋白酶的抑制剂。
大多数的实验室已使用过渡态类似物的概念。此概念由合成最短的可能肽底物组成，其中正常断裂的酰胺键被不能水解的模拟四面体过渡态模板的官能团取代。
到目前为止，对HIV1蛋白酶已提出了大量的模拟不同状态的四面体过渡态模板。它们是氨基乙烯基电子等排体(RICH D.H.等，J.Med.Chem.33(1990)1285-1288)，statine类似物(HUY K.Y.等，FASEB J.5(1991)2606-2610-VENAUD S等，Res.Virol.143(1992)311-319)，次膦酸电子等排体(Grobeiny D.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.169(1990)1111-1116)，二氟酮(SHAM H.L.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.175(1991)914-919)，二羟基亚乙基和羟基乙基胺电子等排体(THAISRIVONGS S.等，J.Med.Chem.34(1991)2344-2356-RICHD.H.等，J.Med.Chem.34(1991)1222-1225)。
考虑到酶的三级结构，也设计了HIV1蛋白酶抑制剂。这些化合物可以分类为对称抑制剂或为二聚抑制剂。为了增加抗HIV肽的总体规模和方法，申请者把它们的研究集中在HIV-2抑制剂的新概念上，此概念基于下列实验的观察1.尽管对感染的成熟病毒颗粒的酶和结构蛋白的序列完成了序列分 析，但未能揭示HIV蛋白酶的专一底物，然而在由这些感染的病毒颗 粒产生的裂解位点注意到了一些专一性。2.代表HIV-1多聚蛋白内已知蛋白水解作用位点模型的许多肽，被认为 由合成的或重组的HIV-1蛋白酶准确地裂解。3.肽是通过测序成熟HIV-1蛋白的胺或末端羰基官能团的推论设计的。
其中，发现合成的肽Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-Phe-Leu-Asp-Gly-Leu在 Leu-Phe残基之间被裂解，该裂解对应于正常的裂解位点727/728聚 合酶(Darke，P.L.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1988，156， 297)。假设位于肽I的苯丙氨酸残基(Phe)的亚甲基基团被杂原 子如硫、氧、氨基、亚砜的取代不会改变Leu和Phe间的切割位点， 有可能提及肽I的新电子等排体的合成和令人吃惊的对HIV-1的抑制 性能。这些新肽含有在α位被Z-苯基取代的甘氨酸，其中Z代表硫、 氧、氨基、亚砜。正常地，α位的碳连接一氮、氧或硫原子的α-取代 甘氨酸是不稳定的。然而，此类型的不同的N-乙酰化α-取代甘氨酸 在文献中已有描述。氨基的乙酰化通过离域肽键上氮电子导致分子的 稳定。代替用简单的N-乙酰化来提供此α-取代甘氨酸的化学稳定 性，申请者们用Leu-Phe肽键以便模拟肽I。
列于表1的肽是由固相合成技术合成的。此合成需要用关键合成子(II)。
合成子(2)和(7)根据表格1合成
合成子(II)以非对映异构体混合物的形式使用。考虑到意外的抗HIV结果，用反相HPLC进行(2)的混合物分离和/或在第二研究阶段相应肽的对映体合成是有利的。
对HIV1蛋白酶活性的测试
列于表1的模型肽与用标准步骤(Billich，J.Biol.Chem.1988，263，17905-17908)部分纯化的HIV-1蛋白酶温育，并用反相HPLC分析切割产物。只有肽I模型被裂解。含硫(2，7，8，9，10和11)的肽在测试条件下令人吃惊地抗任何蛋白水解的裂解。而且，含硫的肽被加入到以肽I做为底物模型的试验中，在与底物具有相同摩尔浓度(约2mM)下注意到它们不是抑制剂。
抗病毒活性
在细胞培养中，也测试了列于表1的代表性的化合物对抑制HIV1感染的能力。MT4细胞株中HIV1的融合作用按REY等(J.Virol.methods1987，16，239-249)所述测定，见表1。本发明的一些新苯基肽被发现为HIV复制的活性抑制剂。
最有效的化合物是(9)和(11)。这些结果显示，与N-端基团裸露的同源(9)和(11)相比，化合物(8)或(10)中N-端基团被Fmoc基保护使抑制病毒复制的能力显著丧失。另外，由BILLICH等(J.Biol.Chem.263(1988)17905-17908)发表的先前技术的结果显示，7到18个氨基酸长度的合成肽可被用作模型抑制底物，用于蛋白酶的研究。
最有活性的化合物是(9)和(11)。这些结果显示与N-端裸露的(9)和(10)同源物相比，在化合物(8)或(10)中N-端基团用Fmoc基团保护引起抑制病毒复制能力的显著下降。另外，由BILLICH等(J.Biol.Chem.263(1988)17905-17908)发表的现有技术的结果显示长度为7到18个氨基酸的合成肽可以用作抑制底物的模型，用于蛋白酶的研究。现在已发现含有在α位由Z-苯基取代的甘氨酸的肽的最短长度为9或10个氨基酸。根据此观点含有1个-Leu-(S)Phe序列的两个二肽(2)和(7)，证明无病毒复制抑制剂活性。至于含碳末端残基初步结果似乎表明羧基(11)或羧基酰胺基可能适于做为HIV病毒复制的抑制剂。
该研究表明HIV-1复制的适度效能抑制剂，掺入苯基丙氨酸电子等排体，可能是等同的。据申请人所知，非底物或HIV-1蛋白酶抑制剂的合成肽具有抗MT4细胞培养物被HIV-1感染的活性还是首次。这类新的HIV蛋白酶合成肽具有重大定义，它基于在HIV蛋白酶合成肽底物裂解部位的苯基丙氨酸残基被Z电子等排原子取代亚甲基基团的电子等排体置换。
这类新化合物的作用机制问题似乎是很难的。试图识别由这类新化合物激活的HIV复制循环靶点的试验必须继续进行。然而，分析试图鉴定这些化合物在细胞中干扰病毒复制循环机制的试验的测试，这里报道的结果允许假设掺入一个Z-苯基单元的某些肽在HIV病毒抑制作用水平上不具活性。这种缺乏活性可能与这些新的合成肽相对于MT4细胞的低膜通透性有关。实际上，虽然具有游离末端酯功能的像(9)和(11)的化合物显示了最强的抗HIV作用，但是发现肽(8)和(10)在感染的培养物中没有活性。因此在掺入Z-苯基片断的这类新合成肽中最高效进入被感染细胞的化合物组成了作用机制研究的良好候选者。
总之，已经开发一组新的细胞培养物中HIV病毒复制抑制剂，它促进在Z原子(Z如前定义)的苯基丙氨酸残基取代。虽然这些新合成化合物的作用机制尚不了解，但是它们代表寻找新抗HIV药物的一种新方法。
评价含有一个α-取代的甘氨酸残基的新肽类似物的抗逆转录病毒性质的操作方法
方法
抗病毒作用的评价基于对MT4细胞系上HIV1病毒致细胞病变作用的研究。MT4株产生于从一个病人分离并被HTLV1病毒转化的T细胞。该株用支原体感染。支原体是无处不在的感染剂，做为天然宿主生活在MT4细胞表面的细菌。这种300-700nm大小的细菌通过形成叫做合胞体的巨大细胞(通过gp120融合)，对HIV的强致病变作用有责任。这种HIV感染在感染后4到5天观察到，然后是细胞死亡。
这种致细胞病变作用直接与下列因素有关，即病毒对细胞的感染，其细胞内复制和细胞对病毒抗原的表达。所以这种作用的抑制对应于HIV1病毒扩增的抑制。这种被HIV1感染的成淋巴细胞系可用于病毒的生产。
感染剂的处理作用是永久性的。实际上它存在于病毒感染之前，之后和过程中。
抗病毒前景基本上涉及控制蛋白成熟和感染颗粒生成的蛋白酶抑制剂，涉及参与唤醒和传播病毒转录的正调控病毒的TAT蛋白的抑制剂，还涉及将病毒RNA转变成双链DNA的逆转录酶的抑制剂，该RNA含有病毒信息并整合到宿主细胞DNA的原病毒形式。
生物学方法
在MT4细胞株中对HIV-1病毒复制的体外抑制作用
为了能够培养MT4细胞8天，并能够察觉合胞体的形成，在10％培养基中进行连续稀释。
MT4试验
-感染前
3×105MT4细胞/100μl加入96孔微量板，2000rpm离心3次，沉淀与100μl被试连续浓度的抗病毒剂在37℃二氧化碳存在下预孵1小时。
-感染
在微量孔中通过加入HIV病毒的10-3稀释进行(这种HIV病毒稀释度被确定以便在4到5天形成合胞体)。在感染过程中抗病毒剂仍存在，病毒的终浓度为5×10-4。
-感染后
在37℃二氧化碳存在下孵育1小时后，MT4细胞用RPMI1640洗三次，并在24孔板中与每毫升一种被试化合物浓度3×105细胞的比例培养。开始培养那天定为D0。
在D3或D4，MT4细胞用不同浓度的抗病毒剂稀释到三分之一。
每天在显微镜下观察合胞体的出现来看是否有相对于对照HIV-1的延迟。
在D8，进行逆转录酶试验。如果细胞没被感染那么被试抗病毒剂有保护作用。
确定IC50剂量，它是50％抑制对照HIV1逆转录酶值的抗病毒剂浓度。
表1含有序列-Leu-(S)Phe-的肽的抗HIV-1活性
IC50相对于试验对照组抑制合胞体形成达50％所需的浓度
TI治疗指数50％MT4细胞不受感染所需的浓度(ID50)比抑制50％合胞体形成所需浓度(IC50)
试验在MT4细胞中进行。病毒株HIV-1Bru
通式I化合物的可预见剂量将为每单位剂量0.1-100mg。
它们将通过消化道或肠胃外途径给药。它们可能被设想以可注射组合物或胶囊或片剂形式用于治疗与HIV病毒相关的疾病。
权利要求
1.含有至少九个氨基酸的合成肽，其结构为
其中式X和Y是保护的或未保护的氨基酸残基，或肽
R是线性或支链烷基
R”是下列基团之一烷基，苯基，卤素，硝基，氨基，烷基胺，烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基酰氨基或腈基
Z是硫，氧，氨基或亚砜
并且n等于0，1，2或3。
2.权利要求1的合成肽，其结构为
其中X，Y，R，R”及n如权利要求1定义。
3.权利要求1的肽，其简化式为
其中Ar是非取代或取代的苯基Z为硫，氧，氨基或亚砜。
4.权利要求3的肽，其简化式为
其中Ar如权利要求3定义。
5.权利要求1或2之一的肽，即
Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-NH2。
6.权利要求1或2之一的肽，即
Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH。
7.获得权利要求1到6的方法，其中式II的[(Boc Leu)-氨基]苯基Z乙酸被用作合成子(synthon)
其中Y是苯基，非取代或被一个，两个或三个R”取代基取代
Z是硫，氧，氨基和亚砜，在其上面通过使用固相树脂技术连接有构成此九肽链的不同氨基酸
然后末端胺基团用三氟乙酸脱保护或在苯甲醚存在下用氢氟酸完成链脱保护并裂解树脂。
8.药用组合物，它含有通式I的至少一个化合物做为活性组分
其中X和Y是保护或未保护的氨基酸残基，或肽
R是线性或支链烷基
R”是下列基团之一烷基，苯基，卤素，硝基，氨基，烷基胺，烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基酰氨基或腈基
Z是硫，氧，氨基或亚砜
并且n等于0，1，2或3。
与可药用的、无毒、惰性赋形剂结合或混合。
9.含有通式I的至少一个化合物做为活性组分的药用组合物
其中Z为硫，氧，氨基或亚砜，Ar是非取代或取代的苯基与可药用的、无毒、惰性赋形剂结合或混合。
10.作为式I化合物合成的中间体
Fmoc-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-NH2。
11.作为式I化合物合成的中间体
Fmoc-Ile-Arg-Lys-Ile-Leu-(S)Phe-Leu-Asp-Gly-Ile-OH。
全文摘要
本发明涉及有机化学领域，以及更特别地涉及化疗领域。本发明的一个更特别的目的是一种含有式(I)的至少九个氨基酸的合成肽其中X和Y是保护或未保护的氨基酸残基，或肽R是线性或支链烷基R”是下列基团之一烷基，苯基，卤素，硝基，氨基，烷基胺，烷氧基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基酰氨基或腈基，Z是硫，氧，氨基或亚砜并且n等于0，1，2或3，式I的化合物是HIV复制抑制剂，它作为一种小天冬氨酰-蛋白水解酶二聚体的抑制剂，该二聚体特异切割编码结构蛋白的多肽前体和HIV病毒的组成酶。用作一种药物。
文档编号C07K14/16GK1165521SQ9619094
公开日1997年11月19日 申请日期1996年6月28日 优先权日1995年6月29日
发明者V·尼达姆, M·坎普罗, J·-L·克劳斯 申请人:拉法尔实验室