专利名称：一种制备神经生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及从人胎盘中制备神经生长因子的方法。
展望二十一世纪人类正从工业社会向信息社会转变与过渡。脑力劳动将成为产生社会财富的主要劳动方式。因此研制、开发神经保护剂(Neuroprotecant)，神经生长因子(Nervegrowth factor，NGF)与神经甾体类生物制剂(Neurosteroids)将为人类做出重要贡献。在1997年中国医药出版社《当代新药研究与开发指南》一书中更加反映出大规模开发、生产NGF的迫切性。神经系统疾病通常具有很大的破坏性，且经常导致死亡。例如中风在美国已成为第三大死因，仅次于心脏病和癌症。随着神经系统疾病的增多，花在该种疾病治疗上的费用达数十亿以至几百亿美元，在美国NGF已进入II期临床，其年销售量达数十亿美元。神经系统疾病除了对病人健康的损害外，其治疗与护理对病人、家属乃至整个社会都会产生巨大的社会和经济负担。然而用于治疗神经系统疾病的常规药物效果往往不理想，所以目前许多国家都在研究NGF，我国也有不少科研单位在研制、生产NGF，从我们所了解的现状来看，目前生产NGF还存在一些不足。①材料来源有限(从脑组织或妊娠流产的胚胎组织)；②异种动物组织(小鼠颌下腺或狗胚胎组织)；③制取方法繁琐(几次层析)；④方法虽简便但纯度差。
本发明制备神经生长因子所需的原材料为人胎盘，取材广泛，且制备过程简便，快速，成本低，且产品的纯度好，活性高，具有很大的经济效益与社会效益。
本发明实施的技术方案将正常健康人足月胎盘处理干净，打碎匀浆，在50-100℃中水浴10-50min，离心4000-8000rpm/min，20-50min后弃沉淀，调PI，收集上清液用酸性缓冲液调pH到4-6，并加中性盐，使终浓度达0.1-1M，再离心4000-8000rpm/min，20-50min后，再一次弃沉淀，收集上清液透析(对蒸馏水、生理盐水或中性缓冲液，在低温下)；或将上清液直接超滤，后收集透析外液或超滤液，无菌抽滤测定NGF含量并做生物活性检测，再无菌分装，加入适量保护剂，或-20℃保存。
具体实施例方式①取新鲜足月胎盘，冲净血污，剔除筋膜，剪碎称重，匀浆；②沸水放20min；③4℃离心7000rpm/min 40min；④收集上清用酸性缓冲液调PH到4，加2M NaCl使终浓度达0.4M；⑤4℃离心，7000rpm/min 40min；⑥收集上清装玻璃纸透析袋对无菌生理盐水4℃透析或直接超滤；⑦收集透析外液或超滤液无菌抽滤测定NGF含量并作生物活性检测；⑧根据生物活性结果分装安瓿，加入适量保护剂，或-20℃保存待用。
成品检定外观 无异物无沉淀的无色透明，澄清的液体无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行PH值 pH＝6.5-7.5多肤含量紫外吸收法0.2-1.2mg/ml过敏试验豚鼠隔日腹腔注射(ip)神经生长因子注射液50BU/kg致敏，共三次，分别于首次致敏注射后d14和d21，静脉注射(iv)神经生长因子注射液100BU/kg进行攻击实验。结果表明，两次iv神经生长因子注射液攻击，均未发现豚鼠产生全身过敏反应。表明神经生长因子注射液对豚鼠未见全身致敏作用。
纯度鉴定 SDS-PAGE电泳，30％聚丙烯酰胺凝胶，厚度1mm垂直平板电泳。T＝15％，C＝6％，SDS浓度为1％，电极缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸(pH8.0)，上样量40ug，电压160V，电泳1hr，用考马斯亮蓝R-250染色。结果显示，二条区带，主带分子量约为14ku左右，背景干净无杂蛋白。
分离纯化的NGF的活性检测过程及结果1.脊髓神经细胞培养采用原代培养的方法，在无菌条件下分离胚胎12天小鼠的脊髓及脊神经节，剔除血管及脊膜，0.125％的胰酶进行消化，制成单细胞悬液，然后接种在24孔，96孔的塑料培养板中，培养24小时后，加入阿糖胞苷抑制非神经元的生长增殖，阿糖胞苷作用24小时后，换上新鲜的培养液，并将同一批标本随机分为实验组和对照组，实验组加入纯化的NGF，它们作用的终浓度分别为160ng/ml，80ng/ml，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，连续在二氧化碳培养箱中培养72小时，此时细胞生长有明显的梯度，进行测活。
2.大脑皮质细胞培养采用原代培养的方法，在无菌条件下分离胚胎18天小鼠的皮质，剔除血管及脑膜。在D-SGH平衡液中清洗。0.125％的胰酶消化，制成单细胞悬液，然后接种在24孔，94孔的塑料培养板中，培养3天后，加入阿糖胞苷抑制非神经元的生长增殖，作用24小时后。换上新鲜的培养液，同时分组加样，分组加样同上。
3.活性检测(1).将培养好的96孔板标本的上清吸出，每空加入200ul 4％福尔马林固定液，固定1小时，吸出固定液，每孔用蒸馏水洗3次，每孔200ul，空气中干燥，每孔再加入100 ul 0.02％结晶紫染色液，染色30分钟后，吸出染色液，用蒸馏水洗3次，每孔200ul，空气中自然干燥后，每孔再加入200ul 10％HAc溶解3小时，测OD值。检测波长590nm作曲线图，计算统计活性浓度。(2).同时在同一批培养的96孔板的细胞中加入10ul10mg/ml的四唑嗅盐，再培养4小时，弃去上清液，每孔再加入100ul的二甲基亚砜。使细胞上吸附的结晶充分溶解，于双波570-630nm的Dynatech MR4000 reader上检测OD值，实验波长570nm，参考波长630nm统计NGF的活性浓度。
4.将同一批接种在24孔培养板的细胞再同等条件下培养72小时后，观察细胞生长状况并照相记录。然后于0.125％的Trypsin消化7-8分钟，再加入2ml 10％FBS/DMEM，用移液管吹打几次，成单细胞后移入离心管内离心0.5分钟，轻轻吸出上清，下层加入2ml Ins-培养液，同时加入20ul胎盘蓝充分混匀，然后记数存活的细胞数将三结果进行分析，取与对照组有显著差异的浓度组，然后取具有活性的共同部分。即为纯化NGF的最佳活性浓度。
结果1. NGF作用脊髓神经元的活性结果NGF(ng/ml)OD(10)0.568+0.061** (20)0.542+0.046* (40)0.551+0.057(80)0.482+0.080(160)0.548+0.091Control 0.461+0.019**P＜0.01 *P＜0.052.NGF作用大脑皮质细胞的活性结果NGF(ng/ml)OD (10)0.265+0.025 (20)0.271+0.049 (40)0.267+0.042(80)0.348+0.014*(160)0.286+0.041Control0.240+0.021P＜0.05以上结果表明此种方法纯化获得的NGF不但对脊髓神经元有强烈的促生长作用，而且对大脑皮质神经细胞生长也有促进作用，它对脊髓和皮质神经元作用的活性浓度也不同，作用脊髓细胞的最佳活性浓度是10ng/ml，作用皮质是80ng/ml。
权利要求
1.一种制备神经因子的方法，其特征在于制备所需的原材料为正常健康人足月胎盘，制备过程为匀浆→水浴50-100℃，10-50min→离心4000-8000rpm/min，20-50min→调PI，上清液用酸性缓冲液调pH到4-6，并加中性盐使终浓度达0.1-1M→离心4000-8000rpm/min，20-50min→透析(或超滤)→定量、定性→无菌分装。
2.根据权利要求1所述的一种制备神经因子的方法，其特征在于透析条件是对蒸馏水、生理盐水或中性缓冲液、在低温下。
全文摘要
一种制备神经生长因子的方法,涉及从人胎盘中制备神经生长因子的方法,其制备的过程为经加热、调等电点、透析(或超滤)三步,本发明取材容易、生产工艺简便、生产时间短(一天内完成)、生产费用极低。制得的人神经生长因子活性高、产量高、纯度好、无异体蛋白,对人体使用安全。经临床观察对神经系统疾病具有良好的疗效。本发明具有广阔的应用前景和重要的社会价值。
文档编号C07K14/435GK1241572SQ9811290
公开日2000年1月19日 申请日期1998年7月2日 优先权日1998年7月2日
发明者王国华 申请人:中国人民解放军第四军医大学