专利名称：抗肝癌单克隆抗体HAb25及其单链抗体和双功能抗体的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及基因工程。
按照世界卫生组织的统计，全世界每年就有100余万患者死与肝癌，而我国肝癌的发病率占全世界的40％。目前国外的Shouval及Dunk等和国内的谢弘等都报道了抗肝癌单克隆抗体，同时也有抗铁蛋白单克隆抗体的报道，其中的一些单克隆抗体用131I标记后，进行了有效的临床肝癌放射免疫显像。然而对于基因工程抗体而言，虽然抗结肠癌、乳腺癌等肿瘤的基因工程鼠/人嵌合抗体、单链抗体等已有报道，但抗肝癌的基因工程抗体国内外目前尚未见报道。
单克隆抗体早已用于肿瘤的治疗研究，但随着研究的深入，鼠源性单克隆抗体暴露出许多不足之处，主要在于①单克隆抗体分子量大，穿透能力低，不易穿透肿瘤毛细血管；②鼠源性单克隆抗体免疫原性高，人体应用会产生人抗鼠抗体(HAMA)，限制了它的重复使用。
本发明的目的是利用基因工程将单克隆抗体改造成单链抗体，用于克服上述缺点，进一步构建双功能抗体又赋予了抗体新的功能，使其具有导向杀伤活性，这使对肝癌的诊断和治疗研究又向前推进了一步。
本发明实施的技术方案一.抗肝癌单克隆抗体HAb25的制备用外科手术切除的新鲜的原发性肝细胞肝癌标本制备肝癌细胞悬液为免疫原免疫BALB/C小鼠，采用腹腔免疫途径，选择了腹腔巨噬细胞或胸腺细胞作为饲养细胞。将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，获得杂交瘤细胞，用石蜡切片进行免疫组织化学方法筛选，凡与正常肝细胞石蜡切片不反应而与肝癌切片反应的予以保留，得到可持续分泌抗体的抗肝癌单克隆抗体HAb25杂交瘤细胞株，将HAb25杂交瘤细胞株接种于小鼠腹腔，收集腹水，腹水内蛋白经硫酸胺沉淀和阳离子常压液相色谱纯化，获得HAb25活性蛋白。HAb25经检测证明具有较强的特异性和较高的亲和力，具体表现在1.肝细胞肝癌石蜡切片阳性反应率为84％(79/94)，与癌周肝、肝炎、肝血管瘤、肝囊肿和肝转移瘤无交叉反应，与肝硬化只有5.7％(3/53)的交叉反应。
2.经胶体金标记后，在4℃下与肝癌细胞作用1小时后，37℃下培养0、5、10、20、30、60、120分钟后，在电经电镜下观察到抗体通过胞饮、被覆内陷、绒毛折断吞噬、糖萼内陷及直接扩散途径内化到肝癌细胞
3.HAb25经131I标记后，注入荷人肝癌裸鼠，72小时可在肿瘤部位清晰显像(ECT)，T/N值为6.84。
4.HAb25经131I标记后以3-5mci/人注入5名疑为肝癌的病人，其中4例在ECT下可显像。HAb25和药物的免疫交联物对荷人肝癌裸鼠有一定治疗作用。
二、抗肝癌单链抗体(scFv25)的制备从HAb25杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR法扩增出单克隆抗体HAb25的轻、重链可变区基因(VL，VH)，经分析是重排的IgV区基因。将VL和VH通过人工合成的多肽Linker连接起来，形成一个分子量只有全抗体1/6的活性抗体分子。具体说明如下1.取HAb25杂交细胞株，提取总RNA，经Oligo(dT)为引物逆转录合成cDNA，加轻、重链引物经PCR扩增出VL和VH，克隆入pUC19质粒载体并进行序列分析，与已知IgV序列比较，有较高的同源性，并有新抗体的一定变异，成功的获得了HAb25的轻、重链可变区基因VL、VH。
2.单链抗体的构建先将人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆载体，构建成pUC19-Linker，进一步将VL克隆入pUC19-Linker，构建成pUC19-Linker-VL，再将VH克隆入pUC19-Linker-VL，构建成pUC19-VH-Linker-VL，即重组抗肝癌单链抗体克隆载体pUC19-scFv25，然后将scFv25亚克隆入pET15b，构建成抗肝癌单链抗体的重组原核表达载体pET15b-scFv25。
3.scFv25的诱导表达重组pET15b-scFv25原核表达载体宿主菌经IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→进一步纯化，获得抗肝癌单链抗体scFv25活性蛋白。
4.scFv25的活性测定scFv25与SMMC-7721肝癌细胞作用封闭抗原后加亲本抗体HAb25，作用后加FITC标记的羊抗鼠IgG，以亲本抗体自身及无关抗体作对照。流式细胞仪测定结果显示，scFv25可封闭亲本抗体53％的亲和活性。
优点单链抗体分子量小、穿透能力强、免疫原性低、半衰期短、血循环及全身廓清快和容易基因工程大量生产等优点，是一种非常具有临床应用潜力的基因工程抗体。
三、抗肝癌单链双功能抗体的制备利用基因工程手段将具有对肝癌细胞特异结合活性的HAb25单链抗体与PE40(假单胞杆菌外毒素)或人肿瘤坏死因子α(TNFα，由单核细胞和巨噬细胞产生的免疫种属特异性的肿瘤细胞杀伤因子)基因偶联，构建抗肝癌双功能抗体，并克隆入原核表达载体进行表达。
1.pBV220-scFv25-PE40抗肝癌单链免疫毒素的构建，表达及其细胞毒作用将保持亲本抗体HAb25对肝癌细胞特异结合活性的scFv25基因，与PE切除第4-252氨基酸的突变子PE40基因偶联，构建抗肝癌单链免疫毒素scFv25-PE40，然后克隆入原核表达载体pBV220，构建成重组pBV220-scFv25-PE40抗肝癌单链免疫毒素原核表达载体。其具体实施步骤如下(1)抗肝癌单链免疫毒素的构建构建成pBV220scFv25，然后再将PE40基因克隆入pBV220scFv25中，使PE40基因紧接于scFv25的3’端，构建成pBV220scFv25-PE40原核表达载体。
(2)pBV220scFv25-PE40的诱导表达及纯化重组pBV220scFv25-PE40表达载体，经42℃热诱导表达，收集菌体并提取包涵体，再经变性，复性，进一步纯化，获得纯度达到电泳纯的抗肝癌单链免疫毒素scFv25-PE40。
(3)抗肝癌单链免疫毒素scFv25-PE40的免疫活性测定以scFv25-PE40为一抗，以鼠抗PE40抗体为二抗，以FITC标记的羊抗鼠IgG为三抗，对HCC-9204肝癌细胞涂片进行间接免疫荧光染色，结果显示，scFv25-PE40能够与肝癌细胞特异性结合。
(4)细胞毒性实验按MTT法进行抗肝癌scFv25-PE40对HCC-9204细胞的毒性实验，结果显示，抗肝癌scFv-PE40对肝癌细胞具有明确的选择性杀伤作用。
2.重组pGEX 4T-1-scFv25-TNFα抗肝癌单链双功能抗体的构建，表达及其导向治疗作用(1)将TNFα基因克隆入pGEX 4T-1-scFv25，构建重组pGEX 4T-1-scFv25-TNFα原核表达载体。
(2)抗肝癌scFv25-TNFα的纯化重组pGEX 4T-1-scFv25-TNFα宿主菌经IPTG诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→GST亲和层析纯化→凝血酶消化和进一步纯化，获得抗肝癌双功能抗体scFv25-TNFα活性蛋白。
(3)间接免疫荧光染色结果显示，scFv25-TNFα较好地保持了亲本抗体的特异性结合活性；MTT实验显示，scFv25-TNFα对肝癌细胞SMMC-7721的细胞毒作用明显；在荷人肝癌裸鼠体内进行的导向治疗实验显示，scFv25-TNFα可使2mm直径的肝癌包块完全缓解，所以scFv25-TNFα有较大的临床应用潜力。
抗肝癌基因工程重组免疫毒素具有以下特点分子量小，易于穿透血管进入肿瘤中心发挥作用，抗瘤效力较高；以融合蛋白形式存在，分子稳定性好；由于已取除毒素的受体结合域，只保留了生物毒性部分，有效降低了毒副作用；重组免疫毒素也具有容易通过基因工程大量生产的特点。上述工作为进一步的基础研究和临床应用奠定了基础。
权利要求
1.抗肝癌单克隆抗体HAb25及其单链抗体和双功能抗体，其特征在于(1)抗肝癌单克隆抗体HAb25以外科手术切除的新鲜的原发性肝细胞肝癌标本制备的肝癌细胞悬液为免疫原免疫BALB/C小鼠。将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，获得杂交瘤细胞，杂交瘤细胞用免疫组织化学方法筛选，得到可持续分泌抗体的抗肝癌单克隆抗体HAb25杂交瘤细胞株，将该细胞株接种于小鼠腹腔，收集腹水，腹水内蛋白经硫酸胺沉淀和阳离子常压液相色谱纯化，获得HAb25活性蛋白。(2).抗肝癌单链抗体(scFv25)①HAb25轻、重链可变区基因(VL，VH)的克隆从上述杂交瘤细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR法扩增出单克隆抗体HAb25的轻、重链可变区基因，经分析是重排的IgV区基因。②抗肝癌单链抗体scFv25的构建先将人工合成的短肽Linker克隆入pUC19克隆载体，构建成pUC19-Linker，进一步将VL克隆入pUC19-Linker，构建成pUC19-Linker-VL，再将VH克隆入pUC19-Linker-VL，构建成pUC19-VH-Linker-VL，即重组抗肝癌单链抗体克隆载体pUC19-scFv25，然后将scFv25亚克隆入pET15b，构建成分子量只有全抗体1/6的抗肝癌单链抗体的重组原核表达载体pET15b-scFv25。③pET15b-scFv25的诱导表达重组pET15b-scFv25原核表达载体宿主菌经IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→进一步纯化，获得抗肝癌单链抗体scFv25活性蛋白。(3)抗肝癌双功能抗体①抗肝癌单链免疫毒素(scFv25-PE40)的构建、表达将PE40基因克隆入pUC19-scFv25中，构建成pUC19-scFv25-PE40重组抗肝癌单链免疫毒素克隆载体，然后再将scFv25-PE40亚克隆入原核表达载体pBV220中，构建成pBV220-scFv25-PE40，即重组抗肝癌单链免疫毒素原核表达载体pBV220-scFv25-PE40。上述载体宿主菌经42℃诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→进一步纯化，获得抗肝癌单链免疫毒素scFv25-PE40活性蛋白。②抗肝癌双功能抗体(scFv25-TNFα)的构建、表达将TNFα基因克隆入pUC19-scFv25中，构建成pUC19-scFv25-TNFα重组抗肝癌双功能抗体克隆载体，然后再将scFv25-TNFα亚克隆入原核表达载体pGEX 4T-1中，构建成pGEX4T-1-scFv25-TNFα，即重组抗肝癌单链双功能抗体原核表达载体pGEX 4T-1-scFv25-TNFα。上述载体宿主菌经IPTG诱导表达，收集菌体→提取包涵体→变性→复性→GST亲和层析纯化→凝血酶消化和进一步纯化，获得抗肝癌双功能抗体scFv25-TNFα活性蛋白。
全文摘要
抗肝癌单克隆抗体HAb25及其基因工程单链抗体和双功能抗体,主要涉及基因工程技术。其主要技术特征是,首先利用杂交瘤技术制备出对人肝癌细胞具有特异结合活性的鼠源性单克隆抗体HAb25;进而通过基因工程技术将HAb25改造构建成抗肝癌单链抗体scFv
文档编号C07K16/30GK1241574SQ9811290
公开日2000年1月19日 申请日期1998年7月2日 优先权日1998年7月2日
发明者刘彦仿 申请人:中国人民解放军第四军医大学