专利名称：具有免疫细胞趋化和造血刺激活性的趋化因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的具有免疫细胞趋化和造血刺激活性的多肽及其突变体、编码所说的多肽的多核苷酸序列、生产所说的多肽的方法以及所说的多肽及其核苷酸编码序列在诊断或治疗免疫系统疾病、造血系统疾病及肿瘤中的应用。
细胞因子是指由机体细胞合成并分泌的小分子多肽类因子，它们调节机体的生理功能和免疫功能，并在参与多种细胞的增殖和分化的过程中，发挥极为重要的生理或病理功能。细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、生长因子、趋化因子等。近年来，随着分子生物学技术的不断进展，对细胞因子的结构、功能、受体、信号传导、表达调控等有了深入的了解。利用基因工程技术生产的重组细胞因子或细胞因子拮抗剂药物已在临床得到应用，收到良好的疗效，开辟了细胞因子新的广阔应用前景。
在细胞因子中，有一类具有细胞趋化作用的小分子多肽，能吸引免疫细胞到免疫应答局部，并参与免疫调节和免疫病理反应。大多数的这类因子是约含100个氨基酸的多肽类分子，现将其命名为趋化因子(chemokine)。根据其结构可主要分为4个趋化因子亚家族CXC、CC、CX3C和C亚家族，其中的C代表半胱氨酸，X代表任一种氨基酸。CXC趋化因子的基因多数定位于第4对染色体，其成员包括白细胞介素-8(IL-8)、干扰素诱导蛋白-10(IFN-IP-10)、MGSA等，它们在生物体内主要起活化和趋化中性粒细胞和T淋巴细胞作用。CC趋化因子多数基因定位于第17对染色体上，其成员包括巨噬细胞炎性蛋白-1α、β(MIP-1α，β)、巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES等，它们则主要活化和趋化单核细胞、淋巴细胞、嗜硷性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。CX3C亚家族目前只发现一个成员，即Fractalkine，其主要功能是活化和趋化T细胞和单核细胞。C亚家族目前也只发现一个成员，即Lymphotactin(Ltn)，主要趋化淋巴细胞。趋化因子的受体均属于G蛋白受体家族，其结构特征是具有7个穿膜区。根据其结合的趋化因子的亚家族成员不同，分别被命名为CXCR1，2，3，4；CCR1，2，3，4，5，6，7；CX3CR等(参见Marco B et al，Human ChemokinesAn UpdateAnnu.Rev.Immunol.1997.15675-705)。大量的功能研究表明，趋化因子在机体的免疫防御、免疫调节、炎症反应、造血调节、血管生成等方面发挥重要的作用。近年还发现人类免疫缺陷病毒(HIV)可利用趋化因子的受体做为其侵入机体免疫细胞的受体，证明了趋化因子与HIV的感染和致病有密切的关联，并且提示有可能利用趋化因子做为药物阻断HIV侵入免疫细胞(Cocchi F，et al.Identification of RANTES，MIP-1，and MIP-1 as the Major HIV-Suppressive FactorsProduced by CD8+T Cells。Science，15 December 1995，p.1811)。临床资料分析表明，在一些感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等病理条件下，趋化因子的体内含量可发生明显变化，出现异常性表达，表现为趋化因子及其受体的缺陷，趋化因子表达过度，以及可溶性趋化因子受体水平增加等。因而，检查趋化因子水平有可能对一些疾病进行辅助诊断、病程观察、疗效判断及治疗监测。在临床治疗应用方面，目前已有一些基因工程的趋化因子药物及其相关药物进入临床实验治疗，有望成为新一代的生物技术药物。例如，髓样造血祖细胞抑制因子(MPIF-1)是一种CC趋化因子，该因子在肿瘤大剂量放、化疗中有可能被用作为造血保护剂发挥治疗效用(Marshall A，HGS launches″first″genomicsproduct in clinic.Nat Biotechnol 1998，16129)。
以上表明细胞因子或趋化因子具有十分重要的研究和临床应用意义，因此进一步发现新的细胞因子或趋化因子尤为重要。鉴于人髓样白血病细胞系U937在有丝分裂原PHA的刺激下能够产生多种已知的细胞因子或趋化因子(Brantschen S，Gauchat JF，de Week AL et al.Differential expression of cytokinemRNAs in human cell lines.Lymphokine Res 1989 8(3)163-72)，而白细胞介素-10(IL-10)具有抑制多种细胞因子表达的功能(Di-Hwei，H et al，Science，1990，250，830)，我们利用了Diatchenko L等人描述的抑制性递减杂交(SSH)技术(Diatchenko L，Y FC，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationAmethod for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes andlibraries.Pro Natl Acad Sci USA.1996 936025-30)从IL-10抑制的人髓样白血病细胞系U937 cDNA中分离并克隆了新的趋化因子基因。经同源性分析显示，其核苷酸序列与已知基因的核苷酸序列无明显的同源性。我们利用已建立的实验系统深入研究了该多核苷酸的结构特征，并在原核和真核细胞中成功地表达了由所说的多核苷酸编码的UCK-1多肽及其同系物和变异体。生物学活性实验表明本发明的UCK-1多肽作为一种分泌性的小分子趋化因子多肽，对多种免疫细胞具有明显的趋化活性，并且对骨髓造血细胞具有促进增殖和集落形成的作用。同时，本发明还发现了UCK-1的至少3种变异体形式，可能为UCK-1 mRNA的不同剪切体。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有免疫细胞趋化和造血刺激活性的多肽，及其具有生物学活性的变异体、类似物、衍生物或其片段。
本发明的另一个目的是提供编码本发明多肽的分离的核酸分子，其中包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA及其类似物和其具有生物学活性的片段。
本发明的再一个目的是提供以重组DNA技术生产所说的多肽的方法，该方法包括在适于表达本发明的多肽的条件下培养含有编码所说多肽之核酸序列的重组体原核或真核宿主细胞，然后从培养基和/或溶胞产物中回收所说的多肽。
本发明的再一个目的是提供含有作为活性成分的上述多肽及一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。
本发明的再一个目的是提供上述多肽或编码这些多肽的多核苷酸，在生产用于诊断或治疗免疫功能紊乱相关疾病的药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供与上述多肽发生特异性免疫反应的多克隆或单克隆抗体。
本发明的再一个目的是提供可用于抑制上述多肽的作用的拮抗剂，以及这些拮抗剂在生产用于治疗类风湿性关节炎、自身免疫病及病毒感染等的药物中的应用。
下列附图是举例显示本发明的实施方案，而不意味着限制本发明的待批要求的范围。
图1显示本发明的UCK-1的cDNA序列(SEQ ID NO1)及由之推测的蛋白质UCK-1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。图2显示本发明的多肽的一种变异体UCK-2的cDNA编码区序列(SEQ ID NO3)及由之推测的蛋白质UCK-2的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。图3显示本发明的另一种变异体UCK-3的cDNA编码区序列(SEQ ID NO5)及由之推测的蛋白质UCK-3的氨基酸序列(SEQ IDNO6)。图4显示本发明的另一种变异体UCK-4的cDNA编码区序列(SEQ IDNO7)及由之推测的蛋白质UCK-4的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。由所示氨基酸序列组成的多肽是已鉴定的成熟形式的多肽(减去起始蛋氨酸残基)，并且其中使用标准的三字母缩写符号表示各氨基酸，上述序列均已在GenBank登记，UCK-1登记号为AF096895；UCK-2登记号为AF 135380；UCK-3登记号为AF135381；UCK-4登记号为AF145216。上述序列将于99年10月在GenBank公布。
图5是对U937细胞进行白细胞介素-10抑制表达研究中所使用的抑制性底物杂交(SSH)的技术路线示意图。
图6显示用于在真核宿主中表达本发明的细胞趋化蛋白质UCK-1的重组表达载体pcDIUCK-1，2，3，4的构建。
图7显示本发明的UCK-1蛋白质对多种细胞的趋化活性。
图8显示本发明的UCK-1蛋白质对哺乳动物造血细胞的生长促进活性。
图9显示本发明的UCK-1，2，3蛋白质对小鼠骨髓细胞生长促进活性。
图10显示利用反转录-PCR检测UCK-1及其变异体UCK-2，3，4在肿瘤和正常组织的表达。
根据本发明的一个方面，本发明提供编码具有图1(SEQ ID NO2)所示推测的氨基酸序列之成熟多肽的分离的多核苷酸及其突变序列。生物学活性实验显示所说的多肽是具有显著的CC家族趋化因子的生物学活性的成熟多肽。
可在人的结肠、胰腺、脑、心脏和胚胎组织，以及相关组织来源的肿瘤中检测到编码UCK-1的多核苷酸。该多核苷酸含有编码99个氨基酸残基的开放读框(从核苷酸152个到449)。并且可在多种肿瘤组织中包括结肠癌、肺腺癌、前列腺癌、卵巢癌在内的和相应胚胎组织中检测到UCK-1的变异体UCK-2，UCK-4的多核苷酸。UCK-2多核苷酸编码序列含有编码152个氨基酸残基的开放读框(ORF)；UCK-3多核苷酸编码序列含有编码67个氨基酸残基的ORF；UCK-4多核苷酸编码序列含有编码120个氨基酸残基的ORF。
本发明的多核苷酸编码序列可以是RNA形式的或DNA形式的，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。所说的DNA可以是双链或单链的。如果是单链的，其可以是编码链或非编码(反义)链。
编码成熟多肽的编码序列可以完全相同于SEQ ID NO1所示的或已保藏的重组体大肠杆菌所携带的编码序列，或者由于遗传密码子的简并性，其可以是不同于编码相同成熟多肽及其衍生物的如SEQ ID NO1所示的或已保藏的重组体大肠杆菌中所携带的DNA编码序列。
编码SEQ ID NO2所示成熟多肽的多核苷酸可以只包括成熟多肽的编码序列或包括成熟多肽的编码序列和附加编码序列、成熟多肽的编码序列和非编码序列，例如内含子或成熟多肽之编码序列的5′和/或3′端非编码序列。
本发明进一步涉及编码具有SEQ ID NO2所示推测的氨基酸序列之多肽或由已保藏的重组体大肠杆菌所携带的cDNA编码之多肽的片段、类似物及衍生物的上述多核苷酸的变异体，多核苷酸的变异体可以是该多核苷酸的天然存在的等位基因变异体、mRNA不同剪切变异体或其非天然存在的变异体。这样的变异体也可以是编码与具有如SEQ ID NO2所示推测的氨基酸序列的多肽有相同或相似生物学活性之多肽的缺失变异体、取代变异体及加入或插入变异体。所说的等位变异体是可以带有核苷酸取代、缺失或加入的，但实质上没有改变所编码之多肽的功能的多核甘酸序列的可替代形式。本发明的UCK-2编码序列(SEQ ID NO3，)、UCK-3(SEQ ID NO5)和UCK-4(SEQ ID NO7)即属于此类变异体形式的多核苷酸序列。由这些变异的核苷酸编码序列编码的UCK变异体可以在功能上与本发明的UCK-1相同、相似或不同。
可以使用本发明全长基因的小片段作为cDNA文库的杂交探针，以从cDNA文库分离全长度基因及其与本发明的UCK基因有高度序列同源的核苷酸序列。这些探针一般至少有30个碱基，并且也可含有多达50个以上的碱基。可使用这些探针鉴定相当于全长度转录物和含有完整基因之基因组克隆的cDNA克隆。方法包括根据已知的DNA序列合成寡核苷酸探针，并在杂交条件下使用含有与本发明的基因互补之DNA序列的标记的寡核苷酸与人cDNA基因组DNA或RNA文库杂交，从中分离出文库中与探针杂交所需要的核苷酸序列。
本发明还涉及与上述序列至少有70％，较好90％，最好95％序列相同性的序列杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。所说的“严格条件”是指只有当序列间至少有95％相同性时才发生杂交的杂交条件。与上述多核苷酸杂交的多核苷酸最好是编码与SEQ ID NO1所示cDNA编码的成熟多肽有基本上相同生物学活性之多肽的多核苷酸。
另外，与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸可以是至少有10碱基，最好有30个碱基的连续序列，并且可以是有或没有保留活性的。可使用这样的多核苷酸作为回收或探查SEQ ID NO1所示多核苷酸的探针，或作为诊断探针，或作为聚合酶链反应(PCR)引物。
因此，本发明涉及与编码SEQ ID NO2所示多肽的多核苷酸至少有70％，最好有90％相同性的多核苷酸及其至少有10个碱基，最好有30个碱基的片段，以及由这样的多核苷酸编码的多肽。
本发明进一步涉及具有免疫细胞趋化活性和造血细胞刺激活性的本发明命名为UCK-1的多肽，该多肽具有如SEQ ID NO1所示的推测的氨基酸序列或具有由已保藏的重组体大肠杆菌所携带的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，以及这些多肽的具有基本上相同功能或活性的片段、类似物和衍生物，并且其中所说的衍生物包括提高了或降低了生物学功能的多肽。
本发明的多肽可以是重组的多肽，天然多肽或合成的多肽，但最好是重组的多肽。
具有图SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或由已保藏的生物学材料携带的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是其中的一个或多个氨基酸残基包括有取代基的，或者其中成熟的多肽是与其他化合物，如用于提高该多肽之半寿期的化合物(如聚乙二醇或脂质)相融合的，或者其中为纯化该成熟多肽而在其侧翼融合有附加氨基酸序列的多肽片段、衍生物或类似物。
本发明的多肽或多核苷酸最好是以分离的形式提供的，并且最好是纯化成均质材料的。所说的“分离的”是指已离开了其原有环境，如离开了活的生物体的或已离开其部分或全部共存材料的多肽或多核苷酸。这样的多核苷酸可以是某种载体的一部分，和/或这样的多核苷酸可以是某种组合物的一部分，因为此时这样的载体或组合物已不是其天然环境的一部分，所以所说的多肽或多核苷酸仍是被分离的。
本发明的多肽包括如SEQ ID NO2所示的多肽，以及与之至少有70％同源性，较好有90％同源性，最好有95％同源性或相似性的多肽，并且包括这些多肽的一部分，其中所说多肽的一部分一般至少包括20个氨基酸，较好包括至少40个氨基酸。如众所周知，两个多肽的“同源性”或“相似性”是通过将一种多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸取代物与第二种多肽的序列相比较而确定的。
可使用本发明多肽的片段或其一部分作为中间体，以肽合成法制备相应的全长度多肽，也可使用本发明多核苷酸的片段或其部分来合成本发明的全长度多核苷酸。
本发明还涉及携带所说的多核苷酸的载体、用该载体转化或转染的宿主细胞，以及以重组DNA技术生产本发明多肽的方法。
可用携带本发明多核苷酸的克隆载体或表达载体转导、转化或转染适当的宿主细胞。所用的载体例如可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体形式的。可在为活化启动子、选择转化体或扩增所需的UCK-1基因而适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。
可按重组DNA技术使用本发明的多核苷酸生产本发明具有免疫细胞趋化活性和造血细胞刺激活性的多肽。为此，可将所说的多核苷酸插入到各种用于表达该多肽的适当表达载体中。这样的载体包括染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、噬菌粒(由质粒和噬菌体DNA组合体衍生的载体)、以及病毒(如杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。
可用各种已知的方法将适当的DNA序列插入到载体的适当限制性核酸内切酶位点中。插入到表达载体中的DNA序列被可操作地连接到适当的表达控制序列即启动子上，以指导mRNA合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。
此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，并含有一个或多个选择标志基因，以提供被转化之宿主细胞的可选择表型特征，如适用于真核细胞的新霉素抗性或二氢叶酸还原酶基因，或适用于大肠杆菌中的氨苄青霉素或四环素抗性基因。
可用含有上文所述适当DNA序列，以及适当启动子或其他转录与翻译控制序列的载体转化适当的宿主细胞，以使宿主表达所需的蛋白质。
可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的多核苷酸，可提到的适当宿主的例子有细菌细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；哺乳动物细胞如CHO、COS和HEK293细胞；以及人细胞如TF-1细胞、U937细胞和Hela细胞。
具体地说，本发明涉及包括上述一个或多个多核苷酸序列的重组构建体，该构建体包括在其中以正向或反向插入了本发明的多核苷酸序列的载体，如质粒或病毒载体，并且在所说的多核苷酸序列的上游可操作地连接了适当的调节序列如启动子序列和增强子序列。
适用的载体的例子包括用于真核细胞的pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等，(1991)高技术通讯1126-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；以及适用于真核细胞的pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。适用的启动子包括lacI、lacII、T7、λPL和trp等细菌启动子，以及CMV、SV40、HSV胸苷激酶等真核细胞启动子。
在一个实施方案中，本发明进一步涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞或人肿瘤细胞，或者是低等真核细胞如酵母细胞，或者是原核细胞如大肠杆菌细胞。可用本领域已知的方法如氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法将所说的构建体导入宿主细胞内。
可按常规方法使用包含在宿主细胞中的构建体产生由重组DNA序列编码的多肽产物。或者，也可使用常规的肽合成仪化学合成本发明的多肽。或者，也可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白质。
必要时，为了提高编码本发明多肽的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中插入增强子序列。增强子一般是约含10-300个碱基对并作用于启动子以增强DNA转录的顺式作用元件。另外，必要时也可在启动子和下游结构序列之间插入一个能指导翻译产物向周质或细胞外培养基中分泌的前导序列(分泌信号)。或者，可根据需要导入编码融合蛋白质的异源DNA序列，所说的融合蛋白质可包括一个赋予所需特征，如用于稳定被表达之产物的或简化其纯化步骤的N未端识别肽。
可适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。
在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学物质诱导)诱导启动子，然后继续培养之。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。
也可用各种哺乳动物细胞表达本发明的重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括人肿瘤细胞系，如Hela、TF-1和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可含有复制原点、适当的启动子和增强子、多聚腺苷酸化位点、切接供体和受体位点、转录终止序列，及5′侧翼非编码序列。可使用衍生于SV40的切接和聚腺苷酸化位点的DNA序列来提供必要的遗传元件。
可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的UCK-1及其变异体多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。
本发明的多肽可以是从天然来源纯化的或化学合成的，或以重组DNA技术由原核或真核宿主产生的。根据重组生产方法中所用宿主的不同，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的，并且可以包括一个起始蛋氨酸残基。
利用RT-PCR技术检测UCK-1在不同组织的表达，发现了UCK-1在多种细胞中均有表达，特别令人惊奇的是，我们发现在某些细胞中存在有UCK-1的变异体形式。对这些变异体基因的克隆化和序列分析，证明它们分别编码152个、67个和120个氨基酸，分别将其命名为UCK-2、UCK-3和UCK-4蛋白质。据我们推测，这些变异体很可能是UCK-1基因的不同的剪切形式。特别是发现UCK-2在多种原发性肿瘤细胞和胚胎细胞中高表达，而正常细胞中的表达水平则相对较低。因此，它们的存在对于肿瘤发生研究和临床诊断将具有重要的潜在价值。
在实施例中，用一个已构建的携带编码UCK-1多肽之多核苷酸序列的重组表达载体(pcDI-UCK-1，pcDI-UCK-2，pcDI-UCK-3)转染COS-7细胞后，经生物活性分析研究培养物和细胞裂解物的趋化作用，发现UCK-1，2，3系分泌性蛋白。上述这些结果提示该多肽为分泌性的具有趋化活性的趋化因子，在免疫调节和造血调节中发挥重要作用。
由于本发明的多肽具有多种生物学活性，因而具有多方面的应用价值，例如本发明的基因工程的重组UCK-1及其变异体由于可具有造血刺激效应，有可能利用本发明在造血系统疾病的治疗方面发挥作用，包括原发性或继发性造血功能障碍等。
本发明的基因工程的重组UCK-1及其变异体由于可具有免疫细胞趋化活性，有可能将其应用于肿瘤和感染性疾病的治疗。
本发明的UCK-1及其变异体的基因导入体内，特别是导入肿瘤细胞作为肿瘤疫苗，有可能作为新的基因治疗手段在肿瘤治疗发挥疗效。
由于本发明发现UCK-1和UCK-2基因在肿瘤中高表达，从而为进一步了解其在肿瘤发病的作用，将其用于肿瘤检测和肿瘤治疗目的提供了必要的基础。
由于UCK-1及其变异体的可具有炎症细胞趋化作用(参见图4)，有可能将其做为抗炎症治疗的药物新靶点，通过抗UCK-1及其变异体抗体或其它封闭剂治疗自身免疫性疾病。
由于本发明的UCK-1及其变异体具有体内刺激骨骼肌细胞增殖的作用(参见实施例8)，有可能利用其治疗各种原因造成肌肉萎缩或其他退行性病变。
由于本发明的UCK-1及其变异体具有体内刺激骨骼肌细胞增殖的作用(参见实施例8)，而在DNA疫苗或DNA药物直接肌肉注射表达时，增殖中的骨骼肌更易于接受DNA，因而可将UCK-1及其变异体与DNA疫苗或DNA药物同时或先后注射，以促进DNA疫苗或DNA药物的免疫及治疗效果。
由于本发明的UCK-1及其变异体具有体内刺激毛囊细胞增殖的作用，有可能利用其促进毛囊增生，治疗脱发症。
可使用本发明的多肽，其片段或类似物或衍生物，或携带其编码序列并表达这些多肽的细胞作为免疫原，以生产该多肽的抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体，并且包括嵌合的、单链的和人源化的抗体及其Fab片段。可用各种已知的方法生产这些抗体和其片段。以常规方法得到的抗体可与多肽本身结合。一般说来，使用只编码本发明的多肽之一部分的序列产生的抗体也能够与整个天然多肽结合。然后可用这样的抗体从表达本发明多肽的组织材料中分离所需的多肽。
可用杂交瘤技术(Kohler and Milstein，Nature 256495-497，1975)或人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，Immunology Today 472，1983)生产人单克隆抗体。另外，可用转基因小鼠来表达抗本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。
另外，可用反义技术制备反义构建体，通过三股螺旋形成反义DNA或RNA来控制基因表达。例如，可使用编码本发明多肽之多核苷酸序列的5′编码部分设计10-30bp长度的反义RNA寡核苷酸。也可设计与基因的转录区域互补的DNA寡核苷酸，从而借以阻止表达产物的转录和产生(参见Cooney et al.，Science241456，1988；Dervan et al.，Science 2511360，1991)。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子的翻译。
可使用本发明的多肽或其拮抗剂作为基本活性成分，与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合，制成药物组合物。根据治疗目的和给药途径，以及使用方法的不同，可使用不同的载体或赋形剂将本发明的药物组合物制成多种不同的剂型。例如可制成适于各种给药途径，特别是胃肠道外途径给药的溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。使用的载体或赋形剂包括但不只限于生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇和其组合。可根据需要，在本发明的组合物中加入一种或多种其他辅助成分，例如有与本发明的UCK-1有协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物，以及选自人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或赖氨酸)和金属阳离子(如Zn2+，Mn2+，Mg2+和Ca2+)的蛋白质保护剂；选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂；以及适当的蛋白酶抑制剂。在粘膜或皮肤局部给药的情况下，所说的组合物可含有例如选自二甲基亚砜和月桂氮卓酮的皮肤渗透剂，以及适当的自由基清除剂。
为了使用上的方便和便于维持组合物各成分特别基本活性成分的生物学活性，可将本发明的药物组合物制作成药盒的包装形式，这样的药盒可包括一个或多个装有本发明药物组合物之一种或多种成分的容器，并在每个容器上按政府制药管理机构指定的形式注明有关药物的使用或销售的批号及相关信息。
可通过常规途径，特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物，例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几微克到几毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量应根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状况及给药方式等因素由临床医生来确定。
也可以根据本发明在体内表达本发明的多肽，即以所谓的“基因治疗”方法使用这些多肽。例如，可以用编码本发明。多肽的多核苷酸于体外基因工程化处理病人的细胞，然后再将工程化改造的细胞导入欲用所说的多肽治疗的病人体内。例如可使用含有编码本发明多肽的RNA反转录病毒颗粒来转染并工程化改造所说的在体内表达本发明多肽的细胞。可按已知方法将产生含有编码本发明多肽之反转录病毒颗粒的生产细胞投用于病人体内，以在体内对细胞进行基因工程化改造并在体内表达所说的多肽。
上述这些方法以及用于这些方法的反转录病毒、包含在载体内的适当的启动子、包括启动子和处于适当启动子控制下之多核苷酸编码序列的载体、用于转染包装细胞系以形成生产细胞系的逆转录病毒质粒载体，以及适当的可被转染的包装细胞都是基因治疗领域中已知的。
可借助各种已知的方法用携带本发明多肽之核酸编码序列的载体体外或体内转染包装细胞或靶细胞。这些方法包括但不只限于电穿孔、微粒轰击(例如使用Biolistic装置)、脂质体转染法，以及磷酸钙沉淀法或这些方法的联合使用。另外，也可以将反转录病毒载体包裹在脂质体中，或者偶联到脂质体上，然后再运送到宿主体的适当靶细胞内。
总之，可由生产细胞系产生包含本发明多肽之核酸编码序列的感染性反转录病毒载体颗粒，然后使用这样的载体颗粒于体外或体内转导宿主真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码所说多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不只限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞和成人癌细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、间质细胞、上皮细胞及表皮细胞。
本发明还涉及使用本发明的多核苷酸作为诊断试剂，检测突变形式的基因以诊断因体内UCK-1表达不足或表达过量所导致的疾病或病理状态。
可用各种技术在DNA水平上检测携带UCK-1基因突变的个体。可从病人的体液中，如血液、尿液、唾液或活体或尸检材料中得到用于诊断试验的核酸。可以使用基因DNA或RNA直接进行检测，也可以使用PCR方法(Saiki et al.，Nature 324163-166，1986)扩增DNA后再进行检测。例如，可使用与编码本发明多肽的核酸互补的PCR引物鉴定和分析待检材料中相应基因的突变，如可与正常基因型相比较并根据扩增产物的大小改变来确定待检基因的缺失或插入。可将扩增的DNA与放射标记的UCK-1及其变异体RNA或反义DNA序列杂交，以鉴定点突变。
可用直接DNA测序法分析参考基因和突变基因之间的序列差异。另外，也可利用克隆的DNA片段作为探针并结合PCR方法，以高敏感性和特异性来检测特定的DNA片段，例如可联合使用测序引物和由扩增的PCR产物产生的单链PCR产物或单链模板分子。
可以在含有或不含变性剂的凝胶，特别是高分辨率凝胶中检测DNA的电泳迁移率来完成基于DNA序列差异的遗传学试验。可在变性甲酰胺梯度凝胶上区分不同序列的DNA片段(如参见Myers et al.，Science 2301242，1985)。另外，也可用核酸酶保护检测法或化学裂解法(如参见Cotton et al.，PNAS，USA，854397-4401，1985)揭示特定部位的序列改变。
本发明还涉及检测各种组织中UCK-1及其变异体蛋白质水平改变的诊断试验法。用于检测得自宿主体内之样品中的UCK-1及其变异体蛋白质水平的检测法是本领域技术人员已知的，并包括放射免疫法、竞争性结合法、Western印迹分析法及酶联免疫吸附法(ELISA)。其中优选的方法是ELISA法。
本发明的多核苷酸序列对于染色体鉴定也是有价值的。该序列可特异地定位于个别人染色体的特定位置并可与之杂交。按照本发明，对本发明的DNA进行染色体作图是将这些序列与疾病相关基因联系起来的第一个重要步骤。
可从cDNA制备PCR引物以进行序列的染色体作图。对基因的3′非翻译区进行计算机分析，以迅速选择出跨越基因组DNA中一个以上外显子并从而加入扩增过程中的引物。然后使用这些引物以PCR法筛选含有个别人染色体的体细胞杂种。只有那些含有对应于引物之人类基因的杂种才产生扩增的片段。对体细胞杂种进行PCR作图是一种指定特定DNA在特定染色体上的位置的便利方法。在按照本发明使用同样的寡核苷酸引物的情况下，可用一组得自特定染色体的片段或大的基因组克隆群体按相似方法完成亚定位。然后再用萤光原位杂交法(FISH)对cDNA克隆进行精确的染色体定位(参见Verma et al.，HumanchromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NY(1988))。
一旦完成了序列的精确染色体定位作图，即可将该序列的物理位置与遗传图数据联系起来。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)来鉴定作图定位于同一染色体区域上的基因与疾病之间的关系。然后，可确定受损或未受损个体间的cDNA或基因组DNA的差异。如果在某些或全部受损个体中观察到突变，而正常个体中没有观察到这种突变，则该突变便很可能是致病因素。
以下借助实施例进一步举例描述本发明，但应明确的是，这些实施例并不以任何方式构成对本发明待批权利要求范围的限制。
实施例1从U937细胞cDNA中分离IL-10抑制的相关基因根据文献报道，IL-10是一种细胞因子合成抑制因子(CSIF)，可对多种来源的细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF等产生抑制效应，(Di-Hwei，H et al，Science，1990，250，830)。推断IL-10抑制的基因中，必然有目前尚未发现的细胞因子或趋化因子，因而采用文献中报导的抑制性递减杂交(SSH)技术(参见Diatchenko L，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridizationA methodfor generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries.Pro Natl Acad Sci USA.1996 936025-30)从U937细胞中分离IL-10抑制的细胞因子候选基因。
以10μg/mlPHA刺激8小时的U937细胞为试验者cDNA(Tester cDNA)来源，以同样浓度PHA刺激并同时加100ng/ml IL-10抑制的U937细胞为驱动者cDNA(Driver cDNA)来源。计数并调整两种cDNA来源细胞数一致，达到1×107个/ml。
细胞总RNA的提取是利用GIBCO-BRL公司的TRIzolTM试剂；mRNA的提取是利用Pharmacia公司的Quick Prep Micro mRNA purification kit，详细操作过程均按说明书进行。提取的总RNA复溶于无RNase的水中，分光光度计(Backman640)定量后，用于Northern blot杂交和文库构建。
采用Clontech PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit提供的寡核苷酸、试剂和酶，分别以上述Driver和Tester mRNA为模板，进行单链及双链cDNA的合成。
SSH差示杂交详细操作过程按说明书进行。利用glassmilk将PCR扩增产物即差异cDNA片段回收并克隆到PGEM-T easy载体中，连接产物转化XL1-Blue菌，挑阳性克隆，用PEG沉淀方法纯化质粒DNA，然后利用自动DNA测序仪进行序列分析。将测序所得到的序列通过国际互连网在GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行同源性比较，与数据库同源性低于90％的序列为新基因，通过GenBank中的BankIt功能进行新基因登记。其中一个可能有某些重要功能的基因定名为UCK-1(该基因在GenBank的登记号为AF096895)。
实施例2UCK-1 mRNA表达的Northern blot检测使用TriZ0LTM试剂盒(GIBCO-BRI Co.)提取各大约1×107个PHA刺激培养8小时后的U937细胞及相同数目PHA刺激培养，并加100ng/ml IL-10抑制的U937细胞的总RNA。提取的总RNA经分光光度计(Beckman 640)定量后，按文献(Sambrook J.Fritsch EF，Maniatic T(1989)″Molecular cloning-a Laboratorymanual″2ndedition，pp343-374，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA)所述方法并使用随机引物荧光素标记试剂盒(Dupont NEN NEL803)进行Northern杂交。结果显示UCK-1在PHA培养8小时后的U937细胞中高表达，IL-10能够抑制其表达，其分子量大小为约500bp。
实施例3UCK-1全长cDNA的序列和结构特征通过SSH得到了得到UCK-1全长cDNA序列，大小与上述Northern杂交结果相吻合。以PHA刺激8小时和PHA刺激同时IL-10抑制8小时的U937细胞文库为模板，利用UCK-1特异引物，扩增UCK-1全长DNA，得到预期的全长，所获序列是正确的，且该基因的表达可被IL-10所抑制，同时发现该基因在PHA刺激的U937细胞中至少有三种不同的剪切形式。
获得的UCK-1的cDNA序列分析发现，UCK-1全长cDNA为534bp，包括Poly A序列及“ATTAAA”加尾信号(图1，上行)。根据序列分析，UCK-1从第152个碱基开始编码99个aa的开放读码框架(图1)。利用Prosite计算机软件分析推测的氨基酸序列，未发现穿膜区序列、DNA结合位点及N-糖基化位点，也没有发现信号肽，但真核细胞表达上清液的活性分析证明UCK-1蛋白可以分泌到细胞外，属于分泌性蛋白(参见实施实例4)。对氨基酸序列进行同源性分析发现UCK-1的35-79位氨基酸与线虫(Caenorhabditis elegans)的amino acidpermease蛋白有46％的同源性，与其它的基因和蛋白无同源性，表明UCK-1为新的基因。在UCK-1蛋白质结构中存在2个连续的半胱氨酸(CC)的结构特点，这种结构往往出现于CC家族的趋化因子中，提示UCK-1可能为一种的趋化因子，但UCK-1与目前已知的任何趋化因子均无明显的同源性，因而需进行功能实验方能进一步确定UCK-1是否属于CC型趋化因子。
实施例4UCK-1，2，3，4蛋白质的真核细胞表达利用PCR技术从PHA刺激的U937细胞cDNA文库中扩增得到UCK-1，2，3，4基因的完整开放读码框架序列，并将其克隆到pGEM-T easy载体中。用限制性核酸内切酶EcoRI将插入片段释放出来，克隆到真核表达载体pcDI的EcoRI位点中，筛选正向插入克隆，经内切酶鉴定正确，命名为pcDI-UCK1，2，3，4。使用Qiagen公司的质粒纯化系统纯化质粒，应用Qiagen公司的高效转染试剂Superfect瞬时转染COS-7细胞，收集转染上清，用作活性分析。用于扩增UCK-1，2，3，4编码区的引物序列如下5 ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA AT 3
5 CCG CTC GAG TTA CAA AAC TTC TTT TTT TTC 3实施例5UCK-1蛋白质的趋化实验利用Ficoll-hypaque(1.077)分层液分离外周血单个核细胞和嗜中性粒细胞，用NH4CL.Tris溶解红细胞，U937细胞，K562细胞，HL-60细胞常规培养，用1.3％的DMSO刺激HL-60细胞4天，得到向嗜中性粒细胞系分化的HL-60细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，备作趋化实验。将转染上清作倍比稀释，加到趋化小室下层孔中，把准备好的细胞加到趋化小室上层孔中，按要求装好趋化小室，嗜中性粒细胞孵育1小时，其余细胞孵育3小时，取膜，刮去非特异细胞，甲醇固定，Giemsa染色，40倍镜下，随机选5个视野记数，取平均值，将UCK-1上清组趋化的细胞数与转染pcDI载体组上清组趋化的细胞数相比，即得到趋化指数。结果如图7所示，UCK-1对中性粒细胞、单个核细胞、U937细胞、K562细胞及DMSO刺激的HL-60细胞均有明显趋化作用。
实施例6UCK-1对正常人低密度骨髓细胞生长的影响利用Ficoll-hypaque(1.077)分离正常人低密度骨髓细胞，用无血清1640洗2次，稀释为2×106/ml，取90μl加到96空培养板中，各作3个复孔，对照组加10μl 1640，GM-CSF组加入10μl 20ng/ml GM-CSF，UCK-1和pcDI组各加相应的转染上清，培养5天，加入MTT，测OD570，结果发现UCK-1能促进骨髓细胞的增殖，其作用强度类似于20ng/ml GM-CSF(图8)。
实施例7UCK-1，2，3对小鼠骨髓细胞生长的影响无菌取Balb/c小鼠骨髓细胞，用Tris.NH4Cl pH7.2溶解红细胞，调整细胞浓度为1.5×106/ml。对照组加10μl正常COS-7细胞培养上清，阳性对照组加小鼠IL-3和SCF，其它各组加10μl pcDI，UCK-1，UCK-2和UCK-3转染上清，培养90小时，加入MTT，测OD570，结果发现UCK-1，UCK-2能明显促进小鼠骨髓细胞的增殖，UCK-3作用不明显(图9)。
实施例8UCK-1在正常细胞和肿瘤细胞的表达及其变异体UCK-2、UCK-3、UCK-4的发现为分析UCK-1在各种胚胎组织，成人组织及肿瘤组织的表达水平和剪切形式，以Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels试剂盒提供的单链cDNA文库作模板，利用UCK-1编码区特异性引物(同构建pcDI载体的引物)，进行PCR扩增，发现UCK-1在多种胚胎组织和肿瘤组织高表达，且存在多种不同的变异体，而在正常成人组织中表达水平低或不表达(图10)。说明该基因可能与胚胎发育及肿瘤的发生有密切关系。
实施例9UCK-1基因在哺乳动物体内的表达及生物活性的研究选择4～6周龄的BABLb/c小鼠为实验动物。利用Qiagen公司的质粒纯化系统纯化真核表达质粒pcDI-UCK1，应用基因直接注射的方法将pcDI-UCK1注射至小鼠肌肉组织及皮下组织(100μg/只)。注射后第10天、第30天分别采取注射局部的小鼠肌肉组织及皮下组织，通过组织学、免疫组织化学、酶学等方法观察pcDI-UCK1表达产物在注射组织局部的生物学效应。结果发现pcDI-UCK1表达产物具有①趋化炎症细胞至注射局部组织的作用；②促进骨骼肌细胞增殖及分化的作用；③促进毛囊角质细胞增殖及分化的作用。
序列表(1)、一般信息(i)申请人北京医科大学、北京北医联合生物工程公司(ii)发明名称具有免疫细胞趋化作用和造血刺激作用的新趋化因子(iii)序列数6(iv)通讯地址(A)联系人马大龙(B)街道海淀区学院路38号(C)城市北京(D)国家中华人民共和国(E)邮编100083(v)计算机可读形式(A)介体类型3.5英寸软盘(B)计算机奔腾166MMX(C)操作系统WINDOWS95(D)软件WORD97(vi)电讯信息(A)电话86-10-62091149(B)电传86-10-62091149
权利要求
1.编码如SEQ ID NO2中所示多肽之氨基酸1至99的分离的多核苷酸，或其片段或等位基因变异体，或与之杂交的核苷酸片段。
2.根据权利要求1的分离的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码具有由保藏登记号为CGMCC No.0392的生物学样品所包含的DNA表达之氨基酸序列的成熟多肽。
3.编码如SEQ ID NO4中所示多肽之氨基酸1至152的分离的多核苷酸，或其片段或等位基因变异体，或与之杂交的核苷酸片段；编码如SEQ IDNO6中所示多肽之氨基酸1至67的分离的多核苷酸，或其片段或等位基因变异体，或与之杂交的核苷酸片段；编码如SEQ ID NO8中所示多肽之氨基酸1至120的分离的多核苷酸，或其片段或等位基因变异体，或与之杂交的核苷酸片段。
4.根据权利要求1或2或3的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是cDNA。
5.根据权利要求1或2或3的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。
6.根据权利要求1或2或3的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。
7.含有权利要求1或2或3所述之DNA的载体。
8.用权利要求7的载体转化、转染或转导的宿主细胞。
9.具有如SEQ ID No2中所示的氨基酸序列的或由保藏物CGMCC No.0392所含的cDNA编码的多肽，及其具有功能等同的片段、类似物或衍生物。
10.可与权利要求9的多肽发生特异性反应的抗体或抑制所说多肽的作用的拮抗剂。
11.生产权利要求8的多肽的方法，包括在适于表达所说的多肽的条件下培养含有编码如权利要求9限定的多肽之核酸序列的宿主细胞，然后从培养基和/或细胞裂解物中回收所说的多肽。
12.含有作为活性成分的权利要求9的多肽及一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂药物组合物。
13.根据权利要求9的多肽或根据权利要求1的多核苷酸在生产用于体外和/或体内诊断或治疗由于先天或后天引起的造血功能障碍相关疾病的药物中的应用。
14.根据权利要求9的应用，其中所说的药物包括用于体外和/或体内诊断或治疗肌肉萎缩、肌肉病变、脱发等疾病的制剂。
15.根据权利要求9的应用，其中所说的药物包括抗肿瘤剂、抗病毒剂和胚胎发育及组织内环境稳定控制剂。
16.根据权利要求9的多肽或根据权利要求1的多核苷酸及由之编码的多肽在生产用于增强DNA疫苗或DNA药物效力的佐剂中的应用。
17.根据权利要求10的抗体或拮抗剂在生产用于体内和/或体外诊断或治疗心脏梗塞、肝坏死、类风湿性关节炎及自身免疫病的药物中的应用。
18.诊断与权利要求的多肽表达不是相关的疾病的方法，该方法包括体外检测编码所说多肽的核酸序列中的突变。
19.一种体外诊断方法，该方法包括分析权利要求9的多肽在得自宿主体内的样品中的存在。
全文摘要
本发明公开了人类细胞来源的一种新的具有免疫细胞趋化活性和造血细胞刺激作用的趋化因子类多肽及编码该多肽的核酸序列及其变异体形式。以重组技术生产该多肽及其变异体的方法和抗该多肽的抗体和拮抗剂。本发明进一步公开了含有该多肽或其DNA编码序列及一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物,以及所说的多肽或编码所说的多肽的核酸在生产用于体外和/或体内诊断或治疗免疫细胞功能异常疾病和/或肿瘤放化疗导致造血功能低下等疾病的药物中的应用。
文档编号C07K14/52GK1244584SQ9910728
公开日2000年2月16日 申请日期1999年5月14日 优先权日1999年5月14日
发明者马大龙, 韩文玲, 张颍妹, 宋泉声, 狄春辉, 黄家强, 汤建, 陈光慧 申请人:北京医科大学, 北京北医联合生物工程公司