专利名称：一种高效提取活化的凝血因子X(FXa)的方法
技术领域：
本发明是关于利用牛血作原料、高效提取活化的凝血因子Ⅹ(FXa)的问题，属于生物技术领域。
凝血因子Ⅹ(FX)是一个糖蛋白(约含糖10％)，它是维生素K依赖的凝血因子，在凝血的瀑布反应中，位于内外源通路的交汇点，所以对凝血的过程有着重要的影响。凝血因子Ⅹ在血浆中的含量一般认为有10毫克/升左右。当血液中的凝血瀑布反应被启动后，凝血因子Ⅹ可以被正常地活化。对外源通路来说，活化剂是活化的凝血因子Ⅶ和组织因子的复合物，在Ca2+存在条件下进行。对内源通路来说，活化剂是活化的凝血因子Ⅸ。活化的凝血因子Ⅷ作为辅酶，大大加速了后者的反应。这一反应不可缺少的条件仍然有Ca2+，另外还有磷脂的存在。而非正常的活化凝血因子Ⅹ不需要凝血因子蛋白的参与，是否有磷脂存在也不要求，只要求有Ca2+存在即可。世界各地的蝰蛇毒素普遍含有非正常活化凝血因子Ⅹ的特异水解酶，蝰蛇毒素中的这种特异水解酶已被用于活化的凝血因子Ⅹ(FXa)的制备中。另外某些肿瘤细胞也含有这类特异水解酶。1985年在肿瘤研究中，发现恶性肿瘤细胞在血液迁移中也能非正常地活化凝血因子Ⅹ，也许正是FXa的定域作用，所以使肿瘤细胞表面产生了纤维蛋白，而这一凝血层象保护壳一样，防御了天然杀手的进入，同时也可躲避免疫系统的识别，这也许是肿瘤跨组织迁移得以实现的一种方式。
抗凝血和抗血栓的新型药物一直是新药研究的重点。专一有效地抑制FXa比抑制凝血酶的效果更好。这是因为凝血酶在血液的抗凝系统中也有重要的作用，而FXa则不介入血液的抗凝系统。专一有效的抑制FXa可以使药效大大的提高。同时，专一有效的抑制FXa还可能具有抗肿瘤迁移的作用。这些研究都需要FXa，特别是现代药物设计所需要的蛋白晶体结构，也将需要较大量的FXa。
由于FXa是选择性很高的精氨酸肽键水解酶，近来已被基因工程的科学家设计成融合基因表达的融合蛋白的限定性内切酶(或称特异性水解酶)，如瑞典Pharmacia公司开发的GST融合基因载体，pGEX系列所设计的活化的凝血因子Ⅹ标识序列为Ile Glu Gly Arg↓，与其它的限定性内切酶相比，它的优点是可以保持克隆后的目的蛋白的全部氨基酸序列，能完全避免不希望引入的氨基酸对产品分子结构的干扰。这种内切酶可以将融合蛋白中目的蛋白按照设计者的意愿，从融合蛋白中设计的酶切位点上切割下来，从而达到了高纯高效的分离目的。在现代的基因工程中，融合蛋白已经扮演了重要的角色，它的高效表达的特性，不仅日益受到重视，特别是它具有纯化“标签”的性质，在亲合色谱中得到了充分的应用，在检测上也是带来诸多便利。限定性内切酶在融合蛋白分离中可以结合分离手段而巧妙的应用，不仅大大简化了分离步骤，提高目的蛋白回收率，而且纯度一般优于直接表达目的蛋白的产品。而药物融合蛋白的生产则是活化的凝血因子十应用的一个新热点。
因此，高效制备FXa是非常有意义的。
目前国内尚无这类分离研究的报道，在国际上现行的文献报道中，都是以研究为目的的分离方法，速度慢，难以满足科技发展的需要。例如，Radcliffe等人利用牛血前处理得到的含凝血因子Ⅹ的步骤较多，再利用DEAE-Cellulose柱层析两次分离方法，再透析除去小分子量杂质，分离时间较长，且FXa容易失活。
本发明的目的就是利用现代分离手段，通过减少分离步骤，提高分离效率，从牛血中获得高纯度活化的凝血因子Ⅹ(FXa)，以达到广泛应用的目的。本发明的实行方案(1)含凝血因子Ⅹ的牛血粗提物的获得取牛血14升，向每升牛血中加入100毫升抗凝剂(含0.2mol/L柠檬酸三钠，17000unit/L肝素，0.2mol/L苯甲脒，10000unit/L大豆胰蛋白酶抑制剂)，立即离心，得到亮黄色血浆；向每升血浆中滴加100毫升1mol/L氯化钡溶液，得到吸附凝血因子Ⅹ的柠檬酸钡沉淀；将沉淀加入到30％饱和度的硫酸铵溶液，搅拌3小时，离心后取清液，再使清液硫酸铵饱和度达到65％，静置约5小时，离心后取含凝血因子Ⅹ的蛋白沉淀，溶解，透析，冷冻干燥，即得含凝血因子Ⅹ的牛血粗提物，以备后用。(2)凝血因子Ⅹ纯化Q-Sepharose柱液相层析将(1)处理14升牛血得到的冻干的牛血粗提物溶解，采用Q-Sepharose柱(2.6×60cm)液相层析进行蛋白分离。洗脱速度为4.0ml/min，缓冲液为50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液，采用0-1.0mol/LNaCl直线梯度洗脱，部分收集(8.0ml/管)。280nm紫外监测。分离结果如
图1。用德国宝灵曼公司方法检测活性确定凝血因子Ⅹ所在的峰，收集，透析，冻干，备用。(3)活化的凝血因子Ⅹ(FXa)的制备活化将(2)得到的凝血因子Ⅹ干粉溶解成20mg/ml的溶液，向每毫升溶液中加入鲁氏蝰蛇毒素中的凝血因子Ⅹ活化酶组分(RVV-X)和CaCl2溶液，使其浓度分别为0.5mg/ml和1mmol/L，室温放置4小时后，立即进行分离。
快速蛋白液相层析(FPLC)利用FPLC(Mono Q柱)将活化后的混合液进行分离纯化。洗脱速度为1.0ml/min，280nm紫外监测，缓冲液为50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液，采用0-0.6mol/L NaCl直线梯度洗脱，按峰收集，分离结果如图2。用德国宝灵曼公司方法检测各收集部分活性，确定FXa所在的部分。采用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测FXa的纯度，检测结果如图3，FXa达到电泳单一纯。
权利要求
1.一种从牛血中高效提取活化的凝血因子Ⅹ(FXa)的方法该方法是从牛血中提取得到含凝血因子Ⅹ的粗提物，利用Q-Sepharose柱液相层析分离得到凝血因子Ⅹ，再活化之，然后直接用Mono Q柱液相层析可分离得到电泳纯的FXa。
2.根据权利要求1的方法，在获得牛血粗提物的过程中，加入在柠檬酸钡沉淀中的硫酸铵溶液的饱和度为30％。
3.根据权利要求1的方法，该方法所用Q-Sepharose柱液相层析的缓冲液体为缓冲液A50mmol/L Tris-HCl，pH8.0；缓冲液BA+1.0mol/L NaCl。且直线梯度为500ml缓冲液A+500ml缓冲液B。
4.根据权利要求l的方法，在凝血因子Ⅹ的活化过程中，鲁氏蝰蛇毒素中的凝血因子十活化酶组分(RVV-X)加入量应为0.1mg/ml，活化时间应为4小时。
5.根据权利要求1的方法，在利用FPLC(Mono Q柱)进行分离纯化时，缓冲液应为50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液，采用NaCl直线梯度洗脱，NaCl梯度应为0-0.6mol/L。
全文摘要
本发明是关于一种从牛血中提取活化的凝血因子X(FXa)的方法,属于生物技术领域。即利用现代分离手段,从牛血中分离得到含凝血因子X的牛血粗提物,再采用Q－Sepharose柱液相层析分离纯化凝血因子X,并活化之。应用快速蛋白液相层析(Mono Q柱)方法,快速分离得到高纯度(电泳纯)的FXa。其特点是分离步骤少、时间短、效率高,从而可以满足生产和科研上的需要。
文档编号C07K1/16GK1297896SQ9912520
公开日2001年6月6日 申请日期1999年11月29日 优先权日1999年11月29日
发明者吴双顶, 赵超, 王晶莹, 马瑞京, 彭安, 刘清亮 申请人:中国科学技术大学, 中国科学院生态环境研究中心