肿瘤坏死因子－γ的制作方法

专利名称：肿瘤坏死因子－γ的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴别的多核苷酸，由这种多核苷酸编码的多肽，此多核苷酸和多肽的应用，以及这种多核苷酸和多肽的生产。具体地，本发明的多肽已鉴别为是肿瘤坏死因子家族的一新成员，在后文称为“TNF-γ-α”。本发明还涉及由编码TNF-γ-α的基因的剪切变体编码的蛋白质，后文称作“TNF-γ-β”。本发明还涉及抑制这些多肽的功能。
背景技术：
人肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和b(TNF-b或淋巴毒素)是一大类多肽介体的相关成员，这些多肽介体包括干扰素，白细胞介素及生长因子，统称为细胞因子(Beutler,B.和Cerami,A.,Annu.Rev.Immuno1.,7:625-655(1989))。
肿瘤坏死因子(TNF-a和TNF-b)最初是由其抗肿瘤活性而发现的，然而现证实它是一个具有多种活性的多效细胞因子，在免疫调节及炎症中起重要作用。目前有8种已知的TNF相关的细胞因子家族的成员，TNF-a,TNF-b(淋巴毒素(LT)-a),LT-b，及Fas、CD30、CD27、CD40和4-1BB受体的配体。除TNF-b之外，这些蛋白质具有保守的C端序列及经常用作膜锚的可变N端序列。TNF-a和TNF-b当与TNF受体结合时，均有同源三聚体功能。
TNF通过许多类型细胞包括单核细胞，成纤维细胞，T细胞，天然杀伤(NK)细胞产生，并主要由活性的巨噬细胞产生。TNF-a已报道在肿瘤迅速坏死，免疫刺激，自身免疫系统疾病，移植排斥，抗寄生虫，产生抗病毒应答，败血休克，生长调节，血管内皮作用及代谢作用等方面均有作用。TNF-a还引发内皮细胞分泌各种因子包括PAI-1，IL-1,GM-CSF和IL-6以促进细胞增殖。另外，TNF-a正调节各种细胞粘附分子如E-Selectin,ICAM-1和VCAM-1。TNF-a和Fas配体也已呈现诱导细胞编程性死亡。
诱导由TNF或LT介导的各种细胞应答第一步是其与特异的细胞表面受体结合。已鉴别两种独立的TNF受体，TNF-R1大约为55Kda,TNF-R2大约为75Kda(Hohman,H.P.等，生物化学杂志.264:14927-14934(1989))，并分离及定性了相应于此两种受体的人和鼠cDNAs(Loetscher,H.等.，细胞，61:351(1990)。这二种TNF-R均呈细胞表面受体的典型结构，细胞表面受体包括胞外，转膜及胞内区。
在生理条件下多数是静止组织的内皮(Denekamp,J.CancerMetas.Rev.9:267-282(1982))，在保持血管稳态及通透性方面起关键作用。内皮细胞在炎症，细胞粘附，凝聚，血栓生成，纤维蛋白溶解及血管生成中是有活性的。在血管生成期间，内皮细胞增殖侵入基质，迁移至血管生成刺激源如癌症细胞附近，与血管周围细胞及基质细胞相互作用，最后，形成连接肿瘤组织至循环系统的毛细管(Folkman,J.Nature Med.1:27-31(1995))。尽管仍不十分清楚调节血管形成的复杂机制，但逐渐明白此过程的开始与结束是正性及负性因子平衡的结果。
在肿瘤组织中明显被正调节的许多血管生成因子已被阐述。这些包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一些成员，如FGF-1，FGF-2，及血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族的成员，以及所有这些分子的受体(Gimenez-Gallego,G.等，科学230:1385-1388(1985)；Schweigerer,L.等，自然325-257-259(1987)；Leung,D.W.，等，科学246:1306-1309(1989)；Burrus,L.W.和Olwin,B.B.生物化学杂志264:18647-18653(1989)；Wermstorm,S.，等，生长因子4:197-208(1991)；Terman,B.I.等，生物化学，生物物理学研究187:1579-1586(1992)；及Vries,C.等，科学255:989-991(1992))。另外，也已报道了一些血管生成抑制因子，包括血小板反应蛋白，血管抑制素，内皮抑制素及血小板因子-4(Good,D.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6623-6628(1990)；O’Reilly,M.S.等，细胞79:315-328(1994)；O’Reilly,M.S.等，细胞88:277-285(1997)；Maione,T.E.等，科学247:77-79(1990))。现已清楚正常血管生成当需要时迅速激活，当不再需要时迅速中止。然而病理性血管生成一旦开始，则通常持续下去并难以结束。这可表明在病理性血管生成进程中，负性调节机制的正常功能丧失或被抑制。据信内皮细胞可以产生自分泌因子以抑制血管生成进程，或保持成熟血管的稳态。
本发明的多肽基于其结构，氨基酸序列同源性及功能相似性已鉴别为是TNF家族的新成员，例如TNF-γ是促炎蛋白质。另外，本发明的TNF-γ多肽是血管生成及内皮细胞生长的负调节物。由于这种调节的被干扰可存在于与血管生成，止血，肿瘤坏死，细胞迁移及许多系统的癌症相关的疾病中，因此需要以这种方式作用的多肽。因而需要鉴别及定性在检测，预防，改进或调节这种疾病中起作用的这种人类多肽。
发明概述根据本发明的一方面，提供了一种新的成熟多肽，其为TNF-γ-α以及一种新的成熟多肽，其为TNF-γ-β，以及其生物学活性d、和有诊断与治疗作用的片段、类似物和衍生物。根据本发明的另一方面，提供了编码人TNF-γ-α或TNF-γ-β的分离的核酸分子，包括mRNAs,DNAs,cDNAs，基因组DNAs及其类似物及其生物学活性的和有诊断与治疗作用的片段和衍生物。
本发明提供了包含多核苷酸的分离的核酸分子，此多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的，或具有由以质粒DNA形式于1994年10月26日保藏在ATCC，保藏号75927的cDNA克隆HUVEO91编码的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的至少一部分。ATCC位于美国弗吉尼亚州马那萨斯大学路10801号，邮编201010-2209。由保藏的TNF-γ-α克隆测序确定的示于图1A和1B(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，含有编码174个氨基酸残基的完整多肽的开放读框，其包括编码N端甲硫氨酸的在783-785位核苷酸的起始密码子，推导的分子量大约为20132Da。
因此，在一实施方案中，本发明提供了含有多核苷酸的分离的核苷酸分子，该多核苷酸具有选自以下一组的核苷序列(a)编码具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQID NO:2所示除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由包含于ATCC保藏号No.75927中的cDNA克隆HUVEO91编码的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由包含于ATCC保藏号NO.75927中的cDNA克隆HUVEO91编码的除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由包含于ATCC保藏号No.75927中的cDNA克隆HUVEO91编码的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；及(g)互补于以上(a),(b),(c),(d),(e)或(f)中任一核苷酸序列的核苷酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了含有多核苷酸的分离的核酸分子，该多核苷酸具有选自以下一组的核苷酸序列(a)编码具有SEQID NO:20中完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1～251位氨基酸)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQID NO:20中除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2～251位氨基酸)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQID NO:20中62～251位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号203055中cDNA克隆HEMCZ56编码的完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由ATCC保藏号203055中的cDNA克隆HEMCZ56编码的除N端甲硫氨基酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号203055中cDNA克隆HEMCZ56编码的氨基酸序列的成熟TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；及(g)互补于以上(a),(b),(c),(d),(e)，或(f)中任一核苷酸序列的核苷酸序列。
本发明的另一实施方案包括含有多核苷酸的分离的核酸分子，该多核苷酸具有至少90％，优选至少95％,96％,97％,98％或99％等同于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中任一核苷酸序列的核苷酸序列，或者该多核苷酸是在严格杂交条件下与以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中多核苷酸或其片段(例如本文所述片段)或其互补链杂交的多核苷酸。这一杂交的多核苷酸在严格条件下与具有只由A残基或只由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸不杂交。本发明的另一核酸实施方案涉及一种含有多核苷酸的分离核酸分子，该多核苷酸编码具有以上(a),(b),(c),(d),(e)或(f)中氨基酸序列的TNF-γ多肽携带表位部分(即片段)的氨基酸序列。本发明另一实施方案涉及一种含有多核苷酸的分离核酸分子，该多核苷酸编码具有含至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个氨基酸取代的氨基酸序列的TNF-γ-多肽氨基酸序列。当然，在始终提高的优选性方面，优选的多核苷酸是编码具有含不超过10,9,8,7,6,5,4,3,2或1个氨基酸取代的氨基酸序列的TNF-γ多肽的氨基酸序列。
本发明还涉及包括本发明分离的核酸分子的重组载体，及含有重组载体的宿主细胞，以及生产这种载体及宿主细胞的方法，以及用它们通过重组技术生产TNF-γ多肽或肽的方法。
根据本发明的另一方面，提供了通过重组技术生产这种多肽的方法，包括在促进所述蛋白质条件下培养含有人TNF-γ核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞随后回收所述蛋白质。
本发明还提供了包含选自以下一组氨基酸序列的分离的TNF-γ多肽(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列(即SEQID NO:2的-27～147位氨基酸)的全长TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:2所示除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26-147位)的全长TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸序列的推定的成熟TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号75927中所含cDNA克隆HUVEO91编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号75927中所含cDNA克隆HUVEO91编码的除N端甲硫氨酸外的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏号75927中所含cDNA克隆HUVEO91编码的推定的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列；和(g)(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的多肽的片段。本发明的多肽还包括具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％等同于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的多肽，以及具有与以上那些氨基酸序列至少90％，优选至少95％相似的氨基酸序列的多肽。本发明其它实施方案涉及一种包含TNF-γ多肽携带表位部分的氨基酸序列的多肽，该TNF-γ多肽具有(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中所述氨基酸序列。具有本发明TNF-γ多肽携带表位部分的氨基酸序列的肽或多肽包括这种多肽的具有至少6或7个，优选至少9个，更优选至少大约30～50个氨基酸的部分，当然任何长度直至并包括上述本发明多肽全部氨基酸序列的携带表位的多肽也包括在本发明内。
本发明还提供了一种分离的TNF-γ多肽，其包括选自以下一组的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO:20所示完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1～251位氨基酸)的全长TNF-γ-β多肽氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:20所示除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2-251位的全长TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:20中62～251位氨基酸序列的推定的成熟TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号203055中cDNA克隆HEMCZ56编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号203055中cDNA克隆HEMCZ56编码的除N端甲硫氨酸外完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏号203055中cDNA克隆编码的推定的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列；及(g)(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的多肽的片段。本发明的多肽还包括具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％等同于上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中那些氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，以及具有与上述序列至少90％，优选至少95％相似的氨基酸序列的多肽。本发明其它实施方案涉及一种多肽，其包含具有上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的TNF-γ多肽的携带表位部分的氨基酸序列。具有本发明TNF-γ多肽的携带表位部分的氨基酸序列的肽或多肽包括这种多肽的具有至少6或7个，优选至少9个，更优选至少大约30～50个氨基酸的部分，当然任何长度直至并包括本发明多肽全部氨基酸序列的携带表位的多肽也包括在本发明内。
本发明的另一实施方案涉及一种多肽，其包含具有一种氨基酸序列的TNF-γ多肽的氨基酸序列，TNF-γ多肽所具有的氨基酸序列含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个氨基酸取代。当然，按始终提高的优选性，肽或多肽优选具有包含TNF-γ多肽的氨基酸序列的氨基酸序列，其含有至少1个，但不超过10,9,8,7,6,5,4,3,2或1个氨基酸取代。在特异的实施方案中，图1A和1B，图20A和20B中氨基酸序列或其片段(例如胞外域和/或其它片段)中添加，取代和/或缺失的数目是1-5,5-10,5-25,5-50,10-50或50-150，优选的是保守氨基酸取代。
在另一实施方案中，本发明提供了与具有上述氨基酸序列的TNF-γ多肽特异结合的分离的抗体。本发明还提供了分离与TNF-γ多肽特异结合的抗体的方法，该TNF-γ多肽具有本文所述氨基酸序列。这种抗体用于如下诊断或治疗方面。
根据本发明的另一方面，提供了一种利用本发明的多核苷酸和/或多肽以筛选兴奋剂及拮抗剂的方法，以用于治疗目的，所述目的包括但非限于伤口愈合，抑制肿瘤增殖，提供抗寄生虫、细菌及病毒抗性，诱导炎症活性，诱导内皮细胞及某些造血细胞增殖，以治疗再狭窄及预防某些自身免疫系统疾病。
根据本发明的另一方面，还提供了核酸探针，其包含足够长度的核酸分子以特异地杂交人TNF-γ序列。
根据本发明的另一方面，还提供了TNF-γ多肽兴奋剂，其模拟TNF-γ并结合TNF-γ受体以激发TNF-γ型应答。
根据本发明的另一方面，提供了这种多肽的拮抗剂，其可用于抑制这种多肽的功能，例如预防败血症休克，炎症，脑疟疾，HIV病毒活化，移植物排斥，骨质疏松及恶病质。
根据本发明的另一方面，提供了检测与TNF-γ多肽及编码这种多肽的核酸序列低表达及过表达相关的疾病的诊断分析法。
在本发明的另一方面，TNF-γ可用于治疗类风湿性关节炎(RA)，通过抑制通常在RA中观测到的维持侵入骨及软骨血管翳所需的血管生成及内皮细胞增殖的增加进行治疗。
在另一方面，TNF-γ可结合作为病毒受体或共同受体的细胞表面蛋白。因此，TNF-γ或其兴奋剂或拮抗剂，可用于在病毒结合或与TNF-γ受体或共同受体相互作用的水平，或在病毒内在化或进入细胞的过程期间，调节病毒感染性。
根据本发明所有这些方面，术语“TNF-γ”指TNF-γ-α和/或TNF-γ-β。
根据本文教导，本领域技术人员将清楚本发明的这些及其它方面。
附图简述下述附图是举例说明本发明的实施方案，而非限制本发明权利要求所包括的范围。
图1A和1B示出本发明TNF-γ多肽的cDNA(SEQ ID NO:1)及相应推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。开始的27个氨基酸(下划线处)是推定的前导序列。使用标准的单字母缩写代表氨基酸。在图1A和图1B中，潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点在TNF-γ-α氨基酸序列中以黑体字的天冬酰胺符号(N)标记，在TNF-γ-α核苷酸序列中以黑体字的(#)在编码这个天冬酰胺残基的第一个核苷酸上标志。潜在的N-连接的糖基化序列发现位于TNF-γ-α氨基酸序列的以下位置N-29～N-32(N-29,Y-30,T-31,N-32)和N-125～D-128(N-125,V-126,S-127,D-128)。在图1A和1B中，潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点在TNF-γ-α氨基酸序列中以黑体的苏氨酸符号(T)标记，在TNF-γ-α核苷酸序列中在编码这个苏氨酸残基的第一个核苷酸上用(*)标记。潜在的PKC磷酸化序列发现在TNF-γ-α氨基酸序列中以下位置T-32～K-34(T-32,N-33,K-34)及T-50～R-52(T-50,F-51,R-52)。在图1A和1B中，潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点在TNF-γ-α氨基酸序列中也以黑体的丝氨酸或苏氨酸符号(S或T)标记，在TNF-γ-α核苷酸序列中在编码适当的丝氨酸或苏氨酸残基的第一个核苷酸上用(*)标记。潜在的CK2磷酸化序列发现在TNF-γ-α氨基酸序列的以下位置S-83～E-86(S-83,Y-84,P-85,E-86)；S-96～E-99(S-96,V-97,C-98,E-99)；S-115～E-118(S-115,L-116,Q-117,E-118)；S-130～D-133(S-130,L-131,V-132,D-133)；及T-135～D-138(T-135,K-136,E-137,D-138)。在图1A和1B中，潜在的十四烷基化位点在TNF-γ-α氨基酸序列中以双下划线标出，潜在的十四烷基化序列发现在TNF-γ-α氨基酸序列的以下位置G-20～K-25(G-20,L-21,A-22,F-23,T-24,K-25)及G-111～L-116(G-111,A-112,M-113,F-114,S-115,L-116)。
图2A-C示出TNF-γ-α(SEQ ID NO:2)与其它TNF家族成员包括人TNF-α(GenBank No.Z15026；SEQ ID NO:3)，人TNF-β(GenBank No.Z15026；SEQ ID NO:4)，人淋巴毒素-β(LT-β；GenBank No.L11016；SEQ ID NO:5)及人Fas配体(FASL；GenBank No.U11821；SEQ ID NO:6)之间的氨基酸序列对比。TNF-γ含有TNF家族的保守氨基酸残基，以有阴影的框示出。此对比的分子以其全部在图2A,2B和2C中表示。
图3A是一示出TNF-γ在人组织表达的RNA印迹分析。所示组织的RNA用标记的TNF-γcDNA探查。由于图3A示出的明显泳道，TNF-γ-αmRNA主要在肾中存在。其它泳道似乎示出强杂交，然而这些实际是非特异性成片泳道。
图3B是示出TNF-γ主要在HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞；泳道9)表达的RNA印迹分析。泳道6和泳道8是非特异成片泳道。所示细胞系的RNA用标记的TNF-γ-αcDNA探查。泳道1是CAMA1(乳腺癌)；泳道2是AN3CA(子宫癌)；泳道3是SK.UT.1(子宫癌)；泳道4是MG63(骨肉瘤)；泳道5是HOS(骨肉瘤)；泳道6是MCF7(乳腺癌)；泳道7是OVCAR-3(卵巢癌)；泳道8是CAOV-3(卵巢癌)；泳道9是HUVEC；泳道10是AOSMIC(平滑肌)；泳道11是包皮成纤维细胞。
图4示出TNF-γ在增殖或静止的内皮细胞中的相关表达。在培养的HUVEC细胞中TNF-γmRNA水平通过Northem印迹分析确定。以b-肌动蛋白密度表示的等量的总RNA(15μg)加样于每个泳道上。相当于TNF-γ的信号称为“VEGI”。在所示时间点(种植后的天数)制备总RNA。同时确定每个培养烧瓶中细胞数。进行双份试验，每个(T-25)烧瓶种植12500个细胞。
图5是TNF-γ蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析照片。TNF-γ如实施例1所述通过细胞表达生产及纯化。
图6是示出杆状病毒表达的TNF-γ的相关纯度及迁移率的凝胶照片。用杆状病毒系统表达及纯化TNF-γ如实施例2所述。
图7A由未处理的(图7Aa)及接触TNF-α(图7Ab),TNF-γ(图7Ac)和TNF-b(图7Ad)后的WEHI 164细胞的照片组成。具有延长的非圆形形态的细胞已被溶解。各种TNF分子以大约0.5μg/ml浓度加入。加入各种TNF分子72小时后照相。
图7B示出TNF-γ(图7Bc)与TNF-α(图7Ba)和TNF-b(图7Bb)对比抑制WEHI 164细胞生长的能力。
图8示出与未处理的L929细胞(图8A)相比重组TNF-α(图8B),TNF-b(图8D)及TNF-γ(图8C)诱导L929细胞的形态变化的能力。形态学变化以黑色圆形细胞表示。用各种重组TNF分子(在E.coli中产生的)，以大约0.5μg/ml处理细胞。在加入各种TNF分子72小时后照相。形态学变化指示细胞已被杀死。
图9示出TNF-γ(图9C),TNF-a(图9A)和TNF-b(图9B)对静脉内皮细胞的作用。在用商购的TNF-a和TNF-b及E.coli产生的TNF-γ处理静脉内皮细胞后，细胞的增殖用MTS分析定量。
图10示出TNF-γ对内皮细胞及乳腺癌细胞增殖的作用。以细胞数对所示TNF-γ浓度作图。(TNF-γ在此图中称为“VEGI”)。示出成年牛动脉内皮(ABAE)细胞(黑圆)生长受抑制，而MDA-MB-231(黑色三角)或MDA-MB-435(空心圆)细胞生长不受抑制。细胞以2×103个细胞/孔种植于24孔平板中，重复三份。ABAE细胞培养基含有补加10％FCS和(1ng/ml)FGF-2的IMEM(Life Technoligies,Inc.,Rockville,MD)。将此培养物在37℃,5％CO2中保持6天。然后细胞用胰蛋白酶消化，通过Coulter计数仪确定细胞数。示出回收的ABAE细胞总数的1/50，以校正与MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞的对比。
图11是HL60细胞的照片；对照(图11A)示出HL60细胞被涂开；及TNF-a(图11B)和TNF-γ(图11C)通过细胞粘附在下部右侧示出诱导细胞粘附及细胞与细胞间的接触。
图12示出重组TNF-γ(以方形表示)，TNF-a(以圆形表示)，及TNF-b(以三角形表示)诱导WEHI 164细胞死亡的能力。细胞死亡与405nm和490nm的吸光度之比成反比。
图13示出TNF-γ未有效地结合两种已知可溶的TNF受体，受体名为sTNF RⅠ(p55；实框)和sTNF RⅡ(p75；虚框)。
图14表明TNF-γ对ABAE细胞在胶原凝胶上形成类毛细管能力的影响。示出重组TNF-γ(SEQ ID NO:2中所示12-147残基，在此图中称为“VEGI”)抑制ABAE细胞形成类毛细管。通过对比在培养基中含或不含有各种浓度TNF-γ时，ABAE细胞形成类毛细管的程度获得P值(t-检验)。
图15示出置于鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上胶原凝胶中，TNF-γ对血管生成的抑制。用FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)诱导新毛细管生长入CAM上胶原凝胶片中。凝胶中血管生成的程度通过评定注射入CAM循环中FITC-右旋糖酐的荧光密度而确定。重组TNF-γ(在此图称为“VEGI”)对毛细管生长的抑制以低于100的数值表示。实验以三份进行。
图16示出TNF-γ对无胸腺裸鼠中人乳腺癌异种移植肿瘤的生长抑制。将TNF-γ过表达的或载体转染的CHO细胞(5×106个细胞/次注射)和人乳腺癌细胞(1×106个细胞/次注射)的混合物注入裸鼠乳房脂肪层中。注射后监测肿瘤大小(范围)。绘出以接种以后天数为函数的MDA-MB-231异种移植肿瘤大小图(图16A)。绘出以接种后天数为函数的MDA-MB-435异种移植肿瘤的大小图(图16B)。空心圆表示用载体转染的CHO细胞共接种的肿瘤值，而实心圆表示用TNF-γ转染的CHO细胞共接种的肿瘤值。
图17示出TNF-γ-α氨基酸序列(SEQ ID NO:2)分析。示出α,β，转角及卷曲区；亲水性及疏水性；两亲区；柔性区；抗原性指数及表面概率，这是用所述计算机程序的缺省参数预测的。在“抗原性指数或Jameson-Wolf”图中，正峰值表示TNF-γ蛋白质高抗原性区的位置，即从中可获得本发明携带表位的肽的区域。
图18A-D示出TNF-γ-α(SEQ ID NO:1)和TNF-γ-β(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列对比，用BESTFIT程序，设定缺省参数。
图19示出TNF-γ-α(SEQID NO:2)和TNF-γ-β(SEQID NO:20)的氨基酸序列对比，用BESTFIT程序，设定缺省参数。
图20A和B示出本发明TNF-γ-β多肽的cDNA(SEQ IDNO:19)及相应推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。使用标准单字母缩写代表氨基酸。甲硫氨酸-1～色氨酸-35间的氨基酸是推定的胞内区。丙氨酸-36～丙氨酸-61(下划线)的氨基酸残基是推定的跨膜序列。在图20A和B中，潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点在TNF-γ-β氨基酸序列中用黑体的天冬酰胺符号(N)标记，在TNF-γ-β核苷酸序列中用(#)在编码这个天冬酰胺的第一个核苷酸上标记。潜在的N-连接的糖基化序列发现在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置N-133～N-136(N-133,Y-134,T-135,N-136)及N-229～D-232(N-229,V-230,S-231,D-232)。在图20A和B中，在TNF-γ-β核苷酸序列中在编码适当的位氨酸或苏氨酸残基的第一个核苷酸上用(*)标记。潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点在TNF-γ-β氨基酸序列中用黑体的丝氨酸或苏氨酸符号(S或T)标记，在TNF-γ-β核苷酸序列中用(*)在编码适当丝氨酸或苏氨酸残基的第一个核苷酸上标记。潜在的PKC磷酸化序列发现在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置S-23～R-25(S-23,C-24,R-25)；S-32～R-34(S-32,A-33,R-34)；R-135～K-137(T-135,N-136,K-137)；和T-154～R-156(T-154,F-155,R-156)。在图20A和20B中,潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点在TNF-γ-β氨基酸序列中也以黑体的位氨酸或苏氨酸符号(S或T)标记。潜在的CK2磷酸化序列发现在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置S-8～E-11(S-8,F-9,G-10,E-11)；S-187～E-190(S-187,Y-188,P-189,E-190)；S-200～E-203(S-200,V-201,C-202,E-203)；S-219～E-222(S-219,L-220,Q-221,E-222)；S-234～D-237(S-234,L-235,V-236,D-237)；及T-239～D-242(T-239,K-240,E-241,D-242)。在图20A和B中，潜在的十四烷基化位点在TNF-γ-β氨基酸序列中用双下划线标记。潜在的十四烷基化序列发现在TNF-γ-β氨基酸序列的以下位置G-6～E-11(G-6,L-7,S-8,F-9,G-10,E-11)；G-124～G-129(G-124,L-125,A-126,F-127,T-128,K-129)；及G-215～L-220(G-215,A-216,M-217,F-218,S-219,L-220)。
发明详述本发明提供了包括编码TNF-γ-α多肽的多核苷酸的分离的核酸分子，该TNF-γ-α多肽具有图1A和B所示氨基酸序列(SEQID NO:2)，它是通过对克隆的cDNA(HUVEO91)测序而确定的。如图2A-2C所示，本发明的TNF-γ-α多肽与人TNF-α(SEQID NO:3),TNF-β(SEQ ID NO:4)，人淋巴毒素-β(SEQ IDNO:5)及FAS配体(SEQ ID NO:6)呈序列同源。本发明的TNF-γ-α至少可抑制血管生成，作为抗肿瘤的类细胞因子的分子，通过抑制与侵入骨及软骨血管翳相关的血管生成及内皮细胞增殖治疗关节炎，作为NF-kB和c-Jun激酶(JNK)的诱导剂，细胞粘附的诱导剂，以及细胞程序死亡的诱导剂(参见实施例，尤其实施例12-15)。SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆(HUVEO91)测序而得，该cDNA克隆于1994年10月26日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，获得的ATCC保藏号为75927,ATCC位于美国马里兰州Rockville,Park Lawn Prive 12301，邮编20852。保藏的质粒包含在pBluescript SK(-)质粒中(Stratagene,LaJolla,CA)。对由克隆HUVEO91编码的蛋白质的进一步定性在1998年2月9日申请的美国临时申请60/074047中阐述，在此全部并入参考。
本发明还提供了包括编码TNF-γ-β多肽的多核苷酸(SEQ IDNO:19)的分离的核酸分子，该TNF-γ-β多肽具有图20A和B所示氨基酸序列(SEQ ID NO:20)，它是通过对克隆的cDNA(HEMCZ56)进行测序确定的。此TNF-γ-B多肽是本文所公开的TNF-γ-α多肽的剪切变体。SEQ ID NO:19所示核苷酸序列是通过对cDNA克隆(HEMCZ56)测序获得的，该cDNA克隆于1998年7月9日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。获得的保藏号为203055。ATCC位于美国佛吉尼亚州马那萨斯市大学道10801号，邮编20110-2209。此保藏的质粒包含于pBluescript SK(-)质粒(Stratagene,La Jolla,CA)。
核酸分子除非另外说明，本文中所有通过测序DNA分子而确定的核苷酸序列都是利用自动DNA测序仪(如Applied Biosystems公司的373型)确定的，而本文中所有的由DNA分子所编码的多肽的氨基酸序列都是通过对上述确定的DNA序列翻译而预测的。因此，正如本领域对通过自动化方法确定的任何DNA序列所了解的那样，本文所确定的任何一个核苷酸序列都可能有误差。自动化确定的核苷酸序列与实际的核苷酸序列典型地具有至少大约90％，更典型地至少大约95％～至少大约99.9％的相同性。实际的序列可以通过本领域所熟知的其它方法包括手工DNA测序方法而更为精确地测定。同样正如本领域所了解的，相对实际序列，在确定的核苷酸序列中的单个插入或缺失，将会导致该核苷酸序列翻译上的移框，因而由确定的该核苷酸序列推导出的所编码的氨基酸序列将会从该插入或缺失点开始，完全不同于该测序DNA分子所编码的实际氨基酸序列。核酸分子或多核苷酸的“核苷酸”序列对于DNA分子或多核苷酸而言是脱氧核糖核苷酸序列，对RNA分子或多核苷酸而言是相应的核糖核苷酸(A,G,C和U)序列，其中在特异的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(T)被尿嘧啶核糖核苷(U)取代。
用本发明所提供的信息，如图1A和B中核苷酸序列(SEQ IDNO:1)，或图20A或B中核苷酸序列(SEQ ID NO:19)；可使用标准克隆筛选方法例如用mRNA作起始物克隆cDNAs的方法获得本发明编码TNF-γ-α或TNF-γ-β多肽的核酸分子(即多核苷酸)。例如，编码TNF-γ-α多肽的多核苷酸可常规得自表达TNF-γ-α的任何细胞或组织，例如人肾及脐静脉内皮细胞。如本发明的一个例子，图1A和B所述的核酸分子(SEQ ID NO:1)在衍生自人脐静脉内皮细胞的cDNA文库中发现。相当于TNF-γ-α的cDNA克隆(克隆HUVEO91)含有一编码有174个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，此蛋白质的大约头27个氨基酸残基是推定的前导序列，这样成熟蛋白质包含147个氨基酸。此蛋白质在C端与兔TNF-a(Ito,H.，等，DNA 5:157-165(1986)；GenBank登录号M12846；SEQ ID NO:7)具有最高度同源性，在一段111个氨基酸的序列上有38％相同性及58％相似性。在TNF家族成员中保守的序列在TNF-γ中也是保守的(见图2A-2C)。带阴影的字母代表保守的氨基酸残基。如图3B所示RNA印迹分析所示，TNF-γmRNA在人脐静脉内皮细胞中特异表达。
另外，编码TNF-γ-β多肽的多核苷酸可常规得自诱导的及静息的内皮细胞，脐静脉，扁桃体，及一些其它类型的细胞和组织。如本发明的一个例子，图20A和B所述的核酸分子(SEQ ID NO:19)在衍生自诱导的内皮细胞的cDNA文库中发现。相当于TNF-γ-β的此cDNA克隆(HEMCZ56)含有一编码有251个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，此蛋白质的大约头35个氨基酸残基是推定的胞内域，且36-61位氨基酸是推定的跨膜域，62-251位氨基酸残基是推定的胞外域。
构成胞外，跨膜及胞内域的氨基酸残基已通过计算机分析推测。因此，本领域技术人员将意识到，构成这些区域的氨基酸残基根据用于定义每个区域的标准可轻微变化(例如有大约1～15个氨基酸发生变化)。
根据本发明的一方面，提供了编码成熟多肽的一种分离的核酸(多核苷酸)，该成熟多肽具有图1A和B的推导的氨基酸序列(SEQID NO:2)或是由克隆HUVEO91的cDNA编码，该克隆HUVEO91在1994年10月26日保藏在ATCC，保藏号75927。
根据本发明的另一方面，提供了编码成熟多肽的一种分离的核酸(多核苷酸)，该成熟多肽具有图20A和B的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)，或是由克隆HEMCZ56的cDNA编码，该克隆HEMCZ56在1998年7月9目保藏在ATCC，保藏号203055。
“分离的”核酸分子或多核苷酸是指已从其天然环境中移出的分子，DNA或RNA。例如，本发明包含在载体中的重组DNA分子(多核苷酸)被认为是分离的。其它分离的DNA分子(多核苷酸)例如包括保存在异源宿主细胞中的重组DNA分子，或溶液中纯化(部分或基本纯化)的DNA分子。分离的RNA分子(多核苷酸)包括本发明DNA分子(多核苷酸)的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的核酸分子或多核苷酸还包括合成产生的这种分子。本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，DNA包括cDNA，基因组DNA及合成的DNA。此DNA可以是双链或单链，且如果是单链的则可以是编码链或非编码(反义)链。
本发明的分离的核酸分子包括编码成熟TNF-γ-α多肽的图1A和B中所述的多核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，编码成熟TNF-γ-β多肽的图20A和B中所述的多核苷酸序列(SEQ ID NO:19)，包含于编码成熟TNF-γ-α多肽的保藏的克隆(HUVEO91)中的多核苷酸序列，此保藏的克隆(HUVEO91)保藏在ATCC中，保藏号75927，包含于编码成熟TNF-γ-β多肽的保藏的克隆(HEMCZ56)中的多核苷酸序列，此保藏的克隆(HEMCZ56)保藏在ATCC中保藏号203055，及包含不同于上述那些序列的序列，但由于遗传密码的简并性，编码与图1A和B，图20A和B的DNA，或保藏的cDNA相同成熟多肽的多核苷酸。当然，本领域熟知遗传密码。因此，本领域技术人员将可常规产生这种简并的变体。
完整的TNF-γ-α蛋白质的氨基酸序列包括一前导序列及一成熟蛋白质，如图1A和B所示(SEQ ID NO:2)。尤其地，本发明提供了编码成熟形式TNF-γ-α蛋白质的核酸分子。因此，根据信号假说，一旦生长的蛋白质链已开始通过粗面内质网输出，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一信号或前导序列，其切割自完整多肽以产生分泌的“成熟”形式的蛋白质。大多数哺乳动物细胞和甚至昆虫细胞以相同特异性切割分泌的蛋白质。然而，在一些情况中，分泌的蛋白的切割不是完全一致的，这产生了两或多种成熟的蛋白质。另外，长期以来已知分泌的蛋白的切割特异性最终是由完整蛋白质的初级结构确定的，即其是多肽氨基酸序列中固有的。因而本发明提供了编码成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列，该成熟TNF-γ-α多肽具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆编码的氨基酸序列。“具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽”是指TNF-γ-α蛋白质的成熟形式，其是通过由保藏的克隆的人DNA序列编码的完整开放读框在哺乳动物细胞(例如下述COS细胞)中表达而产生的。
编码图20A和B的成熟多肽的，或编码由保藏的cDNA(HEMCZ56)编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括但非限于仅成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列及附加编码序列如前导或分泌序列，或跨膜序列，或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(及任选地附加编码序列)及非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’的非编码序列。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列以相同的阅读框与一个有助于多肽从宿主细胞中表达和分泌的多核苷酸相融合，例如，用以控制多肽从细胞中转运的作为分泌序列的前导序列。具有前导序列的多肽是一前蛋白，且可以由宿主细胞切割前导序列以形成成熟形式的多肽。此多核苷酸还可编码前蛋白，即成熟多肽加上另外的5’氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是一蛋白原，且是该蛋白的非活性形式。一旦该原序列被切割，则剩下活性的成熟蛋白。
因此，本发明的多核苷酸例如可编码成熟蛋白质，或具有原序列的蛋白质，或具有原序列及前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸还可具有融入标记序列读框中的编码序列，从而使本发明的多肽纯化。在使用细菌宿主的情况下，标记序列可以是pQE-9载体的6组氨酸标签，以利于纯化融合了该标记的成熟多肽，或者，例如，在使用哺乳动物宿主如COS-7细胞的情况下，标记序列可以是血凝集素(HA)标签。HA标签相应于来自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson等，细胞，37:767(1984))。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖了只含有该多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括有其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明进而还涉及上文所述的多核苷酸的变异体，该多核苷酸变异体编码具有图1A和B，图20A和B中推导的氨基酸序列的多肽及由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物，。此多核苷酸的变异体可以是天然存在的等位基因变异体，也可以是非天然存在的该多核苷酸的变异体。
因此，本发明包括编码图1A和B所示相同的成熟多肽，或者编码由保藏的克隆HUVEO91的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，这些变异体编码图1A和B所示多肽或由保藏的克隆HUVEO91的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这种核苷酸变体包括缺失变异，置换变异及添加或插入变异。
另外，本发明包括编码图20A和B所示成熟多肽，或由保藏的克隆HEMCZ56的cDNA编码的多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，这些变异体编码图20A和B所示多肽或由保藏的克隆HEMCZ56的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这种核苷酸变异体包括缺失变异，置换变异及添加或插入变异。
如上所述，该多核苷酸序列可以具有图1A和1B所示编码序列或保藏的克隆HUVEO91的编码序列的天然存在等位基因变异体的编码序列。或者，此多核苷酸序列可以具有图20A和B所示编码序列或保藏的克隆HEMCZ56的编码序列的天然存在等位基因变异体的编码序列。正如本领域所熟知的，等位基因变异体是一个多核苷酸序列的另一种形式，它含有一个或多个核苷酸的置换，缺失或添加，而不实质地改变所编码的多肽的功能。
本发明进一步涉及本文所述分离的核酸分子的片段。一个分离的具有保藏的cDNAs(HUVEO91和HEMCZ56)的核苷酸序列或如图1A和B(SEQ ID NO:1)，图20A和B(SEQ ID NO:19)所示的核苷酸序列的分离的，或其互补链的核酸分子的片段，是指长度至少15nt，优选至少20nt，更优选至少30nt，最优选至少40,50,100,150,200,250,300,400或500nt的片段。这些片段有许多用处，包括但非限于用作本文所述的诊断探针和引物。当然，根据本发明，与保藏的cDNA克隆HUVEO91，保藏的cDNA克隆HEMCZ56的核苷酸序列，或图1A和B(SEQ ID NO:1)或图20A和B(SEQ ID NO:20)所示核苷酸序列大多数(即使非全部)相应的50～1500nt长度片段也是有用的。例如，一个长度为至少20nt的片段是指包括来自保藏的cDNA克隆(HUVEO91及HEMCZ56)的核苷酸序列，或如图1A和B(SEQ ID NO:1)或图20A和B(SEQID NO:20)所示核苷酸序列的20个或更多个连续碱基的片段。
在一特异实施方案中，本发明的多核苷酸片段编码具有功能活性的多肽。具有“功能活性”的多肽是指能行使一或多种与完整或成熟TNF-γ多肽相关的已知功能活性的多肽。这种功能活性包括但非限于生物学活性(例如抑制血管生成，抑制内皮细胞增殖，诱导NF-kB及c-Jun激酶(JNK)，诱导细胞粘附，及诱导细胞程序化死亡(见实施例尤其实施例12-15))，抗原性[结合(或与TNF-γ多肽竞争结合)TNF-γ抗体的能力]，免疫原性(产生与TNF-γ多肽结合的抗体的能力)与其它TNF-γ多肽形成聚合物的能力，及结合TNF-γ多肽的受体或配体(例如DR3)的能力。
本发明还提供了具有与SEQ ID NO:1的大量片段相关的核苷酸序列的核酸分子，其已从以下相关cDNA克隆中确定HUVEO91(SEQ ID NO:8),HMPAP05(SEQ ID NO:9),HSXCA44(SEQIDNO:10),HEMFG66(SEQ ID NO:11)，及HELAM93(SEQID NO:12)。
本发明还提供了具有与SEQ ID NO:19的大量片段相关的核苷酸序列的核酸分子，其已从以下相关cDNA克隆中确定HUVEO91P01(SEQ ID NO:21),HMPTI24R(SEQ ID NO:22),HELAM93R(SEQ ID NO:23)，及HEMFG66R(SEQ ID NO:24)。
在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸片段包括含有SEQ IDNO:1的1～2442核苷酸残基的至少30个，优选至少50个核苷酸的任何部分的多核苷酸，或由该多核苷酸组成，优选除外从上面所列cDNA克隆中确定的核苷酸序列。本发明TNF-γ-α多核苷酸片段的代表性实例包括含有以下SEQ ID NO:1，或其互补的多核苷酸链，或包含于保藏的克隆HUVEO91中的cDNA的如下核苷酸或由这些核苷酸组成的片段783-1304,800-1300,850-1300,900-1300,950-1300,1000-1300,1050-1300,1100-1300,1150-1300,1200-1300,1250-1300,783-1250,800-1250,850-1250,900-1250,950-1250,1000-1250,1050-1250,1100-1250,1150-1250,1200-1250,783-1200,800-1200,850-1200,900-1200,950-1200,1000-1200,1050-1200,1100-1200,1150-1200,783-1150,800-1150,850-1150,900-1150,950-1150,1000-1150,1050-1150,1100-1150,783-1100,800-1100,850-1100,900-1100,950-1100,1000-1100,1050-1100,783-1050,800-1050,850-1050,900-1050,950-1050,1000-1050,783-1000,800-1000,850-1000,900-1000,950-1000,783-950,800-950,850-950,900-950,783-900,800-900,and 850-900
在另外的特异实施方案中，本发明的多核苷酸片段包括或由含有SEQ ID NO:19的1～1116核苷酸残基的至少30个，优选至少50个核苷酸的任何部分的多核苷酸组成，优选除外从上面所列cDNA克隆中确定的核苷酸序列。(即列自p.25)。
本发明优选的实施方案包括这样的多核苷酸，其编码包含或由SEQ ID NO:2的-1-147(即-1～147),1-147(即+1～147),2-147,3-147,4-147,5-147,6-147,7-147,8-147,9-147,10-147,11-147,12-147及13-147残基的氨基酸序列组成的多肽。本发明还提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的TNF-γ-β多核苷酸片段的代表性实例包括包含或由SEQ ID NO:19或其互补多核苷酸链，或包含于保藏的克隆HEMCZ56中的cDNA的以下核苷酸组成的片段
1-1116,50-1116,100-1116,150-1116,200-1116,250-1116,300-1116,350-1116,400-1116,450-1116,500-1116,550-1116,600-1116,650-1116,700-1116,750-1116,800-1116,850-1116,900-1116,950-1116,1000-1116,1050-1116,1-1100,50-1100,100-1100,150-1100,200-1100,250-1100,300-1100,350-1100,400-1100,450-1100,500-1100,550-1100,600-1100,650-1100,700-1100,750-1100,800-1100,850-1100,900-1100,950-1100,1000-1100,1050-1100,1-1050,50-1050,100-1050, 150-1050,200-1050,250-1050,300-1050,350-1050,400-1050,450-1050,500-1050,550-1050,600-1050,650-1050,700-1050,750-1050,800-1050,850-1050,900-1050,950-1050,1000-1050,1-1000,50-1000,100-1000,150-1000,200-1000,250-1000,300-1000,350-1000,400-1000,450-1000,500-1000,550-1000,600-1000,650-1000,700-1000,750-1000,800-1000,850-1000,900-1000,950-1000,1-950,50-950,100-950,1 50-950,200-950,250-950,300-950,350-950,400-950,450-950,500-950,550-950,600-950,650-950,700-950,750-950,800-950,850-950,900-950,1-900,50-900,100-900,150-900,200-900,250-900,300-900,350-900,400-900,450-900,500-900,550-900,600-900,650-900,700-900,750-900,800-900,850-900,1-850,50-850,100-850,150-850,200-850,250-850,300-850,350-850,400-850,450-850,500-850,550-850,600-850,650-850,700-850,750-850,800-850,1-800,50-800,100-800,150-800,200-800,250-800,300-800,350-800,400-800,450-800,500-800,550-800,600-800,650-800,700-800,750-800,1-750,50-750,100-750,150-750,200-750,250-750,300-750,350-750,400-750,450-750,500-750,550-750,600-750,650-750,700-750,1-700,50-700,100-700,1 50-700,200-700,250-700,300-700,350-700,400-700,450-700,500-700,550-700,600-700,650-700,1-650,50-650,100-650,150-650,200-650,250-650,300-650,350-650,400-650,450-650,500-650,550-650,600-650,1-600,50-600,100-600,150-600,200-600,250-600,300-600,350-600,400-600,450-600,500-600,550-600,1-550,50-550,100-550,150-550,200-550,250-550,300-550,350-550,400-550,450-550,500-550,1-500,50-500,100-500,150-500,200-500,250-500,300-500,350-500,400-500,450-500,1-450,50-450,100-450,150-450,200-450,250-450,300-450,350-450,400-450,1-400,50-400,100-400,150-400,200-400,250-400,300-400,350-400,1-350,50-350,100-350,150-350,200-350,250-350,300-350,1-300,50-300,100-300,150-300,200-300,250-300,1-250,50-250,100-250,150-250,200-250,1-200,50-200,100-200,150-200,1-150,50-150,100-150,1-100,50-100,and 1-50
本发明优选的核酸片段还包括编码TNF-γ-α的一或多个以下区域的核酸分子(例如，如图1A和1B的


所述)SEQ IDNO:2的潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点N-29～N-32(N-29,Y-30,T-31,N-32)及N-125～D-128(N-125,V-126,S-127,D-128)；潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点T-32～K-34(T-32,N-33,K-34)及T-50～R-52(T-50,F-51,R-52)；潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点S-83～E-86(S-83,Y-84,P-85,E-86)；S-96～E-99(S-96,V-97,C-98,E-99)；S-115～E-118(S-115,L-116,Q-117,E-118)；S-130～D-133(S-130,L-131,V-132,D-133)；及T-135～D-138(T-135,K-136,E-13 7,D-138)；及潜在的十四烷基化位点G-20～K-25(G-20,L-21,A-22,F-23,T-24,K-25)及G-111～L-116(G-111,A-112,M-113,F-114,S-115,L-116)。
本发明尤为优选的多核苷酸是那些特征在于编码TNF-γ的结构或功能特性的多核苷酸。这些多核苷酸编码的氨基酸残基包括TNF-γ的α-螺旋和α-螺旋形成区(“α区”)，β-折叠和β-折叠形成区(“β区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，表面形成区，及高抗原指数区(即具有三或多个连续氨基酸残基的抗原区，每个区的抗原指数均高于或等于1.5)。一些优选的区域是图17中所述那些，并包括但非限于用所述的计算机程序的缺省参数分析图1(SEQ ID NO:2)中所述氨基酸序列鉴别的上述类型区域，这种优选的区域包括Garnier-Robson α区，β区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman α区，β区及卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区及疏水区，Eisenberg α和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区及高抗原指数的Jameson-Wolf区。
如上关于TNF-γ-α的阐述(见图17)，代表TNF-γ-β的数据用图20A和20B及SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列可易于制备。这样，上面所列的TNF-γ的结构和功能特征(即Garnier-Robsonα区β区，转角区及卷曲区，Chou-Fasmanα区，β区及卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区及疏水区，Eisenbergα和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区及高抗原指数的Jameson Wolf区等)相等地适用于TNF-γ-α和TNF-γ-β。
一些优选的区域见于图17所列，但也可以用图17中的数据列表加以代表或鉴别。用于产生图17的DNA*STAR计算机程序(设定为原始缺省参数)将易于以此列表格式表示图17中的数据。图17中的数据列表格式可用于方便地确定优选区域的特异边界。
上述图17中所示优选的区域包括但非限于通过分析图1A和1B所示氨基酸序列鉴别的上述类型区域。如图17所示，这种优选的区域包括Garnier-Robosonα区，β区，转角区及卷曲区，Chou-Fasmanα区，β区及卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区及疏水区，Eisenbergα和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区及高抗原指数的Jameson-Wolf区。
此间最优选的片段是那些包括TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的组合一些结构特征的区域的片段，如一些上述特征(1,2,3或4)。
本发明另外的优选核酸片段包括的核酸分子编码一或多个TNF-γ多肽的携带表位部分。尤其地，本发明的这种核酸片段包括的核酸分子编码包含SEQ ID NO:2中Thr-24～Asn-32氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Ile-37～Ile-45氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Met-54～Arg-62氨基酸残基的多肽；包含SEQID NO:2中Gln-63～Asp-71(氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Glu-57～Gly-65氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Val-80～Thr-88氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Leul16～Val124氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Asp133～Phe141氨基酸残基的多肽；包含SEQ ID NO:2中。通过如图17所示的Jameson-Wolf抗原指数分析，这些多肽片段已确定携带TNF-γ蛋白的抗原表位。确定TNF-γ的其它这种携带表位部分的方法在下文阐述。
携带TNF-γ-β蛋白抗原表位的多核苷酸片段，本领域技术人员用上述如图17所示的Jameson-Wolf抗原分析可易于确定。TNF-γ-β的其它这种携带表位部分的方法在下文阐述。
本发明的另外实施方案涉及一种多核苷酸，其优选在严格杂交条件下，与本发明多核苷酸的一部分多核苷酸序列杂交，该多核苷酸例如是保藏在ATCC中保藏号75927的cDNA克隆，ATCC保藏号203055的cDNA克隆，或本文所述的TNF-γ多核苷酸片段。“严格杂交条件”是指在42℃在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(PH7.6),5×Denhardt’s溶液10％硫酸葡聚糖和20ug/ml变性剪切鲑精DNA中培养过夜，随后在大约65℃用0.1×SSC中冲洗滤膜。与“一部分”多核苷酸杂交的多核苷酸是指与参照多核苷酸的至少15个核苷酸(nt)，优选至少20个，更优选至少30个，最优选30-70或80-150个nt，或全长序列杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。上述这些多核苷酸可用作诊断探针及引物，并在下文进一步阐述。当然，只与聚腺苷酸序列(如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:19所示TNF-γcDNA的3’末端序列)，或与T(或U)残基的一段互补序列杂交的多核苷酸，不包括在本发明用于与本发明的核酸的一部分杂交的多核苷酸中，这是因为这种多核苷酸将与含有聚腺苷酸序列或其互补序列的任何核酸分子(例如任何用寡dT作引物产生的双链cDNA克隆)杂交。
在优选的实施方案中，与本文所揭示的参照多核苷酸杂交的多核苷酸，编码基本保留了与由图1A和1B(SEQ ID NO:1)和/或图20A和B(SEQ ID NO:19)或保藏物中cDNA的多核苷酸序列编码的成熟多肽相同生物学功能和活性的多肽。
另一实施方案涉及与参照多核苷酸(即本文所揭示的多核苷酸)杂交，但未保留生物活性的多核苷酸。这些未保留生物活性的多核苷酸，它们例如可用作SEQ ID NO:1多核苷酸的探针以回收多核苷酸，用作诊断探针及用作PCR引物。
本发明还涉及本发明核酸分子的变体，其编码TNF-γ蛋白的部分，类似物和衍生物。变体可以是天然发生的，如天然等位基因变体。“等位基因变体”是指基因的几种可变形式占据了生物体染色体上一给定基因座(基因Ⅱ,Lewin,B.,ed.John Wiley&Sons，纽约(1985))。非天然发生的变体可用本领域已知突变技术产生。
这种变体包括那些通过本文所述多核苷酸序列(包括片段)中的核苷酸取代，缺失或添加而产生的变体。此取代，缺失或添加可以涉及一或多个核苷酸。变体可以在编码区或非编码区，或在二区内。编码区内的变化可产生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。特别优选的是沉默取代，添加及缺失，其不改变TNF-γ蛋白或其部分的性质及活性。保守取代也是特别优选的。
本发明的另外实施方案涉及包含一多核苷酸序列的分离的核酸分子，该多核苷酸序列至少70％或80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％与具有选自以下一组核苷酸序列的多核苷酸相同；(a)编码具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO:2中除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(d)编码具有SEQ ID NO:1～147位氨基酸所示氨基酸序列的TNF-γ-α多肽胞外域的核苷酸序列；(e)编码具有由包含于ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVEO91编码的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号74927的cDNA克隆HUVEO91编码的除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(g)编码具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVEO91编码的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(h)编码具有由ATCC中保藏号No.75927的cDNA克隆HUVEO91编码的氨基酸序列的TNF-γ-A多肽胞外域的核苷酸序列；(i)编码本文所述多肽片段的核苷酸序列；及(j)互补于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)，或(i)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的多肽还包括具有与以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)，或(j)中所述氨基酸序列至少80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同氨基酸序列的多肽，以及与上述那些序列至少90％，优选至少95％相似氨基酸序列的多肽。
本发明的另外实施方案涉及包含一多核苷酸序列的分离的核酸分子，该多核苷酸序列至少70％或80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％与具有选自以下一组核苷酸序列的多核苷酸相同；(a)编码具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO:2中除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQID NO:2的-26～147位氨基酸)的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO:2中1～147位氨基酸所示氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(d)编码具有SEQ ID NO:1～147位氨基酸所示氨基酸序列的TNF-γ-α多肽胞外域的核苷酸序列；(e)编码具有由包含于ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVEO91编码的完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号74927的cDNA克隆HUVEO91编码的除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(g)编码具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVEO91编码的氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的核苷酸序列；(h)编码具有由ATCC中保藏号No.75927的cDNA克隆HUVEO91编码的氨基酸序列的TNF-γ-A多肽胞外域的核苷酸序列；(i)编码本文所述多肽片段的核苷酸序列；及(j)互补于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)，或(i)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的多肽还包括具有与以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h),(i)，或(j)中所述氨基酸序列至少80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同氨基酸序列的多肽，以及与上述那些序列至少90％，优选至少95％相似氨基酸序列的多肽。
具有至少例如95％与本发明参照核苷酸序列“相同”的核苷酸序列的多核苷酸，是指此多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的，只是相对于每100个参照的编码TNF-γ多肽的核苷酸序列之中该序列最多可包含5个点突变。换言之，为获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的一个多核苷酸，在参照序列中最多5％核苷酸可缺失或用另外的核苷酸取代，或在参照序列可插入最多5％的核苷酸。参照(参比)序列可以是图1A和B(SEQ IDNO:1)及图20A和B(SEQ ID NO:19)中所示全部核苷酸序列，或其任何片段。
事实上，任何特定的核酸分子是否与例如图1A和B(SEQ IDNO:1)，图20A和B(SEQ ID NO:19)所示核苷酸序列，或与保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同，可常规应用已知计算机程序确定，如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。Besfits利用Smith和Waterman的局部同源算法(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)，以发现二序列间最佳同源片段。当利用Bestfit或任何其它序列对比程序确定一特殊序列是否例如95％相同于本发明参照序列，当然要设定参数，由此在全长参照序列之上计算相同性百分比，且允许最高达参照序列总核苷数5％的同源性缺口。
在一特异的实施方案中，参照(参比)序列(本发明的序列)与目标序列间的相同性，也指作总体序列对比，用基于Brutlag等的公式(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的FASTDB计算机程序确定。用于DNA序列的FASTDB公式以计算相同性百分率的优选参数是Matrix-Unitary,k-tuple=4,Mismatch Penalty=1,JoiningPenalty=30,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=1,GapPenalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或目标核苷酸序列的长度，无论哪个较短。根据此实施方案，如果因为5’或3’缺失而非内部缺失导致目标序列比参比序列短，要进行手工校正，因为FASTDB程序当计算相同性百分比时不计算目标序列的5’和3’的短缺。对于目标序列相对于查询序列5’和3’端的短缺，百分比性的校正是通过计算不匹配的位于目标序列5’或3’端的参比序列的碱基数，以作为参比序列总碱基数的百分比。通过FASTDB序列对比的结果来确定一个核苷酸是否匹配。然后将此百分数从相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比结果。此校正的结果可用于本发明。FASTDB序列对比中所显示出的，只有在目标序列5’或3’端外侧的碱基，它们不与参比序列匹配，才用于计算以手工调节百分比相同性结果。例如，一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的参比序列对比以确定相同性百分比。缺失发生于目标序列的5’末端。因此FASTDB比对不显示出5’端前10个碱基的匹配。这10个不匹配的碱基相当于序列的10％(5’或3’端不匹配的碱基数/参比序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的相同性百分比中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的相同性百分比就是90％。再例如，一个90个碱基的目标序列与一个100个碱基的参比序列相比较，这时缺的的是内部的核苷酸，因而目标序列的5’或3’端碱基没有与参比序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的相同性百分比不需手工校正。再强调一次，只有目的序列的5’或3’端碱基与参比序列不匹配时才需要手工校正。对于本发明不需要进行其它的手工校正。
在另一优施方案中，本发明涉及与编码SEQ ID NO:2的多肽及其片段的多核苷酸以及该多核苷酸所编码的多肽具有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相同性，其片段具有至少30个碱基且优选至少50个碱基。
在另一优施方案中，本发明涉及与编码SEQ ID NO:20的多肽及其片段的多核苷酸以及该多核苷酸所编码的多肽具有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相同性，其片段具有至少30个碱基且优选至少50个碱基。
本发明还包括与图1A和B(SEQ ID NO:1)，图20A和B(SEQIDNO:19)所示多核苷酸序列，或者与保藏的cDNA的核酸序列或它们的片段具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同性的核酸分子，而不考虑它们是否编码具有TNF-γ功能活性的多肽。这是因为即使某个核酸分子不编码具有TNF-γ活性的多肽，本领域技术人员也知道如何利用该核酸分子，例如用作杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。本发明不编码具有TNF-γ活性的多肽的核酸分子的应用包括，尤其是(1)从cDNA文库中分离TNF-γ基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体涂片原位杂交(例如“FISH”)以获得TNF-γ基因的准确染色体定位，如Verma等，人类染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)中所述；以及(3)Northern印迹分析以检测特异组织中TNF-γmRNA的表达。
但是，优选的是与图1A和B(SEQ ID NO:1)，图20A和B(SEQID NO:19)所示核苷酸序列或与保藏的cDNA的核酸序列具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同性的核酸分子，同时它们编码具有TNF-γ活性的多肽。“具有TNF-γ活性的多肽”是指在特定的生物学试验中显示出类似于但非必须相同于本发明TNF-γ多肽(全长蛋白质或优选成熟蛋白)的活性。例如，测定TNF-γ活性可用如实施例7所述细胞程序死亡分析，通过确定TNF-γ抑制ABAE细胞培养物中FGF-2诱导的类毛细管结构形成的能力，如实施例9中详述；或用如实施例10中所述的绒毛尿囊膜(CAM)血管生成分析，通过如实施例12所述其对细胞NF-KB和c-Jun激酶(JNK)的活化的影响，及其它实施例中所述及本领域中一些另外方式进行测定。
当然，根据遗传密码简并性，本领域技术人员将能够马上意识到有大量的核酸分子，它们具有的序列与保藏的cDNA的核酸序列或者与图1A和1B(SEQ ID NO:1)，图20A和B(SEQ ID NO:19)所示的核苷酸序列或它们的片段具有至少70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同性，这些核酸分子编码具有TNF-γ活性的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并性变异，对于熟练的技术人员来说很显然甚至不需要进行上述的比较试验。本领域所能进一步理解的是，对于这些非简并性变异的核酸分子，也有相当的数量都编码具有TNF-γ活性的多肽。这是因为熟练技术人员完全了解那些较少或者不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸置换(例如以一种脂肪族氨基酸来替换另一种脂肪族氨基酸)。例如关于如何进行表型沉默的氨基酸置换的指导可参见Bowie,J.U.等，“解读蛋白质序列中的信息氨基酸置换的耐受性”，科学，247:1306-1310(1990)，其中作者在文中提示蛋白质能惊人地耐受氨基酸置换。
本发明还提供了分离的核酸分子，其所包含的多核苷酸编码TNF-γ多肽的氨基酸序列(如一个本文所述的TNF-γ多肽片段)，此氨基酸序列含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个，10-20个，5-10个，1-5个，3-5个或1-3个保守氨基酸取代。当然最优选的是多核苷酸编码的TNF-γ多肽的氨基酸序列具有不超过10,9,8,7,6,5,4,3,2或1个保守氨基酸取代。
多核苷酸分析本发明还涵盖了TNF-γ多核苷酸检测互补多核苷酸的应用，例如作为诊断试剂检测与存在突变的TNF-γ-α或TNF-γ-β相关的疾病。这种疾病与TNF-γ-α或TNF-γ-β的低表达相关，例如异常细胞增殖如肿瘤及癌症。
携带人TNF-γ基因突变的个体可通过各种技术在DNA水平检测。用于诊断的核酸可得自患者的细胞，如得自血液，尿液，唾液，组织活检及尸检物。基因组DNA可直接用于检测或可在分析前经PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324:163-166(1986))。也可使用RNA或cDNA。例如，互补于编码TNF-γ-α或TNF-γ-β的核酸的PCR引物可用于鉴别及分析TNF-γ突变。例如通过对比扩增的产物与正常基因型的大小变化可检测缺失与插入。点突变可通过扩增的DNA与放射标记的TNF-γ RNA或标记的TNF-γ反义DNA序列杂交得以鉴别。通过Rnase A酶切或解链温度的不同可区分错配的双链体和充分匹配的序列。
基于DNA序列差异的遗传测试可通过检测在含或不含变性剂的凝胶中DNA片段的电泳迁移率的变化而进行。通过高分辨凝胶电泳可观测小序列缺失及插入。在变性的甲酰胺梯度凝胶上可识别出不同序列的DNA片段，其中不同DNA片段的迁移率根据它们的特异解链或部分解链温度停留在凝胶中不同位置(例如参见Myers等，科学230:1242(1985))。
序列在特殊位置的变化也可通过核酸酶保护分析而揭示，如RNase及S1保护或化学切割法(例如Cotton等，PNAS,USA,85:4397-4401(1985))。
因此，检测特异的DNA序列可通过如杂交，RNase保护，化学切割，直接DNA测序或使用限制酶(例如限制性片段长度多态性(RFLP))及基因组DNA的Southern印迹进行。
除更常规凝胶电泳及DNA测序之外，也可通过原位分析检测突变。
保藏物是根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保藏。在授予专利权后菌株将不受限制地向公众发放。保藏物的提供仅是为了本领域技术人员的方便而非是对如根据35U.S.C.§112而为用于实施而索取保藏物的认可。当出现与本文描述的序列的任何冲突时，保藏材料中所含的多核苷酸的序列以及由其编码的多肽的氨基酸序列是参照物。制造、使用或销售保藏材料需经许可，本文不授予这种许可。
载体及宿主细胞本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体进行遗传工程加工的宿主细胞和通过重组技术生产本发明多肽。
应用本发明的载体，例如可以是克隆载体或表达载体，通过遗传学(转导，转化，或转染)方法，可以制备工程化的宿主细胞。例如载体的形式可以是质粒，病毒颗粒，噬菌体，等。工程化宿主细胞可以在为活化启动子，筛选转化子，或扩增本发明的TNF-γ基因改进的常规营养培养基上生长，。培养条件，如温度，pH等，应是前面筛选宿主细胞表达所使用的条件，本领域中的熟练技术人员对此非常清楚。
本发明的多核苷酸，借助于重组技术可用于合成多肽。因此，例如，此多核苷酸序列可包括在多种可以表达多肽的表达载体中。这些载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，如SV40的衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，酵母质粒，质粒和噬菌体DNA共同构建的载体，病毒DNA，如牛痘病毒，腺病毒，禽类痘病毒和假狂犬病毒。但是，只要可以在宿主体内复制、存活，任何质粒和载体均可使用。
有许多方法可以把适当的DNA序列插入到表达载体中。本领域通常采用的方法是把DNA序列插入在一个合适的限制性内切酶的酶切位点。该过程和其他步骤是本领域的熟练的技术人员所熟知的。
表达载体中的DNA序列与一个合适的表达调控序列(启动子)相连，以指导mRNA的合成。推荐可以使用的启动子是LTR或SV40的启动子，大肠杆菌的乳糖操纵子(1ac)或色氨酸操纵子(trp)，λ噬菌体PL启动子和其他已知的可以调控原核或真核细胞或它们的病毒基因表达的启动子。表达载体还含一个翻译起始的核糖体结合位点和一个转录终止子。载体还含有提高表达的合适的序列。
另外，表达载体应该优选含有至少一个选择标记基因，生成特异的表型特征，用来筛选转化的宿主细胞。这些标记基因有用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素抗性基因，以及用于大肠杆菌或其他细菌培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。
含有如本文上述所列出的适当DNA序列和启动子或调控序列的载体，可用于转化合适的宿主，使宿主表达蛋白。
推荐使用的适当宿主的实例包括，但不仅限于这些细菌细胞，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和链霉菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS和Bowes黑素瘤以及；腺病毒；植物细胞等。合适宿主的选择对本领域熟练的技术人员而言是不成问题的。
更为特殊的是，本发明还包括含有一个或多个上面已充分描述的DNA序列的重组构建体。重组构建体含有一个载体，如质粒或病毒载体，并插入本发明的序列，该序列在载体中可以为正向，也可以为反向。在一个优选的实施方案中，重组构建体还含有调节序列，例如包括启动子，可操纵与基因序列相连。有大量合适的载体和启动子为本领域熟练技术人员所熟知，并且已有商业化的产品供应。以下顺便列举常使用的载体；细菌pHE4-5(ATCC登录号209311及其变体)，pQE70,pQE60,pQE-9，从Qiagen公司可以获得；pBS,pD10,Phagescript,psiX174,Bluescript SK,pbsks,pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A，可以从Stratagene公司获得；ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5，可从Pharmacia公司获得；真核载体pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1和pSG，可从Stratagene公司获得；pSVK3,pBPV,pMSG和pSVL，可以从Pharmacia公司获得。其他合适的质粒载体也可使用，只要其在宿主中可复制和存活。
借助CAT(氯聚素转移酶)载体或其他带有选择标记载体，可以从任何所需基因中选择启动子区。两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提及的细菌启动子包括lacI,lacZ,T3,T7,gpt,λ噬菌体的PR、PL和trp。真核的启动子包括CMV的立刻早期启动子，HSV-tk，早期和晚期SV40，逆转录病毒的LTR，和小鼠的金属硫蛋白-Ⅰ。选择合适的启动子和载体对本领域的专业技术人员而言已是一常规技术。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等的真核细胞，例如哺乳动物的细胞，或者是低等的真核细胞，如酵母细胞，或者也可以是原核细胞，例如细菌细胞。应用下列方法可以把重组体导入宿主细胞中，如磷酸钙转染法，DEAE-纤维素介导的转染法，电穿孔法，转导，感染，或者其他方法(Davis,L，等，分子生物学的基本方法，1986)。
除包括本文所讨论的携带载体构建体的宿主细胞外，本发明还包括来自脊椎动物的原代，第二代和永生化的宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，这些细胞已经工程化，并已删除或取代内源性的遗传物质(如TNF-γ编码序列)和/或包括与本发明的TNF-γ序列有关的具有调控功能的遗传物质(异源性启动子)，它可以激活，改变和/或增加内源性TNF-γ多核苷酸。例如，本领域所熟悉的技术方法，可以用于经同源重组可操纵地结合异源性调控区(如启动子和/或增强子)和内源性TNF-γ多核苷酸序列(见，如美国专利第5641670号，1997年6月24日授权；国际公开WO96/29411,1996年9月26日出版；国际公开WO94/12650,1994年8月4日出版；Koller等，美国科学院研究进展，1989,86:8923-8935和Zijlstra等，自然，1989,342:435-438；每篇文章引入本文作参考)。
宿主细胞中的构建体可以很方便的用来合成由重组序列编码的基因产物。另外，本发明的多肽可以用普通的多肽合成仪进行人工合成。
成熟蛋白质在合适启动子调控下，可以在哺乳细胞，酵母，细菌，或其他细胞中表达。用不含细胞的翻译体系，借助于本发明所构建的DNA构建体的RNA，合成所需要的蛋白质。根据所使用的原核与真核宿主的不同，选择合适的克隆和表达载体，这一点，Sambrook，等已在其编著的“分子克隆实验指南”(第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989年)，其引入本文作参考文献。
高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一个增强子后而增强。增强子为DNA的顺式激活元件，通常长为10-300bp(碱基对)，可以作用于启动子以增强其转录。例子包括在复制起点晚期一侧100-270bp的SV40增强子，巨细胞病毒的早期启动子增强子，位于复制起始位点晚期侧的多瘤增强子，腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择标记如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因，啤酒酵母TRP1基因和来自高效表达基因的启动子，指导下游结构基因的转录。这些启动子可以是编码糖原分解酶的操纵子，如3-磷酸甘油激酶(PGK),α-因子，酸性磷酸酶，或者热休克蛋白等。异源的结构序列在合适的时期与翻译起始位点和终止序列以及前导序列进行装配，前导序列具有指导翻译蛋白分泌到周质空间或胞外培养基中。任选地，异源序列可以编码一种融合蛋白，包括具有所需特征的N端识别肽，如稳定重组蛋白或易于纯化。
细菌用表达载体的构建是将一个编码所需蛋白的结构DNA序列插入载体，与带有合适的翻译起始和终止信号，功能启动子可以调控序列的读码。载体将含有一个或多个表型选择标记和一个复制起始位点，以确保载体在宿主中扩增，维持载体。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌，枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和各种假单胞菌属，链霉菌和葡萄球菌属的菌种，当然其它菌也可以使用。
作为推荐用表达载体，并不仅限于这些实例，较常用的细菌表达载体含有一个选择性标记和细菌的复制起始位点，后者可以从商业化质粒的遗传元件中获得，该质粒包括广为熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)。此类商业化的载体包括，例如pKK223-3(Pharmacia精细化学试剂公司，阿普萨拉，瑞典)和GEM1(Promega生物技术公司，麦迪逊，威斯康星，美国)。这些pBR322的“骨架”部分是由一个合适的启动子和表达的结构基因序列共同构成。
先进行合适宿主株的转化，并使宿主株长到合适的细胞密度，接着使用适当的方法(如改变温度或化学物质诱导)，诱导所选启动子，再将细胞培养一段时间。细胞的收获通常采用离心的方法，用物理或化学的方法进行破坏，这样所得到粗提物以备进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可以使用任何常用的方法进行破坏，这一点本领域里的熟练技术人员非常清楚，包括反复冻融，超声波，机械性破坏，或使用细胞裂解剂。
各种哺乳细胞培养体系也可用于表达重组蛋白。哺乳表达体系的实例包括猴肾成纤维细胞的COS一7细胞系，由Gluzman报道，细胞，1981,23:175，以及其它能表达相应载体的细胞系，如C127,3T3,CHO,Hela和BHK等细胞系。哺乳类的表达载体将含有一个复制起始位点，一个合适的启动子和增强子和任何必需的核糖体结合位点，多聚腺苷化位点，剪接“供体和受体”点，转录终止序列和5’侧区非转录序列。来自SV40剪接体的DNA序列和多聚腺苷化位点可以提供所需非转录的遗传元件。
采用如下方法，可以从重组细胞的培养物中获得和纯化多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和疑集素层析。在纯化过程中，最好含有低浓度(约0.1-5mM)钙离子(Price等，生物化学杂志，1969,244:917)。必要时，可以对蛋白质进行重新折叠，以获得天然蛋白质的完整构象。最后用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化。
本发明中的多肽可以是天然的纯化产物，或化学法人工合成的产物，或通过重组技术由原核或真核宿主产生(如，培养的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)。根据在重组生产过程中所使用的宿主，本发明的多肽可以糖基化的或不发生糖基化。本发明的多肽还可以含有一个起始的甲硫氨酸残基。
另外，应用本领域中已知的技术，本发明的多肽可以化学合成例如，相应于本发明的多肽TNF-γ-α和TNF-γ-β的中段的肽可以用肽合成仪进行合成。再者，必需时，可以把非典型氨基酸或氨基酸的化学类似物作为替代物或附加物，引入TNF-γ多核苷酸序列。不典型氨基酸包括，但不仅限于普通氨基酸的D型同分异构体，2,4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基异丁酸，Abu,2-氨基丁酸，g-Abu,e-Ahx,6-氨基己酸，Aib,2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己丙氨酸，b-丙氨酸，氟代氨基酸，含修饰基团的氨基酸，如b-甲基氨基酸，钙-甲基氨基酸，钠-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸的类似物。再者，氨基酸可以为D型(右旋)亦可以为L型(左旋)。
本发明人已产生了至少15种TNF-γ-α表达构建体，以促进各种大小的TNF-γ多肽产生及在一些系统中产生。其中4个被构建为编码全长TNF-γ多肽。此全长构建体是(ⅰ)pQE9TNFg-27/147,(ⅱ)pQE70TNFg,(ⅲ)pC1TNFg，和pcDNA3TNFg。在所列的第一种表达构建体(pQE9TNFg-27/147)中，此构建体根据实施例1的方法，用于生产具有N末端6个组氨酸标记的全长TNF-γ-α多肽。缺失组氨酸标记的全长TNF-γ-α多肽可基本如实施例1中所进行的，通过用pQE70TNFg构建体在细菌中生产。另外，根据实施例3的方法，通用pC1TNFg或pcDNA3TNFg构建体，在哺乳动物细胞中生产缺失组氨酸标记的全长TNF-γ-α多肽。进一步地，成熟TNF-γ-α多肽在称为pcDNA3/IL6TNFg-1/149的构建体中在白细胞介素(IL)-6信号肽的引导下，从哺乳动物细胞中产生及分泌(见实施例11)。
所剩其它TNF-γ-α表达构建体用于从细菌，杆状病毒，及哺乳动物系统中表达各种TNF-γ突变蛋白。用pQE60细菌表达载体已产生4个N-末端缺失突变体。这些N末端缺失突变构建体是(ⅰ)pQE60TNFg-3/147(代表可能的成熟TNF-γ多肽；由此构建体表达的多肽与SEQ ID NO:20的TNF-γ-β的107-251位氨基酸残基相同)，(ⅱ)pQE60TNFg12/147(代表SEQID NO:2的12-147氨基酸残基，和SEQ ID NO:20的116-251氨基酸残基)，(ⅲ)pQE60TNFg22/147(代表SEQ ID NO:20的22-147氨基酸残基及126-251氨基酸残基)，及(ⅳ)pQE60TNFg28/147(代表SEQ ID NO:20的28-147氨基酸残基及132-251残基)。每个这些表达构建体可用于在细菌中生产这样的TNF-γ多肽，其相对于全长TNF-γ-α多肽分别呈N末端缺失25,39,49及55个氨基酸，相对于全长TNF-γ-β多肽，分别呈N末端缺失106,115,125及131个氨基酸。
其它N末端缺失突变细菌表达构建体已经产生。一个称为pHE4VEGI T30-L174的构建体用细菌表达载体pHE4已经产生，其表达图1A和1B所示TNF-γ-α序列的苏氨酸-30至亮氨酸174的氨基酸序列(SEQ ID NO:2的苏氨酸3至亮氨酸-147的氨基酸残基)，此序列精确地相应于图20A和20B所示TNF-γ-β序列的苏氨酸107至亮氨酸-251的氨基酸残基(SEQ ID NO:20的苏氨酸-107至亮氨酸-251)。另外的产生的细菌表达构建体包括pQE9.VEGI.his.T28-L174,pHE4.VEGI.T28-L174,pHE4.VEGI.T51-L174，及pHE4.VEGI.T58-1174。这些构建体基于pQE9或pHE4细菌表达载体。此构建体的名称表示表达载体，基因名，及由此构建体表达的氨基酸残基(例如pQE9.VEGI.T28-174表示pQE9细菌表达载体用于表达TNF-γ-α多肽的苏氨酸(T)-28至亮氨酸(L)-174的氨基酸(VEGI是TNF-γ-α的实验名称))。
可用于从哺乳动物系中生产分泌的成熟TNF-γ多肽的TNF-γ表达构建体已经产生。此构建体称为pC1/IL6 TNFg-3/147。其编码从人IL-6基因而来的信号肽与成熟TNF-γ序列的融合。一个相似的构建体已经产生，其表达与TNF-γ-α的12-149氨基酸的氨基末端(SEQ ID NO:2，即TNF-γ-β的116-251氨基酸(SEQ ID NO:20))融合的CK-b8信号肽，(该信号肽含有1995年6月23日申请的PCT申请PCT/US95/09058中揭示的CK-b8序列的-21至-1氨基酸)，其是基于pC4哺乳动物表达载体。此构建体称为pC4/CK-b8 TNFg12/147。此构建体的变体已产生，其能表达在TNF-γ羧基端融合有人IgG Fc区的TNF-γ的12-147氨基酸。此融合蛋白也在CK-b8信号肽的引导下分泌，并被称为pC4/CK-b8 TNFg12/147/Fc。此融合分子的人Fc部分的序列示于SEQID NO:18。本领域技术人员已知其它可使用的序列。
TNF-γ-α的-3至147氨基酸(SEQ ID NO:2)；其相应于TNF-γ-β的102-251氨基酸残基(SEQ ID NO:20))，通过用称为pA2GP TNFg-3/147的构建体可从杆状病毒系统中表达和分泌。此表达构建体编码在其氨基末端融合有杆状病毒GP信号肽的成熟TNF-γ编码序列。
两个逆转录病毒TNF-γ表达构建体也已经产生。第一个称为pG1SamEN/TNFg-3/149。此表达构建体用于从哺乳动物系统中生产全长TNF-γ蛋白。一个相关的构建体pG1Sam EN/CK-b8TNFg12/149已经产生，其可用于在CK-b8信号肽的引导下从哺乳动物系统中生产及分泌成熟TNF-γ蛋白。
本发明的其它多肽包括与上述多肽具有至少90％，优选至少95％，更优选至少96％,97％,98％或99％相似性的多肽。本发明的多肽还包括那些与保藏的cDNA编码的多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％,97％,98％，或99％相同性的多肽，并还包括这种多肽的至少30个优选至少50个氨基酸的一部分。
多肽及片段本发明进一步涉及了具有图1A和1B(SEQ ID NO:2)推导出的氨基酸序列的，或由保藏的cDNA HUVEO91所编码的氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的片段，类似物和衍生物。
本发明还涉及具有图20A和20B(SEQ ID NO:20)推导出的氨基酸序列的，或由保藏的cDNAHEMCZ56所编码的氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的片段，类似物和衍生物。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并且优选地纯化至同质程度。术语“分离的”是指材料是从其原始环境(例如，天然环境，如果它是天然产生的)中分离的。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是从一些或者全部共同存在于天然体系的物质中分离出来的同样的多核苷酸或DNA或多肽就是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是一种组合物的一部分，而在这种载体或组合物之中它仍然是分离的而非其天然环境中的一部分。分离的多肽也指已部分或基本从重组宿主细胞中纯化的多肽。例如，通过由Smith和Tohnson所述的一步法(基因6:31-40(1988))可基本纯化TNF-γ多肽的重组生产的形式。根据本发明的分离的多肽和多核苷酸也包括天然或合成产生的这种分子。本发明的多肽和多核苷酸利用本发明的抗TNF-γ抗体，通过本领域熟知的蛋白质纯化法可从天然或重组源料中纯化。
术语“片段”，“衍生物”及“类似物”当指图1A和1B或图20A和20B的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，是指保留了TNF-γ的功能活性即具有与图1A和1B(SEQID NO:2)，图20A和20B(SEQ ID NO:20)所示的和/或由一或二个保藏的cDNA克隆(HUVEO91和HEMCZ56)编码的全部和/或成熟TNF-γ多肽相同的一或多种功能活性的多肽。例如，这种具有所需免疫原性或抗原性的片段，衍生物或类似物可以用于免疫分析，用于免疫接种，用于抑制TNF-γ活性等。因此，本发明一个特异实施方案涉及一种TNF-γ片段，其可被特异结合图1A和B(SEQ ID NO:2)，图20A和20B(SEQ ID NO:20)所示的，和/或由一或两个保藏的克隆(HUVEO91和HEMCZ56)编码的TNF-γ多肽序列的抗体结合。
另外，本发明提供了具有TNF-γ生物学活性的TNF-γ的片段，衍生物或类似物(例如TNF-γ-β多肽的胞外域或成熟TNF-γ-α多肽)。保留或另外缺失了所需相应的TNF-γ性质的TNF-γ的片段，衍生物及类似物可分别用作这种性质及生理相关性的诱导剂或抑制剂，所需相应的TNF-γ性质例如是抑制细胞增殖，肿瘤抑制，抑制血管生成，通过抑制与破坏骨及软骨血管翳相关的血管生成和/或内皮细胞增殖而抗关节炎，NF-kB和c-Jun激酶(JNK)的诱导剂，细胞粘附的诱导剂，及细胞程序死亡的诱导剂(见实施例，尤其实施例12-15)。
本发明的多肽可以具有跨膜区及胞内和胞外域的膜结合受体的方式存在，或者它们以溶解方式存在，其中没有跨膜区。这种形式的TNF-γ例如是图20A和20B(SEQ ID NO:20)所示TNF-γ-β多肽序列，其含有一跨膜区，胞内区和胞外域。
在本领域中能够认识到的是，TNF-γ的一些氨基酸序列可以改变而不显著地影响该蛋白的结构或功能。如果要考虑序列上这类差异，那么应当记住的是该蛋白上有决定活性的重要区域。因此，本发明进一步包括TNF-γ多肽的变异体，它们可表现出基本的TNF-γ活性的，或者含有TNF-γ蛋白区域诸如本文中描述的多肽片段。这种突变包括缺失、插入、倒置、重复和类型置换。如上所述，关于如何进行表型沉默的氨基酸置换的指导可以参见Bowiem,J.U.等“解读蛋白质序列中的信息氨基酸置换的耐受性”科学，247:1306-131(1990)，其中作者指出有二种主要方法研究氨基酸序列对变化的耐受性。第一种方法依赖于进化过程，其中突变体通过天然选择被接受或排斥。第二种方法用遗传工程在克隆的基因的特定位置导入变化的氨基酸，并进行选择或筛选以鉴别保持功能的序列。如作者所示，这些研究表明蛋白质对氨基酸取代有令人惊奇的耐受性。作者还指出在蛋白质的某一位置氨基酸改变似乎是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基要求非极性侧链，而只有少数表面侧链通常是保守的。其它这种表型沉默取代如Bowie所述，在此并入参考。典型的保守取代是脂肪族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile之间的彼此置换；羟基残基Ser和Thr间的互换，酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln间的取代，碱性残基Lys和Arg间的交换，及芳香族残基Phe和Thr间的置换。
因此，图1或2的或由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物可以是(Ⅰ)其中的一个或多个氨基酸残基被保守型或非保守型氨基酸残基(优选的为保守型氨基酸残基)所取代，而且这种取代氨基酸残基可以是也可以不是遗传密码所编码的；或者(Ⅱ)其中的一个或多个氨基酸残基含有取代基团；或者(Ⅲ)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，诸如能够增强多肽半衰期化合物(例如，聚乙二醇)；或者(Ⅳ)其中添加的氨基酸与上述形式多肽相融合，诸如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用于上述形式多肽或蛋白原序列的纯化的序列。从本文的叙述中本领域的熟练技术人员应当能够了解这些片段、类似物和衍生物。
因此，本发明的TNF-γ可包括来自天然的突变或者人工操作的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。正如所表明的，优选的改变是非本质性的，诸如不会显著地影响蛋白质的折叠或活性的保守型氨基酸取代(见表1)。表1保守型氨基酸取代
本发明涉及的多肽包含所述TNF-γ多肽的氨基酸序列，但与所述TNF-γ多肽序列相比，其具有含有至少1个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个保守氨基酸取代的氨基酸序列。当然，最优选的肽或多肽具有TNF-γ多肽的氨基酸序列，该TNF-γ多肽的氨基酸序列含有至少1个但不超过10,9,8,7,6,5,4,3,2或1个保守氨基酸取代。
在另一特异实施方案中，图1A和B(SEQ ID NO:2)，图20A和B(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列，由保藏的克隆编码的多肽序列，和/或本文所述任何多肽片段(例如胞外域或胞内区)中取代，添加或缺失的数目是75、70、60,50,40,35,30,25,20,15,10,9,8,7,6,5,4,3,2,1或150-50,100-50,50-20,30-20,20-15,20-10,15-10,10-1,5-10,1-5,1-3或1-2。
为改良或改变TNF-γ多肽的性质，可利用蛋白质工程。本领域技术人员已知的重组DNA技术可用于产生新的突变体蛋白或突变蛋白或融合蛋白，此突变蛋白包括一或多个氨基酸取代，缺失，添加。这种修饰的蛋白质可示出例如增强的活性或提高的稳定性。另外，它们可以高产量纯化并至少在一定的纯化及贮藏条件下比相应天然多肽呈现较好的溶解性。
因此本发明也涵盖了具有一或多个氨基酸残基缺失、添加或取代的TNF-γ的衍生物和类似物，以产生更适于在选择的宿主细胞中的表达的TNF-γ多肽。例如，半胱氨酸残基可缺失或用另一氨基酸残基取代以消除二硫键；N连接的糖基化位点可改变或消除以获得均一产物的表达，该均一产物更易于从酵母宿主已知高糖基化N端连接的位点中回收及纯化。至此，本发明TNF-γ多肽中任何一个或多个糖基化识别序列上第1个或第3个或这两个氨基酸位上的各种氨基酸取代，和/或任何一个或多个这种识别序列的第二个氨基酸位的氨基酸缺失，将防止TNF-γ多肽在修饰的三肽序列糖基化(例如见Miyajimo等，EMBOJ 5(6):1193-1197)。
本发明TNF-γ蛋白质中为功能所必需的氨基酸可通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244:1081-1085(1989))。后一方法在分子中任一残基上引入单一丙氨酸突变。然后将获得的突变分子进行生物学活性测验如受体结合或体外增殖活性。
所特别感兴趣的取代是将带电荷氨基酸用另一个带电荷的氨基酸或用中性的氨基酸取代，可产生具有较高所需改良性质的蛋白质，如低凝聚性。蛋白质凝聚不仅降低活性而且还会在制备药学配方中产生问题，因为凝聚能产生免疫原性(Pinckard等，临床实验免疫学，2:331-334(1967)；Robbins等，糖尿病，36:838-845(1987)；Cleland等，治疗性药物载体系统评论，10:307-377(1993))。
由于TNF-γ是TNF相关的蛋白质家族的成员，为调整而不是完全消除TNF-γ的生物活性，优选在编码保守的类TNF区即SEQID NO:2的17-147位或SEQ ID NO:20的121-251位的氨基酸中，更优选在该区域中的所有的TNF相关蛋白持家族的成员中都不是保守的残基中进行添加，取代或缺失(见图2A-2C)。也是本发明一部分的是包含编码以上TNF-γ变体的核酸序列的分离的多核苷酸。
TNF-γ多肽的一些氨基酸在TNF相关的蛋白质家族的已知成员中是高度保守的。在TNF-γ的以下这些残基中进行特异突变，将观测到对生物活性的可查影响，这些残基是酪氨酸-15(在SEQ IDNO:2中的位置数)，亮氨酸-35，甘氨酸-41，酪氨酸-43，酪氨酸-46，谷氨酰胺-48，亮氨酸-90，亮氨酸-116，甘氨酸-119，天冬氨酸-120，苯丙氨酸-141，苯丙氨酸-142，及亮氨酸-147。这些相同的氨基酸残基当然存在于SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β的相应位置。
本发明还包括上述TNF-γ多肽的片段。本发明的多肽片段包含有SEQ ID NO:2中氨基酸序列的多肽，由保藏的克隆(HUVEO91)中cDNA编码的多肽，或由与保藏的克隆中核苷酸序列，如图1A和B(SEQ ID NO:1)和/或图20A和20B(SEQ ID NO:19)所示核苷酸序列，或其互补链杂交(如在严格杂交条件下)的核酸编码的多肽。
多肽片段可以是“自立的”或者包含在一个较大的多肽之内，而该片段构成其中的一部分或一个区域，优选的作为一个单独的连续的区域。本发明的多肽片段的代表性实例包括例如以下片段SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:20的大约第1至20位氨基酸，21-40,41-60,61-83,84-100,101-120,121-140,141-160,160-167,161-174,161-180,181-200,201-220,221-240,241-251位氨基酸。而且，多肽片段的长度可以大约为20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140或150个氨基酸。文中“大约”包括了所特别提及的范围，在上和/或下限增加或减少几个(5,4,3,2或1)氨基酸。
在其它实施方案中，本发明多肽的片段(即在此所述的那些)的长度不超过250,225,200,185,175,170,165,160,155,150,145,140,135,130,125,120,115,110,105,100,90,80,75,60,50,40,30，或25个氨基酸。
另外优选的实施方案涵盖的多肽片段包括或由TNF-γ-α的成熟区(SEQ IDNO:2的1-147残基)，TNF-γ-β的胞内区(SEQID NO:20的1-35氨基酸残基)，TNF-γ-β的跨膜区(SEQ IDNO:20的36-61氨基酸残基)，和/或TNF-γ-β的胞外域(SEQID NO:20的62-251氨基酸残基)组成。
本发明的多肽片段包括或由SEQ ID NO:2的亮氨酸-35～缬氨酸-49，色氨酸-104～亮氨酸-116，甘氨酸-119～丝氨酸-127，赖氨酸-139～亮氨酸-147的氨基酸残基组成。这些区域通过与图2A,2B和2C所示TNF家族成员多肽相对比，鉴别为是高度相同的区域。
优选的是具有结构或功能特征的TNF-γ的片段。这种片段包括的氨基酸残基含有TNF-γ的α螺旋和α螺旋形成区(“α区”)，β折叠和β折叠形成区(“β区”)，转角和转角形成区(“转角区”)，卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两亲性区，β两亲性区，表面形成区及高抗原性指数区(即由具有抗原指数等于或高于1.5的氨基酸残基组成的多肽区域，抗原指数用Jameson-Wolf程序的缺省参数鉴定)。一些优选的区域是图17中揭示的那些，并包括但非限于通过分析图1A和B推导的氨基酸序列鉴别的上述类型的区域，这种优选的区域包括Garnier-Robson推测的α区，β区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman推测的α区，β区，转角区及卷曲区；Kyte-Doolittle推测的亲水区及疏水区；Eisenberg的α和β两亲性区；Emini的表面形成区；及Jameson-Wolf的高抗原性指数区，这是用这些计算机程序的缺省参数推测的。本发明还包括编码这些多肽的多核苷酸。
另外，本发明的类似物包括一种蛋白原，其能通过切割蛋白原部分被活化，以产生活性的成熟多肽。
在另一实施方案中，本发明提供了包括或由本发明多肽携带表位部分组成的TNF-γ多肽(例如片段)。此多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指蛋白质的一部分，当本发明的全蛋白是免疫原时，该蛋白质的部分在体内可产生抗体应答。另一方面，多肽的一个可以结合抗体的功能区被称为“抗原性表位”。一个蛋白在体内的免疫原性表位数通常少于抗原性表位数(见如，Geysen等，美国科学院研究进展，1983,81:3998-4002。
为选择携带抗原性表位的肽或多肽(即含有抗体可结合的蛋白质分子的区域的肽或多肽)，本领域熟知模拟蛋白质一部分的相对短的合成肽能引发与部分模拟的蛋白质反应的抗血清(见如Sutcliffe,J.G.等，科学219:660-666(1983))。能引发蛋白质反应性血清的肽经常以蛋白质初级序列表示，该肽可通过一系列简单化学规则定性，并限定为即不是完整蛋白质的免疫优势区(即免疫原性表位)，也不是氨基或羧基端。本发明的携带抗原性表位的肽和多肽因而用于产生抗体包括与本发明多肽特异结合的单克隆抗体(见如，Wilson等，细胞3,7:767-778(1984))。
本发明的携带抗原性表位的肽和多肽优选含有本发明多肽氨基酸序列内的至少7个，优选至少9个，更优选至少大约15-30个氨基酸。可用于产生TNF-γ特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括含有SEQ ID NO:2中大约Thr-24～Asn-2氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大约Ile-37～Ile-45氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大约Met-54～Arg-62氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大约Gln-63～Asp-71氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大约Glu-57～Gly-65氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO:2中大约Val-80～Thr-88氨基酸残基的多肽；含有SEQID NO:2中大约Leu-116～Val-124氨基酸残基的多肽；含有SEQ IDNO:2中大约Asp-133～Phe-141氨基酸残基的多肽；这些多肽通过如图17中所示Jameson-Wolf抗原性指数分析，已确定为携带TNF-γ蛋白的抗原性表位。
本领域熟练技术人员通过使用缺省参数对TNF-γ-β多肽序列(SEQ ID NO:20)进行DNA*STAR分析制备的数据并选择高抗原指数区，可容易地确认TNF-γ-β多肽的抗原区。
另一方面，本发明提供了包含本发明多肽携带表位部分的肽和多肽。这些表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性多肽。“免疫原性表位”是指当本发明的多肽的全部或其片段是免疫原时，引发体内抗体应答的蛋白质一部分。另一方面，多肽的一个可以结合抗体的功能区被称为“抗原决定簇”或“抗原性表位”。一个蛋白在体内的免疫原性表位数通常少于抗原表位数。见如Geysen等，美国科学院研究进展，1983,81:2998-4001。但是，不管它是否为免疫原性表位，可以应用噬菌体展示等方法，制备任何抗原表位的抗体。见如Petersen,G.等，分子普通遗传学，1995,249:425-431。因此，本发明中所涉及的既是免疫原性表位，也是抗原性表位。
包含免疫原性表位的氨基酸序列已列表在上文举例说明。所列出的免疫原性表位只列出含有推测有最高抗原性的表位的氨基酸残基，是用Jameson和Wolf,(1988)Comp.Appl.Biosvi 4:181-186的程序推测的(在此全部并入参考)。Jameson-Wolf抗原性分析用PROTEAN计算机程序，用缺省参数进行(Version 3.11 forthe PowerMacIntosh,PNASTAR,Inc.1228 South Park Street Medison,WI)。未列于以上免疫原性表位表中的多肽的一部分未被认为是非免疫原性的。上文列出的免疫原性表位是举例列出而非完全列出，因为其它免疫原性表位通过所用的特殊程序未被识别。含有其它免疫原性表位的氨基酸用类似于Jameson-Wolf的程序或用本领域已知方法体内测试抗原性应答可常规确定。见如Geysen等所述；美国专利4708781；5,1943924433092；及5480971。(所述参考文献在此全部并入参考)。
特别要指出的是，免疫原性表位包括根据Jameson-Wolf分析预计的关键氨基酸残基。因此，在N末端，C末端或N,C两端的附加的旁侧残基可以添加到这些序列上，合成本发明表位的多肽。因此，免疫原性表位可以包括附加的N末端或C末端的氨基酸残基。附加的旁侧氨基酸残基可以是来自本发明的多肽的连续旁侧N-末端和/或C-末端序列，异源性多肽序列，或可包括本发明的多肽的连续旁侧序列和异源性多肽序列。
含有免疫原性或抗原性表位的本发明多肽至少有7个氨基酸残基长。“至少”意思是含有免疫原性或抗原性表位的本发明多肽，长度至少有7个氨基酸残基或者在7个氨基酸与本发明多肽的全长氨基酸数之间任何整数。优选含有免疫原性或抗原性表位的多肽至少有10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95，或100个氨基酸残基长。但是，需要指出的是，每个和每次在7个氨基酸和全长多肽的氨基酸残基数之间的每个整数，也包括在本发明中。
携带免疫原性和抗原性表位的片段可通过上述的连续氨基酸数目进行说明，或通过这些片段的N末端和C末端在SEQ ID NO:2中的位置进一步说明。本发明还包括每一种的N末端和C末端位置的组合，例如该片段长度至少为7个或至少15个连续的氨基酸残基的片段，可以占据SEQ DI NO:2的氨基酸序列。再者，“至少7个连续的氨基酸残基长”意思是长度为7个氨基酸残基，或在7个氨基酸与本发明全长多肽的氨基酸数之间的任何整数。尤其是7个氨基酸和全长多肽的氨基酸残基数之间的每个整数，也包括在本发明中。
例如，具有免疫原性和抗原性表位的本发明多肽可用于制备可特异结合本发明多肽的抗体，借助免疫方法检测本发明的多肽。例如，抗体对本发明的多肽进行亲和纯化时非常有用。抗体还可以常规地用于多种定性或定量免疫方法中，尤其在应用本领域中所熟知的方法，可以对本发明的多肽进行检测。见，如Harlow，等，抗体实验指南，冷泉港实验室出版社，第二版，1988。
本发明的含有表位的多肽可以通过本领域所熟知的化学合成法和重组方法产生。例如，带有表位的多肽可以用已知的化学合成法进行合成。例如，Houghten已经描述了一种简单的用于合成大量多肽的方法，例如10-20毫克的248种不同的长度为13个氨基酸残基的多肽，这些多肽分别代表HA1多肽的片段的单个氨基酸变异，所有这些多肽的制备和鉴定(利用ELISA结合法进行研究)耗时不到4周的时间(Houghten,R.A.，美国科学院研究进展，1985,82:5131-5135)。这种“同时多个肽合成(SMPS)”方法在Houghten及其同事的美国专利4,631,211中进一步描述。在该方法中，固相合成各种多肽所用的不同的树脂存在于各个溶剂可透过的袋子中，保证固相法中的许多相同的重复步骤得以最优化利用。完全的手工操作过程可以同时进行500-1000种或更多的肽合成(Houghten，等，美国科学院研究进展，1985,82:5131-5135中的第5134页)。
根据本领域所熟知的方法，包括但不仅限于，直接体内免疫，体外免疫和噬菌体展示等方法，本发明的含有表位的多肽可用于诱导抗体的产生。见，例如Sutcliffe，等，见上述；Wilson，等，见上述，和Bittle，等，普通病毒学杂志，1985,66:2347-2354。如果动物直接进行体内免疫，可以应用游离的肽；但是，抗肽抗体的滴度通过肽与一种大分子载体，如匙孔嘁血兰蛋白(KLH)或破伤风类毒素的偶联可得以加强。例如，含有半胱氨酸残基的肽可以应用连接子如马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)与载体偶联，而其他肽可以应用更常见的连接试剂如戊二醛与载体偶联。兔子、大鼠和小鼠等动物既可以用游离的肽，也可以用与载体偶联的肽进行免疫，例如，通过向腹腔注射和/或皮内注射含有约100微克的肽或载体蛋白和弗氏(Freund)佐剂。需要几次加强注射，如间隔为两周，以获得高滴度的抗肽抗体，例如可以应用吸附在固相上的游离肽，借助于ELISA法进行检测。免疫动物血清中抗肽抗体的滴度通过抗肽抗体的筛选而增加，例如，根据本领域中所熟知的方法，可以通过与结合在固相上的肽的吸附和所选抗体的洗脱进行选择。
本领域技术人员应理解的是，含有免疫原性或抗原性表位的本发明多肽可以与异源多肽序列融合。例如，本发明的多肽可以与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定区，或其中的一部分(CH1,CH2,CH3，及其任何组合，包括整个的结构域和部分结构域)，结果均能形成嵌合型的多肽。这些融合多肽有利于纯化，并在体内表现出较长的半衰期。这一点在例如由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物的免疫球蛋白重链或轻链的恒定区的各个结构域组成的融合蛋白示出。见，例如，EPA0394827；Traunecker，等，自然331:84-86。由于IgG部分而具有二硫键二聚结构的融合蛋白也可比单体多肽或其片段具有更有效的结合和中和其他分子的能力。见，例如，Fountoulakis，等，生物化学杂志，1995,270:3958-3964。编码上述表位的核酸还可与一条感兴趣的基因进行重组，所述基因作为一表位标记，有助于表达多肽的检测和纯化。
携带表位的肽和多肽通过任何常规方法生产(见如Houghten,RA.，等，美国科学院研究进展82:5131-5135(1985)；及Houghten等的美国专利No.4631211(1986)所述)。
本发明携带表位的肽和多肽的应用包括但非限于根据本领域熟知方法诱导抗体(见如Sutcliffe等；Wilson等；Chow,M.等，美国科学院研究进展82:910-914；及Bittle,F.J等，普通病毒学66:2347-2354(1985))。本发明的携带免疫原性表位的肽，即当整个蛋白质是免疫原时引发抗体应答的那部分蛋白质，根据本领域已知方法鉴别(见如Geysen等所述，文献同上)。进而，Geysen(1990)的美国专利5,194,392描述了一种通用的方法，检测或确定为表位的拓扑等价物的单体(氨基酸或其它化合物)的序列，它与特定的抗体的互补位(抗原结合位点)相互补。更为通用的，Geysen(1989)的美国专利4,433,092描述了一种方法，检测或确定为配体的拓扑等价物的单体的序列，它与特定受体的配体结合位点相互补。类似地，Houghten,R.A等(1996)的美国专利5,480,971，(发明名称过烷基化寡肽混合物)，公开了线性的C1-C7-烷基过烷基化寡肽及其系列和文库，以及用这种寡肽系列和文库确定优选地结合于所需的受体分子的过烷基化寡肽的方法。因此，本发明的带有表位的肽的非肽类类似物也可以通过这些方法常规地制备。
本领域技术人员应意识到，本发明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽及其携带表位的片段可与免疫球蛋白(IgG)的C区的一部分组合，产生嵌合多肽。这些融合蛋白利于纯化并在体内表现出较长的半衰期。这一点在例如，由人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链的C区的各个结构域组成的嵌合蛋白中示出(EPA394,827；Traunecker等，自然331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚结构的融合蛋白比单体TNF-γ蛋白或蛋白片段更有效地结合和中和其它分子(Fountoulakis，等，生化杂志270:3958-3964(1995))。例如，一种这样的TNF-γ-Fc融合体在此已如上述生产。
本发明TNF-γ多肽的片段(即一部分)的应用包括但非限于作为生产全长多肽的中间物。
对许多蛋白质而言，包括膜相关蛋白质的胞外结构域或分泌的蛋白的成熟形式，本领域已知从N末端或C末端缺失一或多个氨基酸基本不丧失生物功能。例如，Ron等(生物化学杂志，268:2984-2988(1993))报道了修饰的KGF蛋白，其即使缺失3,8或27个N末端氨基酸残基也具有肝素结合活性。另外，一些研究人员报道其中2,4或7个N末端氨基酸已除去的TNF-α突变蛋白，当与天然发生的TNF-α多肽相比时，表现出功能活性提高2-3倍(CREASY,A.A.等，癌症研究47:145-149(1987)；Sidhu,R.S和Bouon,A.P.抗癌研究9:1569-1576(1989)；Kamijo,R.等，生物化学，生物物理学研究160:820-827(1989))。另外，即使一或多个氨基酸从蛋白质的N末端或C-末端缺失导致蛋白质的一或多种生物功能变化或丧失，但其它TNF-γ功能活性仍可保留。
在本发明中，由于本发明的蛋白质是TNF多肽家族成员，从N末端氨基酸直至SEQIDNO:2的35位亮氨酸(相应于SEQIDNO:20的134位亮氨酸)的缺失可保留一些生物活性，如调节许多类型的造血细胞和内皮细胞的生长与分化。具有从N末端至SEQ ID NO:2的亮氨酸-36(相当于SEQ ID NO:20的亮氨酸-135)在内的缺失的多肽预期不保留这种生物活性，因为已知TNF相关多肽中的此残基是为生物活性所需的保守的功能域的起端。
然而，即使一或多个氨基酸从全长TNF-γ的多肽的N末端缺失导致此多肽的一或多种生物功能丧失，但其它生物活性仍可保留。因此，当全长或成熟多肽的少部分残基从N末端除去时，缩短的多肽诱导和/或结合抗体的能力仍被保留，该抗体识别全长或成熟形式的多肽。缺失完整多肽N端残基的特定多肽是否保留这种免疫学活性，可通过本文所述及本领域其它已知常规方法而确定。
由此，本发明还提供了具有缺失自SEQ ID NO:2所示TNF-γ氨基酸序列的氨基端直至35位亮氨酸的一或多个残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。尤其地，本发明提供了含有SEQ ID NO:2的n1-149残基的氨基酸序列的多肽，其中n1是-27至35之间的整数，且第35位被认为是调节各种造血及内皮细胞生长及分化所需的完整的TNF-γ多肽(SEQ ID NO:2所示)N端的第一个残基位。
本发明提供的多核苷酸编码包含或由以下SEQ ID NO:2的残基组成的氨基酸序列的多肽，本发明还涵盖了编码这些多肽的多核苷酸-27 to 147,-26 to 147,-25 to 147,-24 to 147,-23 to 147,-22 to 147,-21to 147,-20 to 147,-19 to 147,-18 to 147,-17 to 147,-16 to 147,-15 to 147,-14 to147,-13 to 147,-12 to 147,-11 to 147,-10 to 147,-9 to 147,-8to 147,-7 to 147,-6 to 147,-5 to 147,-4 to 147,-3 to 147,-2 to 147,-1 to 147,1 to 147,2 to 147,3to 147,4 to 147,5 to 147,6 to 147,7 to 147,8 to 147,9 to 147,10 to 147,11 to147,12 to 147,13 to 147,14 to 147,15 to 147,16 to 147,17 to 147,18 to 147,19to 147,20 to 147,21 to 147,22 to 147,23 to 147,24 to 147,27 to 147,26 to 147,27 to 147,28 to 147,29 to 147,30 to 147,31 to 147,32 to 147,33 to 147,34 to147,and 35 to 147由此，本发明还提供了具有缺失自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β氨基酸序列的氨基端直至134位亮氨酸的一或多个残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。尤其地，本发明提供了含有SEQ IDNO:20的n2-251残基的氨基酸序列的多肽，其中n2是1-134之间的整数，且第135位被认为是调节各类造血细胞和内皮细胞生长与分化所需的完整TNF-γ-β多肽(SEQ ID NO:20所示)N端的第一个残基位。
本发明提供的多核苷酸编码包含或由以下SEQ ID NO:20的残基组成的氨基酸序列的多肽，本发明还涵盖了编码这些多肽的多核苷酸1 to 251,2 to 251,3 to 251,4 to 251,5 to 251,6to 251,7 to 251,8 to251,9to 251,10to 251,11 to 251,12 to 251,13 to 251,14to 251,15 to 251,16 to251,17 to 251,18 to 251,19 to 251,20 to 251,21 to 251,22 to 251,23 to 251,24to 251,25 to 251,26 to 251,27 to 251,28 to 251,29 to 251,30 to 251,31to 251,32 to 251,33 to 251,34 to 251,35 to 251,36 to 251,37 to 251,38 to 251,39 to251,40 to 251,41 to 251,41 to 251,42 to 251,43 to 251,44 to 251,45 to 251,46to 251,47 to 251,48 to 251,49 to 251,50 to 251,51 to 251,52 to 251,53 to 251,54 to 251,55 to 251,56 to 251,57 to 251,58 to 251,59 to 251,60 to 251,61 to251,62 to 251,63 to 251,64 to 251,65 to 251,66 to 251,67 to 251,68 to 251,69to 251,70 to 251,71 to 251,72 to 251,73 to 251,74 to 251,75 to 251,76 to 251,77 to 251,78 to 251,79 to 251, 80 to 251,81 to 251,82 to 251,83 to 251,84 to251,85 to 251,86 to 251,87 to 251,88 to 251,89 to 251,90 to 251,91 to 251,92to 251,93 to 251,94 to 251,95 to 251,96 to 251,97 to 251,98to 251,99 to 251,100 to 251,101 to 251,102 to 251,103 to 251,104 to 251,105 to 251,106 to 251,107 to 251,108 to 251,109 to 251,110 to 251,111 to 251,112 to 251,113 to 251,114 to 251,115 to 251,116 to 251,117 to 251,118 to 251,119 to 251,120 to 251,121 to 251,122 to 251,123 to 251,124 to 251,125 to 251,126 to 251,127 to 251,128 to 251,129 to 251,130 to 251,131 to 251,133 to 251,134 to 251,and 134 to251如上所述，即使一或多个氨基酸从多肽的N端缺失导致多肽的一或多种生物功能丧失，其它生物活性仍将保留。因此，当少于半数的全长或成熟多肽的残基从N端除去时，缩短的TNF-γ-α突变蛋白诱导和/或结合识别全长或成熟多肽的抗体的能力仍将保留。缺失完整蛋白N端残基的特定多肽是否保留这种免疫活性，可通过本文所述的及本领域已知其它方法确定。缺失大量N端残基的TNF-γ-α突变蛋白仍可保留一些生物或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少至6个TNF-γ-α的氨基酸残基组成的肽经常可引起免疫应答。
由此，本发明还提供了具有缺失自图1A和1B(SEQ ID NO:2)所示TNF-γ-α氨基酸序列的氨基端直至图1A和1B所示序列第169位苯丙氨酸(相当于SEQ ID NO:2的142位)的一或多个残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明特别提供了包含图1A和1B的n3-174残基(SEQ ID NO:2的n3-147残基)的氨基酸序列的多肽，其中n3是1-169之间的整数，且170位被认为是至少是为TNF-γ-α多肽免疫原性活性所需的完整TNF-γ-α多肽N端的第一个残基位。
更特别地，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由图1A和1B中所示TNF-γ-α序列的以下残基的氨基酸序列组成(图1A和1B所示TNF-γ-α氨基酸序列与SEQ ID NO:2中所示序列相同，但二序列间计数方式不同；以下氨基酸残基位数在此指图1A和1B中的位数)，所述残基为
R-2 to L-174；R-3 to L-174；F-4 to L-174；L-5to L-174；S-6 to L-174；K-7 to L-174；V-8 to L-174；Y-9 to L-174；S-10 to L-174；F-11 to L-174；P-12 toL-174；M-13 to L-174；R-14 to L-174；K-15 to L-174；L-16 to L-174；I-17to L-174；L-18 to L-174；F-19 to L-174；L-20 to L-174；V-21 to L-174；F-22 to L-174；P-23 toL-174；V-24 to L-174；V-25 to L-174；R-26 to L-174；Q-27 to L-174；T-28 to L-174；P-29 to L-174；T-30 to L-174；Q-31 to L-174；H-32 to L-174；F-33 to L-174；K-34 toL-174；N-35 to L-174；Q-36 to L-174；F-37 to L-174；P-38 to L-174；A-39 to L-174；L-40 to L-174；H-41 to L-174；W-42 to L-174；E-43 to L-174；H-44 to L-174；E-45 toL-174；L-46 to L-174；G-47 to L-174；L-48 to L-174；A-49 to L-174；F-50 to L-174；T-51 to L-174；K-52to L-174；N-53 to L-174；R-54 to L-174；M-55 to L-174；N-56to L-174；Y-57 to L-174；T-58 to L-174；N-59to L-174；K-60to L-174；F-61 toL-174；L-62 to L-174；L-63 to L-174；I-64 to L-174；P-65 to L-174；E-66 to L-174；S-67 to L-174；G-68 to L-174；D-69 to L-174；Y-70 to L-174；F-71 to L-174；I-72 toL-174；Y-73 to L-174；S-74 to L-174；Q-75 to L-174；V-76 to L-174；T-77 to L-174；F-78 to L-174；R-79 to L-174；G-80 to L-174；M-81 to L-174；T-82 to L-174；S-83 toL-174；E-84 to L-174；C-85 to L-174；S-86 to L-174；E-87 to L-174；I-88 to L-174；R-89 to L-174；Q-90 to L-174；A-91 to L-174；G-92 to L-174；R-93to L-174；P-94 toL-174；N-95 to L-174；K-96 to L-174；P-97 to L-174；D-98 to L-174；S-99 to L-174；I-100 to L-174；T-101 to L-174；V-102 to L-174；V-103 to L-174；I-104 to L-174；T-105 to L-174；K-106 to L-174；V-107 to L-174；T-108 to L-174；D-109 to L-174；S-110 to L-174；Y-111 to L-174；P-112 to L-174；E-113 to L-174；P-114 to L-174；T-115 to L-174；Q-116 to L-174；L-117 to L-174；L-118 to L-174；M-119 to L-174；G-120 to L-174；T-121 to L-174；K-122 to L-174；S-123 to L-174；V-124 to L-174；C-125 to L-174；E-126 to L-174；V-127 to L-174；G-128 to L-174；S-129 to L-174；N-130 to L-174；W-131 to L-174；F-132 to L-174；Q-133 to L-174；P-134 to L-174；I-135 to L-174；Y-136 to L-174；L-137 to L-174；G-138 to L-174；A-139 to L-174；M-140 to L-174；F-141 to L-174；S-142 to L-174；L-143 to L-174；Q-144 to L-174；E-145 to L-174；G-146 to L-174；D-147 to L-174；K-148 to L-174；L-149 to L-174；M-150 to L-174；V-151 to L-174；N-152 to L-174；V-153 to L-174；S-154 to L-174；D-155 to L-174；I-156 to L-174；S-157 to L-174；L-158 to L-174；V-159 to L-174；D-160 to L-174；Y-161 to L-174；T-162 to L-174；K-163 to L-174；E-164 to L-174；D-165 to L-174；K-166 to L-174；T-167 to L-174；F-168 to L-174；and F-169 toL-174
因此，本发明还提供了具有缺失自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β的预测的成熟氨基酸序列的氨基酸端，直至第246位苯丙氨酸残基的一或多个残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明特别提供了含有SEQ ID NO:20的n4-251残基的氨基酸序列的多肽，其中n4是2-246间的一个整数，且247位被认为是为至少TNF-γ-β蛋白的免疫原性活性所需的完整TNF-γ-β多肽N端的第一个残基位。
本发明尤其提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽包含或由SEQID NO:20所示TNF-γ-β序列的以下残基的氨基酸序列组成本发明还涵盖了编码这些多肽的多核苷酸。
A-2 to L-251；E-3 to L-251；D-4 to L-251；L-5 to L-251；G-6 to L-251；L-7 to L-251；S-8 to L-251；F-9 to L-251；G-10 to L-251；E-11to L-251；T-12 toL-251；A-13 to L-251；S-14 to L-251；V-15 to L-251；E-16 to L-251；M-17 to L-251；L-18 to L-251；P-19to L-251；E-20 to L-251；H-21 to L-251；G-22 to L-251；S-23 toL-251；C-24 to L-251；R-25 to L-251；P-26 to L-251；K-27to L-251；A-28 to L-251；R-29 to L-251；S-30 to L-251；S-31 to L-251；S-32 to L-251；A-33 to L-251；R-34 toL-251；W-35 to L-251；A-36 to L-251；L-37 to L-251；T-38 to L-251；C-39 to L-251；C-40 to L-251；L-41 to L-251；V-42 to L-251；L-43 to L-251；L44 to L-251；P-45 toL-251；F-46 to L-251；L-47 to L-251；A-48 to L-251；G-49 to L-251；L-50 to L-251；T-51 to L-251；T-52 to L-251；Y-53 to L-251；L-54 to L-251；L-55 to L-251；V-56 toL-251；S-57 to L-251；Q-58 to L-251；L-59 to L-251；R-60 to L-251；A-61 to L-251；Q-62 to L-251；G-63 to L-251；E-64 to L-251；A-65 to L-251；C-66to L-251；V-67 toL-251；Q-68 to L-251；F-69to L-251；Q-70 to L-251；A-71 to L-251；L-72 to L-251；K-73 to L-251；G-74 to L-251；Q-75 to L-251；E-76 to L-251；F-77 to L-251；A-78 toL-251；P-79 to L-251；S-80 to L-251；H-81 to L-251；Q-82 to L-251；Q-83 to L-251；V-84 to L-251；Y-85 to L-251；A-86 to L-251；P-87 to L-251；L-88 to L-251；R-89 toL-251；A-90 to L-251；D-91 to L-251；G-92 to L-251；D-93 to L-251；K-94 to L-251；P-95 to L-251；R-96 to L-251；A-97 to L-251；H-98 to L-251；L-99 to L-251；T-100to L-251；V-101 to L-251；V-102 to L-251；R-103 to L-251；Q-104to L-251；T-105 toL-251；P-106 to L-251；T-107 to L-251；Q-108 to L-251；H-109 to L-251；F-110 toL-251；K-111 to L-251；N-112 to L-251；Q-113 to L-251；F-114 to L-251；P-115 toL-251；A-116 to L-251；L-117 to L-251；H-118 to L-251；W-119 to L-251；E-120 toL-251；H-121 to L-251；E-122 to L-251；L-123 to L-251；G-124 to L-251；L-125 toL-251；A-126 to L-251；F-127 to L-251；T-128 to L-251；K-129 to L-251；N-130 toL-251；R-131 to L-251；M-132 to L-251；N-133 to L-251；Y-134 to L-251；T-135 toL-251；N-136 to L-251；K-137 to L-251；F-138 to L-251；L-139 to L-251；L-140 toL-251；I-141 to L-251；P-142 to L-251；E-143 to L-251；S-144 to L-251；G-145 toL-251；D-146 to L-251；Y-147 to L-251；F-148 to L-251；I-149 to L-251；Y-150 toL-251；S-151 to L-251；Q-152 to L-251；V-153 to L-251；T-154 to L-251；F-155 toL-251；R-156 to L-251；G-157 to L-251；M-158 to L-251；T-159 to L-251；S-160 toL-251；E-161 to L-251；C-162 to L-251；S-163 to L-251；E-164 to L-251；I-165 toL-251；R-166 to L-251；Q-167 to L-251；A-168 to L-251；G-169 to L-251；R-170 toL-251；P-171 to L-251；N-172 to L-251；K-173 to L-251；P-174 to L-251；D-175 toL-251；S-176 to L-251；I-177 to L-251；T-178 to L-251；V-179 to L-251；V-180 toL-251；I-181 to L-251；T-182 to L-251；K-183 to L-251；V-184 to L-251；T-185 toL-251；D-186 to L-251；S-187 to L-251；Y-188 to L-251；P-189 to L-251；E-190 toL-251；P-191 to L-251；T-192 to L-251；Q-193 to L-251；L-194 to L-251；L-195 toL-251；M-196 to L-251；G-197 to L-251；T-198 to L-251；K-199 to L-251；S-200 toL-251；V-201 to L-251；C-202 to L-251；E-203 to L-251；V-204 to L-251；G-205 toL-251；S-206 to L-251；N-207 to L-251；W-208 to L-251；F-209 to L-251；Q-210 toL-251；P-211 to L-251；I-212 to L-251；Y-213 to L-251；L-214 to L-251；G-215 toL-251；A-216 to L-251；M-217 to L-251；F-218 to L-251；S-219 to L-251；L-220 toL-251；Q-221 to L-251；E-222 to L-251；G-223 to L-251；D-224 to L-251；K-225 toL-251；L-226 to L-251；M-227 to L-251；V-228 to L-251；N-229 to L-251；V-230 toL-251；S-231 to L-251；D-232 to L-251；I-233 to L-251；S-234 to L-251；L-235 toL-251；V-236 to L-251；D-237 to L-251；Y-238 to L-251；T-239 to L-251；K-240 toL-251；E-241 to L-251；D-242 to L-251；K-243 to L-251；T-244 to L-251；F-245 toL-251；and F-246 to L-251
相似地，已知许多C端缺失的突变蛋白的生物功能。例如，干扰素γ通过蛋白质羧基端缺失8-10个氨基酸而表现出活性提高10倍(Dobeli等，生物技术学杂志7:199-216(1988))。另外，一些研究人员已报道生物学活性失活的TNF-a突变蛋白，其中只有少至2个氨基酸从C端除去(Carlino,J.A.等，生物化学杂志262:958-961(1987)；Crensey,A-A等.癌症研究47:145-149(1987)；Sidhu,R.S.和Bollin,A.P.抗癌研究9:1569-1576(1989)；Gase,K等，免疫学71:368-371(1990))。
由于本发明的蛋白质是TNF多肽家族的成员，缺失SEQ ID NO:2的C端氨基酸直至146位亮氨酸(相当于SEQ ID NO:20的250位亮氨酸)，仍可保留一些生物活性，如调节多种类型造血细胞和内皮细胞的生长与分化。缺失SEQ ID NO:2的C端氨基酸直至包括146位亮氨酸(相应于SEQ ID NO:20的250位亮氨酸)在内的氨基酸的多肽，预期不保留这种生物活性，因为已知TNF相关多肽中的此残基是生物活性所需保守结构域的起端。
然而，即使蛋白质C端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质的一或多种生物学活性丧失，其它生物活性仍可保留。因此，当成熟或完整蛋白少于半数的残基从C端除去时，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白的抗体的能力仍保留。缺失完整蛋白C端残基的一特定多肽是否保留这种免疫原性活性，通过本文所述的及本领域已知其它方法可确定。
在另一实施方案中，本发明进一步提供了具有去除自SEQ IDNO:2所示TNF-γ-α所示氨基酸序列羧基端直至SEQ ID NO:2的146位亮氨酸的一或多个残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明特别提供了具有SEQ ID NO:2的-27～m1残基的氨基酸序列的多肽，其中m1是146～147间任一整数，且146位被认为是TNF-γ-α多肽调节各类造血和内皮细胞生长与分化所需的完整TNF-γ-α多肽(SEQ ID NO:2所示)C端的第一个残基位。
本发明特别提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽具有SEQ IDNO:2的-27～146及-27～147残基的氨基酸序列。也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了具有去除自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β氨基酸序列羧基端直至SEQ ID NO:20的250位亮氨酸的一或多个氨基酸残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明特别提供了具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列中1～m2残基的氨基酸序列的多肽，其中m2是250～251间的任一整数，且249位是调节各类造血及内皮细胞生长与分化所需的完整TNF-γ-β多肽(SEQ IDNO:20所示)C端的第一个残基位。
本发明特别提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽具有SEQ IDNO:20的1-250及1-251残基的氨基酸序列。也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了多肽片段，其包含或由TNF-γ-α的氨基及羧基端缺失的一或多个氨基酸组成，该片段一般可描述为具有SEQID NO:2的n1-m1残基，其中n和m是如上述的整数。本发明还提供了一种多肽，其具有缺失自TNF-γ-β的氨基和羧基端的一或多个氨基酸，一般可描述为具有SEQ ID NO:20的n2-m2残基，其中n2和m2是如上述的整数。
如上所述，即使多肽C端失一或多个氨基酸导致其一或多种生物活性丧失，其它生物活性仍可保留。因此，当少于完整或成熟多肽半数的残基从C端除去时，缩短的TNF-γ-α突变蛋白保留诱导和/或结合识别全长或成熟多肽的抗体的能力。丧失全长多肽C端残基的特定多肽，是否具有这种免疫原性活性，可通过本文所述及本领域已知方法确定。缺失大量C端氨基酸残基的TNF-γ-α突变蛋白可保留一些生物或免疫原性活性不是不可能的。事实上，由少至6个TNF-γ-α氨基酸残基组成的肽可经常引起免疫应答。
由此，本发明还提供了具有缺失自图1A和1B所示(或SEQ IDNO:2所示)TNF-γ-α氨基酸序列羧基端直至图1A和1B所示序列第6位丝氨酸(或SEQ ID NO:2中-22位)的一或多个氨基酸残基的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明特别提供了含有SEQIDNO:2的1-m3残基的氨基酸序列的多肽，其中m3是6～174之间的一个整数，且6位是至少为TNF-γ-α的免疫原性活性所需的完整TNF-γ-α多肽C端的第一个残基位。
本发明尤其提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽含有或由图1A和1B所示TNF-γ-α序列的以下残基的氨基酸序列组成(图1A和1B所示TNF-γ-α氨基酸序列与SEQ ID NO:2中所示相同，但二序列间计数方式不同；以下氨基酸残基位数为图1A和1B中位数)，所述残基是
M-1 to L-173；M-1 to F-172；M-1 to A-171；M-1 to G-170；M-1 to F-169；M-1 to F-168；M-1 to T-167；M-1 to K-166；M-1 to D-165；M-1 to F-164；M-1 toK-163；M-1 to T-162；M-1 to Y-161；M-1 to D-160；M-1 to V-159；M-1 to L-158；M-1 to S-157；M-1 to I-156；M-1 to D-155；M-1 to S-154；M-1 to V-153；M-1 toN-152；M-1 to V-151；M-1 to M-150；M-1 to L-149；M-1 to K-148；M-1 to D-147；M-1 to G-146；M-1 to E-145；M-1 to Q-144；M-1 to L-143；M-1 to S-142；M-1 toF-141；M-1 to M-140；M-1 to A-139；M-1 to G-138；M-1 to L-137；M-1 to Y-136；M-1 to I-135；M-1 to P-134；M-1 to Q-133；M-1 to F-132；M-1 to W-131；M-1 toN-130；M-1 to S-129；M-1 to G-128；M-1 to V-127；M-1 to E-126；M-1 to C-125；M-1 to V-124；M-1 to S-123；M-1 to K-122；M-1 to T-121；M-1 to G-120；M-1 toM-119；M-1 to L-118；M-1 to L-117；M-1 to Q-116；M-1 to T-115；M-1 to P-114；M-1 to E-113；M-1 to P-112；M-1 to Y-111；M-1 to S-110；M-1 to D-109；M-1 toT-108；M-1 to V-107；M-1 to K-106；M-1 to T-105；M-1 toI-104；M-1 to V-103；M-1to V-102；M-1 to T-101；M-1 toI-100；M-1 to S-99；M-1 to D-98；M-1 to P-97；M-1to K-96；M-1 to N-95；M-1 to P-94；M-1 to R-93；M-1 to G-92；M-1 to A-91；M-1 toQ-90；M-1 to R-89；M-1 to I-88；M-1 to E-87；M-1 to S-86；M-1 to C-85；M-1 toE-84；M-1 to S-83；M-1 to T-82；M-1 to M-81；M-1 to G-80；M-1 to R-79；M-1 toF-78；M-1 to T-77；M-1 to V-76；M-1 to Q-75；M-1 to S-74；M-1 to Y-73；M-1 toI-72；M-1 to F-71；M-1 to Y-70；M-1 to D-69；M-1 to G-68；M-1 to S-67；M-1 toE-66；M-1 to P-65；M-1 to I-64；M-1 to L-63；M-1 to L-62；M-1 to F-61；M-1 toK-60；M-1 to N-59；M-1 to T-58；M-1 to Y-57；M-1 to N-56；M-1 to M-55；M-1 toR-54；M-1 to N-53；M-1 to K-52；M-1 to T-51；M-1 to F-50；M-1 to A-49；M-1 toL-48；M-1 to G-47；M-1 to L-46；M-1 to E-45；M-1 to H-44；M-1 to E-43；M-1 toW-42；M-1 to H-41；M-1 to L-40；M-1 to A-39；M-1 to P-38；M-1 to F-37；M-1 toQ-36；M-1 to N-35；M-1 to K-34；M-1 to F-33；M-1 to H-32；M-1 to Q-31；M-1 toT-30；M-1 to P-29；M-1 to T-28；M-1 to Q-27；M-1 to R-26；M-1 to V-25；M-1 toV-24；M-1 to P-23；M-1 to F-22；M-1 to V-21；M-1 to L-20；M-1 to F-19；M-1 toL-18；M-1 to I-17；M-1 to L-16；M-1 to K-15；M-1 to R-14；M-1 to M-13；M-1 toP-12；M-1 to F-11；M-1to S-10；M-1 to Y-9；M-1 to V-8；M-1 to K-7；and M-1 to S-6
编码这些多肽的多核苷酸也被提供。
本发明还提供了具有自TNF-γ-α多肽的氨基端和羧基端缺失一或多个氨基酸的多肽，其可被描述为具有SEQ ID NO:2的n3-m3残基，其中n3和m3是如上述的整数。本发明也涵盖了编码这种多肽的多核苷酸。
本发明还提供了具有缺失自SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β氨基酸序列的羧基端直至第6位甘氨酸一或多个氨基酸的多肽，及编码这种多肽的多核苷酸。本发明特别提供了含有SEQ ID NO:20的1-m4氨基酸序列的多肽，其中m4是6-250之间的一个整数，且6位是至少为TNF-γ-β蛋白的免疫原性活性所需的完整TNF-γ-β多肽C端的第一残基位。
本发明更特别地提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽含有或由SEQ ID NO:20所示TNF-γ-β序列的以下残基序列组成M-1 to L-250；M-1 to F-249；M-1 to A-248；M-1 to G-247；M-1 to F-246；M-1 to F-245；M-1 to T-244；M-1 to K-243；M-1 to D-242；M-1 to E-241；M-1 toK-240；M-1 to T-239；M-1 to Y-238；M-1 to D-237；M-1 to V-236；M-1 to L-235；M-1 to S-234；M-1 to I-233；M-1 to D-232；M-1 to S-231；M-1 to V-230；M-1 toN-229；M-1 to V-228；M-1 to M-227；M-1 to L-226；M-1 to K-225；M-1 to D-224；M-1 to G-223；M-1 to E-222；M-1 to Q-221；M-1 to L-220；M-1 to S-219；M-1 toF-218；M-1 to M-217；M-1 to A-216；M-1 to G-215；M-1 to L-214；M-1 to Y-213；M-1 to I-212；M-1 to P-211；M-1 to Q-210；M-1 to F-209；M-1 to W-208；M-1 toN-207；M-1 to S-206；M-1 to G-205；M-1 to V-204；M-1 to E-203；M-1 to C-202；M-1 to V-201；M-1 to S-200；M-1 to K-199；M-1 to T-198；M-1 to G-197；M-1 toM-196；M-1 to L-195；M-1 to L-t94；M-1 to Q-193；M-1 to T-192；M-1 to P-191；M-1 to E-190；M-1 to P-189；M-1 to Y-188；M-1 to S-187；M-1 to D-186；M-1 toT-185；M-1 to V-184；M-1 to K-183；M-1 to T-182；M-1 to I-181；M-1 to V-180；M-1to V-179；M-1 to T-178；M-1 to I-177；M-1 to S-176；M-1 to D-175；M-1 to P-174；M-1 to K-173；M-1 to N-172；M-1 to P-171；M-1 to R-170；M-1 to G-169；M-1 toA-168；M-1 to Q-167；M-1 to R-166；M-1 toI-165；M-1 to E-164；M-1 to S-163；M-1to C-162；M-1 to E-161；M-1 to S-160；M-1 to T-159；M-1 to M-158；M-1 to G-157；M-1 to R-156；M-1 to F-155；M-1 to T-154；M-1 to V-153；M-1to Q152；M-1 toS-151；M-1 to Y-150；M-1 to I-149；M-1 to F-148；M-1 to Y-147；M-1 to D-146；M-1to G-145；M-1 to S-144；M-1 to E-143；M-1 to P-142；M-1 to I-141；M-1 to L-140；M-1 to L-139；M-1 to F-138；M-1 to K-137；M-1 to N-136；M-1 to T-135；M-1 toY-134；M-1 to N-133；M-1 to M-132；M-1 to R-131；M-1 to N-130；M-1 to K-129；M-1 to T-128；M-1 to F-127；M-1 to A-126；M-1 to L-125；M-1 to G-124；M-1 toL-123；M-1 to E-122；M-1 to H-121；M-1 to E-120；M-1 to W-119；M-1 to H-118；M-1 to L-117；M-1 to A-116；M-1 to P-115；M-1 to F-114；M-1 to Q-113；M-1 toN-112；M-1 to K-111；M-1 to F-110；M-1 to H-109；M-1 to Q-108；M-1 to T-107；M-1 to P-106；M-1 to T-105；M-1 to Q-104；M-1 to R-103；M-1 to V-102；M-1 toV-101；M-1 to T-100；M-1 to L-99；M-1 to H-98；M-1 to A-97；M-1 to R-96；M-1 toP-95；M-1 to K-94；M-1 to D-93；M-1 to G-92；M-1 to D-91；M-1 to A-90；M-1 toR-89；M-1 to L-88；M-1 to P-87；M-1 to A-86；M-1 to Y-85；M-1 to V-84；M-1 toQ-83；M-1 to Q-82；M-1 to H-81；M-1 to S-80；M-1 to P-79；M-1 to A-78；M-1 toF-77；M-1 to E-76；M-1 to Q-75；M-1 to G-74；M-1 to K-73；M-1 to L-72；M-1 toA-71；M-1 to Q-70；M-1 to F-69；M-1 to Q-68；M-1 to V-67；M-1 to C-66；M-1 toA-65；M-1 to E-64；M-1 to G-63；M-1 to Q-62；M-1 to A-61；M-1 to R-60；M-1 toL-59；M-1 to Q-58；M-1 to S-57；M-1 to V-56；M-1 to L-55；M-1 to L-54；M-1 toY-53；M-1 to T-52；M-1 to T-51；M-1 to L-50；M-1 to G-49；M-1 to A-48；M-1 toL-47；M-1 to F-46；M-1 to P-45；M-1 to L-44；M-1 to L-43；M-1 to V-42；M-1 toL-41；M-1 to C-40；M-1 to C-39；M-1 to T-38；M-1 to L-37；M-1 to A-36；M-1 toW-35；M-1 to R-34；M-1 to A-33；M-1 to S-32；M-1 to S-31；M-1 to S-30；M-1 toR-29；M-1 to A-28；M-1 to K-27；M-1 to P-26；M-1 to R-25；M-1 to C-24；M-1 toS-23；M-1 to G-22；M-1 to H-21；M-1 to E-20；M-1 to P-19；M-1 to L-18；M-1 toM-17；M-1 to E-16；M-1 to V-15；M-1 to S-14；M-1 to A-13；M-1 to T-12；M-1 toE-11；M-1 to G-10；M-1 to F-9；M-1 to S-8；M-1 to L-7；and M-1 to G-6
本发明也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了具有TNF-γ-β多肽的氨基及羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽，其可具有SEQ ID NO:20的n4-m4残基，其中n4-m4是如上述的整数。本发明也涵盖了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明另一实施方案涉及多肽片段，其含有或由以公式mx-nx所述的氨基酸组成，其中m和n分别相当于上述这些符号代表的任一个氨基酸，x代表任一整数。本发明也涵盖了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的特异的实施方案涉及编码多肽的核苷酸序列，该多肽由包含于ATCC保藏号75927的cDNA克隆编码的完整TNF-γ-α氨基酸序列的一部分组成，其中此部分不包括由ATCC保藏号75927的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列氨基端的1～62位氨基酸，或羧基端1个氨基酸，或缺失以上任何氨基端和羧基端氨基酸的组合。本发明还提供了编码所有以上缺失突变体形式的多肽的多核苷酸。
在另一实施方案中，本发明涉及编码多肽的核苷酸序列，该多肽由包含于ATCC保藏号203055的cDNA克隆编码的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分组成，其中此部分不包括由ATCC保藏号203055的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的1～134位氨基酸，或一些数目的氨基端氨基酸(其中所述的数选自1～134)，或羧基端大约1个氨基酸，或任何氨基端和羧基端缺失的氨基酸。本发明还涵盖了编码所有以上多肽的多核苷酸。
本发明还提供了分离的TNF-γ多肽，其所含的氨基酸序列选自以下一组(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全长TNF-γ-α多肽的氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27～147位)；(b)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全长TNF-γ-α多肽的氨基酸序列，但无N端甲硫氨酸(即SEQ ID NO:2的26～147位)；(c)具有SEQ ID NO:2中1-147位氨基酸序列的成熟TNF-γ-α多肽的氨基酸序列；(d)由保藏在ATCC保藏号No.75927的cDNA克隆HUVEO91编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC中保藏号No.75927的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列，但无N端甲硫氨酸；(f)由ATCC保藏号No.75927的cDNA克隆HUVEO91编码的预测的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列。本发明的多肽还包括具有与上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)序列至少70％,80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，及其片段。
本发明还提供了分离的TNF-γ多肽，其所含的氨基酸序列选自以下一组(a)具有SEQ ID NO:20所示完整氨基酸序列的全长TNF-γ-β多肽的氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1～251位)；(b)具有SEQ ID NO:20所示完整氨基酸序列的全长TNF-γ-β多肽的氨基酸序列，但无N端甲硫氨酸(即SEQ ID NO:20的2～251位)；(c)具有SEQ ID NO:20的62-251位氨基酸序列的成熟TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号No.203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号No.203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的完整氨基酸序列，但无N端甲硫氨酸；(f)由ATCC保藏号No.203055的cDNA克隆编码的预测的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列。本发明的多肽还包括具有与上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)序列存在至少70％,80％，优选至少90％，更优选至少95％,96％,97％,98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，及其片段。这些多肽长度至少为10个，15个，20个，25个，30个，优选至少50个氨基酸。
对于一个多肽，其所含的氨基酸序列与参照的TNF-γ多肽的氨基酸序列具有例如至少95％的“相同性”是指，除了相对于每100个参照的TNF-γ多肽的氨基酸序列之中该序列最多包含5个氨基酸变化之外，该多肽的氨基酸序列与参照序列是相同的。换言之，为了获得与参照序列95％相同性的一个多肽，在参照序列上最多5％的氨基酸可以缺失或用其它氨基酸取代，或者在参照序列上可以插入最多5％的氨基酸。这些在参照序列上的突变可以发生在参照的氨基酸序列的氨基端或羧基端，或位于两末端之间的任何位置，可以是在参照序列的氨基酸间各自分散的，或者在参照序列上呈连续的一组或多组。
在实际当中，任一特定的多肽与例如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或保藏的cDNA克隆HUVEO91编码的氨基酸序列是否具有至少95％,96％,97％,98％或99％的相同性，可以方便地利用已知的计算机程序来确定，如Bestfit程序，(Wisconsin序列分析包，Unix系统第8版，遗传学计算机小组，University Resarch Park,575Science Drive,Madison,WI53711)。Bestfit或者其他任何序列比对程序来确定某一序列是否与本发明的参照序列具有至少，例如95％的相同性，需要设置好参数，从而在全长的参照氨基酸序列上计算相同性的百分比，并允许最高达参照序列的氨基酸总数5％的同源性缺口。
确定参照(查询)序列(本发明的序列)和一个目的序列之间的最佳全局匹配，也称全局序列比对，的一个优选的方法可以利用基于Brutlag等(计算机应用生物科学，6:237-2451(1990))的算法FASTDB计算机程序。序列比对中查询序列和目的序列都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所说的全局序列比对的结果以相同性百分比表示。进行氨基酸序列的FASTDB比对以计算相同性百分比时优选的参数为Matrix=PAM0,k-tuple=2,Mismatch Penalty=1,Joining Penalty=20,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=1,Window Size=序列长度，Gap Penalty=5,Gap Size Penalty=0.05,WindowSize=500或者目标核苷酸序列的长度，取较短的。根据这一实施方案如果目的序列因N-或者C-端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正。这是因为FASTDB程序在计算全局相同性百分比时不计算目的序列N-或C-端的短缺。对于目的序列相对于查询序列在N-或C-端的短缺，百分比相同性的修正是通过计算不匹配的位于目的序列N-或C-端的查询序列的残基数，以作为查询序列总数的百分比。一个残基是否匹配通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后将此百分数从FASTDB序列比对中所显示出的相同性百分比中减去，从而获得最终的相同性百分比结果。此修正的结果才可用于本发明。只有在目的序列N-或C-端不与查询序列相匹配的残基，才被计算用以手工调节相同性百分比结果。就是说，只有目的序列的最外端的N-或C-端残基之外的查询残基才需要调节。例如，一个90个氨基酸残基的目的序列与一个100个氨基酸残基的查询序列比对以确定查分比相同性。缺失发生于目的序列的N末端，因此，FASTDB比对不显示出N端前10个残基的匹配。这10个不匹配的残基相当于序列的10％(N-或C-端不匹配的残基数/查询序列中的残基总数)，因而从FASTDB程序计算的百分比相同性中减去这10％。如果剩余的90个残基都完全匹配，那么最终的百分比相同性就是90％。再例如，一个90个残基的目的序列与一个100个残基的查询序列相比较。这时的缺失是内部缺失，因而目的序列的N-或C-端残基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的百分比相同性不需要手工修正。再强调一次，只有目的序列的N-或C-端残基与查询序列不匹配的才需手工修正。对比本发明不需要进行其他的手工修正。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:20的多肽(尤其成熟多肽)，以及与SEQ ID NO:2的多肽具有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相似性(更优选相同性)的多肽，也包括这种多肽的一部分，这部分一般含有至少30个优选至少50个氨基酸。
本发明的多肽还包括SEQ ID NO:20的多肽(尤其该肽的胞外结构域)，以及与SEQ ID NO:20的多肽具有至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相似性(更优选相同性)的多肽，也包括这种多肽的一部分，这部分一般含有至少30个优选至少50个氨基酸。
本发明的其它多肽包括与本文所述多肽具有至少70％,90％，优选至少95％相似性，更优选至少96％,97％,98％或99％相似性的多肽。本发明的多肽还包括与本文所述多肽具有至少70％,80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％,97％,98％或99％相同性的多肽。在特异的实施方案中，这种多肽包含至少30个优选至少50个氨基酸。
如本领域已知两多肽间的“相似性”通过对比氨基酸序列及一个多肽对另一个多肽序列的保守氨基酸置换来确定。两个序列的“相似性百分比”是指用Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer,Group,University ResearchPark,575 Science Drive,Madison,WI 53711)及确定相似性设定的缺省参数，对比两个多肽的氨基酸序列而产生的相似性范围。Bestfits用Smith和Waterman的局部同源程序以发现两序列间最相似的节段。
本发明的TNF-γ-α和TNF-γ-β多肽可以是单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体及更大的多聚体)。在另外的实施方案中，本发明的多聚体至少是二聚体、三聚体或四聚体。
本发明所涉及的多聚体可以是同聚体或异聚体。本文这里所使用的“同聚体”术语，是指仅含有本发明的TNF-γ多肽(包括本文这里所述的TNF-γ片段，变异体，不同的剪接产物和融合蛋白)。这里同聚体为含有相同或不同的氨基酸序列的TNF-γ多肽。在一个特殊的实例中，本发明的一个同聚体为一个仅含有TNF-γ多肽的多聚休，后者含有相同的氨基酸序列。在另一个特殊的实例中，本发明的一个同聚体为一个含有TNF-γ多肽的多聚体，而后者含有不同的氨基酸序列。在特殊的实例中，本发明的多聚体为一同源二聚体(例如，含有相同或不同的氨基酸序列的TNF-γ多肽)或一同源三聚体(如，含有相同或不同的氨基酸序列的TNF-γ多肽)。在另外的实例中，本发明的同聚多聚体至少应是一个同源二聚体，同源三聚体或同源四聚体。
“异聚体”这一术语，在本文是指一个除含有本发明的TNF-γ多肽外，还含有一个或多个异源性多肽的多聚体(即不同的蛋白多肽)。在一个特殊的实例中，本发明的多聚体为异源二聚体，异源三聚体，或异源四聚体。在另外的实例中，本发明的同源多聚体至少为一个同源二聚体，同源三聚体，或同源四聚体。
本发明的多聚体是由亲水、疏水、离子和/或共价连接和/或间接连接，例如通过脂质体的形成。因此，在一个实施例中，本发明的多聚体，如，同源多聚体或异源多聚体在本发明的多肽在溶液中与另一个分子接触时，就可以形成多聚体。在另一个实施例中，本发明的异源多聚体，例如，在溶液中，本发明的多肽与此肽的抗体接触(包括针对本发明的融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)就可以形成异源三聚体或四聚体。在另外一些实施例中，本发明的多聚体可以通过与和/或在本发明的TNF-γ-α和TNF-γ-β多肽之间的共价相互作用形成。这些共价相互作用包括一个或多个存在于该多肽内的氨基酸残基(如，引自SEQ IDNO:_或SEQ IDNO:_，或相应于由保藏克隆所编码一或多个氨基酸残基)。涉及一个或多个存在于TNF-γ-α和TNF-γ-β融合蛋白的异源多肽序列中的氨基酸残基，例如本发明的一个TNF-γ-α-Fc融合蛋白所含的异源序列，以及与来自另一个TNF家族的配体/受体家族成员的异源多肽序列融合体所含的异源序列，其能够形成共价连接的多聚体，例如osteroprotegetin。
本发明还涉及融合蛋白，其中全长TNF-γ多肽或其片段、变体，衍生物或类似物与不相关的蛋白质融合。本发明的融合蛋白可直接将TNF-γ多肽(或其片段、变体、衍生物或类似物)与一同源序列融合而构建，或可用具有一或多个氨基酸的间隔区或衔接子区插入蛋白质的两部分之间而构建。任选地，此间隔区可编码蛋白酶切割位点。融合物的精确位点不是关键的并可常规改变，以使同源和/或异源序列的结合性和/或生物活性最大化。本发明的融合蛋白基于本文所述TNF-γ核苷酸及多肽序列可常规设计。例如，本领域技术人员将意味到，本文所述的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽及其片段(包括具有表位的片段)可与免疫球蛋白(IgG)的恒定区的一部分组合，产生嵌合(融合)多肽。这些融合蛋白质有利于纯化，并在体内表现出半衰期延长。现已示出例如嵌合蛋白由人CD4-多肽的前两个区域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链上恒定区的不同结构域组成(EPA394827,Traunecker等，自然331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白还可在结合及中和其它分子的过程中比单体的TNF-γ蛋白或其片段更为有效(Fountoulakis等，生物化学杂志270:3958-3964(1995))。例如，如上所述已产生了这种TNF-γ-Fc融合物。在另一实施方案中，全长TNF-γ多肽或其片段，变体、衍生物或类似物融合有一或多个其它异源多肽序列，该序列能形成多聚体结构例如Osteoprotegrin的二聚体结构域(见如EP0721983，美国专利No.5478925，及国际公开WO98/49305，均并入参考)。本发明涉及的其它TNF-γ融合蛋白例如包括但非限于TNF-γ多肽序列与使融合蛋白在细胞表面展示的任何氨基酸序列的融合体；或与提供标记功能的酶，荧光蛋白或发光蛋白融合的融合体。
本发明还涉及嵌合OPG多肽的修饰，并包括翻译后修饰，例如包括N-连接或O-连接的糖链，N末端或C末端的加工处理，化学小分子粘附于氨基酸的骨架上，N-或O-连接糖链的化学修饰，以及原核生物宿主细胞表达后，添加或去除N末端的甲硫氨酸残基。多肽还可以用检测标记进行修饰，例如酶，荧光，同位素或亲和标记，用于蛋白质的检测和分离。
本发明还提供了化学修饰的OPG的衍生物，它具有其他优点，如多肽的溶解性、稳定性和循环时间均增高，或免疫原性降低(见美国专利第4179337号)。用于衍生的化学基元可以选自水溶性的聚合物，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯乙醇等。多肽可以在分子内任何位点进行随机修饰，或在分子内预定的位点进行修饰，多肽分子可包括一个、两个、三个或多个粘附的化学基元。
聚合物可以有任何大小的分子量，并且可以有侧链，也可以没有侧链。对聚乙二醇而言，优选的分子量在约1kD到100kD之间(“大约”一词表明在聚乙二醇制剂中，有些分子比所说的分子量重，有些则轻些)，以易于处理和制备。也可使用其他大小的分子，要根据治疗方案而定(如要求持续释放的时程，效应，如果有的话，取决于生物学活性，易于操作，抗原性的大小或缺失，以及其他已知的聚乙二醇对某种治疗性蛋白或蛋白类似物的效应)。
聚乙二醇分子(或其他化学基元)应当与蛋白质结合，应当考虑到对蛋白质的功能或抗原性结构域的影响。对本领域熟练的技术人员而言，有许多结合方法，如EP0401384，本文引入作参考(PEG与G-CSF偶联)，还可以参见Malik等，实验血液学，1992,20:1028-1035(用tresyl chloride对GM-CSF的pegylation)。例如，聚乙二醇可以与氨基酸残基上的反应基团共价结合，例如游离的氨基或羧基。反应基团是那些活化的聚乙二醇可与结合的分子。带有游离的氨基的氨基酸残基，包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；带有游离羧基的氨基酸包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。硫氢基团也可以作为附着聚乙二醇分子的反应基团。治疗应用时优选的是附着在氨基，如附着在N末端或赖氨酸基团上。
人们特别希望在蛋白质N末端进行化学修饰。聚乙二醇作为本发明组合物的实例，可以从各种不同的聚乙二醇分子中进行挑选(根据分子量，侧链，等)，反应混合物中，聚乙二醇与蛋白质(或多肽)分子的比例，所进行的pegylation反应类型，以及获得选择的N端pegylated蛋白质分子的方法。获得N端pegylated制备物的方法(即必要时，就将这种基元与其他monopegylated基元分离开)为通过把N末端pegylated材料从大量的.pegylated分子中纯化出来。那些在N端发生化学修饰的选择性蛋白质是通过还原烷基化实现的，还原烷基化为检测不同原始氨基基团的类型(赖氨酸比N末端)的差异反应性，其用于特异蛋白质的衍化。在适当的反应条件下，可以有选择性的获得蛋白质的衍生物，这类蛋白质为N末端携带含羰基的聚合物。
本发明多肽的用途包括非限于根据本领域技术人员熟知的方法用作SDS-DAGE凝胶上或分子筛凝胶过滤柱上的分子量标记。
功能活性TNF-γ多肽及其片段、变体、衍生物及类似物的功能活性可通过各种方法分析。
例如，在一个实施方案中分析其结合或与全长TNF-γ多肽竞争结合抗TNF-γ抗体的能力，可使用各种已知免疫分析，包括但非限于用如放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫放射分析，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散分析，原位免疫分析(例如用胶体金，酶或放射性同位素)，western印迹，沉淀反应，凝集分析(如凝胶凝集分析，血凝分析)，补体固定分析，免疫荧光分析，A蛋白分析及免疫电泳分析等技术的竞争及非竞争分析。在一实施方案中，通过检测一级抗体上的标记检测抗体结合。在另一实施方案中，通过检测二级抗体或试剂与一级抗体的结合而检测一级抗体。在另一实施方案中二级抗体是标记的。本领域已知许多检测免疫分析中结合的方法，并包含在本发明范围内。
在另一实施方案中，其中TNF-配体被鉴别，例如可通过本领域熟知方法分析结合。在另一实施方案中，可分析TNF-γ结合其底物的生理相关性(信号转导)。
另外，本文所述的分析(见实施例5,6和9～15)及其它本领域已知方法可常规用于测定TNF-γ多肽及其片段，变体和衍生物引发TNF-γ相关的生物活性(如体外或体内抑制或促进细胞增殖，肿瘤形成，血管生成，NF-kB激活及细胞粘附)的能力。
本领域技术人员已知其它方法，并也包含于本发明内。
抗体本发明还进一步与抗体和T细胞抗原受体(TCR)有关，它们可特异地与本发明的多肽结合。本发明的抗体包括IgG(包括IgG1,IgG2,IgG4),IgA(包括IgA1和IgA2),IgD,IgE，或IgM和IgY。本文这里所使用的“抗体”(Ab)这一术语包括所有抗体，包括单链的完整抗体，及其可以结合抗原的片段。本发明中最优选的抗体是结合人抗原的抗体片段，包括，但不仅限于，Fab、Fab’和F(ab’)2、、Fd、单链Fvs(scFV)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH的结构域的片段。抗体可来自任何动物，包括鸟类和哺乳动物。最常见的抗体是人，鼠，免子，山羊，鼠，骆驼，马或鸡来源的。
结合抗原的抗体片段，包括单链抗体，可以仅含有可变区或可以与以下全部或部分成分结合:铰链区，CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区与铰链区，CH1,CH2,CH3结构域的任何组合。本发明还包括嵌合的，人源化的和人单克隆抗体和多克隆抗体，它们可以特异地结合本发明的多肽。本发明还包括抗本发明抗体的独特型抗体。
本发明的抗体可以是单特异的，双特异的，三特异的或具有更多的特异性。多特异性的抗体可以是对本发明多肽的不同的表位具有特异性，或可以对本发明的多肽和异源性组合物如异源性多肽或固相物质均特异。见，如WO93/17715；WO92/08802:WO91/00360；WO92/05793；Tutt.A等，免疫学杂志，1991,147:60-69；美国专利5573920,4474893,5601819,4714681。4925648；Kostelny,S.A.等，免疫学杂志1992,48:547-1553。
本发明的抗体可以根据本发明的多肽的表位或部分进行描述或分类，这些表位或部分可被抗体特异性地结合或识别。表位或多肽的部分可按本文所述进行分类，如通过N末端和C末端的位置，连续的按基酸残基的大小，或图表中所列出的。可以特异地结合任何表位或本发明多肽的抗体也可被排除。因此，本发明包括可特异结本发明多肽的抗体，并且进行同样的排除。
本发明的抗体还可以根据它们的交叉活性进行描述或分类。还包括那些不与本发明多肽的其他任何类似物，同源物(ortholog)或同源物结合的抗体。不与与本发明多肽的同源性分别低于95％、90％85％,80％,75％,70％,65％,60％,55％,50％(根据本领域所熟知的方法和本文所述的方法进行计算)的多肽结合的抗体也包含在本发明中。本发明还包含的抗体是那些只结合由这样多核苷酸序列编码的多肽，该多核苷酸序列在严格的杂交条件下(如本文所述)，与本发明的多核苷酸序列发生杂交。本发明的抗体还可以根据它们的结合的亲和性进行描述或分类。优选的亲和性包括那些解离常数或Kd小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M。
本发明的抗体具有以下用途，包括但不仅限于，本领域所熟知的对本发明多肽进行纯化，检测和定位的方法，包括体内和体外的诊断和治疗方法。例如，抗体可用于免疫分析，用于定量和定性地检测生物样本中本发明的多肽的水平。见，例如，Harlow，等，抗体实验指南，冷泉港实验室出版社，第二版，1988(引入本文作参考文献)。
本发明的抗体可单独应用或与其他组合物联用。抗体还可与一异源多肽在N-或C-末端重组融合，或与肽或其他组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本发明的抗体可与在诊断分析中用作标记的分子和效应分子如异源多肽、药物或毒素重组融合或缀合。例如见WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；US专利5314995和EP 0396387。
本发明的抗体可用本领域已知的任何合适方法制备，例如本发明的多肽或其抗原性片段可给予一动物以诱导产生含多克隆抗体的血清。单克隆抗体可用本领域已知的各种技术如杂交瘤和重组技术制备。例如见Harlow等，抗体实验手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(所述文献引入本文作参考)。
Fab和F(ab′)2可通过用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或菠萝蛋白酶(产生F(ab′)2片段)经蛋白酶裂解而产生。
或者，本发明的抗体可经重组DNA技术或本领域已知的方法经合成化学产生。例如，本发明的抗体可用本领域已知的各种噬菌体展示技术产生。在噬菌体展示方法中，有功能的抗体结构域在携带编码其的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面展示。从组合抗体文库(如人或小鼠)经用抗原、典型地与固体表面或珠结合或被捕获的抗原直接选择而选择具有所需结合性的噬菌体。用于这些方法中的噬菌体典型地是丝状噬菌体包括fd和M13,Fab,Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域与噬菌体基因Ⅲ或基因Ⅷ蛋白重组融合。可用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的例子包括如下文献所述的那些方法，Brinkman U.等(1995)，免疫学方法182:41-50；Ames,R.S.等(1995)，免疫学方法184:177-186；Kettleborough,C.A.等(1994)欧洲免疫学杂志24:952-958；Persic,L.等(1997)基因187:9-18；Burton,D.R.等(1994)免疫学进展57:191-280；PCT/GB91/01134；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401和美国专利5,698,426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908,5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637,5,780,225,5,658,727和5,733,743(所有文献引入本文作参考)。
如上述参考文献所述，在噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生全抗体，包括人抗体，或任何其他所需的抗原结合片段，并在任何希望的宿主中表达，如哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌。例如，用本领域已知的方法，如WO92/22324；Mullinax,R.L等(1992)生物技术12(6):864-869；和Sawai,H.等(1995)AJRI34:26-34和Better,M.等(1988)科学240:1041-1043(所有文献均引入本文作参考)所述的方法，也可采用重组产生Fab,Fab′和F(ab′)2片段的技术。
用于合成单链Fvs的抗体的技术的例子包括以下文献中所述美国专利4946778和5258498；Huston，等，酶学方法，1991,203:46-88；Shu,L，等，美国科学院研究进展，1993,90:7995-7999；和Skerrra,A，等，科学，1988,240:1038-1040。为了某些用途，包括在人的体内使用抗体和用于体外的检测，优先使用嵌合，人源化的或人的抗体。用于合成嵌合抗体的方法，本领域的技术人员非常熟悉。见，如Morrison，科学，1985,229:1202；Oi等，生物技术，1986,4:214；Gillies,D.D.，等，免疫学方法杂志，1989,125:191-202；和美国专利5807715。可应用各种技术对抗体进行人源化，包括CDR移植(EP0239400；WO91/09967；美国专利5530101；和5585089)，镶面技术或重新布置技术(EP0592106,EP0519596；PadlanE.A.，分子免疫学，1991,28(4/5):489-498；StudnickaG.M.等，蛋白质工程，1994,7(6):805-814；RouguskaM.A.等，美国科学院研究进展，1994,91:969-973和链重排技术(美国专利5565332)。人类的抗体可以通过本领域所知的许多方法进行合成，包括上述的噬菌体展示技术。还可见美国专利4444887,4716111,5545806和5814318；98/46645(以其全文作为参考文献)。
本发明还包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价连接)的本发明的多肽的抗体。抗体可对非本发明多肽的抗原是特异的。例如，通过本发明的多肽与可以特异结合细胞表面的受体的抗体进行融合或缀合的方法，抗体可用以与体内或体外的特异类型细胞中的本发明的多肽靶向性地结合。与本发明多肽的融合或缀合的抗体还可以用于本领域所熟知的体外的免疫检测方法和纯化技术。见，例如Harbor，等，同上述和WO93/21232；EP0439095；Naramura,M，等，免疫学通信，1994,39:91-99；美国专利，5475981；Gillies,S.O.等，美国科学院研究进展，1991,89:1428-1432,Fell,H.P.等，免疫学杂志，1991,146:2446-2454(以其全文作为参考文献)。
本发明还包括含有与不是可变区的抗体的结构域重组融合或化学缀合的本发明多肽的组合物。例如，本发明的多肽可以与抗体的Fc区或Fc区的部分进行融合或缀合。与本发明的多肽融合的抗体部分含有绞链区，CH1,CH2,CH3结构域或所有结构域或其部分的任何组合。本发明的多肽还可以与上述的抗体部分进行融合或缀合，以提高多肽在体内的半衰期或用于本领域所熟知的免疫检测方法。多肽还可以与上述的抗体部分进行融合或缀合形成聚合物。例如，与本发明的多肽进行融合的Fc片段，应用Fc的片段之间的二硫键形成二聚体。通过多肽与IgA和IgM中的部分融合，形成高级的多聚体。用于本发明的多肽与抗体的部分进行融合或缀合的方法，为本领域所熟知的。见，例如，美国专利，5336603,56229229,5359046,5349053,5447851,5112946；EP367166；WO96、04388,WO91/06570；Ashkenazi,A，等，美国科学院研究进展，1991,88:10535-10569；Zheng,X.X.，等，免疫学杂志，1995,154:5590-5600；和Vil,H，等，美国科学院研究进展有，1992,89:11337-11341(上述参考文献附此供参考)。
本发明还与作为本发明多肽兴奋剂或拮抗剂的抗体有关。例如，本发明包括完全或部分抑制受体/配体与本发明多肽相互作用抗体。包括受体特异的抗体和配体特异的抗体。还包括不能抑制配体结合但可抑制受体激活的受体的特异抗体。受体的激活(即信号转导)可以通过本文所述的方法或本领域所熟知的其他方法来确定。还包括既可抑制结合配体又可以抑制受体激活的受体特异的抗体。同样地，还包括可以结合配体，并能抑制配体与受体的的结合的中和性抗体，以及结合配体的抗体，因此，可以抑制受体的活化，但是不能抑制配体与受体的结合。还包括可以激活受体的抗体。这些抗体可以作为兴奋剂，在配体-受体的活化过程中，完全发挥或部分发挥其生物学活性。作为具有生物学活性(包括本文所阐述的特异的活性)的兴奋剂或拮抗剂的抗体可以是特异的。上述抗体的兴奋剂应用本领域所熟知的方法进行合成。见，例如，WO96/40281；美国专利5811097；Deng,B，等，血液，1998,92(2):1981-1988；Chen,Z，等，癌症研究，1998,58(16)；3668-3578；Harrop,J.A.，等，免疫学杂志，1998,161(4):1786-1794；Zhu,Z，等，癌症研究，1998,58(15):3209-3214；Yoon,D.Y.等，免疫学杂志，1998,160(7):3170-3179；Prat,M，等，细胞科学杂志，1998,111(pt2):237-247；Pitard,V，等，免疫学方法杂志，1997,205(2):177-190；Liautard,J，等，细胞因子，1997,9(4):233-241；Carlson,N.C.，等，生物化学杂志，272(17):11295-11307；Taryman,R.E.，等，神经元，199514(4):755-762；Muller,Y.A.，等，结构，1988,6(9):1153-1167；Bartunek,P，等，细胞因子，1996,8(6):14-20(上述参考文献附此供参考)。
转基因本发明多肽也可在转基因动物中被表达。任何一种动物，包括但不仅限于，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、母牛及非人的灵长类如狒狒、猴子和黑猩猩可用于构建转基因动物。在特殊的实施例中，作为一个基因治疗方案的一部分，本文所描述的或其它本领域中熟知的技术被用于在人体中表达本发明的多肽。
任何本领域中熟知的技术均可用于将转基因(例如，本发明中的多核苷酸)引入动物体内以产生转基因动物的始祖系。这些技术包括但不仅限于，前核微注射(Patersoil et al.，应用微生物技术，40:691-698(1994)；Carver et al.，生物技术(纽约，NY)11:1263-1270(1993):Wright et al.，生物技术(纽约，NY)9:830-834(1991):Hoppe et al.，美国专利第4873191号(1989))逆转录病毒介导的将基因转移至干细胞系(Van der Putten et al.，美国科学院研究进展，82:6164-6152(1985))胚囊或胚胎；基因靶向至胚胎于细胞中(Thompson et al.，细胞，56:313～321(1989))细胞或胚胎的电穿孔(Lo,1983，分子细胞生物学，3:1803～1814(1983))用基因枪将本发明中的多核苷酸导入法(见例，Ulmeretal.，科学，259:1745(1993))；将核酸构建产物导入胚胎多能干细胞并将干细胞转回至胚囊中；精子介导的基因转移(Lavitrano et al.，细胞，57:717～723(1989))等等。对这类技术的回顾，参见Gordon，“转基冈动物”国际细胞学综述115:171～229(1989)，附此可供参考。
任何本领域中熟知的技术均可用于产生含有本发明的多核苷酸的转基因克隆，例如，将来自于被培养诱导至静止期的胚胎，胎儿，或成熟细胞的细胞核移植入去核的卵母细胞中(Canlpell et al.，自然，380:64～66(1996)；Wilmut et al.，自然385:810～813(1997))。
本发明提供了所有细胞均携带有转基因的转基因动物，也有部分而不是全部细胞携带有转基因的动物，例如镶嵌型和嵌合体动物。转基因可以以单个转基因的形式也可以多拷贝的形式如在多联体中头-头串联或头-尾串联形式被整合。转基因也可按下面的方法被选择性地引入特定的细胞类型中并被激活，例如Lasko等的讲义(Lasko et al.，美国科学院研究进展89:6232～6236(1992))。这种细胞类型特异性激活所需的调控序列视目的特定细胞类型而定并可见于本领域的常用技术中。当希望该多核苷酸转基因被整合入染色体的内源基因位点时，推荐采用基因导向技术。简单地说，当这种技术被应用时，为通过与染色体序列的同源重组而整合入并破坏内源基因核苷酸序列的功能，设计了含有与内源基因同源的核苷酸序列的载体。转基因可按照下面的方法被选择性地引入一种特定的细胞类型，从而仅在该类型细胞中使内源性基因失活，例如Gu的讲义(Gu et al.，科学，265:103-106(1994))，这种细胞类型特异性的失活所需的调控序列视目的特定细胞类型而定并可见于本领域的常用技术中。
一旦产生出转基因动物，可用标准技术来测定重组基因的表达。起始检测可通过Southern印迹斑点杂交分析和PCR技术来分析动物组织以确定发生了转基因的整合。转基因动物组织中转基因的mRNA表达水平可用下列技术确定，这些技术包括但不仅限于，对来自于动物的组织样品的Northern印迹杂交分析，原位杂交分析，逆转录-PCR(rt-PCR)。转基因的基因表达组织样品也可用特异性的转基因产物的抗体进行免疫细胞化学或免疫组化分析。
一旦产生了原始的动物模型，即可进行繁殖、自交，远系繁殖或杂交以产生特定动物的克隆系，类似的繁殖策略包括但不仅限于，将原始动物模型同超过一种整合位点的动物进行远系杂交以建立不同的种系；不同种系的自交以产生复合的转基因动物，由于每个转基因表达的添加效应可更高水平地表达转基因；杂合转基因动物之间的杂交以产生给定位点上的杂种动物不但可以增加表达也可以避免进行DNA分析来筛选动物，不同种系之间的杂交以产生复合的杂合系和纯合系；繁殖动物以将转基因置于一个独特的适用于感兴趣的实验模型的背景中。
本发明的转基因和“敲除”动物的应用包括但不仅限于，用于阐述TNF-γ多肽生物功能的动物模型系统，研究与TNF-γ表达异常相关的病情和/或病症，以及筛查能有效改善这些病情和/或病症的化合物。
也可以通过利用靶向同源重组的方法失活或“敲除”TNF-γ基因和/或其启动子以降低内源性基因的表达(例如，见Smithies etal.，自然，217:230～234(1985)；Thomas&Capecchi，细胞，51:503～512(1987)；Thompson et al.，细胞，5:313-321(1989)；各文献附此可供参考)，例如，可采用本发明中的一个突变，无功能的多核苷酸(或一个完全无关的DNA序列)其两侧同与内源性多核苷酸序列同源的DNA相连(可以是基因的编码区或调控区域)，带有或不带有选择性标记和/或阴性选择标记，来转染可体内表达本发明多肽的细胞。在另一个实施例中，采用本领域熟知的技术产生含有但不表达目的基因的敲除细胞。通过靶向同源重组的DNA构建产物插入导致靶基因的失活。这些方法特别适用于研究及农业领域，在这些领域中胚胎干细胞可被用于产生带有失活靶基因的动物后代(例如，见Thomas&Capecchi 1987以及Thompson 1989,supra)。然而，如果利用适当的本领域技术中所常见的病毒载体将重组DNA构建体在体内引导或导向至所需位点，可将此方法进行常规改进以用于人体。
在本发明的其它实施方案中，将经遗传改造以表达本发明的多肽的细胞或经遗传改造后不表达本发明多肽的细胞(例如，敲除)经体内法导入患者。这类细胞可来源于患者(如，动物，包括人)或一个MHC相容的供体且包括但不仅限于成纤维细胞，骨髓细胞，血细胞(例如，淋巴细胞)，脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞等。采用重组DNA技术将本发明多肽的编码序列引入细胞内，也可以破坏编码序列和/或内源的与本发明多肽相关的调控序列对细胞进行遗传改造，例如，通过转导(用病毒载体，最好是将转基因整合至细胞基因组的载体)或转染过程，包括但不仅限于，利用质粒，粘粒，酵母人工染色体(YACs)、裸露的DNA，电穿孔，脂质体等。本发明多肽可被置于强的组成性或可诱导启动子或启动子/增强子的控制之下以进行表达，最好是分泌本发明多肽。表达且最好能分泌本发明多肽的经改造的细胞可被系统地引入病人体内，例如，在循环系统中或腹膜内。另一种选择是，可将细胞混入基质中并移植到机体内，例如，经遗传改造的成纤维细胞能作为皮肤移植物的一部分被移植到体内，经遗传改造的内皮细胞可作为淋巴管或血管移被移植到体内，经遗传改造的内皮细胞可作为淋巴管或血管移植物的-部分被移植。(见，例如，Anderson et al.，美国专利第5399349号；及Mulligan&Wilson，美国专利第5460959号；各文献附此可供参考)当被引入细胞为非自体型或非MHC相容细胞时，可用熟知的能防止宿主发展对导入细胞的免疫反应的技术将其引入。例如，可将细胞以胶囊化形式引入，该形式可允许同直接接触的胞外环境进行成分交换，但不会使被引入的细胞被宿主的免疫系统所识别。
免疫及循环系统相关疾病诊断本发明人已揭示TNF-γ在人脐静脉内皮细胞、诱导的内皮细胞、巨噬细胞及substantia nigra组织中表达。对许多免疫及循环系统相关疾病而言，可以检测在取自这种疾病患者的免疫及循环系统组织或其它细胞或体液(如血清，血浆，尿液，滑液或脑脊液)中，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表达水平与“标准”TNF-γ-α和/或TNF-γ一β基因表达水平相比照是增高还是降低，“标准”水平是TNF-γ-α或TNF-γ-β在没有免疫及循环系统疾病的个体的免疫及循环系统组织或体液中的基因表达水平。因此，本发明提供了一种用于诊断免疫及循环系统疾病的方法，包括测定编码TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的基因在个体免疫及循环系统组织或其它细胞或体液中的表达水平，并将其与标准TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表达水平相对比，此基因表达水平的增高或降低表示患有免疫及循环系统疾病。
尤其地，据信，患有免疫及循环系统癌症的哺乳动物的一些组织中，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白及编码TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的mRNA的表达水平与相应的“标准”水平相比时明显降低。另外，据信在患有这种癌症的哺乳动物的体液(如血清，血浆，尿液及脑脊液)中检测中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的表达水平，比在相同种类未患癌症的哺乳动物的血清中表达水平要增强。
因此，本发明提供了用于诊断免疫及循环系统疾病，包括这些系统的癌症的一种诊断方法，包括测定编码TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的的基因在个体免疫及循环系统组织或其它细胞或体液中的表达水平，并将之与标准TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表达水平相对比，此基因表达水平的增高或降低表示患有免疫及循环系统疾病。
当诊断免疫及循环系统疾病包括肿瘤的方法已根据常规方法制定时，本发明是用作预测指示剂，从而呈现TNF-γ-α和/或TNF-γ-β基因表达降低的患者比基因表达水平接近正常水平的患者临床后果更严重。
“分析编码TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的基因的表达水平”是指对TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白或编码TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的mRNA在第一个生物样本中的表达水平，进行直接(如通过确定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或间接(如通过与在第二个生物样本中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白或mRNA水平相对比)地定性或定量测定或估计。优选地，在第一个生物样本中测定或估计TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白水平或mRNA水平，并与标准水平相对比，标准水平是在取自在未患免疫及循环系统疾病的个体的生物样本中确定的平均水平。本领域人员应意识到，一旦已知标准TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的水平或mRNA水平，其可重复地用作对照标准。
“生物样本”是指得自含有TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白或mRNA的个体，体液，细胞系，组织培养物或其它源料的生物样本。如所示的，生物样本包括含有游离TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的体液(如血清、血浆、尿液、滑液及脑脊液)，表达完整或成熟TNF-γ-α和/或TNF-γ-β或TNF-γ-α和/或TNF-γ-β受体的免疫及循环系统组织及其它组织源料。本领域熟知从哺乳动物获取活组织及体液的方法。如果生物样本包括mRNA，则活检组织是优选的。
总细胞RNA可用任何适当技术从生物样本中分离，如Chomczynski及Sacchi所述一步硫氰酸胍-苯酚-氯仿法(生物化学分析162:156-159(1987))。编码TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的mRNA水平然后用任何适当方法分析。这些方法包括Northern印迹分析，S1核酸酶作图，聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应，及逆转录连接酶链反应。
分析TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白在生物样本中的水平可用基于抗体的技术进行。例如，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白在组织中表达可用分类免疫组织学方法进行研究(Jalkanen,M.等，细胞生物学杂志101:976-985(1985)；Jalkanen,M.等，细胞生物学杂志105:3087-3096(1987))。其它基于抗体的用于检测TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白基因表达的方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。本领域已知适当的抗体分析，并包括酶标记如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素如碘(125I,121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(112In)及(99mTc)，以及荧光标记如荧光素和罗丹明及生物素。
除分析得自个体的生物样本中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白的水平之外，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白也可经成象而体内检测。体内成象的抗体标记包括通过X-放射显影，NMR或ESR可检测的那些标记。对X-放射显影而言，适当标记包括放射性同位素如钡或铯，其发射可检测的辐射但对患者没有明显的损害。适当的用于NMR和ESR标记包括具有可检测的特有自旋如氚的标记，其可通过标记相应杂交瘤的养分而掺入抗体。
已用适当的可检测成象组分如放射性同位素(例如131I,112In,99mTc)，不透射线的物质，或通过核磁共振可检测物标记的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白特异抗体或抗体片段，导入(例如非肠道地，皮下或腹膜内)检测患有免疫系统疾病的哺乳动物中。本领域应知所用的样本大小及成象系统将确定需要产生诊断性图象的成象组分的量。在放射性同位素情况中，对人而言，注射的放射活性量一般为大约5～20毫居里的99mTc。标记的抗体或抗体片段然后将在含有TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的细胞位置优先积累。体内肿瘤成象见于Burchiel等所述(肿瘤成象第十三章癌症的放射化学检测，Burchiel,S.W.及Rhoodes,B.A.,eds.,Masson PublishingInc.(1982))。
治疗如上所述，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多核苷酸及多肽用于诊断体内TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的表达异常增高或降低的疾病。给定的细胞及组织中若TNF-γ-α和/或TNF-γ-β是表达的且活性由TNF-γ-α和/或TNF-γ-β调节，则将很容易地意识到个体中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的表达水平与标准水平相比的实际变化(提高或降低)，产生与其中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β是表达的和/或是活性的机体系统相关的病理变化。
本领域熟知，除了特异的细胞功能之外，细胞受体分子也通常被病毒用作开始进入潜在宿主细胞的工具。例如，Wu等近来发现(J.Exp.Med.185:1681-1691(1997))细胞趋化因子受体CCR5不仅作为细胞趋化因子受体，也作为嗜巨噬细胞人免疫缺陷病毒(HIV)-1的受体。另外，是细胞趋化因子受体CCR5兴奋剂的RANTES,MIP-1a和MIP-1b抑制各种HIV-1毒株进入易感细胞系(Cocchi,F.等，科学270:1811-1815(1995))。因此，本发明还提供了一种治疗病毒感染的方法，通过预防性或治疗性地施用TNF-γ-α和/或TNF-γ-β或其兴奋剂或拮抗剂，以破坏或阻断病毒颗粒与TNF-γ-α和/或TNF-γ-β受体的相互作用，从而阻止病毒开始感染或持续感染。
本发明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β与它们的受体结合，这样能阻止嗜免疫及内皮细胞病毒感染。编码本发明多肽的cDNA克隆的表达模式提示此分子主要在内皮细胞及选择性造血组织中表达。这些观测结果结合在一起可推测，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的兴奋剂及拮抗剂包括受体可用于阻止或另外调节嗜免疫细胞病毒的感染。能感染人且能感染造血系统细胞的病毒包括但非限于逆转录病毒如HIV-1,HIV-2，人嗜T细胞淋巴细胞病毒(HTLV)-Ⅰ和HTLV-Ⅱ，以及其它DNA和RNA病毒如单纯疱疹病毒(HSV)-1,HSV-2,HSV-6，巨细胞病毒(CMV),EB病毒(EBV),herpes samirii，腺病毒，鼻病毒，流感病毒，呼肠病毒等。
本发明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β或其兴奋剂或拮抗剂预防性或治疗性地阻止病毒感染的能力，本领域技术人员可轻易测试。例如，Simmons等(科学276:276-279(1997))及Arenzana-Seisdedos等(自然383:400(1996))均提出了一种方法，观测在培养的周围血单核细胞中，CCR5趋化因子受体和CC趋化因子RANTES的拮抗剂分别对HIV-1感染的抑制。在上述两种情况中细胞是培养的且然后用病毒HIV-1感染的。CC趋化因子或其受体的兴奋剂或拮抗剂然后立即加入培养基中。通过在感染后第3,6及9天估计病毒感染的相对成功率，确认趋化因子或细胞受体的兴奋剂或拮抗剂的能力。
如下述对感染病毒或有感染病毒风险的个体施用一种药物组合物，该组合物含有一定量的本发明分离的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β，或它们的兴奋剂或拮抗剂。
本发明还用于诊断或治疗哺乳动物优选人体中各种免疫及循环系统相关的疾病。这种疾病包括肿瘤(不完全性地包括乳腺癌，结肠癌，心脏肿瘤，胰腺癌，黑色素瘤，视网膜，成胶质细胞瘤，肺癌，小肠癌，睾丸癌，胃癌，成神经细胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，内皮瘤，成骨细胞瘤。破骨细胞瘤，腺瘤等)及肿瘤转移，细菌、病毒及其它寄生虫感染，免疫缺陷，感染性疾病，淋巴腺炎，自身免疫疾病，移植物及宿主间疾病及任何免疫及循环系统细胞功能失调包括但非限于自身免疫性，关节炎，白血病，淋巴瘤，免疫抑制，免疫性，体液免疫性，感染性肠道疾病，骨髓抑制等。
由于TNF-γ已表现出可诱导细胞NF-Kb和C-jun N端激酶(JNK)活化，因此其还可用于治疗性调节这种细胞及免疫系统疾病如肿瘤及肿瘤转移，细菌、病毒及其它寄生虫感染，免疫缺陷，感染性疾病，淋巴腺炎、自身免疫疾病，移植物与宿主间排斥，自身免疫性，关节炎，淋巴瘤，免疫抑制，感染性肠道疾病，骨髓抑制等相关疾病。
由于TNF-γ-α和/或TNF-γ-β属于TNF超家族，因此它们还可调节血管生成。另外，由于TNF-γ-α和/或TNF-γ-β抑制免疫细胞功能，因此其具有广泛的抗感染活性。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β可用作抗新血管生成剂，通过刺激宿主防御细胞如细胞毒性T细胞和巨噬细胞的侵染及活化，并抑制肿瘤的血管生成以治疗实体肿瘤。本领域技术人员将意识到其中血管增殖是非所需的其它非癌疾病。TNF-γ还可用于增强宿主对慢性和急性感染的防御性，例如通过杀微生物的淋巴细胞的吸附及活化防御肌细菌感染。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β还可通过抑制IL-2生物合成用于抑制T细胞增殖，以治疗T细胞相关的自身免疫疾病及淋巴细胞性白血病。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β还可用于促进伤口愈合，均是通过募集清除碎片及结缔组织活动炎症细胞而进行。以此方式，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β还可用于治疗其它纤维化疾病包括肝硬化，骨关节炎及肺纤维化。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β还提高嗜伊红性粒细胞的数量，该细胞具有杀死大量侵入组织的寄生虫如血吸虫、毛线虫及蛔虫的独特功能。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β还可用于调节造血功能，通过调节各种造血原细胞的活化及分化，例如在化疗后从骨髓中释放成熟白细胞，即干细胞转移。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β还可用于治疗败血症。
以相似方式，TNF-γ-α和/或TNF-γ-β可用于治疗类风湿性关节炎(RA)，其是通过抑制在RA中经常见到的侵入骨与软骨血管翳所需的血管生成或内皮细胞增殖的提高而进行。RA患者滑膜中内皮细胞增殖高于骨关节炎(OA)或正常个体中内皮细胞增殖。新血管生成需要维持侵入骨和软骨的血管翳的增加量。血管生成的抑制与动物模型中早期和慢性关节炎的严重性明显降低相关。
本领域技术人员也应意识到，由于本发明TNF-γ-α和/或TNF-γ-β蛋白是TNF家族成员，因此成熟分泌形式的蛋白质可以溶解形式通过蛋白酶解从表达TNF-γ的细胞中释出。因而，当TNF-γ-α和/或TNF-γ-β成熟形式或溶解的胞外结构域从外源来源加至个体细胞、组织或机体时，此蛋白质将对其个体的靶细胞呈现生理活性。表达此类跨膜蛋白Ⅱ的细胞可加入个体的细胞组织或机体，且这些加入的细胞将结合表达TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的受体的细胞，从而表达TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的细胞可导致对携带受体的靶细胞的作用(如调节内皮细胞生长)。
因而应意识到，由于个体TNF-γ-α和/或TNF-γ-β活性水平的降低引起的疾病，尤其免疫和循环系统疾病，可通过施用TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽(成熟蛋白质形式)而治疗。因此，本发明还提供了治疗需要提高TNF-γ-α和/或TNF-γ-β活性水平的个体的方法，包括对这种个体施用一种药物组合物，该药物组合物包含一定量的本发明的分离的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β，所述的量足以有效地提高这种个体中TNF-γ-α和/或TNF-γ-β的活性水平。
本发明的TNF-γ-α和/或TNF-γ-β多肽可用于抑制肿瘤细胞生长或瘤形成。TNF-γ-α和/或TNF-γ-β可通过细胞程序死亡破坏肿瘤，细胞程序死亡特征在于膜疱疹样变(zeiosis)，细胞质凝聚及内源性内切核酸酶活性(图12)。如表1所示，TNF-γ对测试的具有异常细胞增殖和调节的细胞系列例如纤维肉瘤和癌细胞系有强毒性。如图7A,7B和8所示，TNF-γ通过胞毒活性具有抑制L929和WEHI 164细胞生长的能力。WEHI164细胞是鼠纤维肉瘤细胞。一种优选的施用TNF-γ的方法是直接注射入肿瘤。
TNF-γ的细胞吸附活性可用于伤口愈合。如表1和图9所示，TNF-γ具有强内皮细胞增殖作用，这表明TNF-γ在伤口愈合中起作用。TNF-γ细胞粘附作用也可在伤口愈合中起作用。
TNF-γ也可用于治疗需要生长促进活性的疾病，例如再狭窄。如上所示，TNF-γ表现出对内皮细胞生长具有强增殖作用。因此，TNF-γ也可用于调节造血及内皮细胞生长。
TNF-γ多肽通过其刺激T细胞活化是免疫应答的重要介体。由此，此多肽可用于刺激抗各种寄生虫、细菌和病毒感染的免疫应答。TNF-γ可裂解病毒感染的细胞，并因而用于抑制HIV感染的细胞。
TNF-γ多肽还可用于治疗自身免疫疾病，如通过增强T细胞增殖应答而治疗Ⅰ型糖尿病。表2TNF-γ活性概况来源及细胞系类型细胞毒性增殖分化粘附小鼠L929 成纤维细胞 + - - -小鼠WEHI164 纤维瘤 +++- - -大鼠肾NRK-54E 内皮样 + - - -人THP-1 单核细胞 + - ++ ++白血病人HL-60 早幼粒细胞 - - - ++白血病人RajiBurkitt - - --淋巴瘤人Jurkat T细胞++ - --淋巴瘤原代 HUVEC- ++ -？人动脉原代 内皮+*++ -？人A-431 表皮样 ++ - --癌人293 胎 - ++ --肾注*仅在高剂量。“+”表示活性相对水平。
“-”表示在所测浓度范围无可检测活性
TNF-γ可用于抑制内皮细胞增殖，例如动脉内皮细胞。如图10所示，在近于10μg/ml浓度，TNF-γ可接近完全地抑制内皮细胞生长，而对人乳腺癌细胞的生长无明显影响。因此，TNF-γ可用于治疗抑制内皮细胞增长是有利的疾病。在治疗由于新血管产生而支持肿瘤生长的癌症中，需要抑制内皮细胞生长。TNF-γ可通过抑制是血管主要细胞组分的内皮细胞的生长而抑制这种肿瘤的生长。TNF-γ在此方面的应用效果见图16A和16B所示。这些试验将在以下详细阐述。
尤其地，TNF-γ可在内皮细胞已经开始增殖时调节细胞生长。这种情况如上述在当血管生成是作为肿瘤支持机制而发生时。内源性TNF-γ表达在内皮细胞的增殖培养物中是降低的，而在静止内皮细胞培养物中是增强的(图4)。因此，优选使用本发明的TNF-γ降低增殖内皮细胞培养物中细胞生长的速度，例如在癌症状态中肿瘤大小增大期间。
本发明的TNF-γ已用于在体外降低由内皮细胞形成的类毛细管结构的形成。如图14所示，本发明的TNF-γ可用于抑制由于应答抗原因子如FGF-2，内皮细胞器官化形成类毛细管结构。另外，本发明分离的TNF-γ也可用于抑制修饰的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中内皮细胞的生长及器官化为毛细管，如图15所示。因此，本发明的TNF-γ可用于抑制体外内皮细胞形成毛细管或类毛细管结构。
本发明的TNF-γ可用作抗癌剂。如图16所示，TNF-γ用于抑制异种移植肿瘤模型中人乳腺癌细胞的生长。尽管这些细胞具有高致瘤性，用本发明的TNF-γ治疗可明显抑制异种移植肿瘤的生长。本发明的TNF-γ，或其突变蛋白，可用于治疗许多癌症包括但非限于乳腺癌，结肠癌，心脏肿瘤，胰腺癌，黑色素瘤，视网膜瘤，成胶质细胞瘤，肺癌，小肠癌，睾丸癌，胃癌，成神经细胞瘤，粘液瘤，肌瘤，淋巴瘤，内皮瘤，成骨细胞瘤，破骨细胞瘤，腺瘤等。
本发明的多核苷酸和多肽可用于作研究制剂和材料用以发现人类疾病的治疗和诊断方法。
本发明提供了一种鉴别TNF-γ受体的方法。编码此受体的基因可用各种本领域已知方法鉴别，例如配体淘选及FACS分选(Coligan等，免疫学当前方案1(2)，第5章(1991))。优选地，应用表达克隆，其中聚腺苷酸化的RNA制备自应答TNF-γ的细胞，且产生自此RNA的cDNA文库被分成集合体并用于转染对TNF-γ不应答的COS细胞或其它细胞。在玻片上生长的转染的细胞曝光于标记的TNF-γ。TNF-γ可通过各种方法标记，包括碘化或包含位点特异性蛋白激酶的识别位点。在固定及培养后，将此玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性集合体并制备亚集合体，再重复用亚克隆转染并重筛选，最终产生编码推定的受体的单一克隆。
另一种鉴别受体的方法中，标记的TNF-γ可用细胞膜或表达受体分子的提取制备物进行光亲和连接。交连物经PAGE解离并在X线下曝光。切下含有TNF-γ受体的标记的复合物，解离成肽片段，并进行蛋白质微量测序。得自微量测序的氨基酸序列将用于设计一系列简并的寡核苷酸探针，以筛选cDNA文库以鉴别编码推定的受体的基因。
TNF-γ不与两种可溶的TNF受体sTNF-RⅠ(p55)和sTNF-RⅡ(p75)有效结合。因此，TNF-γ可具有已知TNF蛋白质所包含的活性及其它活性。
配方TNF-γ多肽组合物以良好的医学实践，考虑到个体患者的临床症状(尤其单用TNF-γ多肽治疗的副作用)，TNF-γ多肽组合物的释放位点，施用方法，施用计划及医生已知的其它因素而制备。TNF-γ多肽的“有效量”将根据这些因素而确定。
拮抗剂可与本文如下所述药物可接受载体组合应用。
TNF-γ多肽，多核苷酸和兴奋剂和拮抗剂可以与合适的药物载体一起联合使用。这些组合物包括治疗有效量的该化合物和一种适合药用的载体或赋形剂。此类载体包括但不仅限些，金属盐类，缓冲盐，水，甘油，乙醇，以及上述几种的混合物。配方应适合应用方式。
本发明还提供了一套药物包或药盒，其中包括一个或多个充满一种或多种本发明的药物组合物的容器。所使用的容器中还可包括负责药品或生物制品生产，应用或销售的政府部门的通知，该通知反映出允许用于临床的生产，应用或销售。另外，药物组合物可以与其他有治疗作用的化合物联合使用。
药物组合物可以按方便的方法使用，如外用，静脉，腹腔，肌肉，肿瘤内，皮下，肛门或皮内等途径。使用的药物组合物的量应是对适应症起到有效的治疗和/或预防。总的来说，药物组合物使用剂量至少为10μg/kg体重，并且在多数情况下，使用的剂量每天不超过8mg/kg体重。多数情况下，使用剂量为每天从10μg/kg到1mg/kg，还应考虑到用药途径，症状，等。
基因治疗本发明中，TNF-γ多肽和多肽类的兴奋剂或拮抗剂还可通过在体内表达进行应用，也就是在前文经常提到的“基因治疗”。
因此，患者的细胞可借助于编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行间接体内实验，进行工程化处理，再把工程化细胞植入患者体内，利用表达的多肽进行治疗。这些方法为本领域里所熟知的。例如，应用本领域所熟知的操作方法，即用含有编码本发明多肽RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行工程化处理。
例如，同样也可以通过本领域所熟知的技术方法，进行在体内细胞的工程化处理，使多肽在体内表达。正如本领域所熟知的，用于制备含有编码本发明多肽RNA的逆转录病毒颗粒的细胞，可以用于患者，在体内制备工程细胞，以及在体内进行多肽的表达。用于制备本发明多肽的这些方法和其他方法，对本领域的熟练的技术人员来说，非常清楚。例如，用于工程细胞的表达载体，可以不是逆转录病毒颗粒，例如是腺病毒，其与其他合适的载体联用也可以用于在体内制备工程细胞。
上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒可来自，但不仅限于，莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒，脾坏死病毒，逆转录病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey(哈维)肉瘤病毒，禽类造血白细胞组织增生病毒，长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，腺病毒，髓性增生性肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。在一个实施例中，逆转录病毒质粒载体来自莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒。
载体包括一个或多个启动子。所使用的合适的启动子包括，但不仅限于，逆转录病毒LTR启动子；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(见Miller，等，生物技术，1989,7:980-990)，或其它任何启动子(如细胞启动子如真核细胞启动子，包括但不仅限于，组蛋白，pol Ⅲ，和b-肌动蛋白等的启动于)。也可以使用其它病毒的启动子，包括但不仅限于这些，腺病毒启动于，胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。选择合适启动子的方法，本领域的熟练的技术人员非常清楚。
编码本发明多肽的核酸序列是在合适的启动子的调控之下。可以使用的合适的启动子包括，但不仅限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要的晚期启动子或异源性启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动于；呼吸合胞病毒(RSV)启动于，可诱导启动子，例如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；Apo AI(载脂蛋白AI)启动子；人类球蛋白启动子病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒-胸苷激酶启动子，逆转录病毒LTRs(包括上述的经过修饰的逆转录病毒LTR)b-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子还包括调控编码多肽基因的自身启动子。
逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系，形成生产细胞系。可以转染的包装细胞的实例包括，但不仅限于，PE501,PA317,b-2,b-AM,PA12,T19-14X,VT-19-17-H2,CRE,b-CRIP,GP+E-86,GP+envAml2和DAN细胞系(Miller，人类基因治疗，1990,1:5-14，附为参考文献)。通过本领域所熟知的任何方法，可以用载体进行转导包装细胞。这些方法包括，但不仅限于，电穿孔，脂质体和磷酸钙沉淀法。另一种情况，逆转录病毒载体质粒可以包被在脂质体中，或与脂质偶联，再用于宿主。
产生细胞的细胞系可以生成具有感染能力的边转录病毒的载体颗粒，其中含有编码多肽的核酸序列。再用这些逆转录病毒载体颗粒去转导真核细胞，既可以是体外，也可以是体内。转导的真核细胞将表达编码所需的多肽的核酸序列，用于转导的真核细胞包括，但不仅限于，胚胎干细胞，胚胎瘤细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。
兴奋剂与拮剂剂-分析与分子本发明还与筛选化合物，即用于证实哪些为兴奋剂或拮抗剂所使用的方法有关。本方法的一个实施例是利用，在辅助有丝分裂原ConA存在时，TNF-γ具有显著地刺激人内皮细胞的增殖的优点。内皮细胞可以在96孔的平底培养板(Costar,Cambridge，麻省)中在补加10％热灭活胎牛血清(Hyclone Labs,Logan,UT),1％L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，0.1％庆大霉素(Gibco LifeTechnologies,Grand Island,NY)的RPM1 1640中，加入conA(Calbiochem,La Jolla，加州)，进行培养并获得。ConA和待筛选的化合物以0.2ml终体积加入。在37℃下孵育60h后，用1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷(5Ci/mmol；lCi=37BGq；NEN)处理培养物12-18h，并在玻璃纤维滤膜上收获(PhD,Cambridge Technology,Watertown，麻省)。通过对三份培养样本的液闪(BeckillanInstruments,Irvine加州)计数，计算出3H-胸腺嘧核苷的掺入(cpm)的平均值。显著的3H-胸腺嘧啶核苷的掺入表明刺激内皮细胞的增殖。
另外，TNF-γ与受体相互作用所引起的已知第二信使反应，可通过加或不加化合物时进行测量或比较。第二信使系统包括但不仅限于，cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇的水解。
为分析拮抗剂，进行以上所述的分析，然而在该分析中TNF和被筛选的化合物一起加入，此化合物在存在TNF-γ情况下抑制3H胸腺嘧啶的能力表明此化合物是TNF-γ的拮抗剂。或者，检测TNF-γ拮抗剂可通过在适当条件下组合TNF-γ和潜在拮抗剂及膜结合的TNF-γ受体或重组受体，进行竞争抑制分析，TNF-γ可被标记如放射活性标记，由此结合受体的TNF-γ分子数量可确定潜在拮抗剂的效力。
或者，一种表达TNF-γ受体的哺乳细胞或细胞膜制备物与标记的TNF-γ和化合物一起培育。然后测定此化合物增强或阻断反应的能力。
本发明另一方面提供了一种鉴别与TNF-γ多肽特异性结合的受体蛋白或其它配体结合蛋白的方法。例如，一细胞区室如细胞膜可从表达结合TNF-γ的分子的细胞中制备。此制备物与标记的TNF-γ培养，且根据本领域已知方法分离及定性TNF-γ结合受体或其它结合蛋白质的复合物。或者，TNF-γ多肽可与固体支持物结合，由此从细胞中溶解的结合分子与柱结合，然后洗脱并定性。
在本发明的兴奋剂或拮抗剂的分析中，一细胞区室如细胞膜可从表达结合TNF-γ的分子的细胞中制备，如TNF-γ调节的信号转导或调节途径的分子。此制备物用标记的TNF-γ在有或无可能是TNF-γ兴奋剂或拮抗剂的候选分子的情况下培养。此候选分子与结合分子的结合能力反映在标记的配体结合降低之中。无条件结合的分子，即不诱导TNF-γ对结合TNF-γ结合分子的作用，是良好的拮抗剂。结合良好并激发与TNF-γ相同或相似作用的分子是兴奋剂。
测定潜在的兴奋剂及拮抗剂的类TNF-γ作用可例如通过在候选分子与细胞或合适细胞制备物相互作用后确定第二信使系统的活性后，并对比TNF-γ或激发与TNF-γ相同作用的分子的作用。用于此目的的第二信使系统包括但非限于AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌苷水解第二信使系统。
另一种TNF-γ拮抗剂分析的例子是组合TNF-γ和潜在拮抗剂与膜结合的TNF-γ受体分子或重组TNF-γ受体分子，在适当条件下进行竞争抑制分析。TNF-γ可被标记，如放射活性标记，由此准确地确定结合受体分子的TNF-γ分子的数量以判断潜在拮抗剂的效力。
潜在的拮抗剂包括与本发明的多肽结合的小有机分子，肽，多肽和抗体，并从而抑制或消灭其活性。潜在的拮抗剂也可以是小有机分子，肽，多肽；如在结合分子(如受体分子)相同位点结合的密切相关的蛋白质或抗体，而不诱导TNF-γ诱导的活性，从而通过拒绝TNF-γ结合而阻止TNF-γ的作用。
其它潜在的拮抗剂包括反义分子。反义技术通过三螺旋的形成或反义DNA或RNA，用于调控基因表达。反义技术见于许多研究中所揭示(例如Okano，核酸化学杂志56:560(1991)；“作为基因表达反义抑制剂的寡脱氧核苷酸”，CRC出版，Boca Raton,FL(1988))。三螺旋形成见于许多研究所述(例如，Lee等，核酸研究6:3073(1979)；Cooney等，科学241:456(1988)；Dervan等，科学251:1360(1991))。这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA结合的原理。例如，多核苷酸序列的5’编码区(该核苷酸序列编码成熟的本发明多肽)可用于设计长度为10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸序列。制备的DNA寡核苷酸序列与参与基因转录的一个区互补，因此可以阻止转录和TNF-γ生成，反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，抑制mRNA分子翻译成TNF-γ多肽，上述的寡核苷酸还可以导入细胞中，从而使反义RNA或DNA可以在体内表达，抑制TNF-γ的生成。
特异于TNF-γ的抗体通过结合TNF-γ并阻止TNF-γ与其受体结合而可用作拮抗剂。单克隆抗体尤为有效。然而，特异于TNF-γ受体的抗体可介导明显的细胞应答，此抗体在与其受体相互作用时趋于激发TNF-γ的作用。
潜在的TNF-γ拮抗剂还包括TNF-γ突变体，其结合TNF-γ受体并不激发第二信使应答以有效地破坏受体与天然配体的结合。特别设计的寡核苷酸和小分子也可结合TNF-γ受体(如DR3)并破坏其与TNF-γ的结合，这种小分子例如包括但非限于小肽或类肽分子。
其它潜在的TNF-γ拮抗剂是TNF-γ受体的可溶形式，其结合TNF-γ并阻止其与膜结合的TNF-γ受体相互作用。以此方式，此受体不受TNF-γ刺激。
另一种可能的拮抗剂为借助反义技术制备的反义构建体。反义技术通过三螺旋的形式或反义DNA或RNA，用于调控基因表达。这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA结合的原理。例如，多核苷酸序列的5’编码区(该核苷酸序列编码成熟的本发明的多肽)可用于设计长度为10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸序列。制备的DNA寡核苷酸序列与参与基因转录的一个区互补(三螺旋，见，Lee等，核酸研究，1979,6:3073:Cooney，等，科学，1988,24:456；和Dervan，等，科学，1991,251:1360)，因此，可以阻止转录和TNF-γ的生成。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，抑制mRNA分子翻译成TNF-γ多肽(反义-Okano，神经化学杂志，1991,56:560；寡聚脱氧核糖核酸作为基因表达的反义抑制剂，1988,CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达)。上述的寡核苷酸还可以导入细胞中，从而使反义RNA或DNA可以在体内表达，抑制的生成。
TNF-拮抗剂还可用于治疗恶病质，这种疾病是由TNF-γ抑制的脂蛋白脂肪酶系统性缺陷所致的脂肪明显缺乏。TNF-γ拮抗剂也用于治疗脑疟疾，其中TNF-γ起病理作用。拮抗剂还可通过抑制TNF-γ诱导的炎症细胞因子如IL-1在滑膜细胞中产生而用于治疗类风湿性关节炎。当治疗关节炎时，TNF-γ优选关节内注射。
TNF-γ拮抗剂还可通过TNF-γ阻止移植物刺激免疫系统而用于防止移植物排斥。
TNF-γ拮抗剂还用于治疗骨质疏松，是由于TNF-γ可诱导骨的再吸收。
TNF-γ的拮抗剂还可用作抗炎剂，是由于TNF-γ介导增强的炎症应答。
此拮抗剂还可用于治疗脓毒性休克也称为败血性休克。
这种危重疾病是由于对细菌或其它类型感染的过大反应所致，此反应导致TNF-γ水平提高引起休克及组织损伤。
由于TNF-γ蛋白质在各种组织中与在正常对照组织中相比的过表达可检测疾病的易感性，例如肿瘤及脑疟疾，因此本发明提供了一种诊断方法检测TNF-γ蛋白在各种组织中表达水平的变化，用于检测衍生自宿主的样本中TNF-γ蛋白的表达水平的分析方法，本领域已熟知，包括放射性免疫分析，竞争结合分析，Westerm印迹分析，ELISA分析和“三明治”分析。ELISA分析(Coligan等，Current Protocols In Immunology,1(2),C,(1991))包括制备一特异于TNF-γ抗原的抗体，优选单克隆抗体，另外制备抗单克隆抗体的报道抗体，此报道抗体可附有一种可检测试剂如放射活性，荧光性或辣根过氧化物酶标记。从宿主取样本并在结合样本中蛋白质的固体支持物如聚苯乙烯平皿上培养。平皿上任何游离蛋白质结合位点然后用非特异性蛋白质如BSA保温而覆盖。接着，此单克隆抗体在平皿中培养，在此期间单克隆抗体与粘附于聚苯乙烯平皿的任何TNF-γ蛋白粘附。用缓冲液冲洗掉所有未结合的单克隆抗体，将与辣根过氧化物酶连接的报道抗体置于平皿上，使报道抗体与结合TNF-γ的任何单克隆抗体结合，然后冲洗掉未结合的报道抗体，过氧化物酶底物然后加入平皿中，且在给定时间内显色量，当与标准曲线相对比时，可用以测定给定体积的患者样本中TNF-γ蛋白的数量。
竞争分析可以使用，其中TNF-γ特异抗体结合在固相上，且标记的TNF-γ和衍生自宿主的样本包被在固相上，并例如用液闪色谱法检测标记的量与样本中TNF-γ的量呈正相关。
“双抗夹心”法与ELISA法相似。在用“双抗夹心”法进行检测时，TNF-γ包被在固相上，并且与结合在固相上的抗体结合。然后，第二抗体与TNF-γ结合。三抗为标记的，并与二抗特异结合，将其再加到固相上，并与二抗结合，可以进行定量分析。
染色体作图本发明的序列对鉴定染色体也是有价值的，该序列是靶特异性的，能够与人的某一染色体上的特异位点杂交，当前还用于鉴别染色体上的特异位点。目前仅有很少根据实际的序列数据(重复序列的多态性)的染色体标记试剂能对染色体进行定位。根据本发明对染色体进行DNA作图，对那些与疾病有关的基因序列而言，是至关重要的第一步。重要的第一步。
简而言之，作图通过从cDNA合成PCR引物(最好15-25bp)，可以对染色体的序列进行作图。用计算机对cDNA进行分析，可以快速地筛出在基因组DNA中不跨越两个或两个以上外显子的引物，否则，会使扩增反应复杂化。这些引物用于PCR，来筛选含有人染色体的体细胞的杂合体。只有那些含有符合引物的人类基因的杂合体才能产生扩增片段。
体细胞杂合体的PCR作图，在确定某个特异的染色体上的一个特异的DNA时，是非常快速的。同样的寡核苷酸引物用于本发明的序列，按相同的方式，借助于来自特异染色体的一组片段或者许多大的基因组克隆，可以获得进一步的定位。其他的类似的染色体作图策略包括原位杂交，用标记的流式染色体进行的预筛和通过杂交进行预选来构建染色体的cDNA的特异文库。
cDNA克隆与展开的有丝分裂中期的染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以只用一步就可对染色体进行精确定位。该技术可以与来自长度仅50或60bp的cDNA的探针一起使用。该技术的综述请见Verma，等，人类染色体基本技术指南，Pergamon出版社，纽约，1988。
某一序列一旦在染色体上精确作图定位，该序列在染色体上的物理位置可与遗传作图数据相关。例如，这些数据请参见V.McKusick的“人类的孟德尔遗传”(可以在网上从约翰霍普金斯大学的Welch医学图书馆获得)。在基因和已经在同一染色体的部位作图定位的疾病之间的关系可以通过连锁分析来进行鉴定(物理位置相近的共遗传)。
再者，有必要确定在发生异常和未发生异常的个体之间eDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部发生异常的个体(而不是所有上常个体)中均发现存在突变，那么该突变有可能是该疾病的病因。
根据现有的物理作图和遗传作图技术的分辨率，与某种疾病有关的精确定位在染色体上的某个cDNA可能只是50-500种可能病因之一。(这假定100万个碱基对的作图分辨率和每20kb一个基因)。
利用上述技术，非常有把握地确定TNF-γ的染色体位置为qq32。先前的染色体作图研究已将染色体9这一区域的几个发育缺陷基因座连锁起来。
实施例本发明将以下面的实施例作进一步描述，实施例仅供参考，但必须清楚，本发明并不仅限于这些实例。所有份数或量，如不特殊说明均指重量。
为了便于理解下述的实施例，下面叙述一些经常遇到的方法和/或术语。
“质粒”的第一个字母是为小写p，和/或接着大写字母和/或数字。本文使用的质粒可以购买到，公众不受限地获得，或按照公开发表的方法，应用现有的质粒进行构建。另外，与所述等效的质粒为本领域所熟知，并且熟练的技术人员也非常清楚。
DNA的“消化”，是指应用限制性内切酶对DNA进行催化裂解，后者只作用于DNA中的特定序列。本文所使用的不同的限制性内切酶可以从商家买到，反应条件，辅助因子和其他所必需使用的，为本领域的熟练技术人员所熟知。
在分析研究时，通常1毫克的质粒或DNA片段在20微升的缓冲反应体系中加入2单位的酶。在用分高的片段构建质粒时，通常是5-50毫克的DNA在更大的反应体系中加入20-250单位的酶。不同的限制性内切酶厂家特异提供合适的缓冲液和底物的用量。通常是在37℃孵育一小时，但可以根据试剂供应商的说明进行改变。在酶切消化后，在聚丙烯酰胺凝胶上直接进行电冰，分离所需的片段。
应用8％的聚丙烯酰胺凝胶，对酶切片段进行大小的分离，具体方法见，Goeddel,D，等，核酸研究，1980,8:4057。
“寡核苷酸”是指单链的多聚脱氧核糖核苷酸或两条互补的多聚脱氧核糖核苷酸链，可以化学合成。这些合成的寡核苷酸没有5’端的磷酸，因此不能与另一个寡核苷酸连接，不能在激酶的作用下，加上由ATP提供的磷酸。合成的寡核苷酸将与没有去磷酸化的片段连接。
“连接”是指在双链的核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Sambrook，等，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989,P146)。除非使用其他方法，在已知的缓冲液和反应条件下，大约每0.5毫克的DNA片段可以用10单位的T4DNA连接酶(“连接酶”)进行连接。
除上述的方法外，转化可以按下述方法进行，Graham,F，和VanderEb,A，病毒学，1973,52:456-457。
实施例1,TNF-γ的细菌表达及纯化编码全长TNF-γ ORF,ATCC保藏号No.75927的DNA序列先用相应于TNF-γ蛋白5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增。相应于TNF-γ的另外核苷酸分别加入5’和3’序列中。5’寡核苷酸引物示作SEQ ID NO:3，序列为5’-GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC-3’，其含有-BamHⅠ限制酶位点，后接起始自初始甲硫氨酸密码的TNF-γ编码序列的头24个核苷酸。3’序列为5’-CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG-3’(SEQID NO:14)，含有XbaⅠ位点和互补于TNF-γ的22个核苷酸的序列。此限制酶位点相当于细菌表达载体pQE-9(Qiagen)中的限制酶位点，pQE然后BamHⅠ和XbaⅠ消化。扩增的序列连于pQE-9中并插入具有编码组氨酸标记和RBS的序列框架中，此连接混合物然后用于转化E.coli菌株(购自Qiagen，商标为M15/rep)。转化方法见于Sambrook,J等在分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版(1989)所述，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacⅠ阻抑物并还赋予卡那霉素抗性(Kanr)。转化体通过其在LB平板上生长的能力鉴别，并选择氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并通过限制分析确认。含有所需构建体的克隆在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB平板液板培养基上生长过夜(O/N)。此O/N培养物以1∶100～1∶250的比率用于接种大培养物，细胞生长至OD600在0.4～0.6之间。然后加入IDTG至终浓度为1mM,IPTG通过灭活lacⅠ阻抑物，清除P/O，使基因表达增加。将细胞再生长3～4小时，然后经离心收集细胞。细胞沉淀物溶于离液剂6M盐酸胍中(盐酸胍浓度高于或等于2.5M发现导致回收的重组蛋白纯度较高)。澄清后，在使含有6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过在镍螯合柱上层析，从此溶液中纯化溶解的蛋白质(Hochuli.E等，层析学411:177-184(1984))。在镍螯合柱上进行二次循环将TNF-γ进一步纯化。TNF-γ(纯度90％)自6M盐酸胍PH5.0的柱中洗脱，并在PBS缓冲液中透析以复性。此表达产物经SDS-PAGE电泳，结果见于图5其中标记“M”的泳道含有分子量标记；泳道1是诱导的细胞裂解物；泳道2是未诱导的细胞裂解物；泳道3是在二次镍螯合柱纯化后的TNF-γ蛋白；泳道4是在一次柱纯化后的TNF-γ蛋白质。
本领域技术人员将意识到除了pQE-9之外其它细菌表达载体也可用于表达TNF-γ。一个这种优选的细菌表达载体是pHE4-5。pHE4-5可以pHE4-5/MPIFD23质粒DNA获得(此物建体含有一个不相关的插入体，其编码不相关的ORF)。pHE4-5/MPIFD23质粒在1997年9月30日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登记号NO.209311，用侧翼于不相关的MPIF ORF插入体的NdeⅠ和Asap718限制位点，技术人员将轻易地用通用分子生物学技术，用本发明TNF-γ ORF或其变体置换pHE4-5/MPIFD23质粒中不相关的ORF。
实施例2用杆状菌病毒表达系统克隆和表达TNF-γ编码全长TNF-γ蛋白的DNA序列(ATCC NO.75927)，用相当于该基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增，5’引物序列为5’-GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC-3’(SEQ ID NO:15)，其含有-BamHⅠ限制酶位点(黑体字处)和随后的24个TNF-γ基因的核苷酸。3’引物序列为5’-CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG-3’(SEQID NO:16)，其含有限制内切酶XbaⅠ位点和互补于TNF-γ基因3’非翻译序列的22个核苷酸，扩增的序列用所购得的试剂盒(“Geneclean”,BIO 101 Inc.,La Jolla,CA)从1％琼脂糖凝胶中分离。此片段然后用内切酶BamHⅠ和XbaⅠ消化，并再在1％琼脂糖凝胶上纯化。此片段称为F2。
利用杆状病毒表达系统(综述参照Summers,M.D.及Smith,G.E.，“杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序方法手册”得克萨斯农业实验站公报NO:1555,(1987)将pA2载体(pVL941载体修饰而来)用于表达TNF-γ蛋白。该表达载体含有一个Autographacaliformica核多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子随后有BamHⅠ,XbaⅠ限制内切酶识别位点。猿猴病毒(SV)40的多聚腺苷酸位点被用于高效的聚腺苷酸化。为简便筛选重组病毒将大肠杆菌β-半乳糖苷酶以与连有多角体蛋白基因多聚腺苷酸信号的多角体蛋白启动子相同的方向插入。多角体蛋白序列两侧连有病毒序列使得共转染的野生型病毒可发生细胞介导的同源重组。许多其它杆状病毒载体也可代替pA2例如pA373,pVL941和pAcIM1(Luckow,W.A.和Summers,M.D.，病毒学170:31-39(1989))。
用限制酶BamHⅠ和XbaⅠ消化该质粒，然后根据本领域所知的程序用牛肠磷酸酶去磷酸化。用商业可得的试剂盒(“Geneclean”BIO101 Inc.,La Jolla,Ca)将DNA从1％的琼脂糖凝胶中分离出来。此载体DNA命名为V2。
用T4DNA连接酶连接片段F2和去磷酸化的质粒V2。再转化大肠杆菌XL1兰细胞。通过DNA测序确定克隆片段的序列。
用脂转染法(Felonber等，美国科学院研究进展84:7413-7417(1987))共转染5μg pBac TNF-γ质粒和1.0μg商业可得的线性杆状病毒(“BaculoGold杆状病毒DNA,Pharmingen,San Diego,CA,)。
在含有50μl无血清Grace’s培养基(生命科技有限公司，Gaithersburg,M.D.)的微滴定板的一个无菌孔中混合1μgBaculoGold病毒DNA和5μg pBac TNF-γ质粒。然后加入10μl脂质体和90μl Grace’s培养基，混匀室温孵育15分钟。再将转染混合物逐滴加到培养于有1ml无血清Grace’s培养基的35mm组织培养皿中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)。前后摇动培养皿以混匀新加入的溶液。于27℃孵育5小时。5小时后从皿中移去转染溶液，加入补充了10％胎牛血清的1ml Grace’s培养基。培养皿放回孵箱，继续于27℃孵育四天。
四天后收集上清，用Summers和Smith所描述的相似方法分析噬斑，见上述。一种改良是可简便分离蓝色噬斑的加有“Blue Gal”’(生命科技有限公司，Gaithersburg)的改良胶。(“噬斑分析”的详细叙述可见生命科技有限公司，Gaithersburg，出版的昆虫细胞培养和杆状病毒用户指南，9-10页)。
系列稀释后四天，向细胞中加入病毒，用Eppendorf移液枪头挑走蓝色噬斑。在含200mlGrace’s培养基的Eppendorf试管中重悬含重组病毒的琼脂。稍加离心移去琼脂，将含重组杆状病毒的上清感染培养于35mm平皿的Sf9细胞。四天后收集这些平皿中的上清储存于4℃。
Sf9细胞生长于补充有10％热灭活FBS的Grace’s培养基中。感染复数为2用重组杆状病毒V-TNF-γ感染细胞。6小时后移去培养基，换以无甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900Ⅱ培养基(生命科技有限公司，Gaithersburg)。42小时后加入5μCi35S一甲硫氨酸和5 Ci35S-半胱氨酸。进一步培养细胞16小时后离心收集细胞并通过SDS-PAGE和放射自显影观察标记蛋白。图6示出了一凝胶，其中泳道1和3是TNF-γ和对照培养物的培养基，泳道2和4是TNF-γ和对照培养物的细胞裂解物。
实施例3．在COS细胞中表达重组的TNF-γ质粒TNF-γ-HA的表达衍生自一种载体pcDNA I/Amp(Invitrogen)，其含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)E·coli复制起点，4)CMV启动子，其后接一接头区，一SV40内含子和一聚腺苷酸化位点。将编码全部TNF-γ前体的DNA片段和融合于其框架3’末端的一血凝素抗原(HA)标签克隆至载体的多接头区。因此重组蛋白的表达在CMV启动子控制下。HA标签相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位(I.Wilson,H.Niman,R.Heighten,A Cherenson,M.Connolly,and R.Lerner,1984,Cell 37,767)。HA标签与靶蛋白的融合使得可以用识别HA表位的抗体简便检测重组蛋白。
质粒构建机理如下所述用两个引物经PCR在克隆的原始EST上构建编码TNF-γ(ATCC No.75927)的DNA序列。5’引物(SEQID NO:15)含有-BamHⅠ位点，后接24个起自初始密码子的TNF-γ编码序列的核苷酸；3’引物序列为5’-CGC TCT AGA TCAAGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG ATA GTA AGA AGG CTCCAA AG-3’(SEQ ID NO:17)，含有XbaⅠ位点，翻译终止密码子，HA标签和TNF-γ编码序列后18个核苷酸(不包括终止密码子)。所以，PCR产物含有一个BamHⅠ位点，TNF-γ编码序列，后接融合于框架的HA标签，接着HA标签的翻译终止密码子和一个XbaⅠ位点。PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAⅠ/Amp用BamHⅠ和XbaⅠ限制酶消化并连在一起。用此连接混合物转化E.coli菌株SURE(购自Stragagene Cloning Systems,11099 North Torrey DinesRoad,La Jolly,CA92037)。将转化的培养物置入氨苄青霉素培养平板上并选择抗性克隆。从转化体中分离质粒DNA并通过限制分析检测正确片段的存在。为表达重组TNF-γ,COS细胞用表达载体通过DEAE-DEXTRAN方法转染(J.Sambrook,E.Fritsch,T.Maniatis，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版，(1989))。TNF-γHA蛋白的表达通过放射标记及免疫沉淀法检测(E.Harlow,D.Lane，抗体实验手册，冷泉港实验室出版(1988))。在转染2天后将细胞用[35S]-S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基并用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl,1％NP-40,0.1％SDS,1％NP-40,0.5％DOC,50mM Tris,pH7.5；Wilson,I.等，细胞37:767(1984))。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基。沉淀的蛋白然后用15％SDS-PAGE凝胶分析。
实施例4在人组织中TNF-γ的表达模式进行RNA印迹分析以检测人体组织中TNF-γ的表达水平。用RNA zolTMB系统(Biotecx Laboratories,Inc.6023 South LoopEast,Housten,TX 77033)分离细胞总RNA样本。大约2μg(为进行图3A的RNA印迹)的分离自每个人组织的总RNA用1％琼脂糖-甲醛凝胶分离，并印迹于尼龙滤膜上(Sambrook,Fritsch,andManiatis，分子克隆，冷泉港出版(1989))。根据Stratagene Prime-It试剂盒，用50ng TNF-γ cDNA进行标记反应以产生[32p]标记的TNF-γcDNA。标记的DNA用Select-G-50柱(5 Prime-3Prime,Inc.,5603 Arapahoe Road,Boulder,CO 80303)纯化。滤膜然后与1,000,000 cpm/ml的放射标记的全长TNF-γ基因，在0.5MNa2PO4,pH7.4和7％SDS中在65℃杂交过夜。在室温及60℃用0.5×SSC,0.1％SDS各洗2次后，用增感屏在-70℃曝光过夜。在肾组织中TNF-γ的信使RNA丰富。
除了使用分离自指示组织的10μg聚腺苷酸RNA之外，进行相同反应，获得的结果如图3B所示。在此试验中，编码TNF-γ的信使RNA优先在HUVEC细胞中表达(图3B，泳道9)，但不在其它试验的细胞系中表达；例如泳道1是CAMA1(乳腺癌)；2泳道是AN3CA(子宫癌)；3泳道是SK.UT1(子宫癌)；4泳道是MG63(成骨细胞瘤)；5泳道是HOS(成骨细胞瘤)；6泳道是MCF7(乳腺癌)；7泳道是OVCAR-3(卵巢癌)；8泳道是CAOV-3(卵巢癌)；10泳道是AOSMIC(平滑肌)；11泳道是包皮成纤维细胞。
还进行了Northern印迹分析以确定与HUVEC细胞培养物的增殖速率相关的TNF-γ RNA的相对表达水平。在这些试验中，等量的分离自HUVEC细胞的总RNA(15μg)经电泳分离并如上所述印迹。从种植1,2,3,4,6和7天后的培养物中分离RNA。如图4所示，TNF-γRNA(标记的“VEGI”)只在新种植的培养物(1,2和3天)中低水平可见。然而，TNF-γ RNA的表达在开始接近铺满的培养物(4,6和7天)是明显的。这些试验表明TNF-γ表达在开始接近无增殖或诱导的增殖静止状态的培养物或组织中增高。
实施例5重组TNF-γ抑制WEHI 164,ABAE和L929细胞生长及在HL-60中诱导细胞粘附的能力粘附靶细胞制备自在PBS中用胰蛋白酶消化的铺满培养物，非粘附靶细胞获自固定培养物，并用培养基洗一次。靶细胞以3×105个细胞/ml悬浮于含10％FCS的培养基中。0.1ml等分分液于含有0.1ml用血清稀释的试验细胞样本(WEHI 164和L929)的96孔平底微滴定平板中。持续培养70小时。TNF-a,TNF-b和细菌产生的TNF-γ以0.5μg/mi浓度加入。通过在每个孔中加入20μl MTS和吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液进行MTS分析，以确定胞毒性及增殖活性。在培养3小时后，用ELISA平板读数镜测定在492nm的光密度(OD)。OD492与孔中可见的细胞数成比例。胞毒性百分率如下计算胞毒性％=(100-OD试验/OD对照)×100。72小时后照相，如图7A和8所示，TNF-γ诱导-形态学变化，如黑色圆形细胞(代表杀死的细胞)。
在图7B中，如上所述进行分析，然而加入培养物中的TNF-aTNF-b和TNF-γ的量增加。结果表明TNF-γ是内皮细胞系WEHI 164而非成纤维细胞系L929生长的剂量依赖型的抑制剂。(图8和9)。
由SEQ ID NO:2所示完整TNF-γ氨基酸序列的12～147氨基酸组成的截短形式的TNF-γ多肽(称为TNF-γ12--147)，也用于测试TNF-γ对内皮细胞生长的影响。用TNF-γ12--147处理成牛动脉内皮(ABAE)细胞，导致ABAE培养物中细胞生长接近完全抑制，但在乳腺癌细胞系MDA-MB-435或MDA-MB-231中细胞生长未受抑制(图10，在此图中TNF-γ称为“VEGI”)。用10μg/ml TNF-γ39-174处理内皮细胞生长接近完全抑制，半值抑制浓度值(IC50)大约为1μg/ml(大约70nM)。
为测试TNF-γ的粘附能力，使用HL-60细胞，并在显微镜下观测细胞粘附及细胞间接触。图11示出了TNF-γ诱导细胞粘附的能力。未用TNF-γ处理的培养物含有已铺满培养平皿的细胞。然而，用TNF-γ处理的培养物含有清晰地聚集在一起的细胞。
实施例6测定TNF-γ的编程性细胞死亡的能力在第一个培养步骤中，抗组蛋白抗体吸附固定在微滴定平板的壁上。随后，此壁上的非特异性结合位点通过用培养缓冲液(如阻断剂溶液)处理而饱和。在第二个培养步骤期间，包含于WEHI 164细胞样本中的核小体通过其组蛋白组分与固定化的抗组蛋白抗体结合，WEHI 164细胞样本是用TNF-a,TNF-b或细菌产生的TNF-γ处理的。在第三个培养步骤中，抗-DNA过氧化物物酶(POD)与核小体的DNA组分反应。经冲洗除去所有未结合的过氧化物酶之后，用底物ABTS(2,2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)经分光光度法确定免疫复合物中保留的过氧化物酶数量。抗组蛋白抗体与样本中的组蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4反应。抗DNAPOD抗体与单及双链DNA结合。因此，ELISA可检测单-及寡核小体并可用于测定编程性细胞死亡。细胞死亡的水平通过细胞质组蛋白相关的DNA片段数量而测定，其以在405和490nm的吸光率表示(A405/A490)。这些试验结果如图12所示(见BohringerMannheim Catalogue,0990(9321541170)。
如图12所示，增加量的TNF-γ诱导WEHI 164细胞较高水平地程序死亡，导致细胞死亡。此作用也可在增加量的对照TNF-b或对照TNF-a的任何分析水平观测到。
实施例7．用TNF-γ进行受体结合分析TNF-a和细菌产生的TNF-γ用融合入重组蛋白质末端的6-组氨酸标签，通过Ni-NTA亲和层析而纯化。1μg/孔的蛋白质加入镍螯合包被的96孔平板(Xenopore Corp.)中并培养2小时。冲洗3次之后，将100ng人可溶TNF受体(具体地，sTNF RⅠ或sTNFRⅡ)加入每个孔中并培养2小时。此平板然后冲洗3次，并加入抗sTNF RⅠ或sTNF RⅡ的碱性磷酸酶标记的多克隆抗体，至总体积为200μl。等份底物溶液(200μl)然后加入每个孔中，再将平板培养2小时。用ELISA读数镜测定OD(测试波长450nm，校正波长590nm)。示于图13的结果表明当与用TNF-a观测到的对照结合相对比，TNF-γ未与STNF-受体令人满意地结合。
实施例8通过基因治疗的表达通过皮肤活检从一组织取得成纤维细胞。将所得组织放入组织培养基中并分离成小片。将小块组织放于一组织培养瓶的潮湿表面，约十片一瓶。颠倒瓶子，封严并于室温过夜。室温24小时后倒转瓶子，组织块仍固定在瓶底。此时，加入新鲜培养基(如补加10％FBS，青霉素及链霉素的Ham’s F12培养基)。此培养物然后在37℃培养近一周。这时加入新鲜培养基，随后每2-3天更换一次。再培养此培养物2周后，出现单层成纤维细胞。用胰蛋白酶消化此单层细胞并于大摇瓶中大规模培养。
用Eco RⅠ和HindⅢ消化pMV-7(Kirschmeier,P.T.等，DNA 7:219-25(1988))，随后用牛小肠磷酸酶处理，pMV-7两端是Moloney鼠瘤病毒的长末端重复。此线性载体在琼脂糖凝胶上分离并用玻珠纯化。
编码本发明多肽的cDNA用分别相当于5’和3’末端序列的PCR引物扩增。5’引物含有一个Eco RⅠ位点，3’引物含有一个HindⅢ位点。在T4连接酶存在下，加入等量的Moloney鼠瘤病毒线性骨架和扩增的Eco RⅠ和Hind Ⅲ片段。在适于两片段连接的条件下培养所得混合物。此连接混合物用于转化细菌HB101，然后将转化物置于含卡那霉素的琼脂上以确定载体有相应正确插入的基因。
用含10％小牛血清(CS)，青霉素和链霉素的Dulbecoo改良的Eagles培养基(DMEM)，组织培养兼嗜性pA317或GP tam 12包装细胞使生长至汇合密度。然后将基因的MSV载体加入培养基中，包装细胞将被该载体转导。包装细胞现在可产生含该基因的感染性病毒颗粒(该包装细胞现被称为生产细胞)。
向转导的生产细胞中加入新鲜培养基，接着从汇合包装细胞的10cm平板中收集培养基。将含感染性病毒颗粒的用过的培养基通过微孔过滤器过滤，以除去分裂的生产细胞并用该培养基感染成纤维细胞。从亚汇合状态的成纤维细胞平板中移去培养基，并快速换成生产细胞的培养基。移去这种培养基并换成新鲜培养基。如果病毒滴度高，那么实际上成纤维细胞都会被感染无需选择。如果滴度低，那么就有必要用有选择标记的逆转录病毒载体例如neo或his。
再将工程化的成纤维细胞注入受体，或者单独注入，或者在cytodex 3微载体玻珠上生长至汇合之后注入。成纤维细胞现在生产蛋白产物。
实施例9．体外血管生成分析此分析用于确定TNF-γ12-147抑制成牛动脉内皮(ABAE)细胞培养物中FGF-2诱导的类毛细管结构形成的能力。向含有1×DMEM的每个孔中加入0.5ml预冷的0.7mg/ml鼠尾Ⅰ型胶原(BectonDickinson Labwares,Bedford,MA)溶液，并用NaHCO3将pH调节为中性，从而制备3维胶原凝胶平板(24孔)。在形成胶原凝胶之后(大约1-2mm厚)，以5×104个细胞/孔将ABAE细胞种植。此培养物在5％CO2湿度，在37℃，在含有10％胎牛血清(HyClone,Logan,UT)及补加的L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM中培养，直至达到汇合。培养基然后用含有20ng/ml FGF-2的新鲜培养基置换。TNF-γ12-147作为FGF-2诱导的在ABAE培养物中形成类毛细管结构的抑制剂的效力，通过在培养基中补加0.1,0.3,1,3，或10μg/ml的TNF-γ12-147分析。所有培养物然后在37℃保持48小时，并通过冷冻甲醇(-20℃)固定而中止。
由ABAE细胞形成的类毛细管结构的丰度通过用装备有一个Hamamatsu C2400图象摄影机及一个Zeiss Axioshop显微镜的KotronIBAS Image分析仪加以分析。类毛细管结构的丰度以白色区占总测定区的百分比表示。作为对照。抗原因子FGF-2刺激体外血管生成的EC50值大约为5ng/ml。作为最终对照，在FGF-2为10ng/ml的，观测到最大刺激效力。
如图14所示(其中TNF-γ称为“VEGI”)，通过加入1,3和10μg/ml的TNF-γ12-147(标记为VEGI)可观测到ABAE培养物中FGF-2诱导的类毛细管结构形成被抑制。抑制FGF-2诱导的类管结构形成的IC50值大约为1μg/ml，其类似于在抑制内皮细胞生长时观测的IC50值(见实施例5)。
实施例10鸡绒毛尿囊膜(CAM)血管生成分析基本如Nguyen等(Microvasc.Res.47:31-40(1994))和Iruela-Arispe及Dvorak(Thromb.Haemost.78:672-677(1997))所述方法，进行CAM分析。此方法基于新毛细管生长入直接放在绒毛尿囊膜(CAM)上的胶原凝胶片中。抗原因子FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)包埋在胶原凝胶片中，并与CAM接触。在放入凝胶片24小时后，用Nikon荧光显微镜对凝胶片中血管生成定量。用CCD Sony摄相机将此图象移至Power PC 100AV。用NH Image 1.61软件评估荧光密度。阳性对照(只含有抗原因子)的荧光密度被认为是最大抗原应答，并设为100。由于分析的可变性，抑制超过20％认为是令人满意的。
为实验性确定TNF-γ对FGF-2或VEGF诱导的血管生成的效力，细菌产生的TNF-γ(250ng)与FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)混合，并包埋于胶原凝胶片中。然后将此片如上述放置与CAM接触。如图15所示(其中TNF-γ称为“VEGI”),TNF-γ明显地抑制胶原凝胶中新毛细管生长。
实施例11体内致瘤性分析用异种移植模型进行TNF-γ对血管生成的潜在效力的体内分析。在此试验中，1百万个人乳腺癌细胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)注入雌性裸鼠的乳腺脂肪层中，此癌细胞或者单独注入，或者与用TNF-γ转染的CHO细胞混合注入，或者与只用CHO载体转染的CHO细胞混合注入(每只鼠注入5×106个细胞)。这些试验中表达的TNF-γ多肽由SEQ ID NO:2所示多肽除N端22个氨基酸之外组成。此TNF-γ突变蛋白的N端22个氨基酸用人白细胞介素-6的分泌型信号肽置换(Hirano,T.等，自然324:73-76(1986))。
将用人乳腺癌细胞和表达TNF-γ的CHO细胞或载体转染的CHO细胞联合注射的鼠随机化并每周测二次肿瘤。用测径器测垂直直径，并以二维直径测量值相乘计算肿瘤大小。数据示于图16A和16B，是每组6只鼠的平均+/-标准偏差。
图16A和16B(其中TNF-γ称为“VEGI”)所示结果表明了异种移植肿瘤MDA-MB-231或MDA-MB-435在接种后的大小(mm2)。在接种后0天，5天至28天测肿瘤。其中，乳腺癌细胞与表达TNF-γ的CHO细胞联合注射所致的肿瘤(在图16A和16B中以实心圆表示)的大小令人满意地较小，而那些乳腺癌细胞与只用CHO载体转染的CHO细胞联合注射所致肿瘤(在图16A和16B中以空心圆表示)则较大。
实施例12．通过TNF-γ诱导NF-kB和c-Jun激酶(JNK)细胞性NF-kB通过磷酸化，遍在蛋白化及称为IkBa的内源性NF-kB抑制剂分子最终降解而优先活化。抑制剂的降解使NF-kB的p65亚单位转运至细胞核中，在那它能作为转录调节剂。为此，电泳迁移率变动分析(EMSA)是分析用TNF-γ处理培养的细胞激活细胞性NF-kB的适当方法。
在这些分析中，细胞(2×106/ml)用不同浓度的(0.1～1.0μg/ml)细菌产生的TNF-γ在37℃处理12小时。然后从培养的细胞中制备核提取物，并进行EMSA分析，如本领域所熟知的那样及基本如Singh，S.和Aggarwal,B.B.生物化学杂志270:10631-10636(1995)所述。
用TNF-γ处理U-937细胞12小时，导致NF-kB的p65亚单位的DNA结合增加。p65的DNA结合峰活化在用1μg/ml TNF-γ处理U-937细胞12小时时观测到。然而，用少如0.2μg/ml的TNF-γ处理U-937细胞12小时，导致在p65 DNA结合中产生可观测到的增加。已观测到TNF-γ在开始处理U-937细胞之后30分钟～18小时，激活p65 DNA结合超过基本水平。
这些试验经确定U-937细胞中IkBa对用TNF-γ处理的反应的降解分布图详细阐述。通过Western印迹分析确定IkBa降解时间过程，这一技术本领域技术人员已熟知，并已知Singh和Aggarwal所述(生物化学杂志270:24995-25000(1995))。当U-937细胞用0.1-1.0μg/ml的TNF-γ处理12小时时，IkBa完全降解。
称为c-Jun激酶(JNK)的细胞激酶是细胞活化的早期事件。TNF-γ激活JNK用另一种确定用TNF-γ处理的细胞反应的方法分析。本领域技术人员熟知JNK激酶活化分析，并已由Derjard等阐述(细胞76:1025-1029(1994))。在用0.1-3.0μg/ml TNF-γ处理U-937细胞12小时后，收获细胞并分析JNK激酶活性。在6和12小时，JNK活性分别提高2和3.6倍。
实施例13:TNF-γ治疗大鼠中佐剂诱导的关节炎的效力使用大鼠佐剂诱导的关节炎(AIA)模型，分析TNF-γ治疗类风湿性关节炎(RA)的应用。AIA是本领域技术人员熟知的类风湿性关节炎的特征熟知并可重复的动物模型(Pearson,Ann.Rheum.Dis.15:379(1956):Pearson&Wood.Arthritis Rheum.2:440(1959))。TNF-γ预期能抑制在这一动物模型RA中观测到的为延长侵入骨和软骨的血管翳所需的血管生成或内皮细胞增殖的增加。Lewis和BB大鼠(购自Charles River Lab,Raleigh,NC andUniversity of Massachusetts Medical Center,Worcester,MA)在这些试验中用作一般的及应答佐剂诱导的关节炎的品系。
关节炎初始通过皮在尾根部内注射0.1ml佐剂(5mg/ml)而诱导。每组5～6只大鼠在注射佐剂20天后在关节内注入0.1～1.0mg/kg的TNF-γ或载体。此时，急性炎症达到最大水平而慢性血管翳形成刚刚开始。TNF-γ对血管翳形成的影响，在用佐剂攻击15天后，每周放射分析一次，基本如Taurog等所述(J.Exp.Med.162:962(1985))。简而言之，将鼠用乙醚或水合氯醛麻醉并固定以便二后肢能一起用X光照射。用0-3评分系统遮光检测X光片中的骨膜反应，骨侵蚀，关节腔狭窄及破坏。当用载体处理的大鼠中关节破坏明显时，处死动物。此时，对大鼠脚爪进行组织学评估以检测组织破坏程度及TNF-γ对这些关节的治疗功效。
最后，对用TNF-γ和载体处理的动物每周进行二次临床评估，以用plethysmometer系统评估后爪体积和评估体重。
实施例14:DR3配体(TNF-γ)是以两种不同形式存在，且在不同组织和细胞中差异表达的新抗肿瘤细胞因子背景TNF(肿瘤坏死因子)超家族成员在细胞活化、增殖、分化、编程性细胞死亡、细胞毒性和免疫调节方面发挥非常重要的作用。TNF配体和受体超家族成员经常在各种人癌细胞和/或活化的淋巴细胞中过量表达，其胞外可及性使得它们成为特异抗肿瘤治疗和免疫调节治疗的优异的潜在靶。在过去的几年中，属于TNF受体和配体超家族的分子的名单迅速增加。细胞因子的TNF配体家族由13个Ⅱ型跨膜蛋白(除了TNF-b)组成，TNF受体超家族由18个Ⅰ型跨膜蛋白组成，除了分泌蛋白OPG，也称为OCIF或TR1，以及GPI-连接的细胞表面分子TRID/DcR1/TRIAL-R3。
参与编程性细胞死亡的几种TNF受体超家族成员以及一些胞间信号转导分子含有一段氨基酸序列，约60-80个氨基酸长，称为“死亡结构域”。这些含有死亡结构域的受体，如TNFR1,Fas/Apo-1/CD95,DR3(也称为Ws1,Apo3,TRAMP或LARD),DR4,DR5或TRAIL-R2，在被其配体活化时，募集各种蛋白质，这些蛋白质通过死亡结构域介导细胞死亡。这些蛋白质随后募集其他蛋白质，通过其死亡结构域或死亡效应子结构域转导死亡信号。TNFR1在大多数组织和细胞类型中表达并参与转导3种主要类型的信号转录因子NF-kB、c-jun N-末端蛋白激酶和细胞编程性死亡的活化。而Fas在淋巴细胞、肝、心脏、肺、肾和卵巢中表达。相反，DR3主要在脾、胸腺和外周血淋巴细胞中表达。DR3的配体尚未被鉴别。DR3与TRADD相互作用，与RIP稍弱结合，但当TRADD被过量表达时与RIP强结合。在存在TRADD时，其也与FADD强烈结合。这些结果提示DR3诱导的细胞编程性死亡的机制与Fas和TNFR1诱导的细胞编程性死亡的机制类似。与TNFR1一样，DR3也激活NF-kB。
我们用检索策略已鉴别了几种新的TNF受体和配体超家族成员。一种新的TNF样配体TNF-γ主要在内皮细胞中表达。虽然TNF-γ共享TNF的某些活性，但是它不结合TRNFR1和TNFR2，表明TNF-γ与一独立的受体结合。我们在此显示了TNF-γ与DR3在几种受体-配体结合分析中结合。令人感兴趣地，TNF-γ以两种不同的形式存在，它们在不同细胞和组织中差异表达。结果和讨论我们从含有来自超过620个cDNA文库的超过150万个EST的HGS数据库中鉴别了几个新TNF受体和配体超家族成员。一个新TNF样配体主要在内皮细胞文库中表达，显示与TNF家族其它成员20-30％序列同源性，该蛋白被命名为TNF-γ-α(或称VEGIa，即血管内皮衍生肿瘤生长抑制因子α)。随后的数据库分析和文库筛选鉴别了TNF-γ-α的一种新剪接变体，称为TNF-γ-β(或VEGIb)，这一异构形主要存在于TNFa和IL-1诱导的内皮细胞、单核细胞和活化T细胞的cDNA文库中。TNF-γ-α的cDNA编码174个氨基酸残基，TNF-γ-β编码251个氨基酸。两种蛋白均具有Ⅱ型跨膜蛋白的特征，它们仅在相应于胞内和跨膜结构域的N-末端不同(图18A-D和图19)。
重组TNF-γ在几种细胞系如牛肺动脉内皮细胞和成牛大动脉内皮细胞中诱导细胞编程性死亡〔牛肺动脉内皮细胞与各种浓度的TNF-γ保温48小时，用Hoechst 33342荧光染料(10mg/ml)经核染色评价细胞编程性死亡〕。TNF-γ还体外诱导核因子kB(NF-kB)和c-JunN-末端激酶(JNK)活化，抑制血管发生〔用0.2mg报道质粒(NF-kB-SEAP)经脂转胺试剂(根据厂商指导)转染U937细胞，收集转染的U937细胞并加至具有不同浓度TNF-γ的96孔板(200微升/孔)，37℃保温72小时后，用光度计在450nm测量NF-kB活性〕。
为鉴别新的受体和配体对，建立几种受体-配体结合分析。含有完整胞外域的重组可溶性TNF-γ与固定在BIAcore芯片上的DR3-Fc融合蛋白结合，纯化的DR3-Fc也与固定有TNF-γ的BIAcore芯片结合〔纯化的DR3-Fc或TNF-γ在用TNF-γ或DR3-Fc衍生化的BIAcore仪器流动池中分析，所示数据代表在TNF-γ与固定化DR3-Fc受体结合或DR3-Fc与固定化TNF-γ结合后作图的净结合(脱离率)区，其是经相对质量单位(RU)对时间而测定，结合条件在限制扩散条件下以高受体芯片密度进行〕。使用免疫沉淀技术，重组TNF-γ与DR3-Fc、但不与LTbR-Fc免疫粘附素共免疫沉淀〔如它处所述制备DR3的Fc胞外域或单独的Fc以及相应配体，并进行结合分析。各个Fc融合蛋白用蛋白G-Sepharose沉淀，共沉淀的可溶性配体经与抗TNF-γ抗体免疫印迹检测。如BM化学发光Westem印迹试剂盒方案所述进行印迹和检测〕。
为进一步证实DR3和TNF-γ之间的相互作用，我们用抗重组可溶性TNF-γ的多克隆抗体筛选几种细胞系中TNF-γ的细胞表面表达。与Northern印迹分析一致，通过抗TNF-γ的抗体的免疫染色发现外周血单核细胞(PBMC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在细胞表面表达TNF-γ细胞经胰酶化作用或抽吸而收集，在1500-2000rpm离心5分钟，细胞沉淀在5ml冰冷PBS中重悬及洗涤两次。细胞与抗TNF-γ抗体(10mg/ml)在40℃保温30分钟以检测TNF-γ在细胞表面的表达，细胞与DR3-Fc或LTbR-Fc(10mg/ml)在结合缓冲液(含10％BSA,20mM HEPES,pH7.2,0.02％NaN3的HBSS)中在40℃保温30分钟以检测受体和配体结合。用纯化的人IgG(25mg/ml)作为对照。然后洗涤细胞并用20mg/ml与山羊抗兔或抗人IgG缀合的藻红蛋白(PE)染色。经FACscan流式细胞仪(BectonDickinson,Mountain View,CA)分析荧光。〕。用TNF-γ转染的两个肿瘤细胞系(MC-38/TNF-γ和MDA-231/TNF-γ)也在细胞表面表达TNF-γ。FACS分析显示在MC-38/TNF-γ细胞与DR3-Fc接触之后在大多数群体中有一移位，指示TNF-γ和DR3之间的细胞表面结合。类似地，在用TNF-γ转染的MDA-231细胞中也观察到移位。另外，DR3-Fc蛋白也与HUVEC细胞和PBMC结合。应注意的是在用PHA延长刺激后DR3表达和TNF-γ与PBMC的结合下降。如是预期的，DR3-Fc抑制以剂量依赖方式活化的TNF-γ诱导的NF-kB。〔用0.2mg报道质粒(NF-kB-SEAP)经脂转胺试剂(根据厂商指导)转染U937细胞，收集转染的U937细胞并加至具有不同浓度DR3-Fc报道蛋白和100ng/ml TNF-γ的96孔板(200微升/孔)，37℃保温72小时后，用光度计在450nm测量NF-kB活性。〕TNF-γ的染色体位置位于9q32泳道中，这一染色体位置邻近CD30L(9q33)，但与TNFα、LTα和LTβ基因不同，后三个基因在染色体6上MHC复合物内紧密连锁。令人感兴趣的是，TNF-γ受体DR3位于染色体1的长臂，区域p36.2，位于已定位有CD30、TNFR2和OX40的一个区域。
与TNF-γ和DR3在细胞编程性死亡和免疫调节中的作用以及DR3和TNF-γ的相互作用一致的是，在同种MC-38鼠结肠癌模型中TNF-γ的局部产生导致体内肿瘤的完全抑制。在该相同动物模型中，可阻断TNF-γ功能的可溶性DR3的局部产生促进肿瘤生长。〔将全长TNF-γ和DR3的胞外域分别克隆进pcDNA3表达载体中并转染MCA38细胞。在选择和克隆后，从每个构建体挑取三个克隆进行致瘤性研究。将表达TNF-γ或DR3胞外域的MCA 38细胞(1×106个细胞/小鼠)注射进C57BL6/6小鼠。用测径器测量垂直径并通过两个方向的直径测量值相乘而计算评估肿瘤大小。数据以每组中6个小鼠的平均值+/-SD代表。〕很清楚大多数免疫细胞和癌细胞可表达多于一种TNF受体(甚至多于一种死亡受体)和配体超家族成员。一个配体存在多个受体或一个受体存在多个配体以及存在受体或配体的多个剪接变体形式提示细胞编程性死亡和免疫功能的调节中的未预料到的复杂性。这些受体和配体似乎是功能冗余的，但是它们的表达模式不同，提示在特定功能中涉及不同的特异的组织或细胞。另外，这些配体和受体的表达可在组织内的具体细胞类型水平上不同，并且相同细胞类型的表达也可不同。
预计10％的基因可以可变剪接，但是在许多情况下是产生的蛋白质的功能不清楚。为检查TNF-γ的两个剪接变体的潜在功能显著性，在超过100个cDNA文库中进行PCR分析。这些结果如下表所示
DR3、TNF-γ-α和TNF-γ-β的差异表达模式文库DR3 TNF-ga TNF-gb 文库 DR3 TNF-ga TNF-gb正常组织 异常组织和细胞肝 + + 肝细胞肿瘤 +淋巴结 + + Hodgkin′s淋巴瘤 +扁桃腺 + 横纹肌肉瘤+骨髓+ 鼻息肉脾 + 脾转移黑素瘤心脏+ 脾慢性淋巴细胞胸腺+ + 白血病心包膜 + 伤口愈合(皮肤) ++脑 + B细胞淋巴瘤肺 + 血管外皮瘤骨骼肌 胰腺肿瘤 +胎盘 + 烧伤皮肤 +前列腺 + 前列腺癌，C期垂体 U937细胞 +睾丸+ + 卵巢肿瘤 +结肠 结肠癌，转移至 ++胰腺+ 肝肾 + 结肠癌肾皮质 + Crohn′s病pualmonary 排斥的肾 ++脂肪+ + T细胞淋巴瘤 +卵巢+ + 卵巢肿瘤小脑 子宫内膜肿瘤海马 皮肤肿瘤hyperthalamus 胰腺癌 +嗅觉上皮 + + Jurkat细胞+striatum + Hela细胞 ++depression LNCAP+0.3nM +松果腺 雄激素LNCAP+30nM雄 ++激素胎儿组织 正常细胞8周胚胎+ + HUVEC9周胚胎+ 真皮内皮胎脑 + + + 静息T细胞胎肾 + + 活化T细胞(12hr)胎心 + + + 活化T细胞(16hr)胎胸腺 + 活化T细胞(24hr)胎肺 + + T细胞辅助细胞Ⅰ胎肝 + T细胞辅助细胞Ⅱ胎脾 + CD34+原代树状细胞嗜伊红性粒细胞单核细胞成骨细胞角质形成细胞子宫内膜基质细胞基质细胞TF274如表所示，DR3和两种形式的TNF-γ在不同的组织和细胞中差异表达。在所测试的文库中，发现DR3在大多数组织、活化的T细胞、单核细胞、树状细胞、TH2细胞和几种其它细胞系(如U937，HeLa)以及肿瘤组织(如肝细胞肿瘤和Hodgkin′s淋巴瘤)中表达。在用30nM合成雄激素处理的LNCAP前列腺癌细胞系中的DR3表达增加。TNF-γ-α仅在少数组织或细胞中表达，如胎脑、胎心、脂肪、肾皮质、嗅觉上皮、胰腺癌和HUVEC。相反，TNF-γ-β具有较宽的表达谱，在细胞水平只有内皮细胞、活化T细胞、单核细胞、角质形成细胞、HeLa和Jurkat细胞表达TNF-γ-β。仅有HUVEC、胎脑和胎心cDNA文库表达两种形式的TNF-γ和DR3。TNF-γ-α、TNF-γ-β和DR3在静息T细胞或早期活化T细胞(12hr)中不表达。在用PHA刺激后16小时可检测出DR3，用PHA刺激后24小时可检测出DR3和TNF-γ-β。在活化T细胞中DR3和随后TNF-γ-β的时间依赖性诱导提示DR3和TNF-γ-β可能在活化诱导的细胞编程性死亡中起重要作用。
Northern和eDNA数据库分析表明DR3表达主要在具有高含量淋巴细胞的组织中发现，TNF-γ主要在内皮细胞、单核细胞和活化T细胞中表达。因此，DR3和TNF-γ可能在活化诱导的细胞编程性死亡和淋巴细胞的阴性选择中起作用。不同细胞和组织具有不同的DR3、TNF-γ-α和TNF-γ-β表达谱。不同剪接变体形式的DR3或TNF-γ的表达可在DR3介导的细胞编程性死亡的易感性和抗性之间设定平衡。很清楚的是导致细胞编程性死亡的途径是高度调节过程并涉及一系列蛋白质。
最近描述了命名为Apo3L的另一种DR3的配体，其也是由Tweak公开的。与TNF-γ不同的是Apo-3L/Tweak在许多种组织中表达。这两种DR3配体间的相互关系和功能重要性有待于研究。结论已经鉴定了TNF超家族的一对新的受体和配体，即DR3和TNF-γ。与TNF家族其它配体不同的是TNF-γ以两种不同形式存在且在不同细胞和组织中差异表达。已提示调节DR3功能的一种机制是通过DR3的可变剪接。前mRNA的可变剪接产生至少11个DR3异构体，提供了可能有助于形成免疫应答的一系列功能结果。我们的数据提示DR3功能也可通过其配体TNF-γ的可变剪接和差异表达而调节。这些发现对于我们如何看待细胞编程性死亡和TNF受体超家族功能的调节有很大的影响。鉴别出两种差异表达的DR3配体变体提高了选择性调节细胞编程性死亡、免疫应答和肿瘤的免疫监视的可能性。两种差异表达的TNF-γ的生理学和病理学功能的进一步鉴定可提供TNF受体和配体超家族的生物学活性、生理学功能和治疗性应用的新见识。了解这些基因的作用和机制应能使我们开发在各种生理学和病理学条件下调节细胞编程性死亡和细胞增殖的途径。材料和方法细胞编程性死亡分析牛肺动脉内皮细胞(BPAEC)与各种浓度的TNF-γ保温48小时。经形态学和经用Hoechst 33342荧光染料(10mg/ml)核染色评价细胞编程性死亡，实验进行3份重复。在4个随机视野中记录活细胞和编程性死亡细胞，计数约1000个细胞。如前所述进行DNA片段化分析。BIAcore受体-配体结合分析如前述论文所述产生重组受体DR3-Fc融合蛋白和重组TNF-γ。将纯化的TNF-γ或DR3-Fc分别固定在BIAcore上。在用TNF-γ或DR3-Fc衍生化的BIAcore仪器流动池上分析纯化的DR3-Fc或TNF-γ。在TNF-γ与固定化的DR3-Fc受体结合后或在DR3-Fc与固定化的TNF-γ结合后，测量相对质量单位(RU)对时间图的净结合(脱离率)区域。结合条件是在限制扩散条件下以高受体芯片密度进行。共免疫沉淀和Western印迹分析如前所述(Ni,J.等，生物化学杂志272:10853-10858(1997))在兔中制备抗TNF-γ的多克隆抗血清。如它处所述制备DR3的Fc胞外域或单独Fc及相应配体并进行结合分析。相应的Fc融合体与蛋白G-Sepharose沉淀，用抗TNF-γ抗体的免疫印迹检测共沉淀的可溶性配体。样品上样于凝胶(NOVEX预浇铸凝胶)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。根据BM化学发光Western印迹试剂盒方案所述进行印迹和检测。FACS分析经胰酶化或抽吸收集细胞并在1500-2000rpm离心5分钟。重悬细胞沉淀并在5ml冰冷PBS中洗2次。细胞在40℃与抗TNF-γ抗体(10mg/ml)保温30分钟以检测在细胞表面TNF-γ的表达，与DR3-Fc或LTbR-Fc(10mg/ml)在结合缓冲液(含10％BSA、20mM HEPES,pH7.2和0.02％NaN3的HBSS)保温以检测受体和配体结合。纯化的人IgG(25mg/ml)用作对照。然后洗涤细胞并用20mg/ml与山羊抗兔或抗人IgG缀合的藻红蛋白(PE)染色。经FACscan流式细胞计数仪(Becton Dickinson,Mountain View CA)分析荧光。NF-kB-SEAP(分泌型碱性磷酸酶)报道基因分析经脂转胺试剂(根据厂商指导)用0.2mg报道质粒(NF-kB-SEAP)转染U937细胞，收集转染的U937细胞并与各种浓度的活性TNF-γ或失活(煮沸)TNF-γ一起或与各种浓度DR3-Fc受体和100ng/ml的TNF-γ联合加入96孔板(200ml/孔)。在37℃保温72小时后，用光度计在450nm测量NF-kB活性。用大量cDNA文库和cDNA数据库的PCR分析组织和细胞分布为研究DR3、TNF-γ-α和TNF-γ-β的组织分布，对于每个基因合成两个基因特异性引物。测试了超过100个cDNA文库，给出阳性预计大小信号的文库记为+。体内致瘤性分析将全长TNF-γ和DR3的胞外域分别克隆进pcDNA3表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中并转染MCA38细胞。转染、G418选择和克隆后，每个构建体选择3个克隆进行致瘤性研究。TNF-γ和DR3在MCA38细胞中的表达经Northern分析证实。将表达TNF-γ或DR3胞外域的MCA38细胞(1×106个细胞/小鼠)注射进C57BL6/6小鼠中，随后随机化小鼠并每周测量肿瘤两次。用测径器测量垂直直径估算肿瘤大小并通过将两个方向的直径测量值相乘计算肿瘤大小。数据以每组中6个小鼠的平均值±SD表示。实施例15:TNF细胞因子家族的一个新成员TNF-γ-α导致内皮细胞编程性死亡背景TNF-γ-α是最近检索人体基因组科学有限公司(HGS)cDNA数据库而鉴别的分子量为22kD的新蛋白(Tan，K.B.等，基因204:35-46(1997))。TNF-γ-α是Ⅱ型膜蛋白并与人肿瘤坏死因子a(TNFa)具有30％序列同源性。TNF家族这一新鉴定的成员已证明在内皮细胞和肾、肺和前列腺中丰富表达。在HL-60和THP1细胞中TNF-γ-α的表达经PMA处理诱导。放射杂种作图将TNF-γ基因定位于染色体9q32上，位于CD30L附近。由于其在内皮细胞中过量表达，已提示TNF-γ-α可能在血管功能中起作用(Tan,K.B.等，基因204:35-46(1997))。本研究目的在于探索TNF-γ-α是否诱导内皮细胞编程性死亡，内皮细胞编程性死亡这一现象已提示是导致各种炎症和心血管功能异常的内皮细胞损伤的一个原因(Bryant,D.等，循环97:1375-1381(1998))。为检查这一可能性，我们使用牛肺动脉内皮细胞(BPAEC)，该细胞TNFa诱导的编程性死亡已被证实(Polunovsky,V.A.等，实验细胞研究214:584-594(1994))。在形态学(包括超级结构)和生化鉴定(DNA断裂)基础上检测细胞编程性死亡。另外，我们研究了TNF-γ-α对应力激酶、应力活化蛋白质激酶(SAPK/JNK)和p38促有丝分裂原活化的蛋白质激酶(p38 MAPK)以及caspase的活性的作用。两种信号途径据信参与细胞编程性死亡(Xia,Z.等，科学270:1326-1331(1995))。也确定了TNF-γ-α刺激的BPAEC中Fas和Bcl-2的表达，以研究Fas的死亡促进效应和Bcl-2的抗细胞编程性死亡效应(Nagata,S.和Golstein,P.，科学267:1449-1456(1995))。材料和方法材料TNF-γ-α蛋白(22kD)由HGS提供，Ac-YVAD-AMC和Ac-DEVD-AMC购自美国肽公司(Sunnyvale,CA,USA),ZVAD-fmk和Ac-YVAD-CHO分别得自酶系统公司(Dublin,CA,USA)和肽国际公司(Louisville,KY,USA),Ac-DQMD-AMC,Ac-LEED-AMC,Ac-VETD-AMC和抗p38 MAPK mAb由SmithKline Beecham(SB)制药公司(King of Prussia,PA,USA)提供，Ac-IETD-AMC和小鼠抗人JNKmAb分别购自Biomol研究实验室(Plymouth Meeting,PA,USA)和PharMingen(San Diego,CA,USA)，小鼠可溶性TNF受体1(sTNFR1)和TNF受体2(sTNFR2)得自R&D系统公司(Minneapolis,MN,USA)。细胞培养物BPAEC得自美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD,USA)。细胞在补加10％热灭活FCS的DMEM中如前所述在5％CO2/85％空气的加湿环境中于37℃培养(Yue,T.L.等，分子药物学51:951-962(1997))。使用亚铺满密度的细胞。在实验前，将培养基更换为含2％FCS的DMEM。17-20代的BPAEC用于所有研究。细胞编程性死亡的形态学评价和定量为定量经历细胞编程性死亡的细胞，如前所述(Yue,T.L.等，分子药物学51:951-962(1997))固定细胞单层并用Hoechst 33324染色(分子探针，Eugene,OR,USA)。细胞编程性死亡的形态学特征(细胞收缩、染色质凝聚、起泡(blebbing)和断裂)经荧光显微镜术监控。如前述报道(Yue,T.L.等，分子药物学51:951-962(1997))进行透射电子显微镜术。DNA断裂分析(a)DNA梯用载体或TNF-γ-α处理的细胞在含有100mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH8.0,2.5mM EEDTA,0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液中裂解，裂解物在55℃保温16h。保温后，如前所述用苯酚/氯仿/异戊醇温和抽提3次，用无DNA酶的RNA酶处理，再次抽提并再次沉淀。在含溴化乙啶的1.8％琼脂糖凝胶中进行DNA电泳，在紫外光下观察DNA断裂。
(b)原位末端标记(TUNEL):BPAEC在两室玻片(Nunc)上培养并用TNF-γ-α处理8-24h。用ApopTag原位细胞编程性死亡检测试剂盒(Oncor)根据厂商推荐用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记进行编程性死亡细胞的原位检测。应力活化的蛋白激酶(SAJPK/JNK)分析用如前所述(Yue，T.L.等，分子药物学51:951-962(1997))与谷胱甘肽-Sepharose 4B结合的GST-c-Jun(1-81)测量SAPK活性。简单地说，用载体或TNF-γ-α处理细胞，洗涤并在裂解缓冲液中裂解。校正无核上清液的蛋白质含量并用抗SAPK抗体缀合的Sepharose珠免疫沉淀。混合物在4℃振荡3h。将含GST-c-Jun(1-81),10μC[g-32P]-ATP,125μM ATP和100mM MgCl2的磷酸化缓冲液加入在分析缓冲液中的SAPK结合的珠中。在30℃保温20分钟后通过加入蛋白质上样缓冲液并在90℃加热3分钟终止反应。磷酸化蛋白质在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳随后放射自显影而分辨。泳道密度通过PhosphorImager定量(Yue,T.L.等，J.Mol.Cell.Cardiol.30:495-507(1998))。p38 MAPK分析如上所述制备的细胞裂解物与和蛋白A琼脂糖结合的抗p38MAKP抗体在4℃免疫沉淀4h。如前所述用裂解缓冲液洗珠，随后用激酶缓冲液洗珠(Kumar,S.M.等，生物化学杂志271:30864-30869(1996))。通过加入含2微克GST-ATF2和50μM[γ-32P]ATP(20Ci/mmol)的25微升激酶缓冲液起始免疫复合物激酶分析。磷酸化产物经SDS-PAGE分辨并用Phosphorimage观察。c-JUN的显性干扰突变体在BPAEC中的体外转染细胞在两室玻片中铺板。用Calphos Maximizer转染试剂盒(Clontech)根据厂商推荐，用作为转染细胞的荧光标记的0.5μg/mlPegfp-c-1(Clontech；Li,Y.和Horwitz,M.S.，生物工程23:1026-1028)与1μg/ml空克隆载体pCDNA1(对照)或显性干扰c-Jun突变体pcDNA1-FigΔ169(Xia,Z.等，科学270:1326-1331(1995))一起共转染细胞。转染后，使细胞在完全培养基中复苏24h。细胞用TNF-γ-α处理，在根据方法部分固定细胞后经核染色估计编程性死亡细胞数。Caspase活性分析用TNF-γ-α的载体处理细胞，如前述报道进行Caspase活性分析(Yuc,T.L.等，文献同上)。简单地说，收获细胞并在含25mM HEPES,pH7.5,10％蔗糖，0.1％CHAPS,2mM DDT.5mM PMSF和1μM抑胃酶肽A的缓冲液中重悬。使悬浮液通过25规格针10次以破坏细胞。匀浆液在100000xg离心1h，将澄清的裂解液用于酶分析。细胞抽提物(5-20μg蛋白质)在分析缓冲液中稀释(表2)并在加入底物之前在30℃预保温10分钟。用Cytofluor-4000荧光读板器(Perseptive Biosystems)在激发和发射波长分别为360nm和460nm时测量释放的7-氨基-4-methylcocmarin(AMC)水平。Fas,Bcl-2和Caspase-3表达的免疫组织化学分析细胞在两室玻片上培养，在用载体或TNF-γ-α处理后，用4％低聚甲醛在4℃固定细胞30分钟，然后更换成冷PBS。细胞用0.2％Triton X-100在4℃处理40分钟，用冷PBS洗涤，然后用正常山羊血清(Vector Laboratories)在室温封闭非特异性免疫球蛋白结合位点1小时。细胞样品与一级抗体鼠抗人Fas(UpstateBiotechnology)，鼠抗人Bcl-2(DAKO)或兔抗人CPP32p17肽多克隆抗血清(SmithKline Beecham)在室温保温1小时。作为阴性对照，细胞样品与非免疫IgG(对Bcl-2和CPP32)或IgM(对Fas)而非一级抗体保温。在与一级抗体保温后，用PBS洗细胞，然后与和荧光素异硫氰酸酯缀合的二级抗体保温30分钟。洗细胞，用Weetashield覆盖培养基处理(Vector Laboratories)并经荧光显微镜术(OlympusIX70)观察。统计学分析所有数值以n个独立实验的平均值±S.E.M.表示。用单通道差异分析进行统计学评价。p＜0.05的数值差异被认为是显著的。结果TNF-γ-α在BPAEC中诱导细胞编程性死亡当BPAEC接触TNF-γ-α时，细胞缩小并与其相邻细胞隔离，细胞质变得致密。用Hoechst 33324染色的并经荧光显微镜术评价的细胞证实了断裂核的致密染色质以及质膜的起泡。用透射电子显微镜术的研究表明TNF-γ-α处理的BPAEC含有许多经历细胞编程性死亡特征性形态学改变的细胞，这些改变包括染色质凝聚和出现细胞编程性死亡小体。当细胞与TNF-γ-α(30-300ng/ml)接触24小时时观察到DNA特征性降解为寡核小体长度的片段。用TUNEL方法进一步原位观察DNA片段。相当一部分用TNF-γ-α处理的内皮细胞显示阳性染色，在用载体处理的培养物中未观察到阳性染色的细胞。
TNF-γ-α诱导的内皮细胞编程性死亡是时间和浓度依赖性过程，其EC30值为72ng/ml。在细胞与TNF-γ-α接触6-8小时后观察到具有编程性死亡形态学改变的细胞数显著增加。在相似条件下，10ng/mlTNFa在PEAPC中诱导的细胞编程性死亡为16.7±3.2％(n=4)。sTNFR1和sTNFR2对BPAEC中TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡的影响sTNFR1和sTNFR2均不显示对BPAEC中TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡有影响。在相同条件下，TNFa诱导的BPAHC编程性死亡被sTNFR1明显降低。TNF-γ-α对内皮细胞中Fas和Bcl-2表达的调节在用TNF-γ-α处理8和24h后测定Fas和Bcl-2蛋白的免疫细胞化学分析。Fas在BPAEC中的基础水平为不可检测到，但是在刺激后8和24h检测到许多表达Fas受体的细胞。当用小时IgM取代一级抗体时，未检测到阳性Fas免疫反应性。相反，在未刺激的或TNF-γ-α处理的BPAEC中均未检测到Bcl-2表达。SAPK/JNK和p-38 MAPK的活化关于TNF-γ-α对BPAEC中SAPK/JNK活性的作用，内皮细胞与TNF-γ-α接触诱导SAPK/JNK的快速活化。在刺激后20分钟检测到SAPK/JNK活性的明显增加，在40分钟时达到峰值，然后在60分钟后回到接触水平。内皮细胞中TNF-γ-α诱导的SAPK/JNK的活化是一浓度依赖性过程。SAPK/JNK活性的一些基础活性在存在50和300ng/ml TNF-γ-α时相对于基础水平分别增加5.6±1.4倍(p＜0.05 n=4)和9.1±1.8倍(p＜0.01 n=6)。TNF-γ-α以类似于SAPK/JNK但程度稍低的时间过程活化BPAEC中p38 MAPK。在存在100和300ng/ml TNF-γ-α时，p38 MAKP活性峰值相对于基础水平分别增加3.1±0.5倍和3.8±0.4倍。c-JUN的显性干扰突变体在BPAEC中的表达或p38 MAPK抑制剂SB203580对TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡的作用为研究SAPK/JNK在TNF-γ-α诱导的BPAEC细胞编程性死亡中的作用，我们用c-JUN显性干扰突变体pCDNA1-FlagΔ169转染BPAEC，该突变体中包括JNK结合位点的NH2-末端反式活化结构域被缺失(Xia,Z.等，文献同上)。显性干扰c-JUN构建体在BPAEC中的表达使TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡降低62.8％(p＜0.05)。BPAEC中TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡也被p38 MAPK抑制剂SB203580以浓度依赖方式弱化。在存在3和10μM SB203580时，TNF-γ-α诱导的BPAEC细胞编程性死亡分别降低33％(p＜0.05)和51％(p＜0.01)。当SB203580浓度增加时未观察到进一步的抑制。TNF-γ-α对BPAEC中Caspase的活化TNF-γ-α诱导的BPAEC细胞编程性死亡被在TNF-γ-α处理前1h加入到培养基中的caspase的不可逆细胞通透性抑制剂ZVAD-fmk(Jocobson,N.L.等，细胞生物学133:1041-1051(1996))弱化。在相同条件下，加入caspase-1的相对特异性抑制剂Ac-YYAD-CHO(Thorberry,NA.等，自然(伦敦)356:768-774(1992))直至100μM仍未显示增强BPAEC拯救的作用。为进一步确定caspase家族哪些成员在内皮细胞的TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡过程中活化，我们检查了细胞抽提物的蛋白裂解活性。用一系列确定的肽序列变体在如前所述优化条件下测量AMC形成的相对速率(Yue,T.L.等，文献同上)，所述的变体相对特异于caspase1,3,4,7或8。3次重复实验均观察到类似结果。来自TNF-γ-α处理的BPAEC的细胞抽提物对Ac-DEVD-AMC是高度活性的，对Ac-DQMD-AMC活性程度稍低，但对更特异于caspase1,4和8的其余三个底物没有活性。蛋白酶解活性在细胞用TNF-γ-α处理6h后出现，在24h达到峰值，并在48h内逐渐返回至基础水平。TNF-γ-α处理的细胞抽提物和重组caspase-3对四种底物水解速率的相对速率进行了比较，四种底物中两种酶来源的相对速率非常相似。
为进一步证实caspase-3在BPAEC中被TNF-γ-α活化，进行其酶学活性形式17kD亚基的免疫细胞化学检测。产生抗来自p17亚基的C-末端部分的肽的抗体，如果在“p-10”和“p-20”亚基之间已有特异性裂解，该新表位抗体仅结合caspase-3。使用这一新表位抗体，仅检测到加工的caspase-3，未检测到酶原(Yuc,T.L.等，文献同上)。caspase-3的17kD亚基在TNF-γ-α处理的BPAEC中检测到，但在载体处理的BPAEC中未检测到，其与断裂的核定位于细胞中。讨论本论文的研究证实了一种新的TNF样细胞因子和Ⅱ型跨膜蛋白TNF-γ-α在培养的内皮细胞中诱导强烈的细胞编程性死亡，形态学和生化标准反映了这一点。在我们的实验条件下，根据先前的观察自发性BPAEC死亡约为2-4％(Polunovsky,V.A.等，文献同上)。TNF-γ-α的作用是浓度依赖性的，其EC80值为72ng/ml(3.5nM)，在处理后6-8小时检测到明显数量的编程性死亡的细胞。另外，原细胞编程性死亡基因Fas的表达在TNF-γ-α处理的BPAEC中证实，这与先前报道的在编程性死亡内皮细胞中观察的结果一致(Yuc,T.L.等，文献同上)。
介导TNF-γ-α活性的受体尚未被鉴别。为检查TNF-γ-α是否通过独立的受体起作用，我们测试了sTNFR1和sTNFR2对BPAEC中TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡的影响。这两个TNFR先前已显示阻断细胞表面TNFR1和TNFK2介导的对应答细胞系的TNF生物活性(来自R&D系统的数据)。sTNFR1或sTNFR2均不抑制TNF-γ-α对BPAEC的作用。相反，TNFa诱导的BPAEC细胞编程性死亡显著地被sTNF1降低。结果清楚地提示TNF-γ-α诱导的细胞死亡不依赖于sTNFR1或TNFR2。
最近对TNF家族成员的研究已证实TNFa和Fas在各种细胞类型中激活应力蛋白激酶SAPK/JNK和p38 MAPK(Sluss，H.K.等，细胞生物学14:8376-8384(1994))，但是，这一家族其它成员对SAPK和p38 MAPK的作用未仔细研究。另外，已有SAPK/JNK和p38 MAPK在TNFa或Fas介导的细胞死亡中的作用的不一致报道。例如，TNFa诱导的细胞编程性死亡在U937细胞中依赖于JNK活性(Verjeji,M.等，自然(伦敦)380:75-79(1995)；Zanke,B.W.等，当前生物学6:606-613(1996))，但在成纤维细胞中不是如此(Reinhard,C.等，EMBO J.16:1080-1092(1997))，表明JNK活化的结果在细胞类型之间变化相当大。Fas介导的JNK活化以与TNFa不同的动力学发生，提示TNFa和Fas很可能通过不同的机制激活JNK(Wilson,D.J.等，欧洲免疫学杂志26:989-994(1996))。另外，Juo等最近报道了用特异的p38 MAPK抑制剂阻断p38 MAPK不影响Jurkat细胞中Fas介导的细胞编程性死亡(Juo,P.等，分子细胞生物学17:24-35(1997))。因此，我们感兴趣的是发现是否TNF-γ-α激活JNK和p38 MAPK，以及这一活化在BPAEC中的TNF-γ-α介导的细胞编程性死亡中的作用是什么。本研究清楚证明JNK和p38 MAPK均被TNF-γ-α以相似方式迅速激活，如在TNFa激活的U937中所观察到的一致。另外，c-JUN的显性干扰突变体在BPAEC中的表达降低了TNF-γ-α诱导的细胞死亡，表明在BPAEC中TNF-γ-α的细胞编程性死亡依赖于JNK活性。为表明p38 MAPK在BPAEC中的TNF-γ-α介导的细胞编程性死亡中的可能的作用，测试了特异性p38 MAPK抑制剂SB203580。这一抑制剂已显示能在体外特异抑制p38 MAPK活性，对所测试的各种激酶包括JNK和ERK-1均无作用(Cuenda,A.等，FEBS通信364:229-233(1995))。BPAEC中TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡也被SB203580以浓度依赖方式降低，提示p38 MAPK信号途径参与TNF-γ-α介导的BPAEC细胞编程性死亡。这一作用与在Jurkat细胞中Fas介导的细胞编程性死亡中观察到的不同，在Jurkat细胞中SB203580没有保护性作用(Juo,P.等，文献同上)。另外，TNF-γ-α诱导的p38 MAPK活化在BPAEC中的动力学比Jurkat细胞中观察到的更快，其中p38 MAPK活化的峰值在Fas刺激后2-4h，表明TNF-γ-α和Fas很可能通过不同的机制以不同的结果活化p38MAPK。我们的数据进一步提示TNF家族不同成员可具有不同的信号途径介导细胞死亡或在不同细胞类型中具有不同作用。
最近的研究支持caspase家族成员作为细胞编程性死亡效应子的中心作用(Kumar,S.M.等，文献同上)，但是caspase在内皮细胞编程性死亡中的作用尚未充分探索。caspase家族的两个特征已被验证，它们在特异性天冬氨酸之后裂解其靶蛋白，产生两个亚基，这两个亚基一起形成酶的活性位点(Nicholson,D.W.等，自然(伦敦)376:37-43(1995)；Kumar,S.M.等，文献同上)。在caspase家族中，caspase-3(CPP32)已被认为是在细胞编程性死亡过程中蛋白酶解级联的一个中心组分，并在这一家族中起关键作用(Wang,X.,EMBOJ.15:1012-1020(1996)；Woo,M.，等，基因发育12:806-819(1998))。TNF-γ-α诱导的BPAEC细胞编程性死亡被ZVAD-fmk抑制，提示caspase家族在细胞编程性死亡这一效应子途径中的潜在作用。为确定涉及哪些caspase家族成员，我们通过测量相对特异于caspase1,3,4,7和8(Talanian,R.V.等，生物化学杂志272:9677-9682(1997))的六个不同底物的AMC形成相对速率，检查了来自TNF-γ-α活化的BPAEC的抽提物中蛋白酶解活性的底物特异性。用TNF-γ-α处理BPAEC导致主要针对DEVD-AMC和一定程度针对DQMD-AMC的蛋白酶解活性的增加，两者均显示针对caspase-3的相对特异性(Kumar,S.M.等，文献同上)。当Ac-YVAD-AMC,LEED-AMC或VETD-AMC用作底物时，TNF-γ-α活化的细胞抽提物中蛋白酶解活性没有被诱导，提示可能不涉及caspase1,4和8。另外，对比来自TNF-γ-α处理的BPAEC抽提物与重组caspase-3的底物特异性显示类似的模式，进一步提示caspase-3可能是被TNF-γ-α活化的caspase家族的主要成员。另外，免疫细胞化学研究检测了TNF-γ-α处理的BPAEC中caspase-3的活化形式。据报道在HL-60细胞中鬼臼亚乙苷诱导的细胞编程性死亡的细胞质和核中均发现多个caspase同系物(Martins,I.M.等，生物化学杂志272:7421-7430(1997))。令人感兴趣地，在TNF-γ-α诱导的编程性死亡的BPAEC中，caspase-3的免疫反应性17kD亚基仅与断裂的核定位，进一步表明caspase-3在TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡中的作用。以下事实有待于进一步研究，即这一活性caspase-3是被转运到核中，或者无活性caspase-3已存在于核中等待由TNF-γ-α促进的活化。总之，这些结果提示caspase-3被TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡所活化。但是，我们的结果不能排除这一家族的其他成员，特别是与caspase-3紧密相关的成员如caspase-7介导TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡。另外，ZVAD-fmk在稍后的时间(30小时)抑制BPAEC中TNF-γ-α诱导的细胞编程性死亡比稍早的时间(14小时)的抑制效率低，提示在TNF-γ-α诱导的BPAEC细胞编程性死亡的晚期可能存在不依赖于阴性反馈机制的caspase。
总之，本研究已证明TNF细胞因子家族的一个新成员TNF-γ-α导致内皮细胞编程性死亡。TNF-γ-α看起来通过与TNF受体1或2不同的受体起作用。TNF-γ-α的作用是通过应力蛋白激酶SAPK/JNK和p38 MAPK的活化以及caspase、主要是caspase-3样蛋白酶的活化。已提示细胞编程性死亡是导致各种炎症和心血管损伤的内皮细胞损害的原因(Karsan,A.心血管医学趋势8:19-24(1998))。另外，内皮细胞编程性死亡可能是参与抗血管发生和促血管发生过程之间的平衡的一重要机制，丧失这一平衡将导致各种疾病如实体肿瘤转移和视网膜病(Folkman,J.and Shing,J.，生物化学杂志267:10931-10934(1992)；Brooks,P.C.等，细胞79:1157-1164(1994))。
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PCT/RO/134表(1992年7月)序列表<110>Yu,Guo-LiangNi,JianRosen,Craig A.<120>肿瘤坏死因子-γ<130>PF141P4.PCT<140>PCT/US99/02722<141>1998-08-06<150>60/074,047<151>1998-02-09<150>09/131,237<151>1998-08-07<150>09/005,020<151>1998-01-09<150>08/461,246<151>1995-06-05<150>PCT/US94/12880<151>1994-11-07<160>24<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2442<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(783)..(1304)<220><221>成熟肽<222>(864)..(1304)<220><221>信号肽<222>(783)..(863)<220><221>misc_特征<222>(2265)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2273)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2307)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2336)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2341)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(2379)<223>n等于a,t,g，或c<400>1cccaatcaag agaaattcca tactatcacc agttggccga ctttccaagt ctagtgcaga 60aatccaaggc acctcacacc tagagttcct atacctctga gactccagag gaaagaacaa 120gacagtgcag aaggatatgt tagaacccac tgaaaaccta gaaggttgaa aaggaagcat 180accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240attggtgtta 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180accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240attggtgtta tcatttgact aagaggaaat tatttgtggt gagctccnag tgaggnttag 300ggaccaggng gtgnccaagt ttctatcact tacctcatgn ctntaagnca agtgttttgt 360tcccattgnt gatggggtta aaacnttcag ccatcacttt tggggcaagn atggggnttt 420gangggttgg ngcnggnctt gtcntcgtaa acagggggnt tggtgggttt ttctgggtcc 480ttgggnagga ctt493<210>10<211>380<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(53)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(258)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(316)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(324)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc特征<222>(346)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(367)<223>n等于a,t,g,or<220><221>misc_特征<222>(378)<223>n等于a,t,g,or<400>10ggcagaggtt caatttgatc ataaatttgc ttcaattcag gagctttgaa ggnngtccaa 60ggaaagctct agaaaacagt ataaactttc agaggcaaaa tccttcacca atttttccac 120atactttcat gccttgccta aaaaaaatga aaagagagtt ggtatgtctc atggaatgtt 180cacacagaag gagttggttt tcatgtcatc tacagcatat gagaaaagct acctttcttt 240tgattatgta 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gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720gactctagag gat733<210>19<211>1116<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19atggccgagg atctgggact gagctttggg gaaacagcca gtgtggaaat gctgccagag 60cacggcagct gcaggcccaa ggccaggagc agcagcgcac gctgggctct cacctgctgc 120ctggtgttgc tccccttcct tgcaggactc accacatacc tgcttgtcag ccagctccgg 180gcccagggag aggcctgtgt gcagttccag gctctaaaag gacaggagtt tgcaccttca 240catcagcaag tttatgcacc tcttagagca gacggagata agccaagggc acacctgaca 300gttgtgagac aaactcccac acagcacttt aaaaatcagt tcccagctct gcactgggaa 360catgaactag gcctggcctt caccaagaac cgaatgaact ataccaacaa attcctgctg 420atcccagagt cgggagacta cttcatttac tcccaggtca cattccgtgg gatgacctct 480gagtgcagtg aaatcagaca agcaggccga ccaaacaagc cagactccat cactgtggtc 540atcaccaagg taacagacag ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 600gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 660caagaagggg acaagctaat ggtgaacgtc agtgacatct ctttggtgga ttacacaaaa 720gaagataaaa ccttctttgg agccttctta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 780aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 840tttcttgggg ccgggagtag gggcattcca cagggacaac ggtttagcta tgaaatttgg 900ggcccaaaat ttcacacttc atgtgcctta ctgatgagag tactaactgg aaaaaggctg 960aagagagcaa atatattatt aagatgggtt ggaggattgg cgagtttcta aatattaaga 1020cactgatcac taaatgaatg gatgatctac tcgggtcagg attgaaagag aaatatttca 1080acaccttcct gctatacaat ggtcaccagt ggtcca 1116<210>20<211>251<212>PRT<213>Homo 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sapiens<220><221>misc_特征<222>(4)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(8)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(17)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(24)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(28)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(31)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(35)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(41)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(43)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(46)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(48)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(50)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(53)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(55)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(61)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(63)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(66)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(202)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc-特征<222>(209)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(282)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(306)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(321)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(344)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(380)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(395)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(405)<223>n等于a,t,g，或c<400>22attncggnac 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sapiens<220><221>misc_特征<222>(11)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(46)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(50)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(81)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(138)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(155)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(182)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(188)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(269)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(317)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(322)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(358)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(363)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(375)<223>n等于a,t,g，或c<400>23ctgcactggg nncatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgantgan ctataccaac 60aaattcctgc tgatcccaga ntcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt 120gggaatgaac ctctgaantg ccagtgaaaa tcagncaagc aggccgacca aacaagccag 180antccatnca ctgtggtcat caccaaggta acagacagct accctgagcc aacccagctc 240cttcatgggg accaagtttg tttgcgaant aggttagcaa ctggttccag cccattttac 300cttgggggcc agttctnctt gncaagaagg ggacaagctt atggtggaac gttcatanca 360tcntttttgg gtggntttac acaaaagg 388<210>24<211>458<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>misc_特征<222>(9)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(12)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(119)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(303)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(311)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(387)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(409)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(425)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(427)<223>n等于a,t,g，或c<220><221>misc_特征<222>(453)<223>n等于a,t,g，或c<400>24ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna actttccagg 420cctgncncaa aaaaatggaa agggagttgg tangtccc 458
权利要求
1.一种分离的核酸分子，包含具有与选自如下一组的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的组为(a)编码具有SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27至147位)的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO:2的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26至147位)的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO:2的1-147位所示的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列；和(g)与上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有图1A和1B(SEQID NO:1)的完整核苷酸序列。
3.权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有图1A和1B(SEQ ID NO:1)的编码具有SEQ ID NO:2的-27至147位氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有图1A和1B(SEQ ID NO:1)的编码具有SEQ ID NO:2的1至147位氨基酸序列的成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列。
5.一种分离的核酸分子，包含具有与选自如下一组的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的组为(a)编码包含SEQ ID NO:2的n1至147位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n1是-27至35之间的一个整数；(b)编码包含SEQ ID NO:2的-27至m1位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m1是146至147之间的一个整数；(c)编码具有SEQ ID NO:2的n1至m1位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n和m是分别在上述(a)和(b)中定义的整数；(d)编码由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的完整TNF-γ氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的所述完整氨基酸序列的氨基末端的1至约62个氨基酸；(e)编码由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的完整TNF-γ氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的所述完整氨基酸序列的羧基末端的1个氨基酸；和(f)编码由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的完整TNF-γ氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分包括上述(d)和(e)的任意氨基末端和羧基末端缺失的组合。
6.权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
7.权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有编码TNF-γ多肽的核苷酸序列，该TNF-γ多肽具有由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列。
8.权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有编码成熟TNF-γ多肽的核苷酸序列，该成熟TNF-γ多肽具有由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的氨基酸序列。
9.一种分离的核酸分子，包含在严格杂交条件下与具有与权利要求1的(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中杂交的多核苷酸在严格条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
10.一种分离的核酸分子，包含编码具有权利要求1的(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的氨基酸序列的TNF-γ多肽的携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
11.权利要求10的分离的核酸分子，其编码TNF-γ多肽的携带表位部分，其中所述部分的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2的约Thr-24至约Asn-32；约Ile-37至约Ile-45；约Met-54至约Arg-62；约Gln-63至约Asp-71；约Glu-57至约Gly-65；约Val-80至约Thr-88；约Leu-116至约Val-124；和约Asp-133至约Phe-141序列组成的一组。
12.制备重组载体的方法，包括将权利要求1的分离的核酸分子插入一载体。
13.由权利要求12的方法制备的重组载体。
14.制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求13的重组载体导入一宿主细胞。
15.由权利要求14的方法生产的重组宿主细胞。
16.生产TNF-γ多肽的重组方法，包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求15的重组宿主细胞，并回收所述多肽。
17.一种分离的TNF-γ多肽，包含与选自如下一组序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，所述的组为(a)具有SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-27至147位)的全长TNF-γ多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:2的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的-26至147位)的全长TNF-γ多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:2的1-147位所示的氨基酸序列的预测的成熟TNF-γ多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的预测的成熟TNF-γ多肽的完整氨基酸序列。
18.与权利要求17的TNF-γ多肽特异结合的分离的抗体。
19.治疗患者的肿瘤的方法，包括给予患者权利要求1的分离的核酸分子。
20.治疗患者的肿瘤的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求17的TNF-γ多肽。
21.治疗患者的类风湿性关节炎的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求17的TNF-γ多肽。
22.一种分离的核酸分子，包含具有与选自如下一组的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的组为(a)编码具有SEQ ID NO:20的完整氨基酸序列(即SEQ IDNO:20的1至251位)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO:20的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2至251位)的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO:20的62-251位所示的SEQ ID NO:20的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的胞外域的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的胞外域的核苷酸序列；和(g)与上述(a),(b),(c),(d),(e)或(f)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
23.权利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有图20A和20B(SEQ ID NO:19)的完整核苷酸序列。
24.权利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有图20A和20B(SEQ ID NO:19)的编码具有SEQ ID NO:20的1至251位氨基酸序列的TNF-γ多肽的核苷酸序列。
25.权利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有图20A和20B(SEQ ID NO:19)的编码具有SEQ ID NO:20的约62至约251位氨基酸序列的TNF-γ多肽的胞外域的核苷酸序列。
26.一种分离的核酸分子，包含具有与选自如下一组的序列至少有95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，所述的组为(a)编码包含SEQ ID NO:20的n4至251位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n4是2至246之间的一个整数；(b)编码包含SEQ ID NO:20的1至m4位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m4是6至250之间的一个整数；(c)编码具有SEQ ID NO:20的n4至m4位残基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n4和m4是分别在上述(a)和(b)中定义的整数；(d)编码由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的所述完整氨基酸序列的氨基末端的1至约246个氨基酸；(e)编码由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分排除了由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的所述完整氨基酸序列的羧基末端的1个氨基酸；和(f)编码由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的完整TNF-γ-β氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中所述部分包括上述(d)和(e)的任意氨基末端和羧基末端缺失的组合。
27.权利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
28.权利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有编码TNF-γ-β多肽的核苷酸序列，该TNF-γ-β多肽具有由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列。
29.权利要求22的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有编码TNF-γ-β多肽的胞外域的核苷酸序列，该TNF-γ-β多肽的胞外域具有由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的氨基酸序列。
30.一种分离的核酸分子，包含在严格杂交条件下与具有与权利要求22的(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)的核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，其中杂交的多核苷酸在严格条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。
31.一种分离的核酸分子，包含编码具有权利要求22的(a),(b),(c),(d),(e)或(f)的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
32.制备重组载体的方法，包括将权利要求22的分离的核酸分子插入一载体。
33.由权利要求32的方法制备的重组载体。
34.制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求33的重组载体导入一宿主细胞。
35.由权利要求34的方法生产的重组宿主细胞。
36.生产TNF-γ-β多肽的重组方法，包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求35的重组宿主细胞，并回收所述多肽。
37.一种分离的TNF-γ多肽，包含与选自如下一组序列具有至少95％相同性的氨基酸序列，所述的组为(a)具有SEQ ID NO:20的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的1至251位)的全长TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:20的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:20的2至251位)的全长TNF-γ-β多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO:20的62-251位所示的氨基酸序列的TNF-γ-β多肽的预测的胞外域的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的除N-末端甲硫氨酸之外的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的TNF-γ-β多肽的预测的胞外域的完整氨基酸序列。
38.与权利要求37的TNF-γ-β多肽特异结合的分离的抗体。
39.治疗患者的肿瘤的方法，包括给予患者权利要求22的分离的核酸分子。
40.治疗患者的肿瘤的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求37的TNF-γ多肽。
41.治疗患者的类风湿性关节炎的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求37的TNF-γ多肽。
全文摘要
本发明公开了人TNF－γ－α和TNF－γ－β多肽,编码这些多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术生产这些多肽的方法。本发明还公开了利用这些多肽抑制例如肿瘤或癌症的细胞生长、促进伤口愈合、提供抗感染抗性、诱导炎性活性和刺激某些细胞类型生长以治疗疾病如再狭窄的方法。本发明还涉及用于检测TNF－γ－α和TNF－γ－β核酸序列中的突变或TNF－γ－α和TNF－γ－β多肽的过量表达的诊断方法。本发明还公开了抗这些多肽的拮抗剂及其作为治疗恶病质、脓毒性休克、脑疟疾、炎症、关节炎和移植排斥的治疗剂的应用。
文档编号C07K16/24GK1322244SQ99811864
公开日2001年11月14日 申请日期1999年2月8日 优先权日1998年8月7日
发明者余国良, 倪健, 克雷格·A·罗森, 张筠 申请人:人体基因组科学有限公司