用于拆分对映体混合物的非均相体系的制作方法

专利名称：用于拆分对映体混合物的非均相体系的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及使用二相溶剂体系对疏水酯的对映体混合物进行生物催化剂介导的对映体选择性转化的方法。更具体地说，本发明涉及抗病毒化合物，如2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷(oxathiolane)(FTC)和它的类似物在非均相反应体系中的酶介导的对映体选择性合成。
必须克服以上列举的障碍，以便减少对映体药物抗病毒药物的成本。这些药物对于战胜所发生的病毒性疾病是至关重要的。例如，甚至今天，HIV感染的速度以惊人的速度在继续，全世界每天有16,000例新感染者[Balter，M.Science 280，1863-1864(1998)]。在亚撒哈拉非洲地区，其中至少25％的人口被感染，例如在博茨瓦纳和津巴布韦。然而，抗病毒药物的花费目前远远超过了大多数这些HIV感染者的支出能力。
核酸类似物，如3’-thiaribofuranonsyl-βL-胞嘧啶(“3-TC”)，3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)[Blair E.，Darby，G.，Gough，E.，Littler，D.，Rowlands，D.，Tisdale，M.，抗病毒疗法(Antiviral Therapy)，BIOSScientific Publeshers Limited，1998]，(-)-2’，3’-二脱氧-5-氟-3’-噻胞苷(“FTC”)和2’，3’-二脱氧-3’-噻胞苷是重要的抗病毒剂[Liotta，D.C.，第216届ACS国家会议(216thACS National Meeting)，药物化学摘要(Medicinal Chemistry Abstract)，Boston，MA，1998年8月23-27日；Hoong，L.K.，Strange，L.E.，Liotta，D.C.，Koszalka，G.W.，Bums，C.L.，andSchinazi，R.F.，有机化学杂志(J.Org Chem.)1992，57，5563-5565]。3-TC已经作为抗HIV和抗HBV药物销售和FTC作为抗病毒药物正在进行用于评估的临床试验[Liotta，D.C.，Schinazi，R.F.，and Choi，W.-B.，美国专利5,210,085，5,700,937和5,814,639]。因为(-)-FTC和(-)-2’，3’-二脱氧-3’-噻胞苷二者的(-)对映异构体与相应的(+)-异构体相比，表现了最有力的抗病毒活性和最少的毒性，因此对于制备(-)-FTC和(-)-2’，3’-二脱氧-3’-噻胞苷异构体二者的有效和低成本方法具有迫切的需求，以扩大全世界病人的治疗选项[Liotta，D.C.，第216届ACS国家会议(216th ACS National Meeting)，药物化学摘要(Medicinal ChemistryAbstract)，Boston，MA，1998年8月23-27日；Hoong，L.K.，Strange，L.E.，Liotta，D.C.，Koszalka，G.W.，Burns，C.L.，and Schinazi，R.F.，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1992，57，5563-5565]。
许多水解酶已经用于FTC酯的拆分[Hoong，L.K.，Strange，L.E.，Liotta，D.C.，Koszalka，G.W.，Burns，C.L.，and Schinazi，R.F.，J.Org.Chem.1992，57，5563-5565]。然而，开发用于生产FTC和类似化合物的实用性酶介导化学方法仍然存在障碍。首先，许多FTC酯在含水介质中的溶解度是太低的，以致不能经济可行的生产拆分产物。一种可行的解决方案是添加水可混溶性的辅助有机溶剂以增加酯在溶液中的浓度。实例是乙腈和水的溶液的使用。[Hoong，L.K.，Strange，L.E.，Liotta，D.c.，Koszalka，G.W.，Burns，C.L.，and Schinazi，R.F.，有机化学杂志(J.Org.Chem.)1992，57，5563-5565；Liotta等人，美国专利5,827,727]。虽然水混溶性有机溶剂和水溶液的使用增加了在溶液中底物的浓度，它具有强烈降低酶催化的转化率和酶稳定性的不利影响。其中底物没有完全溶解，而且还作为未溶解的固体悬浮液(高浓度的底物载量)存在时，该问题是特别显著的。在我们的实验室获得了相同的结果。当水混溶性有机溶剂如异丙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲亚砜(DMSO)、甲醇、乙腈、乙醇、1-丙醇用作拆分的辅助溶剂时，最大底物浓度载量是3％。当底物的浓度超过3％时，未溶解的底物的存在降低了对映体选择性。而且，水混溶性有机溶剂和水溶液以大于20％的水混溶性有机辅助溶剂的浓度使用对酶活性、尤其对于猪肝酯酶(PLE)具有显著的负面影响。
本发明特别克服了现有技术中具有导致对映体混合物的酶拆分不经济的那一影响的几个障碍。首先，据认为酶转化应该在均相条件下进行，因为二相体系导致了差的重现性[参见Liotta等，美国专利5,827,727，5,892,025，5,914,331]。使用非均相体系的一个潜在优点是在底物的增强溶解上。据推测，在非均相体系中，能够容纳较高浓度的许多疏水底物。在本发明之前，据信醇溶剂应该避免使用，因为这些溶剂使酶变性[Liotta等，美国专利5,827,727，5,892,025，5,914,331]。本发明具有在现有技术之上的优点，因为它特别提供了与水形成非均相体系的醇溶剂的使用。另外，与以前在现有技术中所能提供的相比，非均相溶剂体系的使用提供了更多疏水底物的增强加溶。而且本发明公开了每单位产物需要更少的酶的方法。
通过本发明获得的其它改进允许在酶催方法中使用几种醇溶剂。另外，本发明提供了作为选择的方法模式，其中酶和有机溶剂的需要通过加入表面活性剂进一步被减少。最后，本发明涉及一种提供保持对映体选择性在高水平的更有效的酶催方法。
本发明的概述本发明涉及在生产手性、非外消旋酯的方法中的几种改进。更具体地说，本发明涉及提供一种使用利用生物催化剂的双相非均相体系来拆分FTC酯和FTC酯的类似物的对映体混合物的改进方法。本发明进一步涉及允许高底物载量和消耗更少量的酶的改进。
根据本发明的第一改进方法提供了在有机溶剂体系中分散酯的对映体混合物以在高底物载量下产生有机组分。提供含水组分，并优选含有分散的水解酶。另外，水解酶能够被加到整个非均相体系中或者不太优选地加到有机组分中。该方法进一步要求将有机组分和含水组分在允许混合物拆分的条件下接触以形成非均相体系，从而产生手性非外消旋的酯和非外消旋醇。有机组分和含水组分的结合形成了非均相体系。通过使用非均相体系，更高的底物浓度是可行的。在一个实施方案中，在反应进行后，手性非外消旋酯化合物可从有机组分中分离，和手性非外消旋醇化合物可从含水组分中分离。取决于具体的化合物和条件，分离步骤可以变化。
本发明也提供了通过大大减少生产既定产物所需酶量来获得改进结果的供选择的方法。这种改进是通过添加表面活性剂到上述非均相体系中，以产生需要更少有机溶剂来溶解底物的改进非均相体系来获得的。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用降低的有机/水相比率的方法，使所需的水解酶进一步减少。
在本发明的另一个实施方案中，表面活性剂添加到体系中使酶反应速度提高和底物更好的溶解。反应的高速度使操作该方法所用的总体酶费用降低。本发明的详细描述在下面的描述中，术语如下定义生物催化剂——蛋白分子，如水解酶。实例包括酯酶、蛋白酶和脂肪酶。
手性化合物——在镜像上不可重叠的化合物，和通常含有不对称碳原子，其中四个不同基团被连接到同一碳原子上。
辅助溶剂——有机溶剂。
转化——用可将单一对映异构体转换为不同化学实体的催化剂处理化合物的对映体混合物的方法。
非对映体——彼此的镜像不相关的立体异构体。
分散——在溶剂中分布酶或对映体混合物原料。酶可以是交联的酶晶体、固定化酶或可溶性酶的形式，和对映体混合物可以是溶解性的或含有残留颗粒。分散体系可以含有至多三相，具有固体结晶和/或颗粒原料和两种不同的液相。
对映异构体——是彼此的镜面反射的立体异构体对。对映异构体在它的镜像上是非重叠的。对映异构体是仅仅在怎样与其它手性分子反应和在对平面偏振光的特性上不同的手性立体异构体。单独的对映异构体对等地旋转偏振光的平面，但在相反的方向。不同的对映异构体通过R和S指示以及偏振光的平面是旋转到右(右旋(+))或旋转到左(左旋(-))来区别。
对映异构体过量——在两种对映异构体的混合物(溶液)中，其中一种对映异构体以更大的程度存在，溶液将显示对应于过量存在的对映异构体的光学旋转(+或-旋转)。对映异构体过量是过量的对映异构体相对于外消旋混合物的量的百分数，并按下式计算(混合物的旋光率)÷(纯对映异构体的旋光率)×100＝％对映异构体过量对映体混合物——两种对映异构体的混合物对映体选择性——从对映体混合物中转化一种对映异构体的优先性。
FTC丁酸酯——指化合物2’3’-二脱氧-5’-丁酸酯-5-氟-3’-噻胞苷酯的对映体混合物，或使用另一命名法，该化合物是2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷，或非正式的2-羟基甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的5’-丁酸酯。
不完全水混溶性有机溶剂——在25℃的水中不完全溶解和与水形成非均相溶液的有机溶剂。不完全。
非均相体系——包括生物催化剂、有机组分、含水组分和底物的双相介质。非均相体系也可指非均相介质或非均相条件或非均相组成。
有机溶剂体系——包括一种或多种下列溶剂的溶液C1—C8未取代烷烃、醇、芳族烃、酮醚，硝基、卤代烷烃或芳族烃有机溶剂，如叔戊基醇、异戊基醇、1-戊醇、3-戊醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、3-乙基-3-戊醇、3-庚醇、甲苯、乙酸丁酯、硝基乙烷、硝基甲烷、二氯甲烷、甲基异丁基酮、二甲基硫醚、四氢噻吩砜或任何其它有利于对映体混合物的溶解而不损坏酶的活动能力的不高于大约50％水混溶性的有机溶剂。
外消旋混合物——两种对映异构体，也称作外消旋变体的等摩尔混合物，通常作为在手性中心的化学反应的结果产生，其中任一种对映产物都不是优先的。
拆分对映异构体或拆分——从对映体混合物中分离对映异构体对的方法。
外消旋混合物的拆分——对映异构体的外消旋混合物的分离。
FTC和FTC丁酸酯的立体化学——在通篇申请中提到的FTC化合物的立体化学如下所示(-)-FTC丁酸酯 -- (-)-FTC -- +)-FTC丁酸酯-- +)-FTC -- 立体异构体——其组成原子与另一化合物的组成原子以相同的顺序排列的化合物，而区别仅在于它们的原子在空间的排列上。
底物载量——对映体混合物的浓度。对于以下所示的实施例，底物载量以百分数表示(重量/非均相体系的体积)，即基于总的溶剂体积。反复地说，百分数(％)(重量/体积)底物载量以整个非均相体系的体积为基，该体系包括含水组分和有机组分。
表面活性剂——当溶解在上述溶液时减少溶液表面张力的表面活性剂。表面活性剂也降低了两种液体之间，或液体与固体之间的界面张力。表面活性剂属于三个类别，以相似的机理起作用。取决于所牵涉的表面的性质，那些类别包括洗涤剂、乳化剂和润湿剂。表面活性剂浓度以百分数(％)(重量/体积)表示，以整个非均相体系的体积为基，该体系包括水性和有机组分。
水不混溶性有机溶剂——在25℃下在水中最大溶解度为10％和与水形成非均相溶液的有机溶剂。有机溶剂浓度以百分数(％)(体积/体积)表示，以整个非均相体系的体积为基，该体系包括水性和有机组分。
不高于大约50％水混溶性的有机溶剂——在25℃的水中不高于大约50％的可溶性和与水形成非均相溶液的有机溶剂。
水混溶性有机辅助溶剂——在25℃与水完全混溶的有机溶剂。
本发明提供了使用水解酶生产结构式I的手性、非外消旋酯的方法 结构式I其中R是C1—C8烷基，链烯基或炔基；X＝H或F；Y＝CH2，O，S，Se，或NH；上述方法包括下列步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％和大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散结构式I的酯的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系，在允许该混合物拆分以产生结构式I的手性非外消旋酯和结构式II的非外消旋醇的条件下； 结构式II
其中X＝H或F；Y＝CH2，O，S，Se，或NH，和其中上述水解酶被分散在上述有机组分，上述含水组分或上述非均相体系中。
本发明也提供了使用水解酶生产手性、非外消旋疏水酯的方法，所述方法包括以下步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％和大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散所述疏水酯的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系，在允许上述对映体混合物的一种对映体形式至相应醇的对映体选择性转化的条件下；和其中所述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中。
另外，本发明提供了从结构式I的对映体混合物或从疏水酯的对映体混合物生产结构式I的手性、非外消旋酯的方法，其中所述方法进一步包括表面活性剂。
另外，本发明提供了使用水解酶生产2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的手性、非外消旋酯的方法，所述方法包括以下步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％和大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散上述2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系，在允许上述对映体混合物的一种对映体形式至相应醇的对映体选择性转化的条件下；其中所述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中。
其中所述对映体混合物的浓度以所述非均相体系的体积为基础来计算。
本发明的一个实施方案提供了使用水解酶生产2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的手性、非外消旋酯的方法，所述方法包括以下步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％和大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散上述2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系，在允许上述对映体混合物的一种对映体形式至相应醇的对映体选择性转化的条件下；其中所述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中；其中上述有机组分占上述非均相体系的大约5％—大约90％；其中上述非均相体系还包括大约1％和大约20％之间的表面活性剂；和其中上述表面活性剂浓度以上述非均相体系的体积为基础计算。
本发明的另一目的是提供用于使用水解酶生产手性、非外消旋疏水酯的非均相体系，包括(a)水解酶；(b)疏水酯底物；(c)有机组分；和
(d)含水组分。
本发明的一个目的是提供从对映体混合物拆分所需对映异构体的方法。
本发明的还一个目的是提供从疏水酯的对映体混合物拆分所需对映异构体的方法。
本发明的进一步目的是提供拆分具有以上结构式I的抗病毒化合物的对映异构体的方法。
本发明最优选的实施方案提供了拆分对映FTC丁酸酯(或其中R是丙基，X＝F和Y＝S的以上结构式I化合物)的方法。
底物载量必需在有机溶剂体系中分散疏水酯的对映体混合物以产生有机组分。以％单位(重量/非均相体系的体积)表示的浓度范围是从大约0.5％和大约45％之间；在大约1.0％和大约45％之间；在大约5.0％和大约45％之间；在大约10％和大约40％之间；在大约10％和大约30％之间，在大约5和大约20％之间；在大约1％和大约5％之间；和在大约10％和大约20％之间的范围选择。
在优选的实施方案中，本发明的有机溶剂体系包括有利于对映体混合物的溶解的一种或多种，不多于大约50％水混溶性的有机溶剂。
在第二个优选实施方案中，本发明的有机溶剂体系包括一种或多种C4—C8醇。
在最优选的实施方案中，本发明的有机溶剂体系包括正戊基醇或3-甲基-3-戊醇的一种或两种。
在优选的实施方案中，本发明的水性溶剂体系包括水，一种或多种缓冲盐，碱化剂，抗微生物防腐剂，稳定剂，过滤助剂，辅酶，或其它有利于酶的分散和作用的赋形剂。
在第二个优选实施方案中，本发明的水性溶剂体系包括水，一种或多种缓冲盐，碱化剂，或其它有利于酶的分散和作用的赋形剂。
在下一个优选实施方案中，本发明的水性溶剂体系包括水，和在大约0.01和大约0.5摩尔之间的pH在大约7.0和大约8.0之间的磷酸盐缓冲剂。
在最优选的实施方案中，本发明的水性溶剂体系包括水，和在大约0.2和大约0.4摩尔浓度之间的pH在大约7.2和大约7.8之间的磷酸盐缓冲剂。
在本发明的另一个实施方案中，水解酶能够拆分一对对映异构体。
在本发明的还一个实施方案中，水解酶能够通过与一种对映异构体的酶催化立体选择性反应来拆分一对对映异构体。
在本发明的优选实施方案中，水解酶能够通过一种对映异构体的酶催化立体选择性转化来拆分一对对映异构体。
在本发明的最优选的实施方案中，水解酶能够通过2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷(或其中R是丙基，X＝F和Y＝S的以上结构式I的化合物或FTC丁酸酯)的(+)对映异构体的酶催化立体选择性转化来拆分一对对映异构体。
在本发明的一个实施方案中，生物催化剂是酶。
在本发明的另一个优选实施方案中，酶是水解酶。
在本发明的优选实施方案中，酶选自酯酶、脂肪酶和蛋白酶。
在本发明的最优选的实施方案中，酶选自猪胰酶(“PL”)，假单胞菌属种脂肪酶，黑曲霉脂肪酶，枯草杆菌蛋白酶，或猪肝酯酶(“PLE”)。
在本发明的一个实施方案中，在含水组分与有机组分接触来制备非均相体系以后，将生物催化剂加到非均相体系中。
在本发明的另一个实施方案中，在含水组分与有机组分接触来制备非均相体系之前，将生物催化剂加到有机相中作为有机组分的一部分。
在本发明的优选实施方案中，在含水组分与有机组分接触之后但在搅拌和混合以制备非均相体系之前，将生物催化剂加到水相中以产生含水组分。
在本发明的最优选实施方案中，在含水组分与有机组分接触来制备非均相体系之前，将生物催化剂加到水相中以产生含水组分。
在本发明的一个实施方案中，在该方法中为拆分对映体混合物而使用的非均相体系含有表面活性剂。以％(重量/非均相体系的体积)表示的表面活性剂的浓度范围选自大约1和大约30％之间的表面活性剂；大约1％和大约20％的表面活性剂；大约1％和大约10％之间的表面活性剂；大约1％和大约5％之间的表面活性剂；大约5％和大约30％之间的表面活性剂；大约10％和大约25％之间的表面活性剂；大约15％和大约25％之间的表面活性剂；大约20％和大约30％之间的表面活性剂；和大约5％和大约15％的表面活性剂。
在本发明的一个实施方案中，酶固定在基质上。
在本发明的优选实施方案中，酶形式是交联酶晶体的形式，例如在PCT专利申请WO92/02617(Navia等人)描述的那些。
在本发明的第二个优选实施方案，酶形式是受控溶解交联蛋白晶体，例如在PCT专利申请WO98/46732(Margolin等人)中描述的那些。
在本发明的最优选的实施方案中，酶以可溶性酶的形式存在。
在本发明的一个实施方案中，上述非均相体系包括在大约10％和99％之间的有机组分。在本发明的另一个实施方案中，上述非均相体系包括在大约10％和大约90％之间的有机组分。更优选非均相体系包括在大约20％和大约80％之间的有机组分。甚至更优选，上述非均相体系包括大约30％和大约70％之间的有机组分。在还更优选的实施方案中，上述非均相体系包括在大约10％和大约50％之间的有机组分。在另一个优选实施方案中，上述非均相体系包括在大约10％和大约60％之间的有机组分。在再一个优选的实施方案中，上述非均相体系包括在大约20％和大约70％之间的有机组分。在又一个优选的实施方案中，上述非均相体系包括在大约50％和大约20％之间的有机组分。
在本发明的一个实施方案中，用于拆分所需对映异构体的上述方法是在选自大约0℃和大约45℃之间；在大约10℃和大约45℃之间；在大约20℃和大约45℃之间；在大约30℃和大约45℃之间；在大约10℃—大约40℃之间；在大约10℃和大约30℃之间；在大约10℃和大约25℃之间；在大约15℃和大约40℃；在大约15℃和大约35℃之间；在大约15℃和大约30℃之间；在大约15℃和大约25℃之间；和在大约20℃和大约35℃之间的温度下进行。
在优选的实施方案中，在本发明方法使用的上述含水组分占上述非均相体系的至少10％(体积/体积)。
在第二个优选实施方案中，在本发明方法中使用的上述含水组分占上述非均相体系的至少50％(体积/体积)。
在最优选的实施方案中，在本发明方法中使用的上述含水组分占上述非均相体系的至少90％(体积/体积)。
在本发明的一个实施方案中，上述用于拆分所需对映异构体的方法在包括表面活性剂的非均相体系中进行。当表面活性剂是上述非均相体系中的一部分时，以％(体积/体积)表示的有机组分的浓度范围从下列范围选择上述非均相体系的大约5％和大约90％之间；上述非均相体系的大约5％和大约80％之间；上述非均相体系的大约5％和大约70％之间；上述非均相体系的大约5％和大约60％之间；上述非均相体系的大约5％和大约50％之间；上述非均相体系的大约5％和大约30％之间；上述非均相体系的大约5％和20％之间；上述非均相体系的大约5％和大约10％之间；上述非均相体系的大约10％和大约30％之间；上述非均相体系的大约10％和大约20％之间；上述非均相体系的大约20％和70％之间；或上述非均相体系的大约25％和大约50％之间；和上述非均相体系的大约30％和大约60％之间。
对映体混合物拆分的反应历程在

图1(以下)所示的反应中说明，其中底物是FTC的乙酸酯、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯或其它正烷基和支化链或芳基酯，或者FTC的这类酯的衍生物，和有机辅助溶剂是不高于大约50％水混溶性的醇，烷烃，芳族烃，酮醚，硝基、卤代烷烃或芳族烃有机溶剂的任何一种，如正戊基醇，异戊基醇，叔戊基醇，3-戊醇，1-或3-庚醇，3-甲基-3-戊醇，4-甲基-2-戊醇，3-乙基-3-戊醇，1-或2-丁醇，硝基甲烷，二氯甲烷，甲基异丁基酮，二甲基硫醚，四氢噻吩砜和其它类似物。
在下面所示的图1中，反应的产物是非外消旋酯和非外消旋醇(图1)。在一个实例中，当X是氟，R是C3H7和Y是硫时，那么化合物A表示FTC丁酸酯的对映体混合物。各种水解酶，如猪肝酯酶(PLE)，来自假单胞菌属种的(PSL)的脂肪酶和来自黑曲霉(ANL)的脂肪酶已经被用作催化剂[对于在混合有机溶剂中的PLE催化的反应参见Ariente-Fliche，C.，Braun，J.，and Le.Goffic，F.，Synth.Commun.22，1149-1153(1992)；Basavaiah，D.，and Krishna，P.R.，纯和应用化学(Pure&Applied Chem.)，64，1067-1072(1992)；Basavaiah，D.，Pandiaraju，S.，and Muthukumaran，K.，四面体不对称(TetrahedronAsymmetry)，7，13-16，(1996)；Mahmoudian，M.，Baines，B.S.，Dawson，M.J.，andLawrence，G.C.，酶微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)，14，911-916，(1992)；Izumi，T.And Kasahara，A.，日本专利JP08092269A(1996)]。图1 R是C1—C8烷基，链烯基，或炔基；X＝H，或F；Y＝CH2，O，S，Se，或NH；生物催化剂可以是可溶性酶，固定化酶或交联酶晶体形式；有机辅助溶剂可以是不高于大约50％水混溶性的有机溶剂的任何一种，如正戊基醇，异戊基醇，叔戊基醇，3-戊醇，1-或3-庚醇，3-Me-3-戊醇，4-Me-2-戊醇，3-Et-3-戊醇，1-或2-丁醇，硝基甲烷，二氯甲烷和其它物。
生物催化剂可以是可溶性酶，固定化酶或交联晶体(CLECTM)形式的酶(Altus Biologics，Inc.，Cambridge，Massachusetts)。反应在间歇式反应器，塔，中空纤维膜[有机合成中的酶催化(Enzyme Catalysis inOrganic Synthesis)，pp.138-150，edited by Drauz，K.And Waldmann，H.，VCH Verlagsgesellschaft GmbH，Weiheim，1995]或膜反应器[Dodds，D.R.，Lopez.，J.L.，Zepp，C.M.，and Rossi，R.F.PCT专利申请No.WO90/04643，1990年5月]中进行。
对于给定底物对来说最佳的特定酶的选择通过用各种酶如猪肝酯酶，猪胰脂肪酶，假单胞菌属种的脂肪酶(PSL)，黑曲霉脂肪酶(ANL)，和蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶，或α-糜蛋白酶处理对映异构体的样品来确定。在对映体混合物用拆分酶处理后，使用标准萃取或液相色谱程序分离产物。产生最大对映体过量的所需产物的那种酶应该是用于本方法的最佳候选者。
该方法能够通过选择给定的对映体混合物和拆分酶结合物和测定反应的理想溶剂条件来进一步改进。在双相体系中，必须决定有机溶剂的选择。最适宜的有机溶剂通过在相同量的一组不高于大约50％水混溶性的有机溶剂的存在下用选择的酶处理对映体混合物的样品来决定。特定的溶剂包括任何不高于大约50％水混溶性(在室温下在水中的溶解度低于50％)的醇，烷烃，芳族烃，酮醚，硝基、卤代烷烃或芳族烃有机溶剂，如正戊基醇，异戊基醇，叔戊基醇，3-戊醇，1-或3-庚醇，3-甲基-3-戊醇，4-甲基-2-戊醇，3-乙基-3-戊醇，1-或2-丁醇，硝基甲烷，二氯甲烷，甲基异丁基酮，二甲基硫醚，四氢噻吩砜等。在等量的各种溶剂的存在下用拆分酶处理对映体混合物后，使用标准萃取或液相色谱程序分离产物。产生最大对映体过量的所需产物的溶剂/酶配对物应该是用于本方法的最佳候选者。
也应评价所选择的有机溶剂的相对量以便获得最佳结果。为此，随后进行与上述相似的工序。使用特定酶/外消旋混合物，所选择的有机溶剂/水性溶剂的比率以如下方式变化95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90和5∶95，([有机溶剂]∶[水性溶剂])。对映体混合物的相同样品在变化比率的有机溶剂与水性溶剂的存在下用标准量的特定酶以规定的时间处理。总体积保持恒定。在等量的各种溶剂的存在下用拆分酶处理对映体混合物之后，使用标准萃取或液相色谱程序来分离产物。产生最大对映体过量的所需产物的溶剂体系/酶配对物应是用于本方法中的最佳候选者。
另外，对于一些外消旋混合物酶有机溶剂结合物，可通过将表面活性剂加到反应中来增强酶活性和降低有机溶剂水平。为了评价表面活性剂是否应该被加到特定方法中，可以实行以下方法的一些变化。首先，表面活性剂通过在由不高于大约50％水混溶性有机溶剂和水性溶剂组成的非均相体系的存在下用所选择的酶和一组表面活性剂处理对映体混合物的样品来选择。该体系应该是与在没有表面活性剂的情况下进行反应相适应的那种。表面活性剂的实例包括Tween系列，如Tween20TM，Tween80TM，PrionexTM，TeepolHB7TM，TergitolTMN-6TM，TergitolTMN-10TM，TergitolNP-4TM，Tergitol15-S-3TM，IgepalCA-630TM，TyloxapolTM，葡萄糖苷-氧化胆酸(Glucode-oxycholic acid)，辛基-β-葡萄糖-吡喃糖苷，CHAPSTM，磺基琥珀酸二辛基酯，或脱氧胆酸。在双相溶剂体系和恒定量的各种表面活性剂的存在下用拆分酶处理对映体混合物之后，使用标准萃取或液相色谱程序分离产物。在规定时间产生最大对映体过量的所需产物的溶剂/酶/表面活性剂结合物应该是用于本方法的最佳候选者。
以取决于一次处理多少样品的浓度或浓度范围来加入表面活性剂。对于给定的溶剂/酶/表面活性剂结合物，应决定最佳的表面活性剂浓度。本技术领域的技术人员将会了解，应该建立仅仅以表面活性剂的浓度不同的一组独立的反应。例如，在pH7-4的20％戊醇和80％三(羟甲基)氨基甲烷或[2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇缓冲剂中使用PLE进行反应。设立具有下列表面活性剂浓度的十个相同反应1％，3％，5％，7.5％，10％，12.5％，15％，20％，25％和30％。在双相溶剂体系的存在下和增加的表面活性剂浓度下用拆分酶以规定的时间处理对映体混合物后，使用标准萃取或液相色谱程序分离产物。在规定时间产生最大对映体过量的所需产物的溶剂/酶/表面活性剂结合物应该是用于本方法的最佳候选者。
用于实施本发明的表面活性剂包括阳离子型、阴离子型、非离子型或两性型，或它们的混合物。优选的表面活性剂将取决于特定酶和/或底物组分。这些筛选工序对本技术领域的那些技术人员是众所周知的。举例性筛选方法在实施例14—30中陈述。
有用的阳离子型表面活性剂的实例包括胺、胺盐、锍、鏻和季铵化合物。这类阳离子表面活性剂的具体实例包括甲基三辛基氯化铵(Aliquat 336)N，N’，N’-聚氧化乙烯(10)-N-牛脂-1，3-二氨基丙烷(EDT-20，’PEG-10牛脂)有用的阴离子表面活性剂例如包括线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、醇乙氧基硫酸盐、羧酸、硫酸酯和烷烃磺酸。阴离子表面活性剂的实例包括Triton QS-30(Anionic)Aerosol22磺基琥珀酸二辛基酯(AOT)烷基硫酸钠(Niaproof)Type-4(4型)Type-8(8型)烷基(C9—C13)硫酸钠(TEEPOL HB7)用于稳定的非离子表面活性剂包括壬基酚乙氧基化物，醇乙氧基化物，脱水山梨醇三油酸酯，非离子嵌段共聚物表面活性剂，酚醇或脂肪酸的聚氧化乙烯或聚氧化乙烯衍生物。非离子表面活性剂的实例包括聚氧化乙烯醚4月桂基醚(Brij 30)23月桂基醚(Brij 35)辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Tritons)Tx-15Tx-100Tx-114Tx-405DF-16N-57DF-12CF-10CF-54聚氧化乙烯脱水山梨醇Monolaurate(单月桂酸酯)(Tween20)脱水山梨醇Sesquioleate(倍半油酸酯)(Arlace83)Trioleate(三油酸酯)(Span85)Polyglycol Ether(聚二醇醚)(Tergitol)TypeNP-4(NP-4型)TypeNP-9(NP-9型)TypeNP-35(NP-35型)TypeTMN-10(TMN-10型)Type15-S-3(15-S-3型)TypeTMN-6(TMN-6型)(2，6，8，-三甲基-4-壬基氧化聚乙烯氧乙醇)Type15-S-40(15-S-3型)
在选择合适的表面活性剂后，有机溶剂的比率有时可显著下降，而不损失产物收率或对映体选择性。所属技术领域的技术人员将明白，测定多大程度地降低有机溶剂的这样一种工序如下使用特定的酶/外消旋混合物/表面活性剂结合物，所选择的有机溶剂与水性溶剂的比率按以下变化[％有机溶剂∶％水性溶剂]，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90和5∶95，以及所需的其它比率。对映体混合物的样品在变化比率的有机溶剂与水性溶剂和表面活性剂的存在下用标准量的特定酶以规定的时间处理。在等量的各种溶剂的存在下用拆分酶处理对映体混合物后，使用标准萃取或液相色谱程序分离产物。产生最大对映体过量的所需产物的溶剂/酶配对物应该是用于本方法的最佳候选者。
实施本发明方法的其它考虑是每单位产物的酶的成本。本发明针对减少以每单位产物为基础的本方法的酶需求量。在一个实施方案中，在非均相体系中减少了有机组分的量。在另一个实施方案中，将表面活性剂加到非均相体系中以进一步减少所需的酶量和进一步减少实施本发明的成本。
本发明尤其针对其中底物包括疏水酯的酶反应。本发明另外针对其中底物在水性溶液中相对不溶的酶反应。具有不完全的水混溶性有机辅助溶剂的非均相体系的使用提供了疏水酯、其它疏水和不溶性化合物的改进溶解作用，与使用水混溶性有机溶剂的体系相比。
为了更好地理解本发明，给出了以下实施例。这些实施例仅仅用于说明，决不被理解为限制本发明的范围。
酶活性通过使用Radiometer pH-stat仪器观察酸的产生，由丁酸乙酯的转化来测定。将丁酸乙酯(40ml)加到20ml的5mM硼酸(pH8)中，并在25℃下搅拌直到完全溶解(10分钟)。加入PLE，和通过加入0.01N NaOH使pH保持在8.0。在5分钟的时间内从碱加入的速度来测定酸生成的速度。
酶稳定性在反应进行的同时测量。测量通过定期取出酶溶液的等份试样和使用丁酸乙酯分析测定活性来进行。实施例2，FTC丁酸酯在83％的正戊基醇(或3-Me-3-戊醇)/水性混合物中的CLECTM-PLE催化反应反应条件和工序与实施例1相同。只是磷酸盐缓冲剂的体积是1ml和有机组分的体积是8.3ml。在36h后正戊基醇的转化率是38％和3-甲基-3-戊醇的转化率是25％(参见表1，反应12和13)。实施例3，FTC丁酸酯在50％正戊基醇/水性混合物中的PSL-催化反应反应条件和工序与实施例1相同，只是使用100mg的可溶性PSL-30(PSL-30是购自Amano的PS30)。在24小时后转化率是56％和(-)-对映异构体优选被水解。剩余酯的光学纯度是92％和转化率为56％(参见表1，反应21)。实施例4，FTC丁酸酯在50％正戊基醇/水性混合物中的ANL-催化反应反应条件和工序与实施例1相同，只是使用200mg的可溶性ANL。在36小时后转化率是45％。剩余酯的光学纯度是63％和转化率是45％(参见表1，反应22)。实施例5，具有2％底物浓度的(±)-FTC丁酸酯在20％的异丙醇(或其它水混溶性有机辅助溶剂)/水性混合物中的PLE催化转化下面的实施例说明在均相体系中使用高用量酶催化剂的现有技术状况。向1ml的购自Altus Biologics，Inc.的Altus PLE溶液(650单位/ml)在39ml的0.3M磷酸盐缓冲剂(pH7.5)中的溶液添加10ml的10％FTC丁酸酯在异丙醇中的溶液。所得到的混合物在24～26℃下搅拌，和反应进程通过HPLC监控。在22h的反应后，转化率达到51％和剩余手性非外消旋酯化合物的光学纯度高于99％(48％化学产率)。这些结果以剩余手性非外消旋酯化合物的HPLC分析为基础。含水层包括水解产物(+)-FTC和(-)-FTC。(+)-FTC和(-)-FTC的比率是96.6对3.4。蒸发有机层以得到0.457g的(-)-FTC丁酸酯。
通过使用其它水混溶性有机辅助溶剂，包括乙腈、DMF、1-甲基-2-吡咯烷酮、甲醇、乙醇、叔丁醇、DMSO、吡啶、二(乙二醇)甲基醚、PEG200和PEG600等来进行类似的反应。乙腈得到了与异丙醇同样的高对映体选择性和需要同样大量的酶。所有其它溶剂得到了比异丙醇更低的对映体选择性。实施例6，具有5％底物浓度的(±)-FTC丁酸酯在20％的异丙醇/水性混合物中的PLE催化转化在2.5ml的购自Altus Biologics，Inc.的Altus PLE溶液(650单位/ml)在37.5ml的0.3M磷酸盐缓冲剂(pH7.5)中的溶液中添加10.0ml的25％FTC丁酸酯在异丙醇中的溶液。在这些条件下，底物被完全溶解。所得到的混合物在24～26℃下搅拌和反应通过HPLC监控。在96h的反应之后，转化率达到60％和剩余酯的光学纯度是74％(38％化学收率)。对映体选择性比具有2％底物浓度的反应更低。实施例7，具有3％底物浓度的(±)-FTC丁酸酯在30％的异丙醇/水溶液中的PLE催化转化在1.5ml的购自Altus Biologics，Inc.的Altus PLE溶液(650单位/ml)在33.5ml的0.3M磷酸盐缓冲剂(pH7.5)中的溶液中添加15ml的10％FTC丁酸酯在异丙醇中的溶液。所得到的混合物在24～26℃下搅拌和反应通过HPLC监控。转化率在2小时后是8％，在此后没有增加。酶在30％的异丙醇很快失去了全部活性。
表1总结了在包括各种不高于大约50％水混溶性的有机溶剂和缓冲剂水溶液的双相非均相体系中FTC丁酸酯与各种酶的拆分反应的结果。
表1在各种双相体系a中FTC丁酸酯的对映体混合物用各种酶的拆分
实施例5—7说明了在均相体系中使用水混溶性醇用于本发明方法的一些问题。这种体系产生了光学纯度降低的产物，延长了反应时间，和使酶失活。实施例8—13，在使用正戊基醇和水的非均相体系中(+)FTC丁酸酯的PLE催化转化反应条件和工序与实施例1相同。非均相体系包括作为催化剂的1ml的Altus PLE溶液(650U/ml)和在以下表2所示的各种体积的戊基醇和磷酸盐缓冲剂。在各种情况下应注意，(+)-异构体的转化的选择性是几乎绝对的，以致所需的稍微高于50％的转化率导致了接近100％的未反应(-)酯的对映体纯度(见表2)。
表2，实施例8—13
实施例14—30，在表面活性剂的存在下在包括正戊基醇和水混合物的非均相体系中(±)-FTC丁酸酯的PLE催化转化实施例14—30在表3中表示。反应条件和工序与实施例1相同。非均相体系包括1ml的作为催化剂的Altus PLE溶液(650单位/ml)和作为表面活性剂加到反应混合物中的1ml(实施例14—21，23，24和30)或0.1g(实施例25—29)的表面活性剂。有机组分包括正戊基醇，和含水组分包括0.3M的磷酸盐缓冲剂，比率50∶50。
表3，实施例14—30
表3续
如表3所示的广泛筛选的表面活性剂显示一些是活化型的(见实施例14，15，19，20，24，28和30)和一些是抑制型的(见实施例16，23，27和29)。选择15种表面活性剂用于进一步分析。表面活性剂Tergitol NP-4，Tween 80，Tyloxapol和磺基琥珀酸二辛基酯钠盐都大约相同程度地增强了PLE活性。在速度上的提高在反应的终止时是最明显的，这归因于酶的稳定化和防止沉淀以及在催化效率上的效果。实施例31—34，在Tween-80的存在下在双相正戊基醇/水混合物中(±)-FTC丁酸酯的PLE催化转化实施例31—34在表4中表示。反应条件和工序与实施例1中相同。非均相体系包括作为表面活性剂的Tween80，0.6ml的作为催化剂的Altus PLE溶液(650U/ml)和所使用的戊基醇和0.3M磷酸盐缓冲剂的体积在下表中给出。
表4，实施例31—34
实施例35，在酶和有机溶剂需求量二者上的对应性下降反应条件和工序与实施例1相同。非均相体系包括0.5ml作为表面活性剂的Tween80，0.3ml作为催化剂的Altus PLE溶液(650U/ml)，和2.0ml作为溶剂的戊基醇和7.5ml的0.3M磷酸盐缓冲剂。非均相体系包括25％的有机组分和75％的含水组分。在48小时后，转化的程度是50％和剩余酯的光学程度是99.3％。
在该实施例中，酶和有机溶剂的量减少了在实施例31—34中所使用水平的几乎一半，而产物收率没有损失。此外，酶需求量仅仅是表5，实施例36—39
实施例40反应条件和工序与实施例1相同。催化剂包括714总单位的猪肝酯酶(Sigma，st.Louis，MO)。非均相体系包括50％作为有机组分的正戊基醇和50％作为含水组分的0.3M的磷酸盐缓冲剂(pH7.4)。在24小时后，转化的程度是50％和剩余酯的光学纯度是97.5％。实施例41，用低酶载量和阴离子表面活性剂的速度提高除了使用Tween-80以外，选择阴离子表面活性剂琥珀酸二辛基磺酸钠盐以提高速度。如表6所示那样，在非均相体系中该表面活性剂的1％载量足以显著提高速度。
反应条件包括1gFTC丁酸酯，0.4％的PLE载量，有机溶剂1-戊醇，2∶8溶剂比率，反应在30℃下进行(表6)。
表6，实施例41
实施例42，表面活性剂对酶载量和有机溶剂浓度的影响本发明的优选实施方案包括0.3—0.4％的酶载量，相对于具有10％底物载量的FTC丁酸酯。以稍大规模进行许多反应以更精确测定一轮一轮变化和转化率对光学纯度的影响。结果如以下表7所示。表7，在低酶载量下的5g规模的反应(28℃，45％1-戊醇，5％Tween，50％水性物质)
如表8所示，以低的有机物/水性物质比率和0.3％的酶载量进行反应在不足48小时获得了高的光学纯度。
表8，在低酶载量下的1g规模的反应(28℃，在20％1-戊醇/5％Tween-80，75％水性物质)
尽管我们在上文中已经描述了许多本发明的实施方案，很明显，可以改动我们的基本构思以提供利用本发明的方法和组合物的其它实施方案。因此，应体会到，本发明的范围通过所附的权利要求书来定义，而不是通过上文存在的作为例子的具体实施方案。
权利要求
1.使用水解酶生产结构式I的手性、非外消旋酯的方法 结构式I其中R是C1—C8烷基，链烯基或炔基；X＝H或F；Y＝CH2，O，S，Se，或NH；该方法包括下列步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％至大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散结构式I的酯的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)在允许该混合物拆分以产生结构式I的手性非外消旋酯和结构式II的非外消旋醇的条件下，将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系； 结构式II其中X＝H或F；Y＝CH2，O，S，Se，或NH，其中上述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中。
2.使用水解酶生产手性、非外消旋疏水酯的方法，该方法包括以下步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％至大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散所述疏水酯的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)在允许上述对映体混合物中的一种对映体形式向相应醇的对映体选择性转化的条件下，将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系；其中所述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中。
3.使用水解酶生产2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的手性、非外消旋酯的方法，所述方法包括以下步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％至大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散上述2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)在允许上述对映体混合物的一种对映体形式向相应醇的对映体选择性转化的条件下，将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系；其中所述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中；其中所述对映体混合物的浓度以所述非均相体系的体积为基础来计算。
4-使用水解酶生产2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的手性、非外消旋酯的方法，所述方法包括以下步骤(a)在有机溶剂体系中以在大约1％至大约25％之间的浓度(重量/非均相体系的体积)分散上述2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷的对映体混合物以产生有机组分；(b)提供水性溶剂体系以产生含水组分；和(c)在允许上述对映体混合物中的一种对映体形式向相应醇的对映体选择性转化的条件下，将上述有机组分和上述含水组分接触以形成非均相体系；其中所述水解酶被分散在上述有机组分、上述含水组分或上述非均相体系中；其中上述有机组分占上述非均相体系的大约5—大约90％；其中上述非均相体系还包括大约1％至大约20％之间的表面活性剂；和其中上述表面活性剂浓度以上述非均相体系的体积为基础计算。
5.根据权利要求1、2、3或4的任一项的方法，其中所述水解酶选自猪肝酯酶、猪胰脂肪酶、假单胞菌属种脂肪酶、黑曲霉脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶。
6.根据权利要求5的方法，其中所述水解酶是交联酶晶体。
7.根据权利要求6的方法，其中所述交联酶晶体是用戊二醛交联的。
8.根据权利要求5的方法，其中所述水解酶是固定化酶。
9.根据权利要求5的方法，其中所述水解酶是可溶性酶。
10.根据权利要求5的方法，其中所述水解酶是猪肝酯酶。
11.根据权利要求1、2、3或4的任一项的方法，其中所述手性非外消旋酯被从所述有机组分中分离出来。
12.根据权利要求1、2、3或4的任一项的方法，其中所述手性非外消旋醇被从所述含水组分中分离出来。
13.根据权利要求1或2的任一项的方法，其中所述对映体混合物是FTC丁酸酯。
14.根据权利要求2的方法，其中所述对映体混合物包括2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷。
15.根据权利要求1、2、3或4中任一项的方法，其中所述对映体混合物以大约5％—大约15％之间的浓度被分散在所述有机组分中。
16.根据权利要求1、2、3或4中任一项的方法，其中所述对映体混合物以在大约1％—大约5％之间的浓度被分散在所述有机组分中。
17.根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述对映体混合物以大约10％—大约20％之间的浓度被分散在所述有机组分中。
18.根据权利要求1、2、3或4中任一项的方法，其中所述有机组分包括不高于大约50％水混溶性的有机溶剂。
19.根据权利要求18的方法，其中所述有机组分包括选自C4—C8醇、硝基甲烷、二氯甲烷、甲苯、甲基异丁基酮、乙酸叔丁基酯和链烷烃中的一种或多种溶剂。
20.根据权利要求19的方法，其中所述有机组分包括正戊基醇和3-甲基-3-戊醇中的一种或二种。
21.根据权利要求4的方法，其中所述表面活性剂选自阳离子型表面活性剂，阴离子型表面活性剂和非离子表面活性剂。
22.根据权利要求21的方法，其中所述表面活性剂选自Tween20TM、Tween90TM、prionexTM、TeepolHB7TM、TergitolTMN-6TM、TergitolTMN-10TM、TergitolNP-4TM、Tergitol15-S-3TM、IgepalCA-630TM、TyloxapolTM、葡萄糖苷-氧化胆酸(Glucode-oxycholic acid)、辛基-β-葡萄糖-吡喃糖苷、磺基琥珀酸二辛基酯和脱氧胆酸。
23.根据权利要求22的方法，其中所述表面活性剂是Tween-80TM。
24.根据权利要求22的方法，其中所述表面活性剂是磺基琥珀酸二辛基酯。
25.根据权利要求4的方法，其中所述表面活性剂被加到所述有机组分中。
26.根据权利要求4的方法，其中所述表面活性剂被加到所述含水组分中。
27.根据权利要求4的方法，其中所述表面活性剂被加到所述非均相体系中。
28.根据权利要求4的方法，其中所述表面活性剂是用所述水解酶配制的。
29.根据权利要求1、2、3或4中任一项的方法，其中所述水性溶剂体系包括水和从缓冲盐、碱化剂、抗微生物防腐剂、稳定剂、过滤助剂、辅酶、有利于分散的赋形剂和有利于酶的作用的赋形剂中选择的赋形剂。
30.根据权利要求29的方法，其中所述水性溶剂体系包括用pH高于大约7的磷酸盐缓冲剂缓冲的水。
31.根据权利要求29的方法，其中所述水性溶剂体系包括用2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇或TRISTM缓冲的水。
32.根据权利要求1、2、3或4中任一项的方法，其中所述允许所述对映体混合物中的一种对映体形式向相应醇的对映体选择性转化的条件包括大约5℃至大约45℃之间的温度。
33.用于使用水解酶生产手性、非外消旋疏水酯的非均相体系，包括(a)水解酶；(b)疏水酯底物；(c)有机组分；和(d)含水组分。
34.根据权利要求33的非均相体系，其中所述水解酶选自猪肝酯酶、猪胰脂肪酶、假单胞菌属种脂肪酶、黑曲霉脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶。
35.根据权利要求33的非均相体系，其中所述水解酶是交联酶晶体。
36.根据权利要求33的非均相体系，其中所述交联酶晶体是用戊二醛交联的。
37.根据权利要求33的非均相体系，其中所述水解酶是固定化酶。
38.根据权利要求33的非均相体系，其中所述水解酶是可溶性酶。
39.根据权利要求34的非均相体系，其中所述水解酶是猪肝酯酶。
40.根据权利要求33的非均相体系，其中所述疏水酯底物是对映体混合物。
41.根据权利要求40的非均相体系，其中所述对映体混合物包括2-丁酰氧甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷。
42.根据权利要求40的非均相体系，其中所述对映体混合物以大约5％—大约15％之间的浓度被分散在所述有机组分中。
43.根据权利要求40的非均相体系，其中所述对映体混合物以大约10％—大约20％之间的浓度被分散在所述有机组分中。
44.根据权利要求40的非均相体系，其中所述对映体混合物以大约1％—大约5％之间的浓度被分散在所述有机组分中。
45.根据权利要求33的非均相体系，其中所述有机组分包括不高于大约50％水混溶性的有机溶剂。
46.根据权利要求45的非均相体系，其中所述不高于大约50％水混溶性的有机溶剂包括选自C4—C8醇、硝基甲烷、二氯甲烷、甲苯、甲基异丁基酮、乙酸叔丁基酯和烷烃中的一种或多种溶剂。
47.根据权利要求46的非均相体系，其中所述有机组分包括正戊基醇和3-甲基-3-戊醇中的一种或两种。
48.根据权利要求33的非均相体系，它进一步包括表面活性剂。
49.根据权利要求48的非均相体系，其中所述表面活性剂选自阳离子型表面活性剂，阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。
50.根据权利要求49的非均相体系，其中所述表面活性剂选自Tween20TM、Tween80TM、PrionexTM、TeepolHB7TM、TergitolTMN-6TM、TergitolTMN-10TM、TergitolNP-4TM、Tergitol15-S-3TM、IgepalCA-630TM、TyloxapolTM、葡萄糖苷-氧化胆酸(Glucode-oxycholic acid)、辛基-β-葡萄糖-吡喃糖苷、磺基琥珀酸二辛基酯、或脱氧胆酸。
51.根据权利要求50的非均相体系，其中所述表面活性剂是Tween80TM。
52.根据权利要求50的非均相体系，其中所述表面活性剂是磺基琥珀酸二辛基酯。
53.根据权利要求48的非均相体系，其中所述有机组分包括所述表面活性剂。
54.根据权利要求48的非均相体系，其中所述含水组分包括所述表面活性剂。
55.根据权利要求48的非均相体系，其中所述表面活性剂是用所述水解酶配制的。
56.根据权利要求33的非均相体系，其中所述水性溶剂体系包括水和从缓冲盐、碱化剂、抗微生物防腐剂、稳定剂、过滤助剂、辅酶、有利于分散的赋形剂和有利于酶的作用的赋形剂中选择的赋形剂。
57.根据权利要求33的非均相体系，其中所述水性溶剂体系包括用pH高于大约7的磷酸盐缓冲剂缓冲的水。
58.根据权利要求33的非均相体系，其中所述含水组分包括用pH高于大约7的2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇(TRISTM)缓冲的水。
59.根据权利要求33的非均相体系，其中所述有机组分和所述含水组分是在允许所述对映体混合物中的一种对映体形式向相应醇的对映体选择性转化的条件下接触的。
60.根据权利要求59的非均相体系，其中所述有机组分和所述含水组分是在允许所述对映体混合物中的一种对映体形式向相应醇的对映体选择性转化的条件下接触的，该条件包括在大约5℃至大约45℃之间的温度。
全文摘要
本发明涉及使用双相溶剂体系对疏水酯的对映体混合物进行生物催化剂介导的对映体选择性转化的方法。更具体地说,本发明涉及抗病毒化合物,如2－羟甲基－5－(5－氟胞嘧啶－1－基)－1,3－氧硫杂环戊烷(FTC)和它的类似物在非均相反应体系中的酶介导的对映体选择性合成。
文档编号C07H19/06GK1329671SQ9981189
公开日2002年1月2日 申请日期1999年10月8日 优先权日1998年10月9日
发明者姚益明, 王益方 申请人:爱尔特斯生物学公司