专利名称：除去n－末端蛋氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种方法，这种方法在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠的存在下，能够有效地从具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基或该蛋氨酸残基的二酮的肽(包括蛋白质)或其盐中除去所述N-末端蛋氨酸残基或该蛋氨酸残基的二酮的方法；另外，本发明还涉及一种N-末端不含可被氧化的蛋氨酸残基或该蛋氨酸残基的二酮的肽或其盐的制造法。
背景技术：
我们知道，当蛋白质在细胞内进行生物合成时，其N-末端是从蛋氨酸开始的，这个蛋氨酸与mRNA的起始密码子AUG相对应。但是通常这个蛋氨酸通过在随后过程中被除去，它不存在于成熟蛋白质分子中。
随着重组DNA技术的进步，可以通过微生物和/或动物细胞，比如大肠杆菌合成有用的蛋白质，然而通过这类方法合成的蛋白质中仍发现保留所述蛋氨酸的例子。比如表达在大肠杆菌里的人类生长激素中带有蛋氨酸的比率几乎达到了100％[自然(Nature)，293，408(1981)]，α-干扰素中达到了50％[干扰素研究杂志(J.Interferon Res.)，1，381(1981)]，在非糖基化人白细胞介素-2(IL-2)中，除了已知rIL-2与天然人白细胞介素-2一样是自丙氨酸起始以外，已有人注意到存在氨基酸末端具有蛋氨酸(N-末端有蛋氨酸残基)的人白细胞介素2分子(Met-rIL-2)。
关于用化学方法除去N-末端氨基酸，Dixon早在1964年已报导，使DL-丙胺酰甘氨酸与乙醛酸、吡啶、乙酸酮发生转氨反应可导致生成丙酮酰甘氨酸[生物化学杂志(Biochem.J.)，92，661(1964)]，他还报道，氨基硫脲与化合物反应可引起胺键裂解，生成甘氨酸[生物化学杂志，90，2C(1964)]。他随后将该反应应用于假单胞菌细胞色素c-551(Pseudomonas cytochrom c-551)，报道了N-末端谷氨酸被除去[生物化学杂志，94，463(1965)]。
具有或不具有N-末端蛋氨酸的各种蛋白质分子可在高级结构、生物活性、和/或稳定性方面各不相同，而且在其N-末端添加蛋氨酸有可能增加抗原性。因此从工业实用性考虑，建立一种除去对应于起始密码子的N-末端蛋氨酸的方法有重大意义。
为解决这个问题，曾有人提出了用溴化氰(BrCN)分解来除去蛋氨酸[科学(Science)，198，1056(1977)]。但是，该方法除了要求成熟蛋白质中不含有蛋氨酸残基外，还使蛋白质经受具有不良影响的化学反应，得不到满意的结果。
除了平成10年72489号(EP-A-812856)所述方法，从具有N-末端蛋氨酸残基的肽或蛋白质中，以选择性并且有效的方式，除去该N-末端蛋氨酸残基，而不论肽或蛋白质的种类如何的方法目前未知。这主要是由于难以鉴定在温和调节下，在不改变终产物、即肽或蛋白质的前提下，能除去N-末端蛋氨酸残基的化学反应。特别是，除去相对大分子的基因工程蛋白质(尤其作为治疗剂使用的那些)中多余之N-末端蛋氨酸时，要求该蛋白质在除去蛋氨酸后活性不受影响，因此通常需要在不加热的情况下从弱酸性溶液到弱碱性溶性持续反应。这是及其苛刻的化学反应条件，现有状况是，尚未鉴定出一组有利的反应。
发明公开本发明者进行了反复试验，旨在通过只切除遗传工程所合成肽(包括蛋白质)的N-末端蛋氨酸残基而提供一种可模拟天然氨基酸序列之肽的生产方法。结果，发现有可能从具有该蛋氨酸二酮的肽上除去该蛋氨酸二酮，其方法是使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽(如方案1式(I)所示)与乙醛酸(一种α-二酮)、或硫酸铜(能提供过度金属离子)、或吡啶(一种碱基如胺)进行转氨基反应，而产生具有该蛋氨酸二酮的肽。然后在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠等存在下，使该肽与3，4-二氨基苯甲酸(一种碱基如二胺)反应。然后水解。就有可能从具有该蛋氨酸二酮的肽中极有效地除去该二酮蛋氨酸残基。因此，本发明者鉴定了一种方法，其从具有蛋氨酸残基的肽中以高产率除去可被氧化的N-末端蛋氨酸残基，从而产生不具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基且活性并未降低的肽，本发明人还进行了进一步研究，以期完成本发明。(方案1) [式(I)中，m表示0或2的整数，X代表具有一个氨基酸残基或至少2个以上氨基酸的任意肽链，但从实用性上来看，实例可以是对应于遗传工程所合成蛋白质之X的一条肽链。另外，在本专利说明书中，术语“蛋白质”或“肽”可指含有多个氨基酸的肽，如果是或蛋白质，可指非糖基化或糖基化的肽或蛋白质。]在本专利说明书上述方案1中，通式(I)所代表的化合物可称之为“具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽”或“具有蛋氨酸残基的肽”；在通式(I)中表示为 [该式中m意义同前述]的部分结构可指“可被氧化的蛋氨酸残基”或“蛋氨酸残基”或“蛋氨酸”；
通式(II)中所代表的化合物可指“具有N-末端可被氧化的蛋氨酸二酮残基的肽”或“具有蛋氨酸二酮残基的肽”；在通式(II)中表示为 [式中m意义同前述]的部分结构可指“可被氧化的蛋氨酸二酮残基”或“蛋氨酸二酮残基”；以及通式(III)所代表的化合物可指“不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽”或“不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽”。
因此，本发明涉及(1)一种除去该蛋氨酸二酮的方法，其特征为，在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其盐与3，4-二氨基苯甲酸或其盐进行反应；(2)方法(1)，其中具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐是通过使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮反应而获得的；(3)方法(2)，其中具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽是通过遗传工程合成的肽；(4)方法(1)，其中肽是(i)生长激素，(ii)β-动物纤维素，(iii)白细胞介素-2(IL-2)，(iv)促神经激素(neutrophin)-3，或(v)apelin；(5)方法(1)，其中所述肽是生长激素；(6)方法(1)，其特征是，乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠作为约0.1或8mol/L的pH约2至9的缓冲液使用；(7)一种除去所述蛋氨酸二酮残基的方法，其特征为，在乙酸及甲酸钠的存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐与3，4-二氨基苯甲酸或其盐进行反应；
(8)一种生产不含有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐的方法，其特征为，在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠，或甲酸及乙酸钠存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其盐与3，4-二氨基苯甲酸或其盐进行反应；(9)生产方法(8)，其中具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其盐是通过通过使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮反应而获得的；(10)生产方法(8)，其特征为，乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠，或甲酸及乙酸钠作为约0.1-8mol/L的pH约2-9的缓冲液使用；(11)一种生产不含有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐的方法，其特征为，在乙酸及甲酸钠存在下，使具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮的肽或其盐与3，4-二氨基苯甲酸或其盐进行反应；(12)一种生产方法，其用于生产不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的人生长激素或其盐，其特征为，将经遗传工程产生的、具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的人生长激素或其盐与乙醛酸或其盐在硫酸铜和吡啶存在下反应，然后与3，4-二氨基苯甲酸或其盐在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠存在下反应；(13)一种应用，其利用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐，以除去具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐中的N-蛋氨酸残基；(14)一种应用，其利用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐，以除去具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐中的蛋氨酸二酮残基；(15)一种应用，其利用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐，从具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐生产不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐；(16)一种应用，其利用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐，从具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐生产不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐。
附图简述
图1表示实施例4a)的电泳结果。泳道1表示分子量标志物，泳道2表示纯化的hGH。
图2表示实施例16a)的电泳结果。泳道1表示分子量标志物，泳道2表示从实施例15得到的BTC。
图3表示实施例18a)的电泳结果。泳道1表示分子量标志物，泳道2表示从实施例17得到的IL-2。
图4表示实施例26所用的DNA片段。
图5表示实施例26的人apelin-36双链的合成模式图。
图6表示实施例27得到的质粒pTB960-13的结构图。
本发明的最佳实施方案在本说明书中，可被氧化的蛋氨酸残基指下述蛋氨酸残基或其亚砜，其中所述蛋氨酸亚砜残基可包括蛋氨酸亚砜或蛋氨酸砜。
尽管具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽是用CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-X[其中，m表示0或2的整数，X表示氨基酸残基或肽链]表示的肽，但也可以是所述肽的盐形式，只要其不抑制本发明的反应，优选药学上允许的盐类，例如含有盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、或磷酸等的无机酸盐，含有乙酸、苯二甲酸、延胡索酸、酒石酸、马来酸、枸橼酸、琥珀酸、甲磺酸、或邻甲苯磺酸等的有机酸盐、碱金属盐如钠盐、或钾盐等，碱土类金属盐如钙盐或铵盐等。
具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽优选是通过遗传工程合成的、具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽。
上述式中，m优选为0，X优选含有至少2个氨基酸的肽。
本发明的肽可以是具有不到50个氨基酸的“肽”，或具有至少50个氨基酸的“蛋白质”。
因此，本说明书中术语“肽”不仅包括具有不到50个氨基酸的分子，还包括具有至少50个氨基酸的分子，优选使用具有至少50个氨基酸的分子(“蛋白质”)。
优选肽包含2-1000个氨基酸，更优选包含15-500个氨基酸，具体实例如以下蛋白质生长激素(GH)[例如，人生长激素(hGH)(如20K-Hgh和22K-hGH)]、β-动物纤维素(BTC)、甲状旁腺激素(PTH)、胰岛素、神经生长因子、脑部衍生的神经营养因子、睫状体神经营养因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、促神经激素-3，4或6、中枢神经系统生长因子、神经胶质细胞生长因子、肺衍生的神经营养因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板生长因子、转化生长因子α或β、血管内皮细胞生长因子、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、蛋白C、血栓调节素、骨生长因子、降钙素、胰岛素样生长因子、干扰素α，β或γ、白细胞介素-1(α，β)至白细胞介素-12、粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血栓形成素、促红细胞生成素、PACAP、心房利钠肽、内皮素、巨噬细胞生长发育因子、造血干细胞生长因子、肝细胞生长因子、胃动素、免疫毒素、肿瘤坏死因子、水蛭素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素、血管紧张素2及其肽拮抗剂、血管紧张素3、舒缓激肽、血管舒缓激肽加强因子、α，β或γ内啡肽、脑啡肽、嗜中性粒细胞趋化因子、促胃液素、胰高血糖素、生长激素释放因子、京都啡肽、胰激肽、促性腺激素释放激素、肥大细胞脱颗粒肽、黑色素细胞刺激激素、神经紧张素、胰蛋白酶抑制剂、催产素、前胰岛素C-肽、分泌素、生长激素抑制因子、促甲状腺素释放激素、泛激素、尿抑胃素、加压素、激肽、吞噬刺激素、促生长因子、促肾上腺皮质激素释放因子、胰岛素样生长因子、降钙素基因相关肽、PTHrP、VIP、DHI、胰岛素调理素、GRP、CCK-PZ、促生长激素神经肽(galanin)、窦肽(antrum peptide)、PPY、胰多肽(pancreaticpolypeptide)、PSP、胰抑素、hCG、hCS、松弛素、血清胸腺因子、促胸腺生成激素、胸腺素、XIII因子、VIII因子、尿激酶原、SOD、VIIa因子、抗凝血酶、或apelin、或它们的突变蛋白(其在野生型蛋白质中有至少一个氨基酸置换、缺失或添加，从而显示相同于野生型蛋白质或更高的生物学或免疫学活性)、或通过化学合成等方法产生的已知肽或新型肽，其中所用肽特别优选经遗传工程产生的肽(包括蛋白质)，尤其是遗传工程产生的生长激素[例如，人生长激素(hGH)(如20K-hGH和22K-hGH)]、促神经激素-3、BTC、甲状旁腺激素、IL-2、apelin、或它们的突变蛋白，特别是生长激素类[如人生长激素(hGH)(有20K-Hgh、22K-hGH)]及它们的突变蛋白，尤其优选的是生长激素类[如人生长激素(hGH)(如20K-Hgh和22K-hGH)]。所述apelin可以是例如Biochem.Biophys.Res.Commun.，251，471-476(1998)中描述的人apelin-36、人apelin-13、或已将apelin-13的N-末端氨基酸(Gln)转化为焦谷氨酸的肽；任何类型的肽只要具有针对APJ的配体活性则都可以接受(Odowd.B.F.等，基因，436，355-359(1993))，实例如专利申请平成10年271654号“对氨基酸序列等同或部分等同于3号序列的受体蛋白具有结合能力的多肽”中所述。
尽管上述肽(其也可是野生型蛋白质)可来自于任何一种动物，从实用性来讲，最好选用人的肽(其也可是包括蛋白质)。
所述肽在除去可被氧化的N-末端蛋氨酸(Met)残基或该蛋氨酸的二酮残基之前或之后可进行再折叠(活化或再生)。
在本说明书中，具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐指用式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X[式中，m表示0-2的整数，X表示氨基酸残基或肽链]所表示的化合物或其盐。具有可被氧化的N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐可以通过化学反应或酶反应等各种反应来获得。例如，化学方法可以是，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮反应，从而通过转氨基反应获得具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐(平成10年专利申请72489号(EP-A-812856))。
在本说明书中，α-二酮可以是任何二酮，只要其使上述肽或其盐的转氨基反应能够进行，实例如用式R1-CO-CO-R2所表示的化合物或其盐[式中，R1表示可以被氢或羧基(优选氢或甲基、更优选氢)所取代的低级烷基或苯基，R2表示可以被羟基、低级烷氧基或低级烷基(优选羟基)所取代的氨基]。
上式中R1所表示的低级烷基有含1-6个碳原子的烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、或叔丁基等，R2所表示的低级烷氧基有含1-6个碳原子的烷基如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、或叔丁氧基等。R2所表示的可含有低级烷基取代的氨基有包含上述R1所表示的1或2个低级烷基的氨基等。盐的实例如类似于上述含可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽盐一样的盐类。
α-二酮的具体例子有乙醛酸、丙酸、草乙酸、苯乙醛酸、2-氧代戊二酸等，其中优选乙醛酸。
α-二酮也可以为盐形式，如钠盐、钾盐等碱金属盐，盐酸盐等无机盐。
具有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮之间的转氨基反应通常优选使1摩尔肽或其盐与约1-10,000摩尔(优选2000-4000摩尔)α-二酮，在大约0-70℃(优选约20-40℃)的条件下进行约10分钟-5个小时(优选约20分钟-2个小时)的反应。只要是不影响所述转氨基反应的任何缓冲液都可以使用(例如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、枸橼酸缓冲液等)，其中最优选乙酸缓冲液。反应中pH优选调整至约2-9，尤其约4-7，最好约pH5-6。
为了促进这种转氨基反应的进程，最好是在过渡态金属离子的存在下使α-二酮反应，通常优选用约0.001-0.1摩尔(优选0.01-0.05摩尔)的过渡态金属离子与1摩尔的α-二酮反应。可使用的过渡态金属离子有铜离子(Cu+，Cu2+)、钴离子(Co2+，Co3+)、镍离子(Ni2+，Ni3+)、铁离子(Fe2+，Fe3+)、锌离子(Zn2+)、铝离子(Al3+)、锰离子(Mn2+等)、镓离子(Ga3+)、铟离子(In3+)、镁离子(Mg2+)和钙离子(Ca2+)，其中优选铜离子或钴离子，尤其优选铜离子(Cu2+)。这些过渡态金属离子通常可以与无机酸如硫酸、硝酸、盐酸或高氯酸，或与有机酸如乙酸、草酸、枸橼酸或碳酸等形成盐形式而添加到反应溶液里，其中优选硫酸铜、乙酸铜，尤其优选硫酸铜。
又，最好在碱基的存在下使α-二酮反应，通常1摩尔的α-二酮使用0.1-20摩尔(优选0.5-10摩尔)的碱基。碱基可以使用烷基胺类如三乙胺、三丁胺等，芳香族胺类如N，N-二甲基苯胺、吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶、或咪唑等，其中最好选用吡啶。
又，在具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐进行转氨基反应期间，或在具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐经转氨基反应产生具有蛋氨酸二酮残基的肽或其盐时，为了防止沉淀，优选根据上述肽、具有蛋氨酸二酮残基的肽、或其盐的种类，向转氨基缓冲液中添加尿素。如使用hGH时，在缓冲液中添加的尿素浓度优选为约1-8M，更优选为约3-6M。
而且，在上述转氨基反应中，优选在过渡态金属离子及碱基的存在下使α-二酮反应，实践时，把含有过渡态金属离子、碱基以及α-二酮3个成分的混合液(如硫酸铜、吡啶以及乙醛酸等)添加到具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐的水溶液中，使转氨基反应得以进行。
通过该转氨基反应获得的、用式CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-X[式中的m表示0或2的整数，X表示氨基酸残基或肽链]所表示的化合物或其盐可从反应溶液中分离，并通过公知纯化肽或蛋白质的方法如提取、盐析、分配、重结晶、或色谱法等纯化，也可以使所述化合物或其盐进行下面的水解反应。
用转氨基反应所得到的具有蛋氨酸二酮残基的肽或其盐通常可以转换为不具有可被氧化之N-末端氨酸残基或该蛋氨酸残基之二酮的氨基酸、肽或其盐。
水解反应中使用的碱基可以是如半胱胺、三乙胺、或三丁胺等烷基胺或其盐，N，N-二甲基苯胺、吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶、或咪唑等芳香族胺或其盐，邻苯二胺、亚苄基-3，4-二胺、3，4-二氨基苯甲酸或它的正烷基取代物(如正甲基-1，2-苯二胺、正乙基-1，2-苯二胺、或正异丙基-1，2-苯二胺等)、2，3-二氨基苯酚、或4-氯-邻苯二胺等二胺或其盐，优选芳香族二胺，尤其3，4-二氨基苯甲酸或其正烷基取代物(如正甲基-1，2-苯二胺、正乙基-1，2-苯二胺、正异丙基-1，2-苯二胺等)，氨基硫脲、丙酮氨基硫脲、或苯氨基硫脲等氨基硫脲，氨基硒脲、丙酮氨基硒脲等氨基硒脲或其盐，优选胺，尤其二胺或氨基硫脲或其盐，特别优选3，4-二氨基苯甲酸或其盐。
在水解反应中可使用的碱基实例如一种类似于具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽盐的碱基。
相对于1摩尔的具有蛋氨酸二酮残基的肽或其盐，碱基需要约1-10000摩尔，优选约200-3000摩尔，更优选约500-3000摩尔。水解反应通常在0-70℃(优选20-40℃)进行约1小时-7天(优选约10小时-5天)。反应时最好以缓冲液为溶剂，这类缓冲液实例如甲酸系列缓冲液(如乙酸-甲酸钠、甲酸-甲酸钠、或甲酸-乙酸钠等)。尽管只要不抑制上述水解反应，任何缓冲液都可使用，但优选乙酸-甲酸钠、甲酸-甲酸钠、或甲酸-乙酸钠缓冲液。反应中pH最好调节到约2-9，尤其约3-7，最优选为4-6。缓冲液的用量优选约0.1-8mol/L，更优选约0.5-6mol/L。
为防止不具有可被氧化之N-末端蛋氨酸的氨基酸、肽或其盐(由具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮的肽或其盐经水解产生)沉淀，优选根据所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮的肽的种类，以及所述不具有蛋氨酸残基之氨基酸、肽、或其盐的种类，向水解反应缓冲液中添加尿素。例如，使用hGH时，优选向缓冲液里加约1-6M的尿素，更优选约2-5M。
尽管如此获得的氨基酸、肽、或其盐可从反应液中分离，并经已知纯化方法如提取、盐析、分配、重结晶、或色谱等纯化，但优选使用SP-Sepharose(Pharmacia Biotech)或DEAE-5PW(Tosoh Corporation)经离子交换层析纯化。
本发明合成的肽其N-末端不具有蛋氨酸，并具有与生物学活性靶肽(如生物学活性天然多肽)相同的氨基酸序列，这类肽具有所述靶肽(如天然多肽)的类似活性，毒性低，可作为药剂或诊断试剂安全使用。
本发明使得有可能从具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基或该蛋氨酸的二酮的肽中特异地除去该蛋氨酸残基或该蛋氨酸二酮。
在本发明的说明书及附图中使用缩写符号表示氨基酸，其符合IUPAC-IUB生化命名委员会的缩写符号或该领域的惯用缩写符号，见以下实例。当氨基酸显示光学异构现象时，若没有特别提示均表示L-构型。
SDS十二烷硫酸钠Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val缬氨酸Leu亮氨酸Iie异亮氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Cys半胱氨酸Met蛋氨酸Glu谷氨酸Gln谷氨酰胺Asp天冬氨酸Asn天冬酰胺Lys赖氨酸Arg精氨酸His组氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸
Trp色氨酸Pro脯氨酸AsxAsp+AsnGlxGlu+Gln以下参考例和实施例仅为具体描述本发明，并非限制。
参考例1(使用T7启动子构建人生长激素(hGH)表达载体)hGH的结构基因通过PCR扩增从人脑垂体cDNA文库(Quick-Clone，CLONTECH公司)中回收，所用引物一个含有紧邻该结构基因起始密码子上游的NdeI切割位点，另一个含有紧邻该结构基因终止密码子下游的BamHI切割位点。由此得到两端均加有限制性内切酶识别位点的hGH酶基因，将其连接至pT7 Blue(DNA连接试剂盒Ver.2宝酒造株式会社)的T克隆位点，产生pT7HGH-Na。将其导入大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选转化体。
另一方面，如下构建表达载体。pBR322用NdeI切割，再用T4 DNA聚合酶(DNA钝化试剂盒，宝酒造株式会社)使末端钝化，重新连接，产生pBRdesNde，其NdeI识别位点缺失。pET3c用BgI II-Eco RV切割，回收约0.26kbp的片段，然后用T4 DNA聚合酶使末端钝化，连接至pBRdesNde的Sca I片段，产生pBR/T7 desNde。或者，经定点诱变(Quick-Change，Stratagene)制备pBR322desBam，其为缺失了BamHI位点的pBR322。将pBR322desBam的Sph I-Eco RV片段与pBR/T7 desNde的Sph I-Eco RV片段连接，产生四环素抗性表达载体pTC。将其中四环素抗性基因和T7启动子反向的载体命名为pTC1，将其中所述基因与启动子同向的载体命名为pTC2。
pT7HGH-Na用Nde I及Bam HI切割，回收hGH结构基因，将其连接至pTC1的Nde I-Bam HI片段，然后导入大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素抗性筛选转化体，从中回收质粒，命名为表达质粒pTCHGH-Na。
大肠杆菌MM294用含有T7 RNA聚合酶基因的重组λ噬菌体(Studier，出处同上)溶源化。然后将hGH表达载体pTCHGH-Na导入该大肠杆菌MM294(DE3)，获得了大肠杆菌MM294(DE3)/pTCHGH-Na。另外hGH的碱基序列在产生pTCHGH-Na时用ABI Prism 377ADNA测序仪证实。
参考例2(具有蛋氨酸残基的hGH(Met-hGH)在大肠杆菌的表达)
将参考例1得到的转化体放入含有1升LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)和5mg/L四环素的2升烧瓶中，30℃振荡培养16小时。将所得培养液转入含20升LB培养基(其含0.02％Newpol LB-625(消泡剂，三洋化成工业)及5mg/L四环素)的50升发酵罐中，37℃通气培养6小时。再转入含360升发酵培养基(1.68％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.1％氯化铵、0.05％氯化钠、0.05％硫酸镁、0.05％Newpol LB-625、0.0005％盐酸硫胺素、1.5％葡萄糖、3.0％Hy-Case Amino、1.0％酵母提取物)的500升发酵罐中，开始37℃通气搅拌培养。当培养液浊度达到约1200Klett单位时，添加17.85mg/L异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTQ)，继续培养时再加入24升的30％葡萄糖，5小时后离心分离培养液，得到约12.3kg湿重的细胞，冻存在-80℃。
上述转化的大肠杆菌(MM294(DE3)，pTCHGH-Na)于1997年12月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏号FERM P-16546，后又于1999年9月24日转为国际保藏，保藏号FERMBP-6888。上述转化的大肠杆菌(MM294(DE3)，pTCHGH-Na)于1997年10月16日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏号IFO 16124。
实施例1(活化Met-hGH)在参考例2所得2kg细胞中，加入50mM Tris/HCl和8M盐酸胍(pH8.0)共6升以裂解细胞，然后用超声细胞破碎机(Sonifier-450、Branson UltrasonicsCorporation)进行超声破碎，离心(10000rpm、120分钟)。向所得的6升上清液中加入50mM Tris/HCl、0.28mM GSSG、1.4mM GSH、0.7M精氨酸(pH8.0)共18升，将pH调整到8.0，4℃活化4天。
实施例2(纯化Met-hGH)将实施例1活化后的再生液用Pellicon盒式系统(PTGC膜，Millipore公司)加入20mM Tris/HCl、2.5M尿素(pH8.0)进行脱盐和浓缩，直至导电性低于10mS，然后对得到的浓缩液5升加入50mM磷酸缓冲液(pH6.0)稀释至50升，4℃下静置过夜。再进行连续离心分离(JCF-Z转头，Beckman公司)，向上清液50升加入10M氢氧化钠将pH调整到7.12，用Pellicon盒式系统(PTGC膜，Millipore公司)浓缩，将缓冲液置换为20mM Tris/HCl(pH8.0)之后，离心(10000rpm、30分钟)得到了上清液。再将这个上清液吸附于用20mMTris/HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱(20cmφ×84cm，Tosoh公司)，充分洗净之后，用20mM Tris/HCl含50mM氯化钠(pH8.0)洗脱，得到了95升洗脱液作为Met-hGH级分。再进一步将这洗脱液用Pellicon盒式系统(PTGC膜，Millipore公司)进行浓缩和脱盐，然后将缓冲液置换为20mMTris/HCl、6M尿素(pH8.0)得到了12.21g的Met-hGH。
实施例3(除去N-末端蛋氨酸残基(N-末端Met)的方法)在实施例2中得到的Met-hGH溶液1800毫升里加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸铜、和50％吡啶溶液共450毫升，充分搅拌之后在25℃下反应60分钟。然后再用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(11.3cmφ×125cm、PharmaciaBiotech公司)按照3L/h的流速洗脱，使用与平衡时一样的缓冲液继续，获得具有蛋氨酸二酮的hGH级分4.2升。将其加入1.2M乙酸、2.4M甲酸钠、3.6M尿素溶液、和48mM 3，4-二氨基苯甲酸溶液20.8升中，充分搅拌，然后在30℃下缓慢搅拌使之反应3天。反应后用Pellicon盒式系列(PTGC膜，Millipore公司)将此溶液浓缩到14升，分2次各7升用20mM Tris/HCl、4.0M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(25.2cmφ×50cm，Pharmacia Biotech公司)按照6L/h的流速洗脱，收集到了20升洗脱物，为hGH级分。再在DEAE-5PW柱(21cm×30cm、Tosoh公司)上经高速液相层析(Gilson HPLC系统，Gilson有限公司)使此溶液流动吸附(flow adsorption)，然后在70％-85％溶剂B的pH梯度(其产生于A＝50mM Tris/HCl+2.5M尿素(Ph8.0)，和B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0))中320毫升/分的流速洗脱70分钟，得到5.84升hGH级分。向其中加入16毫升10M NaOH溶液将pH值调至7.1，分8批进行高速液相层析(Gilson HPLC系统，Gilson有限公司)。使指定量浓缩液流过POROS 20R1柱(5cm×60cm，Nihon PerSeptive Ltd.)并与之吸附，然后在50％-85％溶剂B的pH梯度(通过A＝25％正丙醇+75％50mM Tris/HCl(pH8.5)、B＝35％正丙醇+65％50mM Tris/HCl(pH8.5)产生)中以50毫升/分的流速洗脱150分钟，得到34.7升洗脱物，为hGH级分。将该洗脱物加蒸馏水稀释到200升，然后在Pellicon盒系统(PTGC膜，Millipore公司)中浓缩到5升，再分3次经高速液相层析(Gilson HPLC系统，Gilson有限公司)流过DEAE-5PW柱(10.8cm×20cm、Tosoh公司)并吸附，在70％-85％的pH梯度(通过A＝50mM Tris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)和B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)产生)中以80毫升/分的流速洗脱70分钟，得到1616毫升的hGH级分。向该hGH级分中加入2毫升的10M NaOH溶液将pH调至7.1，用超滤膜(Omega膜，富士胶片公司)浓缩，得到0.4升浓缩液。使之以2升/h的流速流过用蒸馏水平衡的Sephacryl S-100柱(11.3cmφ×50cm、Pharmacia Biotech公司)，得到hGH级分。此外，使该溶液滤过Millipack60(Millipore公司)，获得2391ml hGH溶液(4683mg hGH)。
实施例4(hGH的鉴定)(a)用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析向实施例3所得hGH中加入等量样品缓冲液(其含有100mM DTT[Laemmli，自然，227，680(1979)]并充分搅拌，95℃加热2分钟，用Multigel10/20(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.)电泳。电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色，发现约22Kda的一条带，从而证实纯化的hGH是单体(图1)。
(b)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Perkin Elmer Applied Biosystems，477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得hGH的N-末端氨基酸序列与由cDNA碱基序列推导的hGH的N-末端氨基酸序列一致(表1)。
表1残基编号所测的PTH1)氨基酸(pM) 由hGH碱基序列推导的氨基酸1Phe(848) Phe2Pro(520) Pro3Thr(403) Thr4Ile(620) Tle5Pro(401) Pro6Leu(429) Leu7Ser(92) Ser8Arg(262) Arg9Leu(376) Leu10 Phe(283) Phe11 Asp(182) Asp12 Asn(175) Asn13 Ala(175) Ala14 Met(194) Met
15Leu(261) Leu16Arg(181) Arg17Ala(144) Ala18His(80) His19Arg(152) Arg20Leu(200) Leu21His(71) His1)苯基硫代乙内酰脲用1nmol进行分析。
(c)氨基酸组成的分析用氨基酸分析仪(L-8500A、日立)测定了氨基酸组成。所得hGH的氨基酸组成与由cDNA碱基序列推导的氨基酸组成一致(表2)。
表2氨基酸每摩尔的残基数由hGH碱基序列推导的值Asx 19.8 20Thr1)9.7 10Ser1)16.1 18Glx 27.0 27Pro 7.7 8Gly 8.0 8Ala 6.9 7Cys2)N.D. 4Val 6.8 7Met 2.9 3Ile 7.4 8Leu 26.6 26Tyr 7.9 8Phe 12.4 13His 3.0 3Lys 8.7 9Arg 10.7 11
Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巯基乙酸，110℃、水解24和水解48小时的平均值)1)0小时外插值。
2)未检出。
用约10μg进行分析。
(d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析仪(L-8500A、日立)测定了C-末端氨基酸。所得hGH的C-末端氨基酸与由cDNA碱基序列推导的C-末端氨基酸一致(表3)。
表3C-末端氨基酸 回收率(％)Phe 94气相肼解(Phase hydrazinolysis)(100℃6小时)用20nmol进行分析。
实施例5(测定hGH活性)实施例3所得的纯化hGH对Nb2细胞的生长促进活性(临床内分泌学和代谢，51卷，1058页(1980))等同于标准品(Chemicon Intemational，Inc.，Temecula，Califomia，USA)。
实施例6(除去N-末端Met)实施例3所得具有蛋胺酰二酮残基的hGH级分0.4ml，向其中加入20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)，稀释至2毫升。向该溶液中加入等量的4M乙酸、4M乙酸钠、和6M尿素溶液，以及80mM N-甲基-1，2-苯二胺溶液，充分搅拌，30℃反应20小时。然后使溶液以60ml/h的流速流过用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)预平衡的Sephadex G-25柱(1cmφ×30cm，Pharmacia公司)，收集到hGH级分10ml。然后将此溶液上样于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，经高速液相层析(Gilson HPLC系统，Gilson公司)后吸附，在70％-85％溶剂B的pH梯度(通过A＝50mMTris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)产生)中以7.5ml/min的流速洗脱70分钟，得到hGH。
实施例7(除去N-末端Met)
实施例3所得具有蛋胺酰二酮残基的hGH级分0.4ml，向其中加入20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)，稀释至2毫升。向该稀释液中加入等量的2M乙酸、4M乙酸钠、和6M尿素溶液，以及80mM N-甲基-1，2-苯二胺溶液，充分搅拌，30℃反应20小时。然后使溶液以60ml/h的流速流过用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)预平衡的Sephadex G-25柱(1cmφ×30cm，Pharmacia公司)，收集到hGH级分10ml。然后将此溶液上样于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，经高速液相层析(Gilson HPLC系统，Gilson公司)后吸附，在70％-85％溶剂B的pH梯度(通过A＝50mMTris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)产生)中以7.5ml/min的流速洗脱70分钟，得到hGH。
实施例8(除去N-末端Met)在实施例2中得到的1.8ml Met-hGH溶液里加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸铜、50％吡啶溶液0.45ml，充分搅拌之后，25℃反应60分钟。然后以100ml/h的流速上样于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)预平衡的Sephadex G-25柱(1.5cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，用平衡液洗脱，得到具有蛋氨酸二酮残基的hGH级分10毫升。将其加入49.5ml的1.2M乙酸、2.4M甲酸钠、3.6M尿素溶液和48mM 3，4-二氨基苯甲酸溶液，充分搅拌，然后在37℃温度缓慢搅拌使之反应24小时。然后以500ml/h的流速上样于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)预平衡的Sephadex G-25柱(4.6cmφ×60cm，Pharmacia Biotech公司)，收集到hGH级分150毫升。然后将此溶液上样于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，经高速液相层析(Gilson HPLC系统，Gilson公司)吸附，在70％-85％溶剂B的pH梯度(通过A＝50mM Tris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)产生)中以7.5ml/min的流速洗脱70分钟，得到hGH级分6.7mg。
实施例9(除去N-末端Met)在实施例2中得到的1.8ml Met-hGH溶液里加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸铜、50％吡啶溶液0.45ml，充分搅拌之后，25℃反应60分钟。然后以100ml/h的流速上样于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)预平衡的Sephadex G-25柱(1.5cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，用平衡液洗脱，得到具有蛋氨酸二酮残基的hGH级分10毫升。将其加入10ml的2M甲酸、10M甲酸钠、6M尿素溶液和80mM 3，4-二氨基苯甲酸溶液，充分搅拌，然后在30℃温度缓慢搅拌使之反应3天。然后以500ml/h的流速上样于用20mM Tris/HCl和4.0M尿素(pH8.0)预平衡的Sephadex G-25柱(4.6cmφ×60cm，Pharmacia Biotech公司)，收集到hGH级分100毫升。然后将此溶液上样于DEAE-5PW柱(2.15cm×15cm，Tosoh公司)，经高速液相层析(GilsonHPLC系统，Gilson公司)吸附，在70％-85％溶剂B的pH梯度(通过A＝50mMTris/HCl+2.5M尿素(pH8.0)、B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]+2.5M尿素(pH4.0)产生)中以7.5ml/min的流速洗脱70分钟，得到hGH级分6.0mg。
实施例10(含有蛋氨酸残基的20K-hGH(Met-20K-Hgh)的活化)根据参考例2中平成10年专利申请234386号所述方法得到40g细胞，将其悬浮于100ml PBS(磷酸盐缓冲液)，然后在超声仪(Branson UltrasonicsCorporation)上超声破碎5分钟使细胞破碎。离心裂解液(10,000rpm 20min)，弃去上清液，得到沉淀。加入2升的50mM Tris/HCl和8M盐酸胍溶液(pH8.0)使沉淀溶解，之后离心(10,000rpm 120min)。于所得的2升上清液中加入50mM Tris/HCl、0.28mM GSSG、1.4mMGSH、和0.7M精氨酸(pH8.0)共24升，4℃活化1天。
实施例11(纯化Met-20K-hGH)实施例10所得活化溶液在Minitan超滤器(PTGC膜，Millipore公司)中，通过加入20mM Tris/HCl和2.5M尿素(pH8.0)进行脱盐和浓缩，直到导电性不超过10ms/cm为止，所得浓缩液离心(10,000rpm 20min)，得150ml上清。将其上样于已用50mM Tris/HCl和2.5M尿素/10％乙腈(pH8.2)平衡的HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP柱(1.6cmφ×10cm，Pharmacia Biotech公司)进行吸附，充分洗涤，用氯化钠浓度梯度0-0.18M以3.0ml/min的流速洗脱，得28ml Met-20K-hGH级分。将其用Centriplus-10(Millipore公司)进一步浓缩和脱盐，得浓缩液15ml。将其再次吸附于已用50mM Tris/HCl和2.5M尿素/10％乙腈(pH8.2)平衡的HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP柱(1.6cmφ×10cm，Pharmacia Biotech公司)，充分洗涤，在0％-100％B的pH梯度(用A＝50mM Tris/HCl、2.5M尿素和10％乙腈(pH8.2)以及B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]、2.5M尿素和10％乙腈(pH4.0)产生)中以3.0ml/min的流速洗脱60分钟，得12ml的Met-20K-hGH级分。向其中加入0.6ml 2MTris/HCl(pH7.8)将pH调为7.2，用Centriplus-10(Millipore公司)浓缩。取0.5ml该浓缩液上样于已用含10％乙醇的PBS平衡的SuperdexTM75 HR 10/30(1.0cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，然后用含10％乙醇的PBS洗脱，得Met-20K-hGH级分7.5ml。
实施例12(除去N-末端Met)将实施例11所得6ml Met-20K-hGH溶液上样于用20mM Tris/HCl和8M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(10mm ID×30cm，Pharmacia Biotech公司)，收集洗脱的Met-20K-hGH级分，再用一种超滤系统(DiafloW膜YM10，25mm，Amicon，Inc.)浓缩成2ml。向其中加入2.5M乙醛酸、40mM硫酸铜、和50％吡啶的溶液0.5ml，充分搅拌，25℃反应60分钟。然后上样于用20mMTris/HCl和4M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(10mm ID×40cm，Pharmacia Biotech公司)，收集到具有蛋氨酸二酮残基的20K-hGH级分4毫升。向其中加入1.2M乙酸、2.4M甲酸钠、3.6M尿素、和48mM 3，4-二氨基苯甲酸共20ml，充分搅拌，然后30℃反应65小时。将反应产物上样于用20mM Tris/HCl和4M尿素(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(20mm ID×40cm，Pharmacia Biotech公司)以收集20K-hGH级分，进行高速液相层析(Gilson HPLC系统，gilson公司)，其中将所述级分上样于已用50mM Tris/HCl和2.5M尿素/10％乙腈(pH8.2)平衡的HiLoadTMQ Sepharose 16/10 HP柱(1.6cmφ×10cm，Pharmacia Biotech公司)进行吸附，充分洗涤后，在0％-100％B的pH梯度(用A＝50mM Tris/HCl、2.5M尿素和10％乙腈(pH8.2)以及B＝50mM MES[2-(N-吗啉代)乙基磺酸]、2.5M尿素和10％乙腈(pH4.0)产生)中以3.0ml/min的流速洗脱60分钟，得12ml的20K-hGH级分。向其中加入0.6ml 2M Tris/HCl(pH7.8)将pH调为7.2，用Centriplus-10(Millipore公司)浓缩。取0.5ml该浓缩液上样于已用含10％乙醇的PBS平衡的SuperdexTM75 HR 10/30(1.0cmφ×30cm，Pharmacia Biotech公司)，然后用含10％乙醇的PBS洗脱，得20K-hGH级分7.5ml。
实施例13(鉴定20K-hGH)(a)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得20K-hGH的N-末端氨基酸序列与由cDNA碱基序列推导的20K-hGH的N-末端氨基酸序列一致(表4)。
表4残基编号 所测的PTH1)氨基酸(pM) 由20K-hGH碱基序列推导的氨基酸1 Phe(642)Phe2 Pro(504)Pro3 Thr(342)Thr4 Ile(410)Ile5 Pro(200)Pro6 Leu(378)Leu7 Ser(95) Ser8 Arg(170)Arg9 Leu(285)Leu10 Phe(262)Phe1)苯基硫代乙内酰脲用1nmol进行分析。
(b)氨基酸组成的分析用氨基酸分析仪(6300系统，Beckman公司)测定了氨基酸组成。实施例12中得到的20K-hGH的氨基酸组成与由20K-hGH的cDNA碱基序列推导的氨基酸组成一致(表5)。
表5氨基酸 每摩尔的残基数 由20K-hGH碱基序列推导的值Asx 20.220Thr1)9.7 10Ser1)16.517Glx 22.022Pro 6.9 7Gly 8.0 8Ala 6.2 6Cys2)N.D.4Val 7.0 7Met 2.9 3Ile 6.5 7
Leu 24.3 25Tyr 5.96Phe 12.2 12His 3.13Lys 7.17Arg 10.7 11Trp N.D. 1酸水解(使用6N HCl-1％苯酚，110℃，水解24和水解48小时的平均值)，用约20μg进行了分析。
1)0小时外插值。
2)未检出。
实施例14(20K-hGH的活性测定)实施例12所得的20K-hGH对Nb2细胞的生长促进活性(临床内分泌学和代谢，51卷，1058页(1980))得到证实。
实施例15(具有蛋氨酸残基的人BTC(人Met-BTC)的产生)根据平成6年专利申请87894号(EP-A-A0555785)中实施例4-6，8和13，用以下方法产生人Met-BTC。
(在大肠杆菌中构建人BTC cDNA表达载体)将编码人前BTC(1-147氨基酸残基)的0.6Kb EcoRI-BamHI片段从平成6年专利申请87894号(EP-A-0555785)之实施例5所述质粒pTB1515中分离。将带有ATG翻译起始密码子(5′-TATGGATGGG-3′；5′-AATTCCCATCCA-3′)的人工合成接头连接至所述0.6Kb EcoRI-BamHI片段的EcoRI位点，将所得0.6Kb的NdeI-BamHI片段插入含T7启动子(Gene、56卷、125页(1987))的质粒pET-3c中，构建质粒pTB1505。
为了获得编码人BTC的80个氨基酸残基(平成6年专利申请87894号(EP-A-0555785)的图10-1和图10-2中1(Asp)到80(Tyr))，以质粒pTB1505为模板，2个寡核苷酸(5′-ATACATATGGATGGGAATTCCA-3′；5′-CCGGATCCTAGTAAAACAAGTCAACTCT-3′)为引物进行PCR(聚合酶链式反应)。产物用NdeI及BamHI消化，经2％琼脂糖凝胶电泳，分离得到0.25Kb目的DNA片段。用T4 DNA连接酶将这个0.25Kb的NdeI-BamHI片段连接于pET-3c的T7启动子下游，获得了质粒pTB1516(参照平成6年专利申请87894号(EP-A-0555785)的图13)。
(在大肠杆菌里表达人Met-BTC)将大肠杆菌MM294用含T7 RNA聚合酶基因的λ噬菌体(Studier，出处同上)溶源化。然后将质粒pLysS导入该大肠杆菌MM294(DE3)，获得了大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS。将上述质粒pTB1516导入这些细胞，获得了大肠杆菌MM294(DE3)/pLysS，pTB1516。
将该转化体于2升烧瓶中含50μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml氯霉素的1升LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)内，37℃振荡培养8小时。将得到的培养液转移至含有19升发酵培养基(1.68％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.1％氯化铵、0.05％氯化钠、0.05％硫酸镁、0.02％消泡剂、0.00025％硫酸亚铁、0.0005％盐酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的50升装发酵罐里，在30℃开始通气搅拌培养。当培养液浊度达到约500克莱特单位时添加100mg/L异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTQ)，继续培养，7小时以后终止培养。离心分离培养液，得到约340g湿重的细胞，-80℃冻存。
将该转化的大肠杆菌(MM294(DE3)/pLysS，pTB1516)于1992年4月21日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏号FERM BP-3836，并于1992年4月16日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏号IFO 15282。
将上述方法所得具有N-末端蛋氨酸残基的人β-动物纤维素(Met-BTC)10mg溶于4ml的3M尿素溶液，加入80mM硫酸铜0.25ml、乙醛酸0.25g、和吡啶0.5ml的混合液，25℃下反应1小时。然后将反应液上样于用2.5M尿素+50mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mm ID×600mm L)，用平衡液以6ml/min的流速继续，收集具有蛋氨酸二酮残基的BTC级分。向其中加入等量的2M乙酸、4M甲酸钠、3M尿素溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸至40mM浓度，抽气，氮气密封，25℃反应5天。然后将反应液上样于用50mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速展开，收集不含有N-末端蛋氨酸残基的BTC级分。将收集到的级分调整到pH6.0，吸附至已用50mM磷酸缓冲液+0.1M NaCl+2.5M尿素(pH5.0)平衡的CM-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh Corporation)，在0-100％B(B＝50mM硼酸缓冲液+0.1M NaCl+2.5M尿素，pH9.0)的梯度中以6ml/min的流速洗脱60分钟，得到BTC级分。将其吸附于已用0.1％TFA平衡的C4P-50(10mm ID×250mmL，Showa Denko K.K.)，在20-60％B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)的梯度中以2ml/min的流速洗脱40分钟。收集BTC级分，冻干，获得约2.6mg的BTC。
实施例16(BTC的鉴定)a)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析将实施例15得到的BTC悬浮于样品缓冲液(Laemmli，自然，227，680(1970))100℃加热1分钟后，用Multigel 15/25(第一化学药品株式会社)电泳。电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色，观察到一条蛋白质带，从而证实纯化产物基本为单体(图2)。
b)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得BTC的N-末端氨基酸序列与由BTC cDNA碱基序列推导的BTC N-末端氨基酸序列一致(表6)。
表6残基编号所测的PTH1)氨基酸(pM) 由BTC碱基序列推导的氨基酸(pM)1 Asp(261) Asp2 Gly(457) Gly3 Asn(300) Asn4 Ser(107) Ser5 Thr(75) Thr6 Arg(181) Arg7 Ser(121) Ser8 Pro(245) Pro9 Glu(55) Glu10Thr(71) Thr11Asn(133) Asn12Gly(149) Gly13Leu(132) Leu14Leu(155) Leu
15 N.D. Cys16 Gly(111) Gly17 Asp(70) Asp18 Pro(65) Pro19 Glu(29) Glu20 Glu(64) Glu用1nmol进行了分析。
N.D.未检出1)苯基硫代乙内酰脲c)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪(Beckman 6300E系统)测定了氨基酸组成。所得BTC的氨基酸组成与由BTC的cDNA碱基序列推导的氨基酸组成一致(表7)。
表7氨基酸每摩尔的残基数由BTC碱基序列推导的值Asx 7.0 7Thr1)6.1 6Ser1)4.8 5Glx 9.3 9Pro 3.8 4Gly 7.1 7Ala 4.0 4Cys2)N.D. 8Val 3.9 4Met 00Ile 1.9 2Leu 3.0 3Tyr 3.7 4Phe 3.3 3His 2.3 2Lys 5.0 5Arg 6.9 7
Trp 00酸水解(使用6N HCl和1％苯酚，110℃、水解24和水解48小时的平均值)1)0小时外插值。
2)未检出。
用约20μg进行分析d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析仪(Beckman 6300E系统)测定了C-末端氨基酸。所得到的BTC与cDNA碱基序列推导的C-末端氨基酸序列一致(表8)。
表8C-末端氨基酸分析C-末端氨基酸 回收率(％)BTCTyr 44.6气相肼解(100℃、3.5小时)对15nmol进行分析。
e)BTC的生物活性根据分子细胞生物学8、588(1988)记载的方法，使用BALB/C3T3A31-714克隆4(国际癌症杂志，12，463(1973))测定纯化产物的活性，证实所述产物的活性与标准品的等同。
实施例17如平成10年专利申请72489号(EP-A-812856)参考例5所述，获得具有N-末端蛋氨酸残基的人白细胞介素2(Met-IL-2)50mg，将其溶于40ml的4M尿素溶液，然后加入100mM硫酸铜2.5ml、乙醛酸2.5g、吡啶溶液5.0ml的混合液，25℃反应1小时。反应结束后，将反应液上样于用10mM磷酸缓冲液+2.5M尿素(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速洗脱，收集具有蛋氨酸二酮残基的IL-2级分。向其中加入等量的2M乙酸、4M甲酸钠、3M尿素溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸至终浓度40mM，抽气，氮气密封，25℃反应5天。
反应结束后，将反应液上样于用10mM磷酸缓冲液+2.5M尿素(pH5.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速洗脱，收集不含N-末端蛋氨酸残基的IL-2级分。将收集到的IL-2级分吸附至已用25mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的SP-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh Corporation)，然后在30-80％B(B＝25mM磷酸缓冲液，pH8.0)梯度中以6ml/min的流速洗脱60分钟，得到17.3mg的IL-2级分。
实施例18(IL-2的鉴定)a)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析将实施例17得到的IL-2悬浮于样品缓冲液(Laemmli，自然，227，680(1970))100℃加热1分钟后，用Multigel 15/25(第一化学药品株式会社)进行了电泳。电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色，观察到一条蛋白质带，从而证实纯化的蛋白质基本为单体(图3)。
b)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得IL-2的N-末端氨基酸序列与由IL-2 cDNA碱基序列推导的IL-2 N-末端氨基酸序列一致(表9)。
表9残基编号所测的PTH1)氨基酸(pM) 由IL-2碱基序列推导的氨基酸1Ala(701)Ala2Pro(354)Pro3Thr(359)Thr4Ser(122)Ser5Ser(128)Ser6Ser(78) Ser7Thr(46) Thr8Lys(176)Lys9Lys(61) Lys10 Thr(40) Thr用1nmol进行分析。
1)苯基硫代乙内酰脲c)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪(Beckman 6300E系统)测定了氨基酸组成。所得BTC的氨基酸组成与由IL-2的cDNA碱基序列推导的氨基酸组成一致(表10)。
表10氨基酸每摩尔的残基数由IL-2碱基序列推导的值
Asx 11.812Thr1)12.913Ser1)7.0 8Glx 18.418Pro 4.8 5Gly 2.0 2Ala 4.8 5Cys2)N.D.3Val 3.5 4Met 3.8 4Ile 7.7 9Leu 22.022Tyr 2.8 3Phe 5.6 6His 2.9 3Lys 10.311Arg 3.7 4Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巯基乙酸，110℃，水解24和水解48小时的平均值)1)0小时外插值。
2)未检出。
d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析仪(Beckman 6300E系统)测定了C-末端氨基酸。所得到的IL-2与cDNA碱基序列推导的C-末端氨基酸一致(表11)。
表11C-末端氨基酸分析C-末端氨基酸 回收率(％)IL-2Thr 32.5气相肼解(100℃，3.5小时)用15nmol进行分析。
e)IL-2的生物活性根据日沼(Hinuma)所述利用依赖IL-2的细胞的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，109，363(1982))测定生物活性，证实了该生物活性与标准品具有同等活性。
实施例19(Met-hGH的活化)将4升50mM Tris/乙酸，8M盐酸胍溶液(pH8.5)加入参考例2所得的1kg细胞中，使细胞溶解，然后离心(10,000rpm)。所得上清液4升中加入44升的50mM Tris/乙酸，1.09mM还原型谷胱苷肽，0.055mM氧化型谷胱苷肽、109mM精氨酸、4.36M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。活化后，加入约25升的20mM Tris/乙酸，2.5M尿素溶液(pH8.0)，在Pellicon盒系统(Biomax 8膜，Millipore Corporation)中浓缩并脱盐，直到导电性不超过5mS/cm。加入20mM Tris/乙酸(pH8.0)约35升再次脱盐，然后离心(10,000rpm)获得上清。将上清液吸附于经20mM Tris/乙酸(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱(30cmφ×60cm，Tosoh公司)，再用20mM Tris/乙酸(pH8.0)及20mM Tris/乙酸、25mM氯化钠溶液(pH8.0)充分洗涤，用20mM Tris/乙酸和55mM氯化钠溶液(pH8.0)洗脱，获得50升的Met-hGH级分。经Pellicon盒系统(Biomax 8膜，Millipore Corporation)浓缩和脱盐，得到Met-hGH。
实施例20(Met-hGH的活化)将50mM Tris/乙酸，8M盐酸胍溶液(pH8.5)4升加入参考例2所得的1kg细胞中，使细胞溶解，然后离心(10,000rpm)。所得上清液4升中加入44升的50mM Tris/乙酸，5.45mM一水合半胱氨酸盐酸，109mM精氨酸和4.19M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。活化的Met-hGH比实施例19所得多约1.2倍。活化后，加入25升的20mM Tris/乙酸，2.5M尿素溶液(pH8.0)，在Pellicon盒系统(Biomax 8膜，Millipore Corporation)中浓缩并脱盐，直到导电性不超过5mS/cm。加入20mM Tris/乙酸(pH8.0)约35升再次脱盐，然后离心(10,000rpm)获得上清。将上清液吸附于经20mM Tris/乙酸(pH8.0)平衡的DEAE-Toyopearl 650M柱(30cmφ×60cm，Tosoh公司)，再用20mM Tris/乙酸(pH8.0)及20mM Tris/乙酸、25mM氯化钠溶液(pH8.0)充分洗涤，用20mM Tris/乙酸和55mM氯化钠溶液(pH8.0)洗脱，获得50升的Met-hGH级分。经Pellicon盒系统(Biomax 8膜，Millipore Corporation)浓缩和脱盐，得到Met-hGH。
实施例21(Met-hGH的活化)
将5升50mM Tris/乙酸，8M盐酸胍溶液(pH8.5)加入参考例2所得的1.25g细胞中，使细胞溶解，然后离心(10,000rpm)。所得上清液5升中加入55ml的50mM Tris/乙酸，5.45mM N-乙酰-L-半胱氨酸，109mM精氨酸、和4.91M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。所观察到的活化效率等同于实施例20的(其中添加的是一水合半胱氨酸盐酸)。
实施例22(Met-hGH的活化)将5升50mM Tris/乙酸，8M盐酸胍溶液(pH8.5)加入参考例2所得的1.25g细胞中，使细胞溶解，然后离心(10,000rpm)。所得上清液5升中加入55ml的50mM Tris/乙酸，5.45mM半胱氨酸盐酸，109mM精氨酸、和4.91M尿素溶液(pH8.0)，4℃活化3天。所观察到的活化效率等同于实施例20的(其中添加的是一水合半胱氨酸盐酸)。
实施例23根据平成10年专利申请72489号(EP-A-812856)的参考例3记载的方法产生具有N-末端蛋氨酸残基的人促神经激素-3(Met-NT-3)。
将50mg具有N-末端蛋氨酸的人促神经激素-3(Met-NT-3)溶于8ml 3M尿素溶液中，加入0.2M硫酸铜0.4ml、乙醛酸0.5g、吡啶1ml的混合液10ml，25℃反应1小时。反应结束后，将反应液上样于用2.5M尿素+10mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25mm ID×66mm L)，用平衡液以4ml/min的流速洗脱，收集具有蛋氨酸二酮的NT-3级分。向其中加入等量的2M乙酸、4M甲酸钠、3M尿素溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸至终浓度40mM，25℃反应5天。反应结束后将反应液上样于用2.5M尿素+10mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(46mm ID×600mm L)，用平衡液以10ml/min的流速洗脱，收集N-末端不含有蛋氨酸残基的人促神经激素-3(NT-3)级分。将其pH调整为5.0，再吸附至已用50mM磷酸缓冲液+0.2MNaCl+2.5M尿素pH5.0)平衡的CM-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh公司)，然后用0-100％B(B＝50mM磷酸缓冲液+0.2M NaCl+2.5M尿素、(Ph8.0))的梯度以6ml/min的流速洗脱60分钟，收集NT-3级分。再将NT-3级分吸附于经过0.1％TFA平衡的C4P-50(21.5mm ID×300mm L，昭和电工(株))，然后通过20-60％B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)梯度以5ml/min的流速洗脱40分钟。收集NT-3级分，冷冻干燥，获得约5mg NT-3冻干粉。
实施例24(NT-3的鉴定)
a)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Perdin Elmer Applied Biosystems，477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得NT-3的N-末端氨基酸序列与由NT-3 cDNA碱基序列推导的NT-3 N-末端氨基酸序列一致(表12)。
表12残基编号所测的PTH1)氨基酸(pM) 由NT-3碱基序列推导的氨基酸1Tyr(410) Tyr2Ala(521) Ala3Glu(155) Glu4His(213) His5Lys(587) Lys6Ser(91)Ser7His(161) His8Arg(318) Arg9Gly(214) Gly10 Glu(108) Glu11 Tyr(104) Tyr12 Ser(50)Ser13 Val(208) Val14 N.D. Cys15 Asp(99)Asp16 Ser(41)Ser17 Glu(24)Glu18 Ser(27)Ser19 Leu(63)Leu20 Trp(26)Trp用1nmol进行分析。
N.D.未检出*)苯基硫代乙内酰脲b)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪(Beckman 6300E系统)测定了氨基酸组成。所得氨基酸组成与由NT-3 eDNA碱基序列推导的氨基酸组成一致(表13)。
表13氨基酸 每摩尔的残基数 由NT-3碱基序列推导的值Asx 11.0 11Thr*)8.7 9Ser*)10.4 12Glx 11.0 11Pro 1.7 2Gly 8.0 8Ala 4.8 5Cys N.D. 6Val 8.7 9Met 0 0Ile 6.7 7Leu 5.0 5Tyr 5.1 5Phe 1.2 1His 4.3 4Lys 9.7 10Arg 9.6 10Trp 3.8 4酸水解(使用6N HCl-4％巯基乙酸，110℃，水解24和水解48小时的平均值)N.D.未检出*)0小时外插值。
用约20μg进行分析。
d)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析仪(Beckman 6300E系统)测定了C-末端氨基酸。所得氨基酸与cDNA碱基序列推导的C-末端氨基酸一致(表14)。
表14
C-末端氨基酸 回收率(％)NT-3Thr 42.0气相肼解(100℃，3.5小时)用15nmol进行分析。
e)NT-3的生物活性实施例23所得NT-3的生物活性用DRG(脊后根神经节，取自37.5℃孵8-10天的受精卵)测定，其证实所述NT-3具有与从CHO细胞得到的NT-3相同的活性程度。
实施例25在实施例2所得14.75ml的Met-hGH溶液加入6M尿素溶液至终体积为60ml，再加入0.5M硫酸铜1.2ml、乙醛酸3.75g、和吡啶7.5ml的混合液至终体积为75ml，然后25℃反应1小时。反应结束后，使反应液流过已用4M尿素+20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(4.6cm ID×60cmL)，用平衡液以10ml/min的流速洗脱，收集具有蛋氨酸二酮残基的hGH级分。向其中加入等量的由2M乙酸、4M甲酸钠、和4M尿素组成的溶液，然后加3，4-二氨基苯甲酸使终浓度为40mM，30℃反应4天。反应结束后，使反应液流过用4M尿素+20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡的Sephadex G-25柱(11.3cm ID×80cm L)，用平衡液以30ml/min的流速洗脱，收集N-末端不含有蛋氨酸残基的hGH级分。将收集的hGH级分上样于用50mM Tris缓冲液+2.5M尿素(pH8.0)平衡的DEAE-5PW(5.5cm ID×20cm L，Tosoh公司)而吸附，然后用0-100％B(B＝50mM MES+2.5M尿素、pH4.0)的梯度以15ml/min的流速洗脱60分钟，收集到了hGH级分约60mg。
实施例26(人apelin-36结构基因的制备)用图4所示的6种DNA片段(#1和#5Greiner Japan Co.Ltd.；#2和#6Kikotedc Co.；#3和#4Amersham Pharmacia Biotech)制备apelin-36结构基因(图5)。
a)DNA寡聚体的磷酸化除了#1和#6寡聚体以外，将其余4种寡聚体各1μg指定为5′末端，在100μL磷酸化反应液[50mM Tris/HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，1mM亚精胺、10mM DTT，0.1mg/ml牛血清清蛋白，1mM ATP，10单位的T4多核苷酸激酶(日本基因)]中37℃反应1小时，使5′末端磷酸化。经酚抽提后，吸取上层水相，加入2倍体积的乙醇冷却至-70℃，离心使DNA沉淀。
b)DNA片段的连接将上述a)所得磷酸化的DNA片段与#1和#6各1μg混合至终体积120μL。将上述混合液在80℃保温10分钟，缓慢冷却到室温，使所述片段退火。用第二代TaKaRa DNA连接试剂盒(宝酒造)进行连接反应。在退火溶液30μL中加入溶液II30μL，充分混合，再加入溶液I60μL，37℃1个小时以便实施连接。酚抽提后，吸取上层水相，加入2倍体积的乙醇，冷却至-70℃，离心使DNA沉淀。
c)5′末端的磷酸化将沉淀物溶于10μL TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH8.0)，1mM EDTA)，使之在100μL磷酸化反应液[50mM Tris/HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，1mM亚精胺，10mM DTT，0.1mg/ml牛血清清蛋白，1mM ATP，10单位的T4多核苷酸激酶(日本基因)]中37℃反应1小时。酚抽提后，吸取上层水相，加入2倍体积的乙醇，冷却至-70℃，离心使DNA沉淀将其溶于20μl TE缓冲液中。
实施例27人apelin-36表达质粒的制备用XbaI及AvaI消化pTB960-2(EP-A-499990小山等，生物技术杂志32卷，273页)，经过1％的琼脂糖电泳，用QIAquick Gel ExtractionKit(QIAGEN)抽提约4.4Kbp的DNA片段，将其溶于25μL TE缓冲液中。将这些pTB960-2的XbaI及AvaI片段和上述制备的人apelin-36结构基因通过第二代TaKaRa DNA连接试剂盒(宝酒造)来进行连接反应。即，将pTB960-2的XbaI及AvaI片段溶液1μL与人apelin-36结构基因溶液4μL混合，加入5μL的溶液I，16℃反应30分钟以实施连接。用10μL连接液转化大肠杆菌JM109感受态细胞(东洋纺)，将其接种在含有10μg/ml四环素的LB琼脂平板上，37℃培养1天，选择四环素抗性菌落。这些转化体用LB培养基培养过夜，用QIAprep 8 Miniprep Kit(QIAGEN)制备质粒pTB960-13。用Applied Biosystems 377型DNA测序仪证实该人apelin-36结构基因片段的碱基序列。用质粒pTB960-13转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen公司)，将其接种在含有10μg/ml四环素的LB琼脂平板上，37℃培养1天，得到人apelin-36-CS23融合蛋白表达菌株BL21(DE3)/pTB960-13(图6)。将这个转化的大肠杆菌BL21(DE3)/pTB960-13于1998年12月2日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM BP-6590，另于1998年11月11日保藏于财团法人发酵研究所(IFO)，保藏号IFO16220。
实施例28在含1升LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.5％氯化钠)和5.0mg/l四环素的2升装烧瓶中，37℃振荡培养实施例27所得转化细胞8小时。将所得培养液转移至含19升发酵培养基(1.68％磷酸氢二钠、0.3％磷酸二氢钾、0.1％氯化铵、0.05％氯化钠、0.05％硫酸镁、0.02％消泡剂、0.00025％硫酸亚铁、0.00025％盐酸硫胺素、1.5％葡萄糖、1.5％酪蛋白氨基酸)的50升装发酵罐里，30℃开始通气培养。当培养液浊度达约500Klett单位时，添加异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷至终浓度为12mg/l，然后再培养4小时。培养结束后，离心培养液，得湿重约660g的细胞，-80℃冻存。
实施例29人apelin-36的获得在实施例28所得550g细胞中加入10mM EDTA+1mM(对酰胺基苯基)-甲磺酰氯盐酸(pH6.0)溶液1500ml，超声破碎(Branson超声仪450型)，离心(10,000rpm，60min)。收集上清液，沉淀物再次重复同样的操作。将所收集的上清液pH调至6.0，上样于已用50mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的AF-Heparin Toyopearl 650M层析柱(30mm ID×500mm L，Tosoh公司)，以便吸附，然后洗脱，再用0-100％B(B＝50mM磷酸缓冲液+2MNaCl，pH6.0)梯度洗脱，得到530ml人apelin-36-CS23融合蛋白级分。
用Pellicon Mini盒(Millipore公司)加0.1M乙酸使该洗脱液浓缩，得到人apelin-36-CS23融合蛋白的0.1M乙酸溶液。添加尿素至终浓度为6M，然后加入1-氰基-4-二甲基氨基吡啶嗡盐(DMAP-CN)35mg，室温反应15分钟。反应结束后，将反应液上样于用10％乙酸平衡的Sephadex G-25柱(46mmID×600mm L，Pharmacia)，用平衡液10％乙酸以6ml/min的流速洗脱，获得S-氰化的人apelin-36-CS23融合蛋白级分。使该洗脱液在Pellicon Mini盒(Millipore Corporation)中浓缩并脱盐，得到人apelin-36-CS23融合蛋白的脱盐液。向其中加入尿素至终浓度为6M，再加入1N苛性钠至终浓度0.06N，0℃反应15分钟。反应结束后，用乙酸调整pH为6.0，得到人apelin-36。将其上样于已用含3M尿素之50mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡的SP-5PW(21.5mm ID×150mm L，Tosoh公司)进行吸附，洗涤后，用0-40％B(B＝50mM磷酸缓冲液+1M NaCl+3M尿素，pH6.5)梯度洗脱，得到人apelin-36级分。将它们上样于已用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡的C4P-50(21.5mm ID×300mm L，昭和电工)，洗涤后，用15-30％B(B80％乙腈/0.1％TFA)的梯度洗脱，收集到人apelin-36级分，冻干，得到人apelin-36冻干粉。
a)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪(日立L-8500A氨基酸分析仪)测定了氨基酸组成。
如此获得的氨基酸组成与具有N-末端蛋氨酸残基之人apelin-36的DNA碱基序列所推导的氨基酸组成一致(表15)。
表15氨基酸组成分析氨基酸 每摩尔的残基数 由人apelin-36的碱基序列所推导的值Asx 1.0 1Thr1)0 0Ser1)1.9 2Glx 3.0 3Pro 5.7 6Gly 5.7 6Ala 0 0Cys2)N.D.0Val 1.0 lMet 2.0 1Ile 0 0Leu 2.0 2Tyr 0 0Phe 1.9 2His 1.0 1Lys 1.8 2Arg 7.3 8Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巯基乙酸，110℃，水解24和水解48小时的平均值)
1)0小时外插值。
2)未检出。
b)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems 477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得 apelin-36的氨基酸序列除了在N-末端具有蛋氨酸残基以外，还与DNA碱基序列所推导的N-末端氨基酸序列一致(表16)。
表16N-末端氨基酸序列残基编号 所测的PTH1)氨基酸 由人apelin-36的碱基序列推导的氨基酸(pM)1Met(526)2Leu(648) Leu3Val(513) Val4Gln(437) Gln5Pro(463) Pro6Arg(216) Arg7Gly(232) Gly8Ser(129) Ser9Arg(129) Arg10 Asn(142) Asn11 Gly(185) Gly12 Pro(219) Pro13 Gly(202) Gly14 Pro(188) Pro15 Trp(88) Trp16 Gln(116) Gln17 Gly(120) Gly18 Gly(72) Gly19 Arg(56) Arg20 Arg(40) Arg用1nmol进行分析。
1)苯基硫代乙内酰脲
c)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析仪(日立L-8500A氨基酸分析仪)测定了C-末端氨基酸。(表17)。
表17C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸 回收率(％)人apelin-36Phe 38.6气相肼解(100℃，6小时)经过以上鉴定，实施例29所得人apelin-36属于在N-末端具有蛋氨酸残基的一类分子(Met-apelin-36(人))。
实施例30(生物活性测定)根据平成10年专利申请271645号中实施例6的方法(Cytosensor)测定实施例29所得Met-apelin-36的活性，证实该Met-apelin-36(人)具有等同于人工合成的人apelin-36的活性。
实施例31(除去N-末端蛋氨酸残基)将实施例29所得4mg的Met-apelin-36(人)溶于3M尿素溶液0.8ml，加入含有80mM硫酸铜0.05ml、乙醛酸0.046g、和吡啶0.1ml的混合液，25℃反应1小时。反应结束后，将反应液上样于用2.5M尿素+10mM磷酸缓冲液(pH5.5)平衡的Sephadex G-25层析柱(10mm ID×250mm L)，用平衡液以0.5ml/min的流速洗脱，收集具有蛋氨酸二酮残基的人apelin-36级分。向其中加入含2M甲酸钠、4M乙酸、和3M尿素的等体积溶液，再加3，4-二氨基苯甲酸至终浓度为40mM，30℃反应3天。反应结束后，将反应液上样于用50mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25层析柱(25mm ID×600mm L)，用平衡液以4ml/min的流速洗脱，收集N-末端不含有蛋氨酸残基的人apelin-36级分。将收集到的人apelin-36级分的pH值调整到6.0，再吸附至用50mM Tris缓冲液+0.1 NaCl+2.5M尿素(pH5.0)平衡的CM-5PW(7.5mm ID×75mm L，Tosoh公司)，然后用0-100％B(B＝50mM硼酸缓冲液+0.1M NaCl+2.5M尿素，pH9.0)的梯度以0.8ml/min的流速洗脱40分钟，收集人apelin-36级分。然后将此人apelin-36级分再吸附至用0.1％TFA平衡的C4P-50(10mm ID×250mm L，昭和电工(株))，然后用15-30％B(B＝80％乙腈/0.1％TFA)的梯度以2ml/min的流速洗脱40分钟。收集人apelin-36级分，冻干，得到人apelin-36。
a)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪(日立L-8500A氨基酸分析仪)测定了氨基酸组成。
如此获得的氨基酸组成与由hA10L的DNA碱基序列所推导的氨基酸组成一致(表18)。
表18氨基酸组成分析氨基酸 每摩尔的残基数 由人apelin-36的碱基序列所推导的值Asx 1.0 1Thr1)0 0Ser1)1.9 2Glx 2.9 3Pro 6.3 6Gly 5.9 6Ala 0 0Cys2)N.D.0Val 1.0 1Met 1.0 1Ile 0 0Leu 2.0 2Tyr 0 0Phe 1.9 2His 1.0 1Lys 1.9 2Arg 7.6 8Trp 0.9 1酸水解(使用6N HCl-4％巯基乙酸，110℃，水解24和水解48小时的平均值)1)0小时外插值。
2)未检出。
b)N-末端氨基酸序列分析用气相蛋白质测序仪(Applied Biosystems 477A型)测定N-末端氨基酸序列。所得氨基酸序列与人apelin-36的DNA碱基序列所推导的N-末端氨基酸序列一致(表19)。
表19N-末端氨基酸序列残基编号 所测的PTH1)氨基酸 由人apelin-36的碱基序列推导的氨基酸(pM)1 Leu(475)Leu2 Val(845)Val3 Gln(365)Gln4 Pro(563)Pro5 Arg(425)Arg6 Gly(424)Gly7 Ser(138)Ser8 Arg(423)Arg9 Asn(245)Asn10Gly(290)Gly11Pro(197)Pro12Gly(234)Gly13Pro(197)Pro14Trp(101)Trp15Gln(76) Gln16Gly(84) Gly17Gly(130)Gly18Arg(79) Arg19Arg(116)Arg20Lys(43) Lys用1nmol进行分析。
1)苯基硫代乙内酰脲c)C-末端氨基酸的分析用氨基酸分析仪(日立L-8500A氨基酸分析仪)测定了C-末端氨基酸。(表20)。
表20C-末端氨基酸的分析C-末端氨基酸 回收率(％)人apelin-36Phe 86.6气相肼解(100℃，6小时)实施例32(生物活性测定)根据平成10年专利申请271646号中实施例6的方法(Cytosensor)测定实施例31所得人apelin-36的活性，证实该人apelin-36具有等同于人工合成的人apelin-36的活性。
工业实用性通过本发明能够从具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽、蛋白质或其盐中特异地选择且有效除去该蛋氨酸残基，还能有效地合成不含有可被氧化的N-末端蛋氨酸残基的肽、蛋白质或其盐。此外，根据本发明的方法，在温和的条件下不论肽或蛋白质的种类如何，均可以用化学方法除去N-末端的蛋氨酸残基，因此用基因工程改造的、含有蛋氨酸残基的肽、蛋白质或其盐作为原料，有利于生产具有天然氨基酸序列的肽或蛋白质。
序列表<110>TAKEDA化学工业公司<120>除去N-末端蛋氨酸的方法<130>2554WOOP<140>PCT/JP99/05456<141>1999-10-04<150>JP10-282476<151>1998-10-05<160>6<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1ctagaaagga gatatcatat gctggttcaa ccgcgtggtt ct 42<210>2<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2cgtaatggtc cgggtccatg gcaaggtggt cgtcgtaaat ttcgtc 46<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3gtcaacgtcc gcgtctgtct cataaaggtc cgatgccgtt ttgcc45<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4gaccattacg agaaccacgc ggttgaacca gcatatgata tctccttt 48<210>5<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5ggacgttgac gacgaaattt acgacgacca ccttgccatg gacccg 46<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6tcggggcaaa acggcatcgg acctttatga gacagacgc 39
权利要求
1.一种除去可被氧化之蛋氨酸二酮残基的方法，其特征在于，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐，在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠的存在下与3，4-二氨基苯甲酸或其盐发生反应。
2.权利要求1的方法，其中所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐是通过使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮反应而得到的肽或其盐。
3.权利要求2的方法，其中所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐是经基因工程产生的肽。
4.权利要求1的方法，其中所述肽是(i)生长激素，(ii)β-动物纤维素，(iii)白细胞介素-2，(iv)促神经激素-3，或(v)apelin。
5.权利要求1的方法，其中所述肽是生长激素。
6.权利要求1的方法，其中所述乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠作为缓冲液使用，其浓度约0.1-8mol/l，其pH约2-9。
7.一种除去上述可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的方法，其中使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐，在乙酸及甲酸钠的存在下与3，4-二氨基苯甲酸或其盐发生反应。
8.一种产生N-末端不含有可被氧化之蛋氨酸残基的肽或其盐的方法，其特征在于，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐，在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠的存在下与3，4-二氨基苯甲酸或其盐发生反应。
9.权利要求8的产生方法，其中所述具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐是通过使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐与α-二酮反应而得到的肽或其盐。
10.权利要求8的产生方法，其特征在于，所述乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠作为缓冲液使用，其浓度约0.1-8mol/l，其pH约2-9。
11.一种产生N-末端不含有可被氧化之蛋氨酸残基的肽或其盐的方法，其特征在于，使具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐，在乙酸及甲酸钠的存在下与3，4-二氨基苯甲酸或其盐发生反应。
12.一种产生N-末端不含有蛋氨酸残基的人类生长激素或其盐的方法，其特征在于，使经过基因工程产生的、具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的人类生长激素或其盐在硫酸铜和吡啶存在下与乙醛酸或其盐反应，然后在乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠的存在下与3，4-二氨基苯甲酸或其盐发生反应。
13.一种应用，其用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐从具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐除去该蛋氨酸残基。
14.一种应用，其用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐从具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐除去该蛋氨酸二酮残基。
15.一种应用，其用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐从具有可被氧化之N-末端蛋氨酸残基的肽或其盐产生不具有N-末端可被氧化之蛋氨酸残基的肽或其盐。
16.一种应用，其用(i)乙酸及甲酸钠、甲酸及甲酸钠、或甲酸及乙酸钠，和(ii)3，4-二氨基苯甲酸或其盐从具有可被氧化之N-末端蛋氨酸二酮残基的肽或其盐产生不具有N-末端可被氧化之蛋氨酸二酮残基的肽或其盐。
全文摘要
本发明涉及一种使N－末端具有可氧化之蛋氨酸二酮残基或其盐的肽除去该蛋氨酸二酮残基的方法,其特征在于使该肽与3,4－二氨基苯甲酸或其盐在有乙酸和甲酸钠、甲酸和甲酸钠、或甲酸和乙酸钠存在的情况下反应;本发明还涉及一种制备不含N－末端蛋氨酸残基或其盐的肽的方法。
文档编号C07K1/12GK1322211SQ99811785
公开日2001年11月14日 申请日期1999年10月4日 优先权日1998年10月5日
发明者西村纪, 浅野常夫, 末永正人, 大前弘明, 奥谷范雄 申请人:武田药品工业株式会社