专利名称：在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法
技术领域：
本发明涉及聚合物生物材料的表面改性技术，具体说涉及利用接枝-涂层技术在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法。
背景技术：
人体组织的缺损或功能衰竭为常见的疾病，严重影响了病人的身体健康和生存质量。对这些疾病的现代治疗方法之一是组织工程技术。组织工程的方法是将细胞接种于细胞外基质替代物-可降解支架上。这种支架可为细胞提供一个空间结构，使细胞在上面生长，体外培养一定时期后形成细胞与替代物的复合物，再将其移植到体内受损组织处，以修复受损组织。组织工程中所用的支架材料包括两种，一种为可生物降解的人工合成聚合物生物材料，另一种为天然的生物大分子材料。
人工合成的聚合物生物材料和天然生物大分子材料各有其优缺点。前者有易加工、降解速率可调节、力学性能好、来源稳定的优点，但是一般的人工合成可降解聚合物具有较强疏水性的表面，而且其表面缺乏细胞可以识别的位点，因而不具有良好的细胞相容性。天然生物大分子材料多来自于动物体内细胞外基质，因而其优点是具有良好的细胞相容性。例如胶原是细胞外基质中的重要组成部分，其分子链上具有细胞膜表面受体可以识别的位点，因而能够促进细胞的粘附和基质的分泌。天然生物大分子材料的缺点是力学性能较差，来源有限，而且材料的结构、形状和降解速度难以控制。为了将上述两种材料的优点相结合，一种方便的方法就是将天然大分子涂层在聚合物材料的表面，这样既可保持合成聚合物材料的良好的力学性能，又能赋予合成聚合物材料表面良好的细胞相容性。然而天然生物大分子如胶原等均为强亲水性材料，而合成聚合物生物材料如聚酯类材料等一般为强疏水性材料，因此直接将生物大分子溶液涂层在疏水性的聚合物材料表面，所得到的涂层无法分布均匀，并容易剥落，不具有良好的稳定性。
发明内容
本发明的目的是为了在合成聚合物生物材料表面特别是在可降解的聚酯类生物材料表面形成稳定的生物大分子涂层，以提高材料表面的细胞相容性。提出利用“接枝-涂层”技术在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法。
本发明提出的在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法，包括以下步骤
(1)将聚合物生物材料放入浓度为10～40％的过氧化氢溶液中，在紫外光辐照下氧化，氧化温度20～80℃，时间0.1～10小时，在材料表面引入大分子过氧化氢团，去离子水冲洗，除去游离的过氧化氢分子；
(2)在氮气保护下，将光氧化后的聚合物生物材料浸于浓度为0.1～20v％的含羧基的乙烯基单体溶液中，在亚铁离子存在条件下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，单体中亚铁离子的浓度为0.0001～0.01摩尔/L，反应温度20～60℃，反应时间20～80分钟。反应后材料表面引入羧基。去离子水洗涤，除去未反应的单体；
(3)将经接枝聚合反应后表面引入羧基的聚合物生物材料浸于含有1～50mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，在0～40℃温度下，反应1～24小时，反应过程中材料表面的羧基被活化。将材料取出，浸入生物大分子溶液中，生物大分子溶液的浓度为1～100mg/mL，使活化的羧基与生物大分子中的氨基发生缩合反应，从而将生物大分子化学接枝在材料表面。反应温度0～50℃，反应时间1～24小时，反应后将材料从生物大分子溶液中取出，并保留物理涂附在材料表面的大分子溶液，直接干燥，得到稳定的生物大分子涂层；
(4)对于能够溶于pH呈中性水溶液的生物大分子涂层如明胶涂层，需浸入戊二醛进行交联反应，以增强其稳定性。戊二醛浓度为0.5～20v％，反应时间1～10小时，温度0～10℃，反应后用去离子水中清洗，除去未反应的戊二醛；对于不溶于pH呈中性水溶液的生物大分子涂层如胶原涂层，则不必进行交联反应。
本发明中，所说的聚合物生物材料主要是但不限于聚乳酸材料，包括聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚碳酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚羟基丁酸酯及其共聚物，及上述聚合物的混合物和它们之间的共聚物，还包括上述聚合物的不同空间结构的产物，如左旋聚乳酸(PLLA)、右旋聚乳酸(PDLA)和内消旋聚乳酸(PD，LLA)。聚合物生物材料的形态包括二维的平面膜和三维的多孔支架。
本发明中，所说的生物大分子包括明胶、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、透明质酸等含有氨基的天然蛋白质类大分子及其衍生物或多糖类大分子及马来酸、马来酸酐、富马酸和富马酸酐。
本发明将化学接枝和物理涂层的工艺相结合，既在材料表面化学接枝一层生物大分子，同时又在材料表面物理涂附生物大分子，使得生物材料表面的生物大分子的含量既高，又具有较强的稳定性。通过本发明，可方便地在生物材料表面引入各种生物大分子，从而在生物材料表面模拟人体或动物体内细胞外基质的成份，显著提高生物材料的生物相容性，尤其是细胞相容性。本发明工艺简单，操作方便。
图1利用“接枝-涂层”技术所制备的表面涂层胶原的PLLA膜的扫描电镜照片。
图2未改性PLLA膜表面软骨细胞的激光共聚焦显微镜照片。接种密度40000/cm2，培养时间48小时。荧光素二乙酸酯(FDA)染色。
图3利用“接枝-涂层”技术所制备的表面涂层胶原的PLLA膜表面软骨细胞的激光共聚焦显微镜照片。接种密度40000/cm2，培养时间48小时。FDA染色。
图4利用“接枝-涂层”技术所制备的表面涂层明胶的PLLA膜的扫描电镜照片。
图5利用“接枝-涂层”技术所制备的表面涂层明胶的PLLA膜表面软骨细胞的激光共聚焦显微镜照片。接种密度40000/cm2，培养时间48小时。FDA染色。
图6未改性的PLLA多孔支架中软骨细胞的激光共聚焦显微镜照片。接种密度600×104/ml，培养时间2周，FDA染色。
图7利用“接枝-涂层”技术所制备的涂层胶原的PLLA多孔支架内软骨细胞的激光共聚焦显微镜照片。接种密度150×101/ml，培养时间2周，FDA染色。
具体实施例方式
通过下述实施例可以更好地理解本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
利用“接枝-涂层”技术实现胶原在聚-L-乳酸(PLLA)平面膜表面的稳定涂层
将PLLA平面膜浸于30％的过氧化氢溶液中，在250w的紫外灯照射下氧化1小时，氧化为温度50℃。去离子水清洗以除去游离的过氧化氢。在氮气保护下，将光氧化后的PLLA平面膜浸于浓度为5v％的甲基丙烯酸溶液中(含有0.0015摩尔/L的硫酸亚铁胺)，在30℃下引发甲基丙烯酸在PLLA膜表面的接枝聚合反应，反应时间1小时，从而在材料表面引入羧基。将PLLA膜浸于10mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，反应温度为4℃，反应时间为4小时，反应过程中材料表面的羧基被活化。然后将PLLA膜浸入4mg/mL的胶原/乙酸溶液(pH＝3.5)中，4℃下反应24小时。反应后将PLLA膜从胶原溶液中取出，并保留物理涂附在材料表面的胶原溶液，直接干燥，在PLLA膜表面得到均匀稳定的胶原涂层。图1为表面涂层胶原的PLLA膜的扫描电镜照片，照片表明涂层分布均匀。胶原涂层具有良好的稳定性，见表1。与空白对照相比，软骨细胞在涂层胶原后的PLLA膜表面的铺展良好，分布均匀，表明材料的细胞相容性明显提高，见图2和图3。
实施例2
利用“接枝-涂层”技术实现明胶在聚-L-乳酸(PLLA)平面膜表面的稳定涂层
将实施例1中的胶原溶液改为10mg/mL的明胶的磷酸盐缓冲液溶液(pH＝5.5)，可在PLLA膜表面得到均匀的明胶涂层。为了提高明胶涂层的稳定性，将上述表面涂层明胶溶液的PLLA膜真空干燥后再浸于2.5％的戊二醛溶液中交联2小时，交联温度10℃。交联后将膜放入10℃去离子水中清洗20分钟，以除去未反应的戊二醛，真空干燥。图4为表面涂层明胶的PLLA膜的扫描电镜照片，由图可见明胶涂层分布均匀。表1中数据表明明胶涂层有较好的稳定性。软骨细胞在涂层明胶后的PLLA膜表面的铺展良好，分布均匀，表明材料表面的细胞相容性明显提高，见图5。
实施例3
利用“接枝-涂层”技术实现胶原在聚-L-乳酸(PLLA)多孔支架内部表面的稳定涂层
将PLLA多孔支架浸于30％的过氧化氢溶液中，通过抽真空的方法使支架中的空气放出，然后恢复压力将过氧化氢溶液压入支架内部，在250w的紫外灯照射下氧化1小时，氧化为温度50℃。通过离心的方法将支架中的过氧化氢溶液去除。将去离子水压入支架内部，然后离心去除，反复多次以清洗去除多孔支架中的游离的过氧化氢。在氮气保护下，将光氧化后的PLLA支架浸于浓度为10v％的甲基丙烯酸溶液中(含有0.0015摩尔/L的硫酸亚铁胺)，将甲基丙烯酸溶液压入多孔支架内部，在30℃下引发甲基丙烯酸在PLLA多孔支架内部表面的接枝聚合反应，反应时间1小时，从而在材料表面引入羧基。将去离子水压入支架内部，然后离心去除，反复多次以清洗去除多孔支架中未反应的甲基丙烯酸单体。将PLLA多孔支架浸于10mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDAC)的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，并将液体压入支架内部。反应温度为4℃，反应时间为4小时，反应过程中材料表面的羧基被活化。离心去除多孔支架中的EDAC溶液，将多孔支架浸入2.5mg/mL的胶原/乙酸溶液(pH＝3.5)中，并将液体压入支架内部，4℃下反应24小时。反应后将PLLA多孔支架从胶原溶液中取出，直接干燥，在PLLA多孔支架内部得到均匀稳定的胶原涂层。多孔支架内部的胶原涂层具有优良的稳定性，见表1。与空白对照相比，胶原涂层后PLLA多孔支架中的软骨细胞分布均匀，铺展良好，表明改性后的多孔支架具有优良的细胞相容性，见图6和图7。
表1为利用“接枝-涂层”技术在PLLA膜表面或PLLA多孔支架内部涂层的明胶或胶原的含量及其稳定性
表权利要求
1.在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)将聚合物生物材料放入浓度为10～40％的过氧化氢溶液中，在紫外光辐照下氧化，氧化温度20～80℃，时间0.1～10小时，在材料表面引入大分子过氧化氢团，去离子水冲洗，除去游离的过氧化氢分子；
(2)在氮气保护下，将光氧化后的聚合物生物材料浸于浓度为0.1～20v％的含羧基的乙烯基单体溶液中，在亚铁离子存在条件下，引发乙烯基单体在聚合物材料表面的接枝聚合反应，单体中亚铁离子的浓度为0.0001～0.01摩尔/L，反应温度20～60℃，时间20～80分钟，反应后去离子水洗涤，除去未反应的单体；
(3)将经接枝聚合反应后表面引入羧基的聚合物生物材料浸于含有1～50mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中，在0～40℃温度下，反应1～24小时，将材料取出，浸入浓度为1～100mg/mL的生物大分子溶液中进行缩合反应，反应温度0～50℃，反应时间1～24小时，反应后将材料从生物大分子溶液中取出，直接干燥，得生物大分子涂层；
(4)对于能够溶于pH呈中性水溶液的生物大分子涂层，浸入戊二醛进行交联反应，戊二醛浓度为0.5～20v％，反应时间1～10小时，温度0～10℃，反应后用去离子水中清洗，除去未反应的戊二醛；对于不溶于pH呈中性水溶液的生物大分子涂层，则不必进行交联反应。
2.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法，其特征在于所说的聚合物生物材料包括聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚碳酸酯、聚酸酐、聚膦腈、聚羟基丁酸酯及其共聚物，及上述聚合物的混合物和它们之间的共聚物，还包括上述聚合物的不同空间结构的产物，如左旋聚乳酸(PLLA)、右旋聚乳酸(PDLA)和内消旋聚乳酸(PD，LLA)。
3.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法，其特征在于所说的聚合物生物材料的形态包括二维的平面膜和三维的多孔支架。
4.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法，其特征在于所说的生物大分子包括明胶、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、透明质酸等含有氨基的天然蛋白质类大分子及其衍生物或多糖类大分子及其衍生物。
5.按权利要求书1所述的在聚合物生物材料表面稳定涂层生物大分子的方法，其特征在于步骤(2)中所说的含有羧基的乙烯基单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸、马来酸酐、富马酸和富马酸酐。
全文摘要
本发明公开了在聚合物生物材料表面稳定地涂层生物大分子的方法。首先将材料浸于过氧化氢溶液中并在紫外光照射下进行氧化，以在生物材料表面引入大分子过氧化氢基团，然后在亚铁离子的存在下引发含有羧基的乙烯基单体在材料表面的接枝聚合，将羧基引入材料表面。利用羧基作为反应基团，并利用水溶性碳化二亚胺作为缩合剂，使生物材料与含有氨基的生物大分子溶液反应，可将生物大分子化学接枝在材料表面，同时保留物理涂附在材料表面的生物大分子溶液，制备出表面稳定地涂层了生物大分子的生物材料，从而赋予生物材料表面良好的生物相容性，尤其是细胞相容性。本发明具有实施工艺简单，所得生物大分子涂层稳定，效果显著，操作方便等优点。
文档编号C08J7/04GK1445265SQ03116450
公开日2003年10月1日 申请日期2003年4月14日 优先权日2003年4月14日
发明者高长有, 马祖伟, 龚逸鸿, 沈家骢 申请人:浙江大学