专利名称:改进蒸馏酒质量的方法
本发明涉及改进蒸馏酒质量的方法。
所有的发酵制品包括精制清酒、啤酒、葡萄酒和samshu、以及最终麦芽汁(用以蒸馏威士忌、白兰地、shochu等的原料)等都含有脲，这是使蒸馏酒变质的主要原因，当蒸馏酒进行巴氏消毒或长期储存时，脲使蒸馏酒失去味道並使它们的风味变质。为了去掉脲，一种已知的方法是向蒸馏酒或最终麦芽汁中加入脲酶制剂，並使之在10～20℃的低温下反应(日本专利公报20830/1981号)。
脲酶(E、C、3、5、1、5)是一种将脲分解为氨和二氧化碳气的酶，它广泛分布于自然界中，例如植物、动物和微生物。来自刀豆(Canavalia Adans)和巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteuri)的常规脲酶已经为实际应用在进行工业化生产。
上述脲酶产品的最佳PH值在中性至碱性区，当PH值在酸性区时，不仅反应难以进行，而且酶易于钝化，当反应温度在室温以上或进行反应的反应混合物中含有有机溶剂(如乙醇时)，这一点尤为显著。因此，日本专利公报20830/1981号所公开的方法是有缺陷的，为了除去含有大约20%乙醇的精制清酒中的脲，该方法必须大量加入来自刀豆或细菌(最佳pH6-8)的脲酶，而且反应只能花很长时间在10-20℃的低温下进行;因此，以工业化的观点看来，该方法对于蒸馏酒的生产是不能令人满意的。
本发明者认为，为了生产高质量的蒸馏酒，制备一种甚至在含有乙醇的酸性蒸馏酒中也能保持稳定並具有良好作用的脲酶是极为必要的。作为他们的研究结果，他们发现，用最佳pH值在酸性区(pH2-5)的来自乳酸细菌的脲酶进行处理，只要加入少量脲酶，就能在短时间内和甚至在较高温度下通过分解除去蒸馏酒中的脲。在进一步研究之后，本发明者已经完成了本发明。
这就是说，本发明涉及蒸馏酒质量的改进，其特征在于用酸性脲酶处理蒸馏酒。
本发明所用酸性脲酶是指这样一种酶，它从1摩尔脲和1摩尔水中产生2摩尔氨和1摩尔二氧化碳气，其活性的最佳pH值范围在pH-5最好是pH2-4.5，关于此酶的一般性质没有限定，例如PH稳定性、最佳温度、热稳定性、底物专一性、抑制剂的特性、Km值及分子量。
酸性脲酶通常由产酸性脲酶的菌株生成。这种菌株最好是那些所谓的“乳酸细菌”，例如属于下列属的菌株链球菌属、足球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属和双歧杆菌属。最好是使用下列有代表性的菌种屎链球菌(Streptococcus faecium)、缓症链球菌(S.mitis)、干酪乳杆菌干酪变种(Lactobacillus casei var casei)Steeptococcus mitior、牛链球菌(S、bovis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)幼儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)猪双歧杆菌(B.suis)和Bifidobacterium choerinum，但关于菌株没有限定;甚至来自乳制品，土壤、腐败酸变的食物、动物的器官和分泌物等的新鲜分离物也可使用，只要它们能产生酸性脲酶就行。此外从这些菌株通过紫外辐射或诱变剂处理而得到的人工变异株，以及通过人工分离的基因片段的重组而得到的其他菌株也可使用，这些基因片段对于所述酸性脲酶活性的表达是必需的。
具体地说，产酸性脲酶的菌株包括发酵乳杆菌JCM5867(IFO 14511CCTCC M87078)、发酵乳杆菌JCM 5868(IFO 14512 CCTCC M87079)、发酵乳杆菌JCM 5869(IFO 14513、CCTCC M87080)、Streptococcus mitior PG-154(IFO 14633，CCTCC M87083)、牛链球菌PG-186(IFO 14634、CCTCC M87084)和Bifidobacterium choerinum PG-196(IFO 14635，CCTCC M87082)。IFO号码是指在大阪发酵研究所(IFO)的保藏号，CCTCC号码是指在中国武汉典型培物收集中心的保藏号。
这些微生物在下表指出的日期保藏于CCTCC。
微生物 在CCTCC的保藏日期 保藏号发酵乳杆菌JCM5867 1987.10.4 CCTCC M87078发酵乳杆菌JCM5868 1987.10.4 CCTCC M87079发酵乳杆菌JCM5869 1987.10.4 CCTCC M87080S.mitior PG-154 1987.10.4 CCTCC M87083牛链球菌PG-186 1987.10.4 CCTCC M87084B.choerinum PG-196 1987.10.4 CCTCC M87082发酵乳杆菌JCM5867、发酵乳杆菌JCM5868和发酵乳杆菌JCM5869已经以上述IFO号码列入《第13期研究通讯(1985～1986年度报告)1987》，该书由IFO出版。
上述六种微生物具有下列细菌学性质。
菌株性质 JCM5867 JCM5868 JCM5869细胞形状 短杆 短杆 短杆(0.6-1.2×1.0-2.0)(0.6-1.2×1.0-2.0)(0.6-1.2×1.0-1.2游动性 - - -子形成 - - -
革兰氏染色 + + +最佳生产温度 30～40℃ 30～40℃ 30～40℃在45℃的生长 + + +在15℃的生长 - - -氧需求 兼性厌氧菌 兼性厌氧菌 兼性厌氧菌氧化-发酵试验 发酵的 发酵的 发酵的发酵类型 从葡萄糖大量生成 从葡萄糖大量生成 从葡萄糖大量生成DL-乳酸和乙醇 DL-乳酸和乙醇 DL-乳酸和乙醇气体形成葡萄糖 + + +葡萄酸 + + +酸形成葡萄糖 + + +葡糖酸 + + +甘露醇 - - -水杨苷 - - -棉子糖 + + +卫矛醇 - - -肌醇 - - -乳糖 + + +松三糖 - - -蜜二糖 + + +麦芽糖 + + +纤维二糖 - - -七叶苷 - - -甘油 - - -
甘露糖 - - -鼠李糖 - - -核糖 + + +阿拉伯糖 - - -山梨醇 - - -蔗糖 + + +果糖 + - -半乳糖 + + +海藻糖 - - -木糖 - - -过氧化氢酶 - - -氧化酶 - - -硝酸盐还原 - - -明胶液化 - - -营养缺陷性 硫胺素 硫胺素 硫胺素泛酸钙 泛酸钙 泛酸钙烟酸 烟酸 烟酸核黄素菌株性质 PG-196 PG-154 PG-186来源 猪十二指肠 猪十二指肠 猪结肠细胞形状 短杆 短杆 球形(0.6-0.8× (0.8-1.0× (0.8-1.0×1.0-1.5)μ 0.8-1.0)μ 0.8-1.0)μ游动性 - - -孢子形成 - - -革兰氏染色 + + +氧需求 微需氧菌 兼性厌氧菌 兼性厌氧菌氧化-发酵试验 发酵的 发酵的 发酵的发酵类型 均一的L-乳酸 均一的L-乳酸 均一的L-乳酸过氧化氢酶 - - -氧化酶 - - -氮还原 - - -明胶液化 - - -淀粉水解 + - +(微弱)MR试验 +(微弱) - +VP试验 + +(微弱) +(微弱)吲哚形成 - - -硫化氢形成 - -ND ND从精氨酸 - - -形成NH3石蕊牛乳 - - -从葡萄糖形成气体 - - -七叶苷分解 + - -
最佳生长温度(℃) 25-37 30-37 25-37在45℃的生长 - - -在15℃的生长 - - -在pH4.0的生长 - - -在pH9.6的生长 - - -在3%氯化钠水溶 + - -液中的生长在6.5%氯化钠 - - -水溶液中生长α-溶血作用 - - +(微弱)β-溶血作用 - - -酸形成阿东糖醇 - ND ND阿拉伯糖 + - -阿拉伯糖醇 - ND ND熊果苷 - +(微弱) +纤维二糖 + + +卫矛醇 - ND ND果糖 - + +半乳糖 + + +葡萄酸盐 - - -葡萄糖 + + +甘油 - - -肌醇 - - -菊粉 - - -乳糖 + + +
麦芽糖 + + +甘露糖 - - +甘露醇 - - -松三糖 - - -蜜二糖 + - -α-甲基葡 +(微弱) ND -ND糖苷棉子糖 + + -鼠李糖 - - -核糖 +(微弱) - -水杨苷 - + +山梨醇 - - -山梨糖 - ND ND淀粉 + - +蔗糖 +(微弱) + +海藻糖 - - -木糖 + - -木糖醇 - ND NDDNA含量(%) 65.5 40.3 40.1肽葡聚糖 Lys ND ND类型OrnSerAlaGlu
在上面的表中，符号“ND”是指没有进行实验，Lys、ASP、Ala、Orn、Ser和m-DAP分别代表赖氨酸、门冬氨酸、丙氨酸谷氨酸、鸟氨酸、丝氨酸和间二氨基庚二酸。通过将上述细菌学性质与《伯杰氏分类细菌学手册，第2卷》(1986)中的描述比较，检查了上述菌株的分类学位置。作为检查结果，PG-196菌株虽然由阿拉伯糖、纤维二糖、核糖和木糖等形成酸都是阳性，但将它分入微生物Bifidobacterium choerinum仍是合适的;PG-154菌株虽然α-溶血作用为阴性，但仍属于Streptococcus mitior;PG-186菌株的七叶苷水解虽然为阴性，但仍属于牛链球菌。
酸性脲酶从这些菌株中通过常规的静止培养、摇床培养、通气旋转培养或固体培养而进行连续或间歇式生产。所用培养基是细菌能在其中生长的常规培养基。碳源最好选自能被同化的碳水化合物、脂肪、脂肪酸和醇类，它们可以单独使用或结合使用。氮源包括有机氮源如蛋白胨、大豆粉棉籽粉、玉米浸泡液、酵母膏、肉膏、麦芽浸膏和乳清等，以及无机氮源例如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵，它们根据需要可以单独使用或有益地组合起来后使用。除了碳源和氮源以外，最好是在培养基中加入基本生长因子或生长促进剂如矿物质、氨基酸和维生素。有时加入脲、硫脲或其类似物以诱导酸性脲酶的形成。为了控制培养过程中的pH值和泡沫，补加合适的苛性碱溶液、碳酸钠溶液或钙盐溶液或抗泡沫剂是有效的。
听选择的培养温度在适于所用细菌生长的范围内，通常为15～50℃最好是25～40℃。培养时间持续到足够细菌生长和酸性脲酶的生产，通常是5～50小时。
在上述条件下培养以后，细菌细胞中通常含有酸性脲酶。通过离心、沉淀、凝集、通过有孔膜或陶瓷过滤等从培养物中收集活细胞，在本发明中，这种细胞可用作酸性脲酶的粗制品，而不必经过任何进一步处理或经过冷冻干燥、喷雾干燥、丙酮干燥等。使所述酶溶解也是可行的，即通过冻熔、研磨、声波处理渗透休克、溶菌酶、表面活性剂等(单独使用或结合使用即可)处理细胞，然后结合使用各种合适的酶纯化的常规技术进行纯化，例如鱼精蛋白处理、盐析、有机溶剂处理、等电点沉淀、电泳、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析和结晶，从而产生比活细胞有更高专一活性的酶粗制品或纯化制剂，它们可用于本发明的方法中。
下面说明用酸性脲酶处理蒸馏酒的方法。
用于处理蒸馏酒的酶形式，可以是含有该酶的细菌细胞，或通过常规的提取和纯化技术得到的酸性脲酶的粗制品或纯化制剂，或通过将酶制剂包埋在天然聚合物如琼脂和角叉藻聚糖或合成聚合物如聚丙烯酰胺和脲烷树脂中而得到的固化制品，或通过结合在一种载体如活性炭、陶瓷、葡聚糖、琼脂糖及其有关物质和有孔玻璃上而得到的固化制品。
要用本发明方法处理的蒸馏酒是那些含有脲的饮料，包括发酵制品如精制清酒、啤酒、葡萄酒、果酒、samshu、威士忌麦芽汁、shouhu麦芽汁(Shouhu是一种日本烈性酒)和白兰地麦芽汁及其中间产物等。例如，可用本发明方法处理的有日本清酒、最终麦芽汁、麦芽汁挤压过滤后装在大桶中的未精制的清酒、生酒精、巴氏消毒后的防腐清酒、装瓶前的精制清酒等，但是，最好在巴氏消毒前加入所述酶进行处理。
用酸性脲酶处理这些酶蒸馏酒时，加入0.00001单位/ml至1单位/ml的酸性脲酶是非常有益的，尤其是0.0001单位至0.1单位/ml。一单位是指在单位时间内(分钟)分解脲而释放出1微摩尔氨所需酶量。本文后面一单位写作1U。
处理蒸馏酒的温度通常为0℃-80℃，最好是10℃～60℃。pH为2-7，较好是3-5。处理时间要持续到足以除去蒸馏酒中的脲，通常为20分钟-200天，更经常是5小时至120天。
也能通过下述方法用酸性脲酶处理蒸馏酒，即在为生产蒸馏酒而进行的乙醇发酵过程中，使产酸性脲酶的微生物活细胞一起培养。
在完成乙醇发酵之前的任何时间，都可加入产酸性脲酶的细菌。最好是接种产酸性脲酶的细菌，使其在生产酵母麦芽汁的过程中或制备糖化混合液的过程中生长，然后根据常规方法使其经历主发酵(乙醇发酵)。可在主发酵的合适时间接种並培养产酸性脲酶的细菌，最好是在整个发酵期的中期之前。
使产酸性脲酶的细菌在蒸馏酒的酵母麦芽汁中生长时，应在通常加入酵母之前接种产酸性脲酶的细菌，当产酸性脲酶的细菌充分生长后再接种酵母;然后根据常规方法制备种子麦芽汁並用于淀粉的糖化过程。如果使产酸性脲酶的细菌在粗原料或糖化的粗原料中生长，则应对粗原料〔如蒸米、曲米(一种蒸米上的Aspergirus oryzae的培养物)、麦芽、大麦汁、葡萄汁、淀粉〕或糖化的粗原料接种产酸性脲酶的细菌，並在充分生长后用于淀粉糖化。
产酸性脲酶细菌的培养温度並无限定，但最好是28-40℃。产酸性脲酶细菌的生长数目无限定，但最好是108/ml或更多。含有产酸性脲酶细菌的种子麦芽汁或粗原料或糖化的粗原料可用于完成乙醇发酵之前的任何糖化阶段或糖化过程的任何时间。例如生产精制清酒时，它们可在糖化过程的初期，中期或终止加入时使用，或糖化过程中的任何时间使用。含有产酸性脲酶细菌的种子麦芽汁或粗原料或糖化的粗原料的加入量並无限定，但最好是3-15%。
在种子麦芽汁中加入产酸性脲酶的细菌时，如果该细菌是产酸菌株则没有必要加入酸，然而，如果该细菌不产酸，则在加入酵母之前要加入酸(例如乳酸)，加入量几乎等同于通常用于种子麦芽汁的量。
本发明的乙醇发酵可在常规条件下进行(温度、时间等)，在随后的过程中，例如过滤、压缩过滤、巴氏消毒、储存、陈化和蒸馏等，不要求对所用条件进行改变。
与用来自刀豆的中性至碱性脲酶处理的常规方法相比较，本发明用酸性脲酶处理蒸馏酒的方法在经济上更为优越，因为所需脲酶数量要少得多也就是说，本发明的方法只需要常规方法的大约1/100-1/10000的酶单位或大约1/10-1/100重量的酶或更少的量，就能通过分解完全去掉脲。因此，由于处理后残留在蒸馏酒中的脲酶导致的腐败实际上是可以忽略的。这与常规方法相比较是更为有益的一个方面。
此外，利用本发明的方法，脲的分解在更高温度下在短期内和甚至在酸性pH3-5(这对于蒸馏酒是常见的)的条件下进行;脲能够被高效率分解，这对工业化生产是很有利的。
本发明在下面用实例给予更具体的说明。这些实例仅仅作为实例给出它们绝不限制本发明的范围。
培养物中酸性脲酶的活性通过普盐法进行比色测定，使离心收集的培养物细胞置于无菌的去离子水中，取一体积已适当稀释的细胞悬浮液与等体积的含脲的0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)混合，使混合物在37℃反应30分钟，然后比色测定所产生的氨。活性以单位表示，一个单位(1U)是指单位时间(分钟)产生一微摩尔氨的酶量。
实例1对发酵乳杆菌JCM5867(IFO 14511、CCTCC M87078)进行穿刺培养，培养基组成为0.5%肉膏、0.5%食盐、1.0%碳酸钙和1.5%琼脂，培养后将其接种到200ml的Erlenmeeyer培养瓶中，每个瓶中含有50ml pH7.0的无菌培养基(用30%苛性苏打中和)，该培养基的组成为2.0%葡萄糖2.0%无水醋酸钠，1.0%蛋白冻、1.0肉膏、0.2%酵母膏、0.5%食盐和0.005%硫酸镁(每摩尔含有大约4摩尔结晶水)、然后在37℃下静置培养24小时。每个瓶中产生的种子培养物转移至两个2升Erlenmeyer培养瓶的一个中，每个瓶中含有1升与上述组成相同的无菌培养基，然后在37℃下静置培养24小时。这些培养液中的脲酶活性为0.1U/ml。
通过离心收集培养液中的细胞，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗两次，悬浮在含有30ml0.05M磷酸缓冲液(pH7.2)0.02M EDTA和0.01M二硫苏糖醇的溶液中，进行声波处理;用硫酸铵使上清液进行分离，收集在40%-70%饱和度下得到的沉淀，将其溶于10ml0.05M磷酸缓冲液中，透析过液，冰冻干燥，结果得到260.4mg酸性脲酶的粗酶粉末。脲酶活性为0.5U/mg，纯化效率为65.1%。
粗酶粉的一般性质如下最佳pH pH2-4.5最佳温度 60-70℃pH稳定性 在pH2-10时，在37℃下处理2小时保持稳定热稳定性 在pH4时，在60℃以下处理2小时保持稳定然后，使粗酶粉溶于精制清酒中(含有20%乙醇和30ppm脲，pH4.3)使其浓度大约为0.02U/ml或0.1U/ml，保持在30℃下使精制清酒中的脲分解;结果示于表1中。用市售得来的刀豆脲酶制剂以10U/ml作为对照。用刀豆的脲酶以10U/ml处理5天，精制清酒中的脲大约只减少了一半，而用低至0.1U/ml的酸性脲酶只处理一天，就使脲完全分解了。
通过硝普盐比色法测定酸性脲酶和刀豆脲酶的活性，分别测定在pH4.0和pH7.0产生的氨。通过酶法测定精制清酒中的脲含量，使用依赖NADP+的谷氨酸脱氢酶测定用脲酶分解脲产生的氨。
这些测定方法也适用于下述实例。
表1所用脲酶的 处理天数种类与数量 0天 1天 2天 5天ppm ppm ppm ppm0.02U/ml酸性脲酶 30 5 3 00.1U/ml酸性脲酶 30 0 0 010.0U/ml刀豆脲酶 30 18 14 13实例2在生清酒中(含有20%乙醇和30ppm脲pH4.3)加入实例1中得到的酸性脲酶的粗酶粉，使酸性脲酶的活性大约为0.01U/ml或0.03U/ml，保持在10℃或15℃下分解脲。如表2所示，用0.003U/ml酸性脲酶在10℃下处理8天后使生清酒中的脲完全分解。味觉试验表明，处理后的精制清酒比对照的精制清酒(未用酸性脲酶的粗酶粉处理)质量更为优越，失味更少。
表2温度 脲酶量 处理天数0 2 4 6 8mU/ml ppm ppm ppm ppm ppm10℃ 10 30 12 4 0 03 30 18 10 4 015℃ 10 30 8 0 0 03 30 14 8 3 3
实例3如实例1的同样方法培养发酵乳杆菌JCM5867(IFO 14511 CCTCC M87078)，从得到的4升培养液中收集细胞，冰冻干燥后产生2.0g干细胞。这些干细胞的酸性脲酶活性为0.35U/ml。
生清酒(含有20%乙醇和30ppm脲，pH4.3)在75℃下巴氏消毒1分钟，迅速冷却至30℃，向其中加入上述干细胞，使酸性脲酶的活性大约为0.01U/ml或0.003U/ml，保持在30℃下。随着时间的脲浓度变化示于表3中。
表3脲酶量 处理天数0 4 6 1010mU/ml ppm ppm ppm ppm30 9 0 03 30 16 7 0实例4生清酒(含有20%乙醇和30ppm脲，pH4.3)在62℃下巴氏消毒15分钟，迅速冷却至55℃，加入实例1中得到的酸性脲酶的粗酶粉使之无菌溶解，使其活性大约为0.003U/ml，然后迅速冷却至室温，在精制清酒的常规条件下贮藏，随着时间的脲浓度变化示于表4中。
表4脲酶量 处理天数0 4 7 103mU/ml 30ppm 12ppm 4ppm 0ppm混合物温度(℃) 20 21 23 24实例5发酵完成以后，在清酒的最终麦芽汁中(含有18%乙醇和30ppm脲，pH4.2)加入实例1得到的酸性脲酶的粗酶粉，使其活性大约为0.01U/ml，保持在13℃，三天以后过滤至大桶中。如表5所示最终麦芽汁中的脲在3天内完全分解。在最终麦芽汁过滤以后，在大桶的清酒中也检测不到脲。
表5处理天数0 1 2 3 大桶中的清酒脲(ppm) 30 18 8 0 0
实例6在啤酒中(含有4.2%乙醇和5.1ppm脲，pH4.2)溶入实例1得到的酸性脲酶的粗酶粉，使其浓度大约为0.003U/ml，在10℃下保持3天;啤酒中的脲浓度变化示于表6中。脲在3天内能够完全分解。味觉试验表明，这样处理的啤酒比未用酸性脲酶处理的啤酒更好，失味更少。
表6处理天数0 1 2 3脲(ppm) 5.1 3.0 1.5 0实例7用如实例1所述的同样方法培养发酵乳杆菌JCM5867(IFO14511，CCTCC M87078)，使得到的4升培养液离心而收集细胞，冰冻干燥后产生2.0g干细胞。这些干细胞中酸性脲酶的活性为0.35U/ml。这些干细胞以0.5mg/ml的浓度是浮在精制清酒中(含有20%乙醇和30ppm脲，pH4.3)，在50℃下保持6小时，使脲完全消失。
实例8在葡萄酒中(含有12.1%乙醇和6.2ppm脲，pH3.7)加入实例7得到的含有酸性脲酶的干细胞，使其活性大约为0.03U/ml在15℃下保持5天，使葡萄酒中的脲完全消失。
然后从葡萄酒中去掉细胞，通过味觉试验与未用细胞处理的葡萄酒比较;用细胞处理的葡萄酒更好，失味更少。
实例9在威士忌麦芽汁中(含有5.3%乙醇和5.0ppm脲、pH4.3)加入实例1得到的酸性脲酶的粗酶粉，浓度为0.01U/ml，在22℃下保持24小时，使威士忌麦芽汁中的脲完全分解。
这样处理的威士忌麦芽汁和未处理的威士忌麦芽汁，每种都在玻璃蒸馏器中蒸馏两次，以得到含有50%乙醇的威士忌产品。用味觉试验比较这两种产品;处理后的威士忌产品更好，失味更少。
实例10在米酒麦芽汁(rice shochu mash)中(含有17.5%)乙醇和30ppm脲，pH3.8)加入实例7得到的含有酸性脲酶的干细胞，使其活性大约为0.03U/ml，在15℃下保持2天，使米酒麦芽汁中的脲完全消失。
加入细胞的米酒麦芽汁和未加细胞的米酒麦芽汁在减压下蒸馏，以产生含40%乙醇的米酒产品。通过味觉试验比较这两种产品;处理后的产品更好，失味更少。
实例11对发酵乳杆菌JCM5867(IFO 14511，CCTCC M87078)进行穿刺培养，培养基组成为0.5%葡萄糖、1.0%蛋白冻、1.0%酵母膏、0.5%肉膏、0.5%食盐、1.0%碳酸钙和1.5%琼脂，然后接种入两个1升的Erlenmeyer培养瓶中，每个瓶中含有500ml pH7.0的无菌培养基(用30%苛性苏打中和)，培养基组成为2.0%葡萄糖、2.0%无水醋酸钠、1.0%蛋白冻、1.0%肉膏、0.2%酵母膏、0.5%食盐和0.005%硫酸镁(每摩尔含有大约4摩尔结晶水)，然后在37℃下静置培养24小时，使活细胞数变为2.4×10g/ml。产生的种子培养物以10000rpm离心10分钟，收集的细胞用500ml无菌水洗涤后再次离心。洗涤后的细胞悬浮在10ml无菌水中。
在蒸米和清酒曲(相当于30kg碾好的米和30kg曲米)混合物中加入120升水，在55℃保持5小时使之糖化。使糖化混合液加热至70℃保持5分钟以进行消毒，然后冷却至35℃。在其中加入10ml上述的发酵乳杆菌JCM5867的活细胞悬浮液。然后使混合物在35℃下保温2天。乳酸细菌数目控制在2×10g/ml。混合物冷却至28℃在其中接种清酒酵母Kyokai-7，使其浓度大约为2×107/ml，保温4天后对麦芽汁给予第一次加入，使其沉降一天而不加入(odori)然后给予第二和第三次加入;然后使其正常规的温度变化条件下进行发酵。然后，在第19天时对麦芽汁给予第四次加入，乙醇和未精制的清酒过滤到大桶中。表7列出了本实例中各糖化阶段各组分的数量。表8概括了种子麦芽汁中的变化。表9给出了过滤到大桶中的清酒的分析结果。从表中可以清楚地看到，用产酸性脲酶的乳酸细菌处理种子麦芽汁后制备的最终麦芽汁中几乎检测不到脲，因为它已经被酸性脲酶分解了而在对照中却能检测到脲。产品质量也更好，味道比对照更为丰富。
表7、糖化过程各阶段中各组分的量(kg)清酒酵母 第一次 第二次 第三次 第四次培养物 加入 加入 加入 加入 总计总米 60 130 255 475 80 1000蒸米 30 95 200 395 80 800曲米 30 35 55 80 200水 120 100 320 620 150 1310
表8、种子麦芽汁随着时间的变化加入酵母后的天数 1 2 3 4 5Baume(Be)对照 11.3 10.1 8.9 7.7 6.1本发明 13.5 10.5 7.8 6.6 6.0乙醇(Alc)(%)对照 1.5 3.6 5.8 7.0本发明 1.5 5.0 6.3 6.7酸性(T、A)对照 4.10 5.10 5.75 6.32 7.10本发明 5.58 8.28 10.18 9.85 9.90氨基酸酸性(A.A.)对照 2.0 1.71 1.85 1.80 1.90本发明 5.30 4.57 3.77 3.60 3.45发酵乳杆菌 对照 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0JCM5867计数(×106)本发明 380 400 400 400 400乳酸 对照 510 615 700 800 920(ppm)本发明 1094 1157 1230 1270 1260表9、过滤至大桶中的清酒的分析结果Be Alc T.A A.A 脲(ppm)对照 -2.3 19.9 1.80 1.75 15.3本发明 -2.0 19.9 1.85 1.82 0.0
实例12在蒸米和清酒曲的混合物中(相当于60kg碾好的米和40kg曲米)加入180升水，在55℃保持5小时以进行糖化。糖化混合物通过加热至70℃並保持5分钟进行巴氏消毒，然后冷却至35℃。在此冷却的糖化混合物中加入40ml实例11得到的发酵乳杆菌JCM 5867的活细胞悬浮液。然后使混合物在35℃下保温2天。乳酸细菌的计数控制在2×108/ml。此糖化混合物的总量在第12天加到麦芽汁中(第4次加入)，在第18天给予第5次加入及加入乙醇，将清酒过滤到大桶中。表10列出了本实例中各糖化阶段各组分的数量表11给出了麦芽汁中脲含量随时间的变化。后一个表表明，用产酸性脲酶的乳酸细菌处理的第4次加入加进麦芽汁后，其中的脲含量在加入之后即开始下降，在过滤到大桶中时已变为0，这表明脲已被酸性脲酶分解。在大桶中的清酒也检测不到脲。味觉试验表明，大桶中的清酒质量极佳，具有浓厚清新的味道。
表10、糖化过程各个阶段各组分的数量(kg)清酒酵母 第一次 第二次 第三次 第四次 第五次培养物 加入 加入 加入 加入 加入 总计总米 50 125 235 430 100 60 1000曲米 25 35 45 60 40 205蒸米 25 90 190 370 60 60 795水 100 100 290 550 180 120 1340
表11、麦芽汁中脲含量的变化(ppm)麦芽汁年龄(天) 12 13 14 16 18 大桶中的清酒对照 21 24 26 28 30 24本发明 21 11 3 1.2 0 0实例13在GAM半固体商品培养基上(Nissui Seiyaku Co.Japan)培养Streptococcus mitior PG-154(IFO 14633 CCTCC M87083)，将其接种到200ml的Erlenmeyer培养瓶中，其中含有50ml pH7.0的(用30%苛性碱中和)无菌的种子培养基，培养基组成为3%葡萄糖、1.5%蛋白冻、1%肉膏、0.8%酵母膏、0.5%食盐、0.2%无水醋酸钠、0.005%硫酸镁(每摩尔大约含有4摩尔结晶水)和0.001%硫酸钴(7分子水合物)，使其在34℃下静置培养24小时。取5ml此种子培养物转移至200ml的Erlenmeyer培养瓶中，其中含有100ml同样组成的无菌培养基，在32℃下静置培养2天。测定此培养物中酸性脲酶的活性，测定活性为0.6U/ml。
取5ml上述得到的培养物以3000rpm离心10分钟以收集细胞然后用水洗涤细胞，离心，悬浮于1ml无菌水中，加入50ml异丁醇並在50℃下保持15分钟，从而产生一种酶溶液，利用0.2M柠檬酸盐缓冲液测定它的最佳pH。结果示于表12中。如表所示，本发明的所有菌株在酸性范围内具有强烈的脲分解活性。
表12pH 3 4 5 6 7 8 9相对活性(%) 68 100 98 67 26 14 13从80ml培养物中离心收集细胞，浸于50%乙醇中消毒，离心並冰冻干燥。得到的干细胞重16.9mg，酸性脲酶活性为1.44U/mg。
将干细胞加到精制清酒中(含有20%乙醇和30ppm脲，pH4.3)使酸性脲酶活性大约为0.01U/ml，保持在30℃下分解精制清酒中的脲;结果示于表13中。
表13处理天数 0 2 4 6 10脲(ppm) 30 11 2 0 0实例14在GAM半固体商品培养基中(Nissui Seiyaku Co.Japan)培养下面表14所列的菌株，接种到200ml的Erlenmeyer培养瓶中，每个瓶中含有50ml无菌的GAM商品培养基(Nissui Seiyaku Co.Japan)，使其在34℃下静置培养24小时。从每种这样得到的种子培养物中取5ml转移至200ml的Erlenmeyer培养瓶中，每个瓶中含有100ml无菌培养基，此培养基是通过在同样的GAM商品培养基中加入0.005%硫酸镁(每摩尔含有大约4摩尔结晶水)而得到的，然后使其在32℃下静置培养3天。测定这些培养物的酸性脲酶活性结果示于表14中。
表14菌株 培养物中酸性脲酶活性(U/ml)牛链球菌PG-186(IFO 14634 CCTCC M87084) 0.4Bifidobacterium choerinum PG-196 1.2(IFO 14635、CCTCC M87082)取5ml通过上述方法得到的培养物，以3000rpm离心10分钟以收集细胞，用水洗涤，离心、悬浮于1ml无菌水中，在其中加入50ml异丁醇，並在50℃下保持15分钟;利用0.2M柠檬酸盐缓冲液测定所得酶溶液的最佳pH值。结果示于表15中。如表所示，本发明的这些菌株在酸性范围内具有强烈的脲分解活性。
通过上述方法得到的PG-186和PG-196菌株培养物各取80ml，通过离心收集细胞，浸于50%乙醇中4小时以消毒，离心並冷冻干燥。这样得到的干细胞分别重30.2mg和64.0mg，酸性脲酶活性分别为0.38U/mg和0.6U/mg。
将干细胞加到精制清酒中(含有20%乙醇和30ppm脲，pH4.3)使其酸性脲酶活性大约为0.01U/ml，保持在30℃下以分解精制清酒中的脲。结果示于表16中。
表15相对活性(%)PH PG-186 PG-1963 40 353 85 1005 100 306 70 357 35 238 17 389 15 35表16处理天数脲酶来源 0 2 4 6 10PG-186 30 10 0 0 0PG-196 30 18 8 1 0
权利要求
1.一种改进蒸馏酒质量的方法，其特征在于该方法包括用酸性脲酶处理含脲的蒸馏酒。
2.根据权利要求
1的方法，其中的蒸馏酒是由发酵过程产生的並包括其中间产物。
3.根据权利要求
2的方法，其中的发酵制品是清酒、啤酒、葡萄酒、果酒、samshu、威士忌麦芽汁、日本米酒(shochu)麦芽汁、白兰地麦芽汁。
4.根据权利要求
1的方法，其中的酸性脲酶是从1摩尔脲和1摩尔水产生2摩尔氨和1摩尔二氧化碳气的酶，其活性的最佳pH在酸性范围内。
5.根据权利要求
4的方法，其中的酸性范围是pH2-5。
6.根据权利要求
1的方法，其中的蒸馏酒用含有所述脲酶的细菌细胞形式的酸性脲酶或酸性脲酶的粗制品或纯化制剂进行处理。
7.根据权利要求
1的方法，其中的处理是通过在蒸馏酒中加入0.00001单位/ml至1单位/ml的酸性脲酶而进行的。
8.根据权利要求
1的方法，其中的处理如下述进行使产酸性脲酶微生物的活细胞在蒸馏酒生产的乙醇发酵过程中进行共培养。
9.根据权利要求
8的方法，其中的产酸性脲酶的微生物属于下列属链球菌属、足球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属和双歧杆菌属，它们能够产生酸性脲酶。
10.根据权利要求
8的方法，其中的产酸性脲酶的微生物在生产酵母麦芽汁的过程中或制备糖化混合液的过程中接种並使其生长，然后使其经历主发酵阶段。
专利摘要
用脲酶处理含脲的蒸馏酒，该酶活性的最佳pH在酸性范围中，尤其是pH2—5范围内。通过这种处理，能够完全分解蒸馏酒中的脲并使其去掉，与使用最佳pH在中性至碱性区域的脲酶的常规的处理法相比较，本发明所用数量少得多，所需时间也更短。从实用观点看来，本发明的方法更加具有优越性，这样产生的蒸馏酒的质量优于常规处理所得到的蒸馏酒。
文档编号C12N9/78GK87106909SQ87106909
公开日1988年4月27日 申请日期1987年10月14日
发明者柿本茂八, 隅野靖弘, 山田秀明, 今安聪, 市川英治, 水津哲义 申请人:武田药品工业株式会社, 月桂冠株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan