专利名称：一种高水溶性大豆异黄酮衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明属于化学技术领域，具体涉及用酶的方法合成所需要的化合物。
背景技术：
人工合成的雌激素用于妇女更年期综合证的治疗有时会引起其他类疾病。鉴于大豆异黄酮在预防和降低癌症发生率，提高骨密度，缓解潮热，增加机体免疫力方面有非常好的作用，所以成为激素替代疗法(hormone replacementtherapy，HRT)中常常使用的成分而用于口服药物。
然而近期的许多研究都证实，口服大豆异黄酮的生物有效性(bioavailability)较低，其吸收是在小肠中进行的(Turner NJ，Thomson BM，Shaw IC.Bioactive isoflavones in functional foodsthe importance of gutmicroflora on bioavailability.Nutr Rev.2003 Jun；61(6Pt 1)204-13.)。天然糖苷型大豆异黄酮被小肠微生物分泌的beta-葡萄糖苷酶转化为苷元，然后才能被肠道上皮细胞所吸收，然后进入血液(Setchell KD，Brown NM，Zimmer-Nechemias L，Brashear WT，Wolfe BE，Kirschner AS，Heubi JE.Evidence for lack of absorption of soy isoflavone glycosides in humans，supportingthe crucial role of intestinal metabolism for bioavailability.Am J Clin Nutr.2002Aug；76(2)447-53.)。所以不同人群肠道的菌群环境，肠道上皮细胞的吸收能力等均有差异，也导致对口服摄入的大豆异黄酮的吸收利用率不同。
为了增加生物有效性，目前广泛使用的方法是将天然大豆异黄酮糖苷用酸或beta-葡萄糖苷酶进行体外水解，以大豆异黄酮苷元的形式作为食品药品的成分。从改善人体小肠菌群环境的角度考虑，低聚果糖(Mathey J，Puel C，Kati-Coulibaly S，Bennetau-Pelissero C，Davicco MJ，Lebecque P，Horcajada MN，Coxam V.Fructooligosaccharides maximize bone-sparing effects of soyisoflavone-enricheddiet in the ovariectomized rat.Calcif Tissue Int.2004Aug；75(2)169-79.Epub 2004 May 20.)和菊糖(Zafar TA，Weaver CM，Jones K，Moore DR 2nd，Barnes S.Inulin effects on bioavailability of soy isoflavones andtheir calcium absorption enhancing ability.J Agric Food Chem.2004 May19；52(10)2827-31.)也被加入大豆异黄酮产品。
但是，大豆异黄酮的吸收与代谢必竟是一个较为复杂的过程。最近的几项研究也表明，在体外将大豆异黄酮糖苷转化为苷元并不能增加妇女对他的吸收(Zheng Y，Lee SO，Verbruggen MA，Murphy PA，Hendrich S.The apparentabsorptions of isoflavone glucosides and aglucons are similar in womenand are increased by rapid gut transit time and low fecal isoflavonedegradation.J Nutr.2004 Oct；134(10)2534-9.Zubik L，Meydani M.Bioavailability of soybean isoflavones from aglycone and glucoside forms inAmerican women.Am J Clin Nutr.2003 Jun；77(6)1459-65.)，也不能改变妇女血浆和尿液中异黄酮的药代动力学过程(Richelle M，Pridmore-Merten S，Bodenstab S，Enslen M，Offord EA.Hydrolysis of isoflavone glycosides toglycones by beta-glycosidase does not alter plasma and urine isoflavonepharmacokinetics in postmenopausal women.J Nutr.2002 Sep；132(9)2587-92.)。
大豆异黄酮苷元是极度疏水的分子，而且通常只联有一个葡萄糖残基，所以他们在水中的溶解性极低。即使对于大豆异黄酮中溶解性较好的大豆苷(daidzin)，在室温下于水中的溶解度也不超过25μM，这严重限制了其在食品药品中的添加与使用。现在的异黄酮产品主要是一些胶囊片剂，品种单一，口味很差。大豆是日常饮食的主要异黄酮来源，然而由于口感风味组织形态的原因，相当一部分人不喜欢吃大豆食品。并且由于大豆中的异黄酮含量不高，加工贮藏过程中的损失，生物有效性低等原因，造成人体吸收异黄酮的量过低，使得大豆食品远远不能提供60-100mg异黄酮苷元/人/天，起到防病治病的效果。即使在大豆和大豆食品消费量特别大的日本，每人一天的平均异黄酮摄入量也仅为28mg。异黄酮的低溶解度，也使得液态大豆食品中异黄酮浓度较低。最近的调查研究表明，在美国和英国市场，大豆奶制品中的异黄酮浓度仅有1.26-21.13mg/100g。解决这些不利的措施就是在食品中添加大豆异黄酮。然而由于大豆异黄酮的水溶性相当地差，至今仍不能将大豆异黄酮提取物作为功能性食品添加剂和膳食增补。为了提高大豆异黄酮的溶解性，国际上相继开发出一些新技术。JP2002155072使用beta-环状糊精来螯合异黄酮分子，这是至今为止能工业化生产能提高溶解度的最有效的方法。所得到的螯合异黄酮，溶解度能增加5-6倍。然而由于beta-环状糊精能引起溶液混蚀，并且能束缚风味特质，所以这种产品的应用也是有限的。EP1057416将异黄酮与羟丙基或、和琥珀酰基淀粉溶液共热，也能得到溶解性提高的混和物。US6458406/US2004175475加入钙镁盐或有机无机酸来增加异黄酮的溶解度，然而必须用氢化的方法脱色，并且产物中矿物盐含量较高。JP2003128542加入阿拉伯树胶。这些加入的增溶物质在很大程度上也严重影响产品在各种食品中的使用，并且增溶物质的添加量也是受限的。US2002111466/WO2004073658应用化学反应脂化形成异黄酮羧酸或磷酸脂来提高其溶解度，然而这种分子结构改变的异黄酮的生理功能也需要被重新评价。US2004220116是于高温下在大豆异黄酮提取物与水的共混物中加入5倍量的乳化剂聚山梨醇酯。US2004137127是在大豆异黄酮中加入亲水聚合物聚烯吡酮或聚乙二醇。US2004126443以整粒大豆为原料用水高温提取异黄酮，然后再以离心酶解的步骤除去蛋白。这种方法虽然可以得到水溶性异黄酮，但是其浓度较低；而且整个方法只考虑到异黄酮，对大豆中其他成分利用不足，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆异黄酮的衍生物，克服以往的大豆异黄酮作为治疗、保健品使用存在的前述不足。
本发明的另一个目的是提供一种该大豆异黄酮衍生物的制备方法。
本发明的大豆异黄酮衍生物是以环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮，其结构式为
本发明的大豆异黄酮衍生物的制备方法是用热稳定的环葡聚糖转移酶，以高浓度的淀粉做为糖基供体，将天然大豆异黄酮转化成以环葡聚糖络合为主的多糖基化异黄酮。
在酶促反应的过程中，以0.5％-5％大豆异黄酮糖苷作为糖基受体，以0.5％-20％淀粉作为糖基供体，加入0.1U-200U/mL的环葡聚糖转移酶，在20-95℃，5min-5hr的反应条件下，既可得到以环葡聚糖络合为主的多糖基化异黄酮。研究中发现，增加底物的浓度，可以减少酶的用量，缩小反应体系的体积，降低能耗，从而显著地提高反应的效率和增加以环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮的产率。
为了提高上述方法得到的大豆异黄酮衍生物的纯度，将反应结束所得的多糖基化异黄酮用冷却结晶，离心过滤，树酯吸附，溶剂萃取，喷雾冷冻干燥等分离方法对环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮进行纯化。
本发明的积极效果是所得到的环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮是在原天然大豆异黄酮糖苷分子的葡萄糖残基上共价结合上几个额外的葡萄糖基，然后再与反应中形成的环葡聚糖络合而形成的。具有较高的水溶性。经检测，环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮在室温时水中的溶解度是95.2mM，比天然大豆异黄酮提取物高222倍。反应产品中也包括未被环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮。反应过程中，未改变苷元部分的分子结构，最大程度上保留了天然大豆异黄酮的活性。经配液，过滤，消毒，即可制成注射液，口服液，或再经冷冻干燥制成粉针剂。用于肿瘤(特别是乳腺癌和前列腺癌)，潮热，骨质疏松，高脂血症等疾病的治疗。克服了过去大豆异黄酮只能口服，生物有效性低，治疗效果不明显等缺点。
本发明的环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮的水溶性是用以下方法测定的将过量的大豆异黄酮加入装有1mL水的Eppendorf离心管中，在室温下于超声波清洗机内超声提取1hr，用0.45μm微孔滤膜过滤后，取10μL，用高效液相色谱测定其内异黄酮含量。高效液相色谱测试条件C18色谱柱，260nm紫外检测器；流动相A水/甲酸(100/0.1)；流动相B甲醇/水/甲酸(50/50/0.1)。洗脱梯度0-30min，流动相B由0增加至100％。分别以金雀黄素，染料木素和大豆素做标准曲线，以此确定样品中各异黄酮的含量。
本发明的环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮可以与其他用于乳腺癌的化学治疗的药物，包括但不限于环磷酰胺，洛莫司汀，苯丁酸氮芥，氨甲蝶呤，氟尿嘧啶，阿霉素，长春碱酰胺，去甲长春花碱，顺铂，紫杉醇，泰素帝，三苯氧胺，氨鲁米特性激素，氨鲁米特，氟尿嘧啶，环磷酰胺，阿霉素，表阿霉素，米托蒽醌，卡铂，或与前列腺癌的化学治疗的药物，如雌激素等，制备而成复合药物。也可于番茄红素，維生素E等，制备而成口服液，用于提高前列腺癌患者的辅助治疗。
本发明的环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮可以单独或与一些有利于提高骨密度的矿物盐，增加异黄酮和矿物盐吸收的低聚糖和维生素，以及其他一些有利于骨质健康的成分一起被制成口服液，用于妇女更年期综合症，骨质疏松症等疾病的预防和治疗。这些成分包括，但不限于乳酸钙，葡萄糖酸钙，磷酸镁，氨基葡萄糖盐酸盐，硫酸软骨素，大豆低聚糖，低聚果糖，菊糖，维生素D等。
附图为环葡聚糖转移酶催化大豆异黄酮和淀粉转糖基化反应示意图。
具体实施例方式
实施例1大豆异黄酮提取物400g和玉米淀粉1200g被溶解于60℃ pH6.550mM 10L的NaOC2H5-C2H5OOH缓冲液，保温10min，然后加入环葡聚糖转移酶(2U/mL)，在上述条件下反应5hr。待反应结束以后，先将反应液冷却至室温，再将反应液于4000rpm/min离心10min，得到的上清液流经一个2.5×5cm AmberliteXAD-16大孔树脂柱，再用2倍体积的水洗除去可溶性糖类化合物和缓冲液，然后用2倍体积的乙醇洗脱吸附于树脂柱中的异黄酮，最后采用减压浓缩的方式除去乙醇，从而得到多糖基大豆异黄酮混和物。
实施例2.将消毒灭菌后的100g多糖基大豆异黄酮，20g大豆低聚糖，10g乳酸钙溶解于5L医药用纯水中，制备成大豆异黄酮加钙口服液。
实施例3.将消毒灭菌后的100g多糖基大豆异黄酮和30g紫杉醇溶解于5L医药用纯水中，再经0.22μm膜过滤，从而制备成大豆异黄酮紫杉醇注射液。临用前将本品5mL稀释于0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液500ml中，用非聚氯乙烯材料的输液瓶和输液管，并通过所连接的0.22μm孔径过滤器过滤后，制成静脉滴注液。
权利要求
1.一种高水溶性大豆异黄酮衍生物，其特征是以环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮，其结构式为
2.一种高水溶性大豆异黄酮衍生物的制备方法，其特征是用0.1U-200U/mL热稳定的环葡聚糖转移酶，以0.5％-5％大豆异黄酮糖苷作为糖基受体，以0.5％-20％淀粉作为糖基供体，在20-95℃，5min-5hr的反应条件下，所得到的以环葡聚糖络合为主的多糖基化异黄酮。
全文摘要
一种高水溶性大豆异黄酮衍生物及其制备方法，属于化学技术领域。是用热稳定的环葡聚糖转移酶，以高浓度的淀粉做为糖基供体，将天然大豆异黄酮转化成以环葡聚糖络合为主的多糖基化异黄酮。本发明的积极效果是所得到的环葡聚糖络合的多糖基化异黄酮具有较高的水溶性。在室温时水中的溶解度是95.2mM，比天然大豆异黄酮提取物高222倍。反应过程中，未改变苷元部分的分子结构，最大程度上保留了天然大豆异黄酮的活性。经配液，过滤，消毒，即可制成注射液，口服液，或再经冷冻干燥制成粉针剂。用于肿瘤(特别是乳腺癌和前列腺癌)，潮热，骨质疏松，高脂血症等疾病的治疗。克服了过去大豆异黄酮只能口服，生物有效性低，治疗效果不明显等缺点。
文档编号C08B37/00GK1844134SQ20051001669
公开日2006年10月11日 申请日期2005年4月7日 优先权日2005年4月7日
发明者李丹, 李荣和, 朴官和 申请人:李丹, 李荣和, 朴官和