专利名称：一种蛋白质印迹两亲性聚合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于分子印迹技术，特别是涉及一种蛋白质印迹高分子化合物在分子印迹技术的基础上的一种生物大分子印迹技术。该技术所制备的材料具有专一性识别特定蛋白质的功能。原理是在聚合物内部构建出许多与蛋白质在形状和静电上互补的空洞。
背景技术：
有选择性地识别蛋白质的原理是建立这样的假设之上的高分子的纳米洞在尺寸、形状、氢键及静电特征上与蛋白质互补。这种情况下，它相似于分子印迹技术(MIT)(参见Wulff，G.Molecular imprinting incross-linked materials with the aid of molecular template a way towardsartificial antibodies.Angew.Chem.Int.Ed.，1995，341821-1832)。MIT广泛地应用在从高分子催化剂到传感器设计、人工受体/抗体及手性分离的HPLC固定相。
聚合物表面印迹蛋白质已经用于蛋白质的识别(参见Shi，H.&Ratner，B.D.Template recognition of protein-imprinted polymer surfaces.J.Biomed.Mater.Res.，2000，491-11)，但表面印迹蛋白质因表面所限还难以在蛋白质的识别和分离中得到广泛的应用。聚合物的本体印迹仍然是制备蛋白质识别材料的主要研究方向。然而，蛋白质印迹聚合物所得到的空洞对蛋白质的识别能力仍然有限。其原因之一是分子识别除了在形状上的互补外，还应在静电作用上尽可能的互补。蛋白质表面同时带有亲电和亲核两亲性基团，只有在聚合物中也同时存在两亲性基团时才可能呈现蛋白质与聚合物之间的静电互补。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质印迹两亲性聚合物及其制备方法，它将含有叔胺的单体N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，以及含有羧酸基团的单体甲基丙烯酸引入聚合物结构单元中，产生出一种两亲性共聚物链网络，2种模板蛋白质鸡蛋清溶菌酶(LSZ)或血清白蛋白(BSA)；两亲共聚物被任一种蛋白质印迹，得到了能识别这种蛋白质的功能材料；两亲共聚物与蛋白质表面的极性基团通过多重静电相互作用和氢键相结合，它可用于制造色谱固定相。
本发明的技术方案一种蛋白质印迹两亲性聚合物，其特征在于聚合物是N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸共聚物；聚合物是交联型聚合物；聚合物结构中具有模板蛋白质所印迹的空洞。
上述所说的印迹两亲性聚合物的模板蛋白质可以取鸡蛋白溶菌酶或牛血清白蛋白。
一种蛋白质印迹两亲性聚合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成(1)非印迹两性聚合物的制备在30～60mL磷酸钾缓冲液所形成的悬浮液中，加入3.41～6.82g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，1.72～3.44g的甲基丙烯酸，以及0.51～1g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.25～0.5g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用250mL 0.1M的盐酸洗涤3～5次；真空干燥；(2)蛋白质印迹两亲性聚合物的制备；(3)高性能液相色谱模板蛋白质印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物(1、2和3)中吸附和萃取蛋白质；在室温下洗提，并用分光光度计在220nm处进行跟踪。
本发明的工作原理在于LSZ或BSA作为模板蛋白质在聚合前用来对单体进行定向。N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(MAPMAm)和甲基丙烯酸(MAA)是可离子化的单体，常常扮演酸、碱、亲核或亲电结构单元的角色。由于静电相互作用，MAPMAm倾向于朝着蛋白质的天冬氨酸和谷氨酸靠拢，而MAA倾向于挨近赖氨酸、精氨酸、丝氨酸和组氨酸。
如图1所示，以水溶性引发剂V-50引发自由基聚合反应。在模板蛋白质的存在下，用单体和交联剂的共聚来包埋模板蛋白质。利用酶消化方法，使被包裹的模板蛋白质分解。分解的模板从聚合物母体中移除，从而在聚合物中留下了模板形状的空洞。这些空洞在形状上可与模板蛋白质互补。由于使用了两性聚合物，从而在一定程度上使空洞中的基团在极性上也与模板蛋白质的表面极性基团互补，即是聚合物空洞中的叔胺基团倾向于与蛋白质酸性侧链接近，而聚合物空洞中的羧基倾向于与碱性侧链接近。这可进一步提高印迹聚合物对蛋白质特异的识别性能。
被碾碎、过筛和萃取的共聚物用于高效液相色谱的固定相。以装载在分析柱上的非印迹和LSZ印迹的MAPMAm-MAA共聚物分别来分辨LSZ。LSZ在8.3min时从非印迹聚合物中被洗提出来，而对LSZ印迹的聚合物，在相同的保留时间下并没有峰出现，这说明LSZ倾向于结合那些在LSZ存在下制成的共聚物。用非印迹聚合物或BSA印迹的聚合物来分辨LSZ。LSZ在7.9min时能从两种聚合物中被洗提出来。BSA(Mr66kDa)在尺寸上大于LSZ(Mr 14.6kDa)。这说明虽然LSZ能被装载入BSA印迹洞，但它不能与洞结合。
本发明的优越性在于蛋白质侧链是通过静电相互作用和氢键与聚合物相应位置上的氨基、羧基和酰氨基进行相互作用的。蛋白质表面上的电荷和极性分布极其复杂。两亲聚合物中碱性的MAPMAm和酸性的MAA是随机排列的。洞中的静电分布可根据蛋白质的表面进行调节，以便使模板蛋白的那些对识别必不可少的静电信息能够被转移到印迹洞中。
图1为本发明所涉一种蛋白质印迹两亲聚合物及其制备方法中N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺与甲基丙烯酸共聚物包埋印迹蛋白质的示意图。
具体实施例方式实施例1一种蛋白质印迹两亲性聚合物，其特征在于聚合物是N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸共聚物；聚合物是交联型聚合物；聚合物结构中具有模板蛋白质所印迹的空洞。
上述所说的蛋白质印迹两亲性聚合物的模板蛋白质是鸡蛋白溶菌酶。
上述所说的蛋白质印迹两亲性聚合物不溶于任何溶剂。
一种蛋白质印迹两亲聚合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成(1)非印迹两性聚合物的制备
在30mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5，0.01M)所形成的悬浮液中，加入3.41g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，1.72g的甲基丙烯酸，以及0.51g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.25g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用250mL 0.1M的盐酸洗涤5次；真空干燥；(2)两性聚合物的鸡蛋白溶菌酶印迹在0.15g的鸡蛋白溶菌酶的20～30mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5)所形成的悬浮液中，加入3.41g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，1.72g的甲基丙烯酸，以及0.51g的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.25g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用100mL 0.1M的盐酸洗涤5次；将颗粒用2.0mg的链霉蛋白酶(XXI型)的5mL磷酸钾缓冲液(pH 8.0)处理48h；产物真空干燥；(3)高性能液相色谱蛋白质印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物(1、2和3)中吸附和萃取蛋白质；在室温下洗提，并用分光光度计在220nm处进行跟踪。
实施例2一种蛋白质印迹两亲性聚合物，其特征在于聚合物是N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸共聚物；聚合物是交联型聚合物；聚合物结构中具有模板蛋白质所印迹的空洞。
上述所说的蛋白质印迹两亲性聚合物的模板蛋白质是牛血清白蛋白。
上述所说的蛋白质印迹两亲性聚合物不溶于任何溶剂。
一种蛋白质印迹两亲聚合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成(1)非印迹两性聚合物的制备在60mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5，0.01M)所形成的悬浮液中，加入6.82g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，3.44g的甲基丙烯酸，以及1g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.5g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用250mL 0.1M的盐酸洗涤3次；真空干燥；(2)两性聚合物的牛血清白蛋白印迹在0.3g的牛血清白蛋白的20～30mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5)所形成的悬浮液中，加入6.82g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺3.44g的甲基丙烯酸，以及1g的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.5g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用100mL 0.1M的盐酸洗涤3次；将颗粒用2.0mg的链霉蛋白酶(XXI型)的5mL磷酸钾缓冲液(pH 8.0)处理72h；产物真空干燥；(3)高性能液相色谱蛋白质印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物(1、2和3)中吸附和萃取蛋白质；在室温下洗提，并用分光光度计在220nm处进行跟踪。
权利要求
1.一种蛋白质印迹两亲性聚合物，其特征在于聚合物是N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸共聚物；聚合物是交联型聚合物；聚合物结构中具有模板蛋白质所印迹的空洞。
2.根据权利要求1所述的蛋白质印迹两亲性聚合物，其特征在于印迹两亲性聚合物的模板蛋白质可以取鸡蛋白溶菌酶或牛血清白蛋白。
3.一种蛋白质印迹两亲性聚合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成(1)非印迹两亲性聚合物的制备在30～60mL磷酸钾缓冲液所形成的悬浮液中，加入3.41～6.82g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，1.72～3.44g的甲基丙烯酸，以及0.51～1g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.25～0.5g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用250mL 0.1M的盐酸洗涤3～5次；真空干燥；(2)蛋白质印迹两亲性聚合物的制备。
4.根据权利要求2和3所述的一种蛋白质印迹两亲性聚合物的制备方法，其特征在于鸡蛋白溶菌酶印迹两亲性聚合物的制备方法为在0.15～0.3g的鸡蛋白溶菌酶的20～30mL磷酸钾缓冲液所形成的悬浮液中，加入3.41～6.82g的N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺，1.72～3.44g的甲基丙烯酸，以及0.51～1g的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺；加热到60℃后，加入0.25～0.5g的V-50；用以氮气向悬浮液内鼓泡，直到形成交联的凝胶；将固体碾碎并挤压过60目的筛网；所得到的聚合物用100mL 0.1M的盐酸洗涤3～5次；将颗粒用2.0mg的链霉蛋白酶(XXI型)的5mL磷酸钾缓冲液处理48～72h；产物真空干燥。
5.根据权利要求2和3所述的一种蛋白质印迹两亲性聚合物的制备方法，其特征在于牛血清白蛋白印迹两亲性聚合物的制备方法为在反应体系中加入0.15～0.3g作为一种模板蛋白质的牛血清白蛋白；该共聚物依照2聚合的过程进行合成；将得到的聚合物进行真空干燥。
全文摘要
一种蛋白质印迹两亲性聚合物及其制备方法，其特征在于聚合物是N－[3－(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸共聚物；聚合物是交联型聚合物；聚合物结构中含有模板蛋白质所印迹的空洞。其方法分别以鸡蛋清溶菌酶和牛血清白蛋白印迹两亲性聚合物N－[3－(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺－甲基丙烯酸共聚物，使聚合物内部形成了分别与上述2种蛋白质在形状上互补空洞结构。两亲性聚合物结构中的叔胺和羧基可与蛋白质表面的不同氨基酸在静电上互补，这可进一步提高印迹聚合物对蛋白质的识别能力。液相色谱测试表明，印迹聚合物对其模板蛋白质具有专一的识别能力。
文档编号C08F2/44GK1911975SQ20051001644
公开日2007年2月14日 申请日期2005年11月25日 优先权日2005年11月25日
发明者黄积涛, 郑嗣华, 张嘉琪, 谢秀荣, 黄卫洪 申请人:天津理工大学