多层丝蛋白薄膜的制作方法

专利名称：多层丝蛋白薄膜的制作方法
多层丝蛋白薄膜
本发明涉及一种形成多层丝蛋白薄膜的方法和由所述方法获得的多 层薄膜。本发明还涉及包含所述多层薄膜的各种物质、产品和组合物，以 及所述多层薄膜在多种应用中的用途。
多层薄膜有效用于许多目的"气应用可以据说是落入两大类表面 与其环境的适合的相互作用和具有确定的结构特征的构造"装置"。开发 区域的范围包括涂料、胶体稳定、发光或光电装置、电极修饰、光学存储 和磁性薄膜、高电荷密度电池、生物材料、生物相容性的改变、酶固定、 水处理和造纸的絮凝、功能性膜、分离、载体、可控释放装置、传感器和 纳米反应器。制备多层薄膜和胶囊的优选方法的主要性质在于以纳米规格 的可控垂直构造。多肽多层薄膜定义为由多肽形成的多层薄膜。在一些情 形中，另一种类型的聚合物被包括在构造过程中，例如化学修饰的多肽13， 非生物学有机聚电解质14，或多糖"。多肽薄膜可以沉积并在另外是生物 惰性的表面上赋予特异性生物功能性或者将生物活性表面转变成对细胞 不具黏附性的表面2Q。
多肽的多层薄膜有希望用于开发包括下述理想特征中的一些的应用 防污、生物相容性、可生物降解性、特异性生物分子敏感性、可食性、环 境温和性、热反应性、和粘性或非粘性。丝蛋白理想地以它们的生物化学 性质适用于这样的应用，可以对各种聚合物合成方法中的化学结构、控制 二级结构形成的能力、或基因组数据的可用性进行控制。
专利申请US 2005/0069950 Al描述了通过静电逐层自我组装(ELBL)
在适当的表面上构造超薄多层多肽薄膜。此外，它描述了设计用于纳米构 造用于生物医学和其它领域的薄膜的多肽的方法。提供了鉴定用于ELBL 的氨基酸序列信息中确定长度的序列基序和在中性pH处的静电荷并且记 录需要的基序数目的新型方法。US 2005/0069950要求小的、多荷电的肽 在ELBL组装中的应用。
蜘蛛丝是表现出非凡物理特性的蛋白聚合物。在不同类型的蜘蛛丝中，拖丝是最集中进行研究的。拖丝的丝被圆网蜘蛛(orb weaving spiders) 用于构建它们的网的框架和半径并作为总是拖在后面的生命线。为了这些 目的，需要高的拉伸强度和弹性。这些特性的组合导致比大多数其它已知 材料更高的韧性。拖丝的丝通常由两种主要的蛋白组成，其主要结构具有 共同的重复结构。
圆网的捕获螺旋，部分由鞭状腺形成的胶粘性丝组成，所述丝因此命 名为鞭状丝，是有弹性的，并且在断裂之前可以在长度上拉伸3倍，但是
仅提供拖丝的丝的拉伸强度的一半的拉伸强度。
早先己经开发了在大肠杆菌(E.coli)中重组生产蜘蛛丝蛋白的系统。 作为一个实例，参考WO 2006/008163 A2,WO 2006/002827 Al,和美国临 时申请号60/712,095 (未公布的)。在其中所述的表达系统中，单结构单元 (block)(=组件(modules))可以自由变化，并且因此可以适合具体情形 的需要。这种类型的组件还在参考文献21中公开。
然而，迄今为止，尚不存在由这些可获得的丝蛋白形成多层薄膜的通 用方法。在现有技术中已知的方法不能以通用方式用于生产由丝蛋白形成 的各种多层薄膜。如上文提及， 一些公布依赖于带电的表面从而稳定所述 多层薄膜，但是没有提供通用的方法。
因此，本发明的目的是提供生产多层丝蛋白薄膜的方法，和提供由所 述方法获得的薄膜。本发明的另一个目的是提供对于那些多层薄膜的各种 应用。
这些目的通过独立权利要求的主题而实现。优选实施方案在从属权利 要求中列出。
本发明人首次建立了由不同来源的丝蛋白形成的多层薄膜的方法。他 们表明可以加工丝蛋白的多层，以形成稳定的和有用的多层薄膜。这一发 现是出乎意料的，由于从现有技术不能预测到，在不产生特定条件例如相 反电荷层的情形下，可以由丝蛋白形成稳定的多层薄膜。
按照第一方面，本发明提供形成多层丝蛋白薄膜的方法，所述方法包 括下述步骤
a) 提供溶解在或悬浮在适当溶剂中的一种或多种丝蛋白溶液；
b) 将一种所述溶液形成薄膜；C)蒸发所述溶剂，由此形成第一丝蛋白薄膜层；禾口 d)重复步骤a)-c)—次或多次，以在所述第一丝蛋白薄膜层上形成另 外的丝蛋白薄膜层，从而形成多层丝蛋白薄膜。
在某些时间内已经知道铸塑由丝蛋白特别是由蜘蛛丝蛋白形成的薄
膜。关于蜘蛛丝蛋白的薄膜铸塑参见参考文献22。然而，其中没有描述多 层薄膜的形成。
令人惊讶地，除了多层薄膜可以通过本发明的方法形成的事实之外， 提供可以形成处理(tailor)的多层薄膜的优点。作为实例，薄膜的厚度可以 通过所用的蛋白质溶液的浓度而得到控制。此外，不同的丝蛋白可以以相 同层或不同层组合，以实现需要的特征。另外，本方法允许将所述丝蛋白 层与其它的例如人工聚合物组合，从而实现不同的目的(如它们将在下文 详细列出)。
另外，可以令人惊讶地表明，单层丝蛋白薄膜形成稳定的多层薄膜， 而不需要所述单薄膜层表面的任何修饰(与上文引用的参考文献相反)。 这可以由丝蛋白的两亲性特征解释，其不导致对不同层的排斥，并且因此 允许形成稳定的多层薄膜。
在一个实施方案中，多层薄膜的每个单层由包含一种或多种类型的丝 蛋白的丝蛋白溶液形成。哪种类型的丝可以用于实施本发明将在后面进行 解释。例如，所述多层薄膜由包括相同的(同质多层薄膜)或不同的(异 质多层薄膜)丝蛋白的层形成。
如上文提及，在优选实施方案中，所述多层薄膜包括由丝蛋白形成的 一层或多层，以及包括其它蛋白质或非蛋白质物质的一层或多层。
在一个实施方案中，所述多层薄膜的一个单层的厚度在0.5-1.5 pm的 范围内。然而，还可以设计更薄或更厚的薄膜(达到3.0 pm)。此外，本 发明的多层薄膜优选包括2-1000层、优选2-100层和最优选2-20层。
所述非蛋白质物质优选选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚(苯乙烯磺酸盐 (酯))(PSS)、聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)、聚(丙烯酸)(PAA)、和/或聚 (二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)。所述非蛋白质物质可以单独或 与其它非蛋白质物质和/或丝蛋白和/或其它蛋白质物质组合使用。
那些其它蛋白质物质可以优选地选自胶原、弹性蛋白或角蛋白。那些
7蛋白质物质的实例是贝类足丝蛋白，例如从贻贝物种,优选
从贻贝(M ，紫贻贝(M ga〃oprav/"c/a/&) , M c"/z/or"/am,或
Gewfer/a dew/wa获得的那些。
MASCOLO和WAITE(1986)首先鉴定了贻贝中的足丝线的化学梯度。 在用胃蛋白酶处理所述丝线后，鉴定了两种胃蛋白酶抗性的胶原片段，叫 作ColP禾QColD，分别具有50kDa和60kDa的分子量。ColP可以主要在 最接近的区域中找到，而几乎不能在远端区域内找到。相反，ColD的量 在远端部分增加到约100% (LUCAS等，2002; QIN和WAITE, 1995)。在足 丝线以及在贝类足中，还存在胶原样的蛋白质，其参与所述线结构的构建。 这种额外的蛋白质叫作ColNG(NG二没有梯度)，并且与ColD和ColP相 反，其均匀地分布在整个丝线中。它的生理学功能大概是在两种其它丝线 胶原之间的接合体(QIN和WAITE, 1998)。
角蛋白属于坚韧且不溶的纤维状结构蛋白家族，形成在爬形动物、鸟 类和哺乳动物中发现的坚硬的但非矿物化的结构。角蛋白还在许多动物包 括蛔虫的胃肠道中发现。存在许多类型的角蛋白。由昆虫和蜘蛛产生的丝 丝心蛋白通常分类为角蛋白。
胶原是动物中结缔组织的主要蛋白，并且是哺乳动物中最丰富的蛋 白，占总量的约40%。它是坚韧的和不能伸展的，具有极大的拉伸强度， 并且是软骨、韧带和腱的主要成分，并且是骨骼和牙齿的主要蛋白成分。 胶原在整个身体的许多位置存在，并且以已知类型的不同形式存在，其中 所述类型特别包括I型到XIII型胶原(总共存在27种类型的胶原)。
弹性蛋白，是结缔组织中的一种蛋白，其是弹性的，并且允许机体中 的许多组织在伸展或收縮后恢复它们的形状。当皮肤被戳或刺时，弹性蛋 白帮助皮肤回到它的初始位置。它主要由氨基酸甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸 和脯氨酸组成。弹性蛋白通过连接许多可溶的原弹性蛋白分子形成大块的 不溶的、持久交联的阵列而形成。
然而，本发明不限于这些蛋白质的物质，并且可以使用许多其它的物质。
作为溶剂，优选使用极性溶剂。所述极性溶剂优选地选自水、甲酸、 六氟异丙醇和/或乙酸。水是最优选的，原因在于它的良好的可用性和无毒
8性。在这种溶剂中，丝蛋白被溶解或悬浮。此外，溶剂必须从可以容易地 被蒸发掉的那些物质中选择，以使得溶解的蛋白留下，由此形成单一薄膜层。
在本发明的意义中，"溶液"意指包含丝蛋白并且易于进行薄膜铸塑 的任何液体混合物。除了蛋白质单体之外，那些溶液还可以包含高度有序 的聚集体，其包括，例如，二聚体、三聚体、和四聚体。溶液可以包含增 强所述溶液的防腐性、稳定性或可使用性的添加剂。
本文的混悬液定义为固体颗粒在液体中的分散体。如果所述颗粒直径
为 100nm，那么所述混悬液是胶质。
在优选实施方案中，丝蛋白选自昆虫丝蛋白或蜘蛛丝蛋白，优选天然 或重组的丝蛋白，优选来自昆虫纲(Insecta)、蛛形纲(Arachnida)的丝 或它们的类似物。
特别优选的是来自圆网蜘蛛(园蛛科(Araneidae)和Araneoids)的拖丝 和/或拖丝或鞭形蛋白的鞭形序列。
蜘蛛丝通常是表现出非凡物理特性的蛋白聚合物，但是对于由不同蜘 蛛生产的各种丝的组成仅存在有限的信息(参见Scheibd， 2004)。在不同 类型的敏U虫朱丝中，来自金黄色圆网敏H虫朱(golden orb weaver) Nephila clavipes 禾口花园十字蜘虫朱(garden cross spider)十字园蛛(Araneus diadematus)的,包丝 是最集中进行研究的。拖丝的丝通常由两种主要蛋白组成，并且还不清楚 是否有其它的蛋白在丝组装和最终的丝结构中起显著作用。来自十字园蛛 的拖丝的两种主要蛋白成分是ADF-3和ADF-4 (十字园蛛丝心蛋白 (△raneus 2iadematus ￡ibroin))。
应该注意到，当用于本文时，术语"蜘蛛丝蛋白"不仅包括所有的天 然序列，还包括从其所衍生的所有的人工或合成的序列。
因此，蜘蛛丝序列可以衍生自本文叫作"真实的"序列。这一术语意 指潜在的核酸序列是从它们的天然环境中分离而不对其序列本身进行实 质的修改。接受发生的唯一的修饰是对真实的核酸序列进行修饰以使所述 序列适合在宿主中表达而并没有改变所编码的氨基酸序列的情形。
所述真实的序列优选地衍生自天然存在的蜘蛛丝蛋白的氨基端不重 复区(鞭形蛋白)和/或羧基端不重复区(鞭形和拖丝蛋白)。那些蛋白的优选实例将在下文显示。
按照另一个实施方案，所述真实的序列衍生自天然存在的蜘蛛丝蛋白
的氨基端不重复区(鞭形蛋白)和/或羧基端不重复区(鞭形和拖丝蛋白)。
按照一个优选实施方案，拖丝蛋白是野生型ADF-3, ADF-4, MaSp I, MaSp II，并且鞭形蛋白是FLAG。术语ADF-3/-4用在由十字园蛛生产的 MaSp蛋白(十字园蛛丝心蛋白-3/-4)的情形中。两种蛋白，ADF-3和~4 属于MaSp II蛋白(主要壶腹状spidroin II)种类。清楚地参考 WO2006/002827,其内容通过引用结合于此。
己经开发了单体序列组件，其也形成本发明的起点。这些组件衍生自 蜘蛛十字园蛛的基因ADF3禾B ADF4，以及蜘蛛Nephila clavipes的基因 FLAG。所用的ADF3禾PI ADF4序列的变化是公众可获得的(在登记号 U47855和U47856下可用)。前两种基因(ADF3和ADF4)编码形成蜘蛛 拖丝线的蛋白，第三种编码鞭形丝的蛋白。基于这些蛋白的氨基酸序列， 设计了一些组件
组件A:GPYGPGASAA AAAAGGYGPG SGQQ(SEQ ID NO:1)
组件C:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NCJGPSGPGGY GPGGP(SEQ ID NO:3)
组件Q:GPGQQGPGQQ GPGQQGPGQQ(SEQ ID NO:2)
组件K:GPGGAGGPYG PGGAGGPYGP GGAGGPY(SEQ ID NO:4)
组件sp:GG丁TUEDLD IT!DGADGP1 TISEEL丁I(SEQ ID NO:5)
组件X:GGAGGAGGAG GSGGAGGS(SEQ ID NO:6)
组件Y:GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGSGPGGY(SEQ ID NO:7)
组件A「GPYGPGASAA AAAAGGYGPG CGQQ(SEQ1DNO:8)
组件AK:GPYGPGASAA AAAAGGYGPG KGQQ(SEQ!DNO:9)
组件Cr:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQ>GPCGPGGY GPGGP(SEQ ID NO:)0)
组件GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPKGPGGY GPGGP(SEQ ID NO:11)
组件cK2:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPK NQGPSGPGGY GPGGP(SEQ ID NO:2)
组件CK「GSSAAAAAAA ASGPGGYGPK NC GPCGPGGY GPGGP(SEQ ID NO:13)
组件sp"GGTT11EDLD ITIDGADGP1 T〗CEELT1(SEQIDNO:14)
组件spK:GGTTIIEDLD 1TIDGADGP1 T1KEELT1(SEQ !DNO:15)
组件Xr.GGAGGAGGAG GCGGAGGS(SEQ1DNO:16)
组件x、GGAGGAGGAG GKGGAGGS(SEQ ID NO:17)
组件Y「GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGCGPGGY(SEQ ID NO:18)
组件YK:GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGKGPGGY(SEQ ID NO:19)从这些氨基酸组件，组装合成的蜘蛛丝蛋白构建体。其中，这些组件 和衍生自其的蜘蛛丝蛋白形成本发明形成多层薄膜方法中的原材料。
本发明还涉及特异性肽TAGs的应用。这些标记(例如，在SEQ ID NO: 20-27中公开的标记，下文)含有半胱氨酸或赖氨酸。TAG的序列是这样 选择的，以致可以最大可能程度地排除与其它丝蛋白的相互作用和对组装 行为的影响。
开发了下述标记，优选用于蜘蛛丝构建体
由这些组件形成的合成丝蛋白的优选实例可以在书籍实例中找到，并 且优选地是(AQ)24NR3和C16。
可以从中获得丝蛋白的产丝昆虫的实例特别是家蚕蛾(^m x mon')、爿W/2eraea my/z'to (生产褐色丝的黄刺蛾)。后者生产柞蚕丝。柞蚕 丝是由褐色的野生丝茧形成的褐色丝纱线或织物。这些虫子以各种植物和 树如橡树、樱桃树和野生桑树的叶子为生。这样的昆虫的其它实例是角石 蛾科(caddies files)(例如，//ydrap^c/ze s/owowae)，蛾(例如，蜡螟(Galleria mellonella)(蜡蛾(wax moth)),地中海粉斑螟(五p/zeWn'a ^e/zwW/a)(粉 蛾(flour moth)),印度谷斑螟(P/o&a /Wer; w"cfe〃a)(印度谷斑螟)，或 金星柊叶槭大蚕蛾(7fya/op/wra cecro/ /a)(丝蛾(silk moth)))。
多层薄膜的层优选地包括结合在其中或位于两个相邻的层之间的一 种或多种试剂。那些试剂优选选自盐、染料、金属、化学品和/或药剂。在 这一点上，参考图9， 11和12，其显示这样的结合的原理。要被结合的物 质可以是固体、半固体或液体，但没有限制。
例如，所述药剂可以选自由下列各项组成的组中止痛剂；催眠药和
(SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23) (SEQIDNO: 24) (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 27)镇静药；用于治疗精神病紊乱如抑郁和精神分裂症的药物；抗癫痫药和抗 惊厥药；用于治疗帕金森病和亨廷顿病、衰老和阿尔茨海默病的药物；目 的是治疗CNS外伤或中风的药物；用于治疗上瘾和药物滥用的药物；用 于寄生虫感染和由微生物引起的疾病的化学治疗剂；免疫抑制剂和抗癌 药；激素和激素拮抗剂；用于非金属毒性试剂的拮抗剂；用于治疗癌症的 细胞生长抑制剂；用于医药的诊断物质；免疫活性和免疫反应性试剂；抗 生素；止痉挛药；抗组胺药；止呕药；松弛剂；兴奋剂；大脑扩张药；促 精神药；血管扩张药和收縮药；抗高血压药；用于治疗偏头痛的药物；催 眠药、升血糖药和降血糖药；平喘药；抗病毒药；以及它们的混合物。
此外，按照本发明的多层薄膜可以这样设计，其作用为局部或全身的 药物递送系统。局部系统可以包括多层系统，其中结合粘性液体，并且所 述系统应用到皮肤上达预先确定的时间。在那段时间里，液体通过一层或 多层所述多层薄膜渗透，由此将确定量的所述液体提供到皮肤表面。在这 种情形中，多层薄膜可以叫作TTS (透皮治疗系统)。药物物质如激素或 烟碱可以通过这种方式施用。
作为备选方案，固体物质可以结合在一层或多层所述多层薄膜内部和 /或一层或多层所述多层薄膜之间。在口服施用后，颗粒将通过所述层迁移 或将通过体液的流入(渗透(omotic)系统)而被挤出，或通过缓慢溶解一 层或多层外层并且随后(持续)释放各自的物质。
在其它应用中，例如服装，所述多层薄膜可以特别适合必需的应用领 域，例如，可以具有一层或多层密封的或防水层。另外，作为实例，可以 将银结合在层中以提供杀菌作用。
按照另一个优选实施方案，所述丝蛋白在上述定义的步骤lb)之前或 之后被共价官能化。在这种联系中，还参考后附的实施例，参见图7和8。
所述层还可以进一步加工，以获得其它特征。例如，由于对于大部分 蛋白薄膜(其主要是水溶性的)的应用，水不溶性是先决条件，所以可以 加工所述薄膜，以变成水不溶性的。对于这种目的的适当的方法是用磷酸 钾或甲醇处理。
用于铸塑多层薄膜的各层的丝蛋白溶液包含0.1-20%，优选0.5-10%, 更优选1-3% w/v的丝蛋白。注意到溶液的浓度是决定性的是很重要的，
12原因在于它将确定薄膜的实际厚度。还通过这种方式，可以生产具有预先 确定的厚度的层的处理的多层薄膜，以适应具体考虑的应用。
本发明的多层薄膜的层可以通过任何可用的方法形成，优选通过将所 述溶液塑模、旋涂或铸塑到适当的支持物上而形成。支持物的类型通常没 有限制，然而，聚苯乙烯、玻璃或硅烷的支持物(或对所用的溶剂是抗性 的任何其它表面)可以称为适当的支持物。
在第二方面，本发明涉及可通过上述定义的方法获得的多层薄膜。本 发明的多层丝蛋白薄膜包括至少两层丝蛋白薄膜。
按照第三方面，本发明提供化妆品组合物；药物或医药组合物，优选 药物递送系统，人造细胞，隐形眼镜涂层，持续释放的药物递送系统，人 造皮肤移植物；食品组合物；汽车零件；航空组件；计算机或数据存储装 置；建筑材料；纺织品或膜，其包括上述多层薄膜。
此外，本发明提供所述多层薄膜在医学中的应用。
本发明将通过下述非限制性实施例和附图进行举例说明。
附图显示如下
图l合成的丝蛋白(AQ)24NR3和d6的CD-光谱，所述丝蛋白溶解在 6 M硫氰酸胍中，然后针对5 mM磷酸钾pH 8.0透析(实线)，或溶解在HFIP 中(虚线)。
图2由(AQ)24NR3和(:16形成的蛋白薄膜的CD-光谱。薄膜由在HFIP 中的蛋白溶液直接铸塑到平面石英玻璃上，并且通过CD-光谱法分析(虚 线)。所述薄膜随后用1M磷酸钾加工并且再分析。由于在确定薄膜厚度 中的不准确性，不能确定eMKw。
图3由HFIP溶液铸塑并且用磷酸钾加工的C,6薄膜的修饰。(A)当 C,6的羧基基团被用EDC活化(+)时，只发生荧光素(黄色)的有效偶联。 相反，没有EDC活化(-)时，只有很少的荧光素结合到薄膜上。(B)使用 X-Gal作为底物监测偶联的P-半乳糖苷酶的活性。蓝色沉淀物的出现表示 酶活性只在用EDC (+)活化的薄膜上，而未活化的薄膜只表现出残留的酶
活性(-)。
图4多层丝薄膜的铸塑。
图5具有不同官能性的多层丝薄膜的铸塑。图6具有不同官能性的多层丝薄膜的铸塑。
图7试剂与丝蛋白的化学偶联，如所显示，例如使用EDC (N-乙基 -N，—(3_二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)诱导氨基-反应试剂的偶联。
图8丝表面的特异性官能化。在多层薄膜中，通过使用由不同蛋白铸 塑的多层丝薄膜可以获得极性。
图9在多层丝薄膜中结合试剂。


图10在多层丝薄膜中结合试剂。在铸塑之前将不同颜色的化学品加 入到丝蛋白溶液中，作为原理的证据。
图11在夹心式多层丝薄膜中结合固体试剂。 图12在夹心式多层丝薄膜中结合流体试剂。
实施例
蜘蛛丝蛋白的薄膜铸塑
为了铸塑薄膜，本发明人先前使用两种合成丝蛋白，(AQ)24NR3和C16， 其衍生自花园蜘蛛十字园蛛的拖丝的丝蛋白ADF-3和ADF-4。基于先前 的观察，即，ADF-3和ADF-4以及其衍生物表现出显著不同的溶解性和 组装行为，选择这些蛋白。测量(AQ)24NR3和C,6溶液的圆二色性(CD)揭 示水性缓冲液和HFIP对二级结构的不同影响。在水性溶液中，两种蛋白 都表现出在低于200 nm波长处具有单一最小值的CD-光谱，其是主要是
随机巻曲蛋白的指示(图1)。
相反，两种蛋白在HFIP中的光谱表现出在201-202 nm处的一个最小 值和在220 nm处的一个额外的最小值((AQ)24NR3)或肩峰(C,6)，其是增加 的a-螺旋含量的指示(图1)。氟化醇对蛋白和肽的这种作用早先已有报 道，并且对于丝的丝心蛋白和衍生自蜘蛛A^ /n7ac/av^"的拖丝的丝蛋白 MaSpl的合成丝蛋白也观察到这种作用。
薄膜是将200 ^含有2% w/v蛋白的HFIP溶液铸塑到聚苯乙烯表面 (或石英玻璃上用于CD-测量)上而成。在溶剂蒸发后，(AQ)24NR3和C16 都形成可以容易地从所述表面上剥离的透明薄膜。假设溶剂完全蒸发，并 且蛋白薄膜的密度与关于蜘蛛拖丝的丝的报道值1.3 g/cm3—致，那么计算 所述薄膜的厚度在0.5-1.5 pm范围内。当与水接触时，由任一种蛋白形成的铸出的(As-cast)(新鲜制备的)薄膜溶解。由于水不溶性是大部分蛋 白薄膜应用的先决条件，我们寻找使得薄膜不溶的加工方法。已知磷酸钾 诱导所用的丝蛋白聚集并形成化学稳定的结构。甲醇也己经用来获得不溶 的丝形态。因此，用1M磷酸钾或甲醇加工(温育)铸出的薄膜导致水溶 性薄膜转变成水不溶性薄膜。
为了研究薄膜的结构特征，通过CD-光谱法研究潜在的蛋白的二级结 构。铸出的薄膜表现出在208 nm和220 nm处具有两个明显的最小值的光 谱，其指示ot-螺旋含量高于可溶蛋白的(x-螺旋含量。在用1 M磷酸钾加 工后，薄膜表现出在218 nm具有单一最小值的光谱，其是富含(3-折叠的 蛋白质结构典型的光谱(图2)。在将薄膜用甲醇加工后，获得相似的结果 (数据未显示)。因此，从水溶性到水不溶性的转化与蛋白二级结构从(x-螺旋到P-折叠的转换并行。
为了检测它们的化学稳定性，将薄膜在8 M尿素、6 M盐酸胍和6 M 硫氰酸胍中浸没24小时。用磷酸钾或甲醇加工的铸出的两种蛋白的薄膜 以及(AQ)24NR3薄膜在所有这些变性剂中是可溶的。相反，用磷酸钾或甲
醇加工的d6薄膜只溶解在硫氰酸胍中。d6薄膜的这种显著的化学稳定性
与天然拖丝的丝的化学稳定性以及与重组产生并组装的ADF-4的化学稳 定性相同。先前的研究可以使组装特性和组装的结构的稳定性与丝蛋白的 氨基酸序列直接相关。因此，蜘蛛丝薄膜的特性可以直接通过操作相对应 的丝基因而改变丝蛋白的一级结构而进行修饰(图2)。
蛋白薄膜的许多应用需要在所述薄膜表面上存在特异的官能性。为了 证明，所用的蜘蛛丝薄膜可以用小的有机分子以及生物大分子诸如蛋白质 进行修饰，将发色团荧光素和酶P-半乳糖苷酶化学偶联到用磷酸钾加工的 C，6薄膜上，作为原理的证明。偶联通过用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺(EDC)活化C,6表面暴露的羧基基团而实现。将所述薄膜用乙二 胺进一步温育，导致形成酰胺。乙二胺的剩余的游离氨基基团随后与异硫 氰酸荧光素偶联，通过形成稳定的硫脲衍生物而导致荧光素的有效共价连 接(图3)。类似地，将P-半乳糖苷酶与EDC-活化的C,6薄膜温育导致在
C16的羧基基团和p-半乳糖苷酶的在酶表面上可及的伯胺(例如，来自赖
氨酸残基)之间形成酰胺键。在重复清洗这样修饰的薄膜后，P-半乳糖苷
15酶的活性可以用5-溴-4-氯-3』引哚-(3-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)作为底物进行
检测(图3)。
本发明人可以证明，蛋白薄膜可以由合成的蜘蛛丝蛋白获得。所述薄 膜，其开始是水溶性的，可以用磷酸钾或曱醇加工导致水不溶性，这是许 多应用的主要要求。由两种不同合成蜘蛛丝蛋白形成的薄膜的化学稳定性 的比较表明所述薄膜的特性是基于所述蛋白的一级结构。利用我们先前建 立的关于蜘蛛丝基因的克隆策略，可以产生形成表现出特异特性的薄膜的 丝蛋白。由于不同的功能性分子可以共价附着到所述薄膜表面上，因此可 以实现许多技术或医学应用。
蛋白(AQ)24NR3和Cm可以从HFIP或甲酸溶液起始铸塑成一些薄膜。 然而，可以使用以我们的组件(序列1-27)构建的任何其它的丝蛋白以及 天然昆虫和蜘蛛丝蛋白。将蛋白溶液铸塑到聚苯乙烯、玻璃或硅烷上(或 对所用的溶剂是抗性的任何其它表面上)，并且之后完全蒸发掉溶剂。由 六氟异丙醇溶液铸塑的薄膜是水溶性的。为了获得水不溶性，这些薄膜必 须用甲醇、乙醇或磷酸钾处理。由甲酸铸塑的薄膜在不经过加工的情况下， 不溶于水。
薄膜的厚度可以通过所用的蛋白溶液的浓度进行控制(数据未显示)。 重要地，薄膜可以由单一蛋白(一种蛋白薄膜)或两种蛋白(两种蛋白薄 膜)的溶液铸塑而成。
两种蛋白薄膜
本发明人分析了由包含两种蛋白成分的溶液铸塑的薄膜(两种蛋白薄 膜)与一种蛋白薄膜相比是否表现出不同的结构或稳定性。将(AQ),2和C6
或者(AQ)24NR3和C16NR4溶解在HFIP中(每种蛋白1% w/v,总共2% w/v)。关于序列信息，参考WO2006/008163,其通过引用结合于此。
两种蛋白薄膜由(AQ:h2/d6 (摩尔比例1:1)或(AQ)24NIG/C,6NR4 (摩尔 比例1:1.8)混合物铸塑而成。显著地，两种蛋白薄膜表现出由单一丝蛋白 铸塑的薄膜的特性的组合。S(AQ)12/C16形成的铸出的两种蛋白薄膜在所 有检测的试剂中都是可溶的。在用甲醇加工后，这些薄膜在水和尿素中变 得不溶，但是在GdmCl和GdmSCN溶液中可溶，这反映出在平C,6或平(AQ)12薄膜之间的化学稳定性。铸出的(AQ)24NR3/d6NR4两种蛋白薄膜不 能完全溶解于水。在水处理后，无定形蛋白聚集体保留。可以排除在NR 区域之间形成分子间二硫键引起无定形聚集，原因在于在还原剂如(3-巯基 乙醇(5% (Wv))的存在下，薄膜的性质不改变。用甲醇加工 (AQ)24NR3/d6NR4薄膜导致在水和尿素中的化学稳定性。
在两种蛋白薄膜的情形中，用甲醇处理导致受两种蛋白影响的化学稳 定性。与常规合成聚合物相比，在掺合通常引起混合的特性的情形中，这 样的发现对于蛋白是令人惊异的。通常，蛋白的结构和相互作用是复杂的， 并且取决于许多因素。当混合时，两种不相互作用的蛋白通常保留在不存 在第二种蛋白时发现的它们的化学稳定性。如果它们的确相互作用，通常 两种蛋白都表现出更高的化学稳定性。在我们的情形中，两种蛋白似乎相 互作用，但是所获得的化学稳定性在单一化合物的化学稳定性之间。
多层薄膜
多层薄膜可以通过将其它的层铸塑到已经存在的薄膜上而获得(图4， 5和6)。多层薄膜的所有的层可以由蜘蛛丝形成，但是薄膜层可以另外由 其它物质如昆虫丝、弹性蛋白、胶原、角蛋白、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚 (苯乙烯磺酸盐(酯))(PSS)、聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)、聚(丙烯酸)(PAA)、 聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)等形成。丝薄膜的厚度可以由 蛋白浓度控制。每一层可以包含具有不同的化学和物理特性的不同的丝蛋 白(天然昆虫或蜘蛛丝，或基于我们的组件序列1-27的重组丝)。此外， 每一薄膜可以包含不同修饰的丝蛋白(所述修饰可以在薄膜铸塑之前发 生)。最后，每一层可以通过将试剂化学偶联到各自的丝蛋白上而进行铸 塑后加工，以具有需要的官能性(图7和8)。
通过将物质在铸塑之前加入，可以将物质结合到由重组蜘蛛丝蛋白铸 塑的薄膜中(图9和10)。备选地，所述物质可以提供在丝薄膜的顶部， 并且可以在它的上面铸塑另一层丝薄膜(图11和12)。
总之，通过本发明可以实现下述目的
在铸塑之前或之后，单一丝薄膜层可以被共价官能化。此外，可以在 铸塑之前制备丝和试剂(诸如盐、染料、金属、化学品、药物等)之间的
17掺合物。逐层铸塑产生在每一层具有不同官能性的多层薄膜。这样的多层 多官能化丝蛋白薄膜完全是新颖的。另外，掺合其中每一种被不同官能化 的不同的蜘蛛丝蛋白，用于铸塑单一薄膜是新颖的。由此，多层蛋白薄膜 的每一个单层薄膜可以提供不同的官能性，产生具有单一功能的确定空间 分布的复杂三维构架。如果，所述单一功能可以联络，那么结果是巧妙的 三维结构。最后，丝薄膜可以与其它现有的聚合物薄膜成层，产生不同成 分的混合的多层薄膜。
本发明的工业应用性
多层、多官能性构架和结构是用于食品科学、废物处理、和化妆品、 医学、药物、汽车、航空等市场的大量创新性产品的基础。所述应用包括， 例如，装置涂层(例如，用于先进的内皮细胞附着)，药物递送系统，人 造细胞，隐形眼镜涂层，持续释放的药物递送系统，生物传感器，和具有 许多电学(例如，发光二极管)、磁性、电致着色、和光学特性(例如， 增加手持计算机和计算机屏的亮度，减少干扰细胞信号的量，和通过反射 红外线(热射线)而使得汽车能够更有效地作用并且由此减少对空调的负 担)的功能先进的材料。
多层丝薄膜可以吸收正常可被吸收的光并且将它转换成有用光，并且 增加亮度。在汽车工业中，可以利用多层丝薄膜反射太阳红外热量，原因 在于非传导性的薄膜完全透明，这是可以有效用于建筑应用的特性，在建 筑应用中增加的日光传播是需要的。由于光学干扰作用，包括数百层透明 的丝聚合物的多层薄膜反射。反射和传播的波长随着它们保持的角度的结
果而变化。
多层薄膜可以用来形成薄的纳米多孔和微多孔膜，并且可以用作纳米 反应器，用来合成金属性纳米颗粒。
氢键多层丝薄膜可以用于如显微模式和药物递送的应用，其中需要控 制氢键薄膜的解构速率。调节多层薄膜的解构行为的一种方法是通过所述 薄膜的结构设计进行。
另一种应用将是对映体的分离。手性是生物学中分子识别的关键。制 药工业对于单一对映体药物的需求已经促进了对手性分子的制备级别的分离的技术的发展。由于操作简单和成本低廉，基于膜的分离已经吸引了 许多注意。
多层丝薄膜的其它应用是人造皮肤移植物。主要的烧伤事故包括对皮 肤的广大损伤。需要及时覆盖，以限制流体流失并且辅助组织修复和再生。 理想的皮肤替代品的结构和功能特征应该紧密配合自体移植的皮肤。替代 物制备方法及其成分的可塑性为覆盖提供添加价值，将排斥和炎性反应的 活化减到最小。多层蜘蛛丝薄膜可以有效用于制备人造皮肤移植物，因为 所述方法提供生产薄膜的简单方法，而不限于大小、形状和组成，并且多 肽是固有的生物相容性的。
纳米过滤(NF)是压力驱动的膜分离过程，其用于诸如水软化、盐水改 造和染料盐(dyesalt)分离的应用。这样的应用不需要高NaCl排斥，其 对于反渗透(RO)膜是典型的，因此NF在比RO显著更低的压力下发生， 并且因此需要更少的能量。由于这一原因，NF的应用快速增长，但是继 续开发稳定的并抗污的选择性的、高流动率的膜应该提高这种分离技术的 用途。在RO和NF中，因为皮肤层的最小厚度允许合理的流动率而不管 它的致密的性质，膜由在高渗透性支持物上的选择性皮肤层组成。用于产 生这样的膜结构的典型方法包括相转换和通过界面聚合作用、移植或薄膜 沉积在预先形成的多孔支持物上而形成复合膜。复合膜特别有吸引性，因 为它们只需要少量的潜在昂贵的皮肤材料。多层丝薄膜为形成用于NF、 气体分离和过蒸汽化的膜的皮肤层提供可控的方法。
文献
(1) Decher，G.科学(5We匿)1997,277,1232.
(2) Chen, W.; McCarthy, T. J.大分子(Macromolecules) 1997,30,78.
(3) Bertrand, P.; Jonas, A.; Laschewsky, A.; Legras, R.大么、子'決速通i刊 (Macromol. Rapid Comm.) 2000, 21,319.
(4) Hammond, P. T.胶体界面科学当代观点(Cwr C>p/". Cb〃oW/"ter/ace SW.) 2000,4,430.
(5) Anzai, J.-I. 5w7^sefe'^agaAw 2001， 50, 585.
(6) Tripathy, S. K.， Kumar, J.， Nalwa, H. S., Eds,;聚电解质和它们的应用手
19册(Handbook of Polyelectrolytes and their Applications).第l-巻.基于齊3电 解质的多层，自我组装和纳米结构(Polydectroyte-based Multilayers, Self-assemblies and Nanostructures);美国禾斗学出版社(American Scientific Publishers) : Stevenson Ranch, CA, 2002.
(7) Decher， G., Schlenoff, J. B., Eds.;多层薄膜纳米复合物材料的顺序组装 (Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials);
Wiley-VCH: Weinheim,德国，2003.
(8) Schonhoff, M.胶体界面科学的当代观点(Curr. Opin. Colloid Interface Sci.) 2003, 8, 86.
(9) Schonhoff， M. J. Phys,Condens. Mater. 2003, 15, R1781.
(10) Hammond, P. T.高级材料(Ad. Mater.) 2004,16,1271.
(11) Muller,M.;等.黏附(Adhesion) 2004,80,521.
(12) Peyratout, C. S.; Da"hne, L. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, 3762.
(13) Boulmedais, F.;等.生物材料(Biomaterials) 2004,25,2003.
(14) Hubsch, E.;等.Langmuir 2005， 21, 3664.
(15) Picart, C.;等.美国国家科学院学报(Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A.)2002, 99, 12531.
(16) Elbert, D. L.; Herbert, C B.; Hubbell, J. A. Langmuir 1999， 15, 5355.
(17) Richert，L.;等.生物大分子(Biomacromolecules) 2002， 3， 1170.
(18) Halthur, T. J.; Claesson, P. M.; Elofsson, U. M.美国化学学会杂志(J. Am. Chem. Soc.) 2004, 126, 17009.
(19) Richert, L.; Amtz, Y.; Schaaf, P,; Voegel,丄-C.; Picart， C, Surf. Sci. 2004, 570， 13.
(20) Haynie, D.;等.生物大分子2005,6,2895.
(21) Hiimmerich, D.; Helsen, C.W.; Oschmann, J.; Rudolph, R.; Scheibel, T. 生物化学(Biochemistry) 2004,43,13604.
(22) Hiimmerich, D.; Slotta, U.; Scheibel, T.应用物理学(Applied Physics A) 2006, 82, 219.
20
权利要求
1. 一种形成多层丝蛋白薄膜的方法，所述方法包括下列步骤a)提供溶解在或悬浮在适当溶剂中的一种或多种丝蛋白溶液；b)将一种所述溶液形成薄膜；c)蒸发所述溶剂，由此形成第一丝蛋白薄膜层；和d)重复步骤a)-c)一次或多次，以在所述第一丝蛋白薄膜层上形成另外的丝蛋白薄膜层，从而形成多层丝蛋白薄膜。
2. 权利要求l的方法，其中所述多层薄膜的每一单层由丝蛋白溶液形 成，所述丝蛋白溶液包含一种或多种类型的丝蛋白。
3. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述多层薄膜由包含相同 的(同质多层薄膜)或不同的(异质多层薄膜)丝蛋白的层形成。
4. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述多层薄膜包括由丝蛋 白制成的一层或多层和包含其它蛋白质或非蛋白质物质的一层或多层。
5. 权利要求4的方法，其中所述非蛋白质物质选自聚苯乙烯、聚氯乙 烯、聚(苯乙烯磺酸盐(酯))(PSS)、聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)、聚(丙 烯酸)(PAA)、和/或聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)。
6. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述其它蛋白质物质选自 胶原、弹性蛋白或角蛋白。
7. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述溶剂是极性溶剂，优 选选自水、甲酸、六氟异丙醇和/或乙酸。
8. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述丝蛋白选自昆虫丝蛋 白或蜘蛛丝蛋白，优选天然或重组的丝蛋白，优选来自昆虫纲(Insecta)、 蛛形纲(Arachnida)的丝或它们的类似物。
9. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述多层薄膜的层包括结 合在其中的或位于两层相邻层之间的一种或多种试剂。
10. 权利要求9的方法，其中所述一种或多种试剂选自金属、化学品 和/或药剂。
11. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述丝蛋白在步骤lb) 之前或之后被共价官能化。
12. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述丝蛋白溶液包含0.1-20%,优选0.5-10%,更优选1-3% w/v的丝蛋白。
13. 前述权利要求中一项或多项的方法，其中所述薄膜通过将所述溶 液塑模、旋涂或铸塑到适当的支持物上而形成。
14. 一种多层薄膜，其可通过权利要求1-13中一项或多项的方法获得。
15. —种多层丝蛋白薄膜，其包括至少两层丝蛋白薄膜。
16. 权利要求15的多层薄膜，其中所述多层薄膜的每个单层由丝蛋白 溶液形成，所述丝蛋白溶液包含一种或多种类型的丝蛋白。
17. 权利要求15或16的多层薄膜，其中所述多层薄膜由包含相同的 (同质多层薄膜)或不同的(异质多层薄膜)丝蛋白的层形成。
18. 权利要求15-17中一项或多项的多层薄膜，其中所述多层薄膜包 括由丝蛋白形成的一层或多层和包含其它蛋白质或非蛋白质物质的一层 或多层。
19. 权利要求18的多层薄膜，其中所述非蛋白质物质选自聚苯乙烯、 聚氯乙烯、聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)、聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)、聚(丙 烯酸)(PAA)、和/或聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)。
20. 权利要求18的多层薄膜，其中所述其它蛋白质物质选自胶原、弹 性蛋白或角蛋白。
21. 权利要求15-20中一项或多项的多层薄膜，其中所述丝蛋白选自 昆虫丝蛋白或蜘蛛丝蛋白，优选天然或重组的丝蛋白，优选来自昆虫纲、 蛛形纲的丝或它们的类似物。
22. 权利要求15-21中一项或多项的多层薄膜，其中所述多层薄膜的 层包括结合在其中的或位于两层相邻层之间的一种或多种试剂。
23. 权利要求22的多层薄膜，其中所述一种或多种试剂选自金属、化 学品和/或药剂。
24. 权利要求15-23中一项或多项的多层薄膜，其中所述丝蛋白是被 共价官能化的。
25. 化妆品组合物；药物或医学组合物，优选药物递送系统、人造细胞、 隐形眼镜涂层、持续释放的药物递送系统、人造皮肤移植物；食品组合物; 汽车零件；航空组件；计算机或数据存储装置；建筑材料；纺织品或膜，其包括权利要求14-24中一项或多项的多层薄膜。
26.权利要求14-24中一项或多项的多层薄膜在药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种形成多层丝蛋白薄膜的方法和由所述方法获得的多层薄膜。本发明还涉及包含所述多层薄膜的各种物质、产品和组合物，以及所述多层薄膜在多种应用中的用途。
文档编号C08L89/00GK101460570SQ200780020474
公开日2009年6月17日 申请日期2007年4月13日 优先权日2006年5月3日
发明者乌特·斯洛塔, 托马斯·沙伊贝尔 申请人:慕尼黑技术大学