专利名称：一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种聚氨基酸的分离纯化技术，更具体的说是涉及一种采用 双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法。
背景技术：
聚氨基酸类物质，如聚谷氨酸[y-;70/7^/w"/z7/cac/V，以下简称Y-PGA〗 是微生物合成的一种水溶性的高分子，通常由5000个左右谷氨酸单体组成， 相对分子质量一般在10万 10G万之间。由于其发酵液具有粘稠特性，造 成聚谷氨酸和菌体的分离难当困难，通常的分离提取方法都收不到理想的效 果，提取效率只有40-50%,产品的纯度仅有30-40%。
双水相(Aqueous two-phase system,简称ATPS)萃取技术，是近年出现 的一种极具应用前途的新型生物化工分离技术。它是由两种化学结构不同的 亲水性聚合物，或一种亲水性聚合物和无机盐，在水中以适当的浓度形成互 不相溶的两相，利用待分离组分在两相间分配的差异，从而达到物质分离提 纯的目的。ATPS具有生物相容性高、单级分离提纯效率高、溶质分配过程 温和、与其它技术间相互集成性强、能进行萃取性的生物转化、操作容易、 能够精确地按比例放大、对环境污染小、成相物质可回收等特点。
成功利用双水相萃取技术分离聚谷氨酸的关键是寻找合适的双水相体 系和寻找合适的萃取条件，包括系统条件和环境条件。目前在生化工程中应
用最广泛的两种双7jc相体系是聚合物/聚合物体系、聚合物/盐体系，聚乙二 醇/葡聚糖、聚乙二醇/磷酸盐或聚乙二醇/硫酸盐是这两者的代表。
在本实验室既往的研究中，王雷、李楠等人采用分子量为1500的聚乙 二醇与磷酸盐组成双水相体系对除菌后的发酵液进行聚谷氨酸的分离，经过 自然分相，聚谷氨酸的分配系数为31.7，上相收率为96.8%,分离提取产品 纯度为81%。该方法由于发酵生产使用的菌体为纳豆芽孢杆菌或地衣芽孢杆 菌，菌体细小，在实际生产的离心除菌操作时需要使用转速为
312000-15000r/m以上高速连续排渣或间歇式离心机，而此种离心机的造价 昂贵，设备投资大。再有，从整个生产周期来考虑，采用离心除菌和自然分 相工艺所需的处理时间较长，致使生产周期延长。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种高效、简便、降低 生产成本的采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法。
本发明通过下述技术方案实现
一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法，其特征在于， 包括下述步骤
(1) 在常温下，将平均分子量为1000的聚乙二醇溶液、pH值为8.0 的磷酸盐緩沖液、未除菌的原发酵液和水制成混合溶液，其中，平均分子量 为1000的聚乙二醇(PEG1000 )的质量百分含量为23%,磷酸盐的质量百分 含量为23%，未除菌的原发酵液的质量百分含量为10%,余量的水；
(2) 将上述混合溶液在3000r/min条件下离心5分钟分相。经离心后 菌体被分离到容器的底部，而上相与下相清楚地得到分离。分别测定上相、 下相中聚谷氨酸的含量，通过上下相中聚谷氨酸的浓度计算出双水相萃取的 分配系数，然后根据上下相的体积计算出上下相中聚谷氨酸的提取率，综合 分配系数和提取率。分配系数和提取率越高，体系的分配效果越好。
(3) 取上相，用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，得到聚谷 氨酸浓缩液，将聚谷氨酸浓缩液冷冻干燥得到聚谷氨酸粉末。
所述磷酸盐为磷酸钠钾盐。
平均分子量为1000的聚乙二醇溶液的质量分数为50%,磷酸盐緩冲液 的质量分数为30%。
本发明具有下述技术效果
1. 本发明的方法采用PEG1000与磷酸盐组成双水相体系对未经除菌的 原发酵液直接进行聚谷氨酸的分离纯化，可使除菌和分离提取聚谷氨酸一步 完成，从而缩短了提取时间和生产周期，降低了生产成本，并节省了高速离 心设备的投资，分离纯化方法简便、高效。而且，分离效果更好,提取率更 高，纯度更高，可节省设备的^v费用和降低生产成本。
2. 本发明的方法采用离心操作，既能达到除菌的目的，又能达到分相的目的， 一举两得。
3.本发明的方法利用膜分离技术浓缩料液，还可以同时回收聚乙二醇， 经过简单处理后可重复使用，从而节省了双水相试剂的用量，降低了生产成 本。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明详细说明。 实施例1
将PEG1000配置成质量分数为50%的溶液。依照Henderson-Hasselbach 方程计算出HP0A与H2P(V的比率，用磷酸氬二钾、磷酸二氢钾配置成pH值 为8. 0、质量分数为30%的磷酸钾盐緩沖液。未除菌的原发酵液中y-PGA的 含量为6. 4mg/g (w/w)。
在室温条件下，上述配置的PEG1000溶液、磷酸钾盐緩冲液、未除菌的 原发酵液和水制成混合溶液，混合液中聚乙二醇的质量百分含量为23%,磷 酸钾盐的质量百分含量为23%,发酵液的质量百分含量为10%。放入离心机 中在3000r/min条件下离心5分钟分相，分别测定上、下相中聚谷氨酸的浓 度和含量，此时聚谷氨酸的分配系数1(=37. 5,上相提取率为97.8%。将上相 分离出，釆用截流体积为6000的超滤膜分离出PEGIOOO，得到聚谷氨酸浓 缩液。将聚谷氨酸浓缩液真空冷冻干燥得到聚谷氨酸粉末，测得其纯度为 89.5%。'
使用本发明的聚乙二醇/磚酸钾盐双水相体系萃取聚谷氨酸，在5分钟 内便可完成除菌分相，并与膜分离和冷冻干燥等其它生物分离技术集成，优 化了聚谷氨酸的制备工艺，缩短了操作周期，提高了产品的收率和纯度，为 聚谷氨酸的产业化打下基础。
权利要求
1、一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括下述步骤(1)在常温下，将平均分子量为1000的聚乙二醇溶液、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液、未除菌的原发酵液和水制成混合溶液，其中，平均分子量为1000的聚乙二醇的质量百分含量为23％，磷酸盐的质量百分含量为23％，未除菌的原发酵液的质量百分含量为10％，余量的水；(2)将上述混合溶液在中速3000r/min条件下离心5分钟分相；(3)取上相，用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，得到聚谷氨酸浓缩液，将聚谷氨酸浓缩液冷冻干燥得到聚谷氨酸粉末。
2、 根据权利要求1所述的采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸 的方法，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸钾盐。
3、 根据权利要求1或2所述的采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷 氨酸的方法，其特征在于，平均分子量为1000的聚乙二醇溶液的质量分数 为50%,磷酸盐緩冲液的质量分数为30% 。
全文摘要
本发明公开了一种采用双水相体系从原发酵液中提取聚谷氨酸的方法，旨在提供一种高效、简便、降低生产成本的提取聚谷氨酸的方法。包括下述步骤在常温下，将PEG1000溶液、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液、未除菌的原发酵液和水制成混合溶液，其中，PEG1000为23％，磷酸盐为23％，未除菌的原发酵液为10％，余量的水；将混合溶液在3000r/min条件下离心5-10分钟分相；取上相，用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，将聚谷氨酸浓缩液冷冻干燥得到聚谷氨酸粉末。本发明的方法可使除菌和分离提取聚谷氨酸一步完成，分离纯化方法简便、高效。而且，提取率更高，纯度更高，可节省设备的投入费用和降低生产成本。
文档编号C08G69/10GK101503511SQ20091006805
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者楠 李, 雷 王, 黄登禹 申请人:天津商业大学