专利名称：：多孔树脂珠和利用其制备核酸的方法多孔树脂珠和利用其制备核酸的方法技术领城本发明涉及多孔树脂珠和利用其制备核酸的方法，所述多孔树脂珠包含芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。
背景技术：
：基于亚磷酰胺法(phosphommiditemethod)的固相合成方法被广泛用于化学地合成核酸，比如DNA和RNA。在该方法中，将固相合成用栽体填装到反应柱中并应用于自动核酸合成仪，其中所述载体担栽预先经可裂解的连接体连接的将变成待合成核酸的3'端的核苷。随后，根椐合成程序在合成循环中重复进行(l)核苷的5'-OH基团的脱保护；(2)将核苷亚磷酰胺偶联到所述5，-OH基团上；(3)未反应的5，-OH基团的加帽；和(4)所得亚磷酸酯的氧化，由此合成出具有期望序列的核酸。最后通过使用氨等水解可裂解的连接体，从固相合成用栽体上切掉合成的核酸(例如非专利文献1)。常规地,CPG(可控孔玻璃)、硅胶等的无机颗粒已被广泛用作核酸的固相合成用载体。作为对它们的替代，已经开发出具有改良的化学稳定性的高度交联的、不溶胀的多孔聚苯乙烯颗粒(例如,专利文献l)和使得在核酸药物的制备中实现核酸的大量合成的低交联的、可溶胀的多孔聚苯乙烯颗粒。同时，相较于DNA的合成，RNA的合成遇到这样的问题amidite的偶联效率因为必须使用在其2，-OH基团上结合有保护基的亚磷酰胺而降低，其导致所得RNA纯度的降低。为了在合成RNA的同时最小化纯度的降低，有必要减少核苷-连接体键合的量，其中所述核苷在固相合成用栽体上用作合成起始点，但是，这却导致每单位量的固相合成栽体的合成量降低的新问题。
发明内容本发明人进行了深入研究以解决上述问题，并且发现当利用由特定的芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物构成的多孔树脂珠作为固相合成用栽体，来进行RNA的化学合成时，可以化学地合成高純度的RNA而不会降低合成的量。本发明人基于该发现进行了进一步研究，从而完成了本发明。因此，本发明涉及以下[l]-[8]:[1〗多孔树脂珠,其包含第一芳香族单乙彿基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。[2]上述[l]所述的多孔树脂珠，其中所述共聚物进一步包含具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的第二芳香族单乙烯基化合物作为结构单元。[3]上述[l]所述的多孔树脂珠，其中在所迷共聚物中所迷(甲基)丙烯酰胺衍生物单元的含量是0.3-4mmol/g。[4]上述[2]所述的多孔树脂珠，其中存在于所述第二芳香族单乙烯基化合物中的所迷官能团是氨基或羟基。[5]上述[4]所述的多孔树脂珠，其中在所述共聚物中所述氨基或羟基的含量是0.05-lmmol/g。〖6]上述[l]所述的多孔树脂珠，其中所述(甲基)丙烯酰胺衍生物选自由N-烷基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺、N-烷氧基(甲基)丙烯酰胺、2-(甲基)丙烯酰胺链烷磺酸、N-羟烷基(甲基)丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺和丙烯酰基吗啉组成的组。[7]上迷[l]所述的多孔树脂珠，其中所迷二乙烯基化合物是二乙烯基苯。用于制备核酸的方法，包括将核苷酸结合到各自通过可裂解的连接体结合到上迷[1H7]任一项所迷的多孔树脂珠上的核苷、核苷酸或多核苷酸上以得到延长的多核普酸。本发明提供多孔树脂珠，其在核酸合成中用作固相合成用栽体时，使得能实现核酸的大量合成而不降低其合成純度。本发明所述多孔树脂珠的使用，使得即便是对于难以化学地合成的核酸如RNA,也可以避免合成量的降低和合成纯度的降低。具体实施方式本发明提供多孔树脂珠，其包含芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。此处所用术语"芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物"指的是包含芳香族单乙烯基化合物，二乙烯基化合物和(甲基)丙烯酰胺衍生物作为其结构单元的共聚物。该共聚物可以通过共聚芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体和(甲基)丙烯酰胺衍生物单体来制备。本发明所述的多孔树脂珠中，芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物的含量通常为80重量％或更多，优选90重量％或更多，更优选95重量％或更多，和最优选基本100重量％。在最优选的实施方案中，本发明所述的多孔树脂珠由芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物构成。本发明所述多孔树脂珠中使用的第一芳香族单乙烯基化合物的选择并无特别限定；实例包括苯乙烯；核烷基取代(nuclearalkyl-substituted)的苯乙烯比如邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三曱基苯乙烯和对叔丁基苯乙烯；a-烷基取代的苯乙烯比如a-甲基苯乙烯和a-曱基-对甲基笨乙烯；核面代笨乙烯比5如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙彿和溴苯乙烯；卣代烷基苯乙烯比如氯甲基苯乙烯和氟甲基苯乙烯;羟基苯乙烯;羟甲基苯乙烯;苯甲酸乙烯基酯;苯乙烯磺酸钠;氰基苯乙烯;甲氧基苯乙烯；乙氧基苯乙烯;丁氧基苯乙烯;硝基苯乙烯;酰氧基苯乙烯比如乙酰氧基苯乙烯和苯甲酰氧基苯乙烯等。所迷第一芳香族单乙烯基化合物优选苯乙烯。此处，所述第一芳香族单乙烯基化合物与下述第二芳香族单乙烯基化合物的区别在于所迷第一芳香族单乙烯基化合物不具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团。来自第一芳香族单乙烯基化合物单体的典型结构单元是下述结构单元(a)。-ch—ch2—d'(a)在组成本发明所迷的多孔树脂珠的共聚物中，来自第一芳香族单乙烯基化合物单体的结构单元的含量没有特别限定，且含量优选l-9.5mmol/g,更优选2-9mmol/g,还更优选3-8mmol/g。本发明的多孔树脂珠中使用的二乙烯基化合物的选择并无特别限定；实例包括芳香族二乙烯基化合物比如二乙烯基苯、甲基二乙烯基苯、二乙烯基甲苯和二乙烯基萘；单和多乙二醇二(甲基)丙烯酸酯比如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸酯和四甘醇二(甲基)丙烯酸酯;单和多丙二醇二(甲基)丙烯酸酯比如丙二醇二(甲基)丙烯酸酯和二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯；二(甲基)丙烯酸酯化合物比如1,2-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，3-丁二醇二(曱基)丙烯酸酯、1,4-丁二醇二(曱基)丙烯酸酯、1>戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，9-壬二醇二(曱基)丙烯酸酯、1,10-癸二醇二(曱基)丙烯酸酯、2-甲基-l,8-辛二醇(甲基)丙烯酸酯和1，4-环己二醇二甲基丙烯酸酯等。该二乙烯基化合物优选二乙烯基苯。6二乙烯基苯包括邻、间和对二乙烯基苯及其混合物。来自二乙烯基化合物单体的典型结构单元是下迷结构单元(c)。在构成本发明所述的多孔树脂珠的共聚物中，来自二乙烯基化合物单体的结构单元的含量(mmol)并无特别限定，含量通常为0.1-2mmol/g,优选为0.2-lmmol/g,且更优选为0.3-0.8mmol/g。若该二乙烯基化合物含量过低，则所述多孔树脂珠不会具有足够的耐溶剂性、热稳定性或多孔性，其进而有时导致在核酸的固相合成中难以获得期望的效果。若该二乙烯基化合物含量过高，则其在有机溶剂中的溶胀性会降低，其进而有时导致通过固相合成而合成的核酸量的减少及其合成纯度的降低。N-烷基(曱基)丙烯酰胺中含有的烷基是直链或支链烷基，通常具有1-6个碳原子，优选1-3个碳原子。N-烷基(甲基)丙彿酰胺的实例包括N-甲基(曱基)丙烯酰胺，N-乙基(甲基)丙烯酰胺，N-正丙基(曱基)丙烯酰胺，N-异丙基(甲基)丙烯酰胺，N-叔丁基(甲基)丙烯酰胺和N-月桂基(甲基)丙烯酰胺。N-烷氧基烷基(曱基)丙烯酰胺中含有的烷氧基是直链或支链烷氧基，通常具有1-6个碳原子,优选1-3个碳原子。N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺中含有的烷基是直链或支链烷基，通常具有1-6个碳原子，优选1-3个碳原子。N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺,N-乙氧基曱基(甲基)丙烯酰胺，N-丙氧基甲基(曱基)丙烯酰胺，N-丁氧基甲基(甲基)丙烯酰胺,N-乙氧基乙基(甲基)丙烯酰胺,N-甲氧基丙基(甲基)丙烯酰胺,N-乙氧基丙基(曱基)丙烯酰胺和N-异丙氧基乙基(曱基)丙烯酰胺。2-(甲基)丙烯酰胺链烷磺酸中含有的烷烃是直链或支链烷烃，通常具有l-6个碳原子，优选为1-3个碳原子。2-(甲基)丙烯酰胺链烷磺酸的实例包括2-丙烯酰胺丙烷磺酸，2-丙烯酰胺正丁烷磺酸，2-丙烯酰胺正己烷磺酸和2-丙烯酰胺-2-曱基丙烷磺酸所述(曱基)丙烯酰胺衍生物优选是双丙酮丙烯酰胺，N-异丙基(曱基)丙烯酰胺，N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺或N,N，-二甲基(甲基)丙烯酰胺。来自(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的典型结构单元是以下结构单元。在构成本发明所述的多孔树脂珠的共聚物中，来自(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的结构单元的含量通常为0.3-4mmol/g,优选0.4-3.5mmol/g，且更优选0.6-3mmol/g。若所述(甲基)丙烯酰胺衍生物的含量过低，则得不到避免合成的核酸的量降低和合成純度降低的预期效果；若所述(甲基)丙烯酰胺衍生物的含量过高,则多孔树脂珠难以形成。在一个优选实施方案中，本发明所迷的多孔树脂珠中的共聚物，除了第一芳香族单乙烯基化合物之外，进一步包含第二芳香族单乙烯基化合物作为其结构单元，所述第二芳香族单乙烯基化合物具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团。在连接核苷和多孔树脂珠中使用这种官能团是有利的，因为当用于核酸合成的连接体具有羧基时，它可以容易地结合到该羧基上。这类官能团的实例包括，但不限于氨基和羟基。所述第二芳香族单乙烯基化合物的实例包括,但不限于得自所述第一芳香族单乙烯基化合物的一个或多个氢原子被能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团取代的化合物。特别地，所述第二芳香族单乙烯基化合物例示为轻基苯乙烯单体比如羟基苯乙烯或其取代衍生物；羟烷基苯乙烯单体比如羟甲基苯乙烯或其取代衍生物；酰氧基苯乙烯比如乙酰氧基苯乙烯,乙酰基氧基苯乙烯和苯甲酰氧基苯乙烯,其中所述酰氧基通过水解转化为轻基；氨基苯乙烯单体比如氨基苯乙烯或其取代衍生物；氨基烷基笨乙烯单体比如氨基甲基苯乙烯或其取代衍生物；和它们的酰化单体，等等。所述第二芳香族单乙烯基化合物优选未取代的对羟基苯乙烯、对氨基苯乙烯或对乙酰氧基苯乙烯。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>在构成本发明所述的多孔树脂珠的共聚物中，来自第二芳香族单乙烯基化合物单体的结构单元的含量，通常为0.05-lmmol/g,优选0.1-0.8mmol/g，且更优选0.2-0.7mmol/g。若所述第二芳香族单乙烯基化合物过低，则得不到避免合成的核酸的量降低和合成纯度降低的预期效果；若所述第二芳香族单乙烯基化合物过量，则多孔树脂珠倾向于难以形成。在构成本发明所述的多孔树脂珠的共聚物中，能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的含量优选为0.05-lmmol/g，更优选为0.1-0.8mmol/g，且还更优选为0.2-0.7mmol/g。若所迷官能团含量过低，则合成的核酸量容易降低；若所述官能团含量过高，则核酸的纯度容易下降。当所述能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团是氨基或羟基时，在本发明所述的多孔树脂珠中，所述氨基或羟基的含量按照JISK0070通过滴定来进行测量。特别地，使用预定量的乙酰化试剂(乙酸酐和吡咬)对固相合成用栽体中的测量目标羟基进行乙酰化，通过使用氢氧化钾滴定来测定在该乙酰化过程中未被消耗的乙酸酐的量，并计算所述氨基的含量或羟基的含量。具体程序如下所示。将吡。定添加到25g的乙酸酐中，以使总体积为100ml，得到乙酰化试剂。称量0.5-2g的样品(干多孔树脂珠)到烧瓶中，并精确添加0.5ml的上述乙酰化试剂和4.5ml的吡啶。在95-10(TC保持2hr后，将烧瓶中的混合物冷却至室温，之后添加lmi的蒸馏水。对该烧瓶加热10min以分解在乙酰化中没有消耗的乙酸酐。将该烧瓶中的所有内容物转移至烧杯中，并用蒸馏水稀释以使总体积为150ml,之后使用0.5mol/l的氢氧化钾水溶液滴定稀释液。另外，以相同方法，但不添加样品来进行空白测量。ii样品的羟基的含量通过下述式(l)计算A=(B-C)x0.5(mol/l)xfxlOOO+M...(l)其中AOimol/g)为样品的羟基含量；B(ml)为被添加以中和空白溶液的氢氧化钾水溶液的量；C(ml)为被添加以中和样品的氢氧化钾水溶液的量；f为氩氧4b钟7JC溶'液因子(fisafactorfortheaqueouspotassiumhydroxidesolution"M(g)为称量出的样品的重量。对本发明所述的多孔树脂珠的孔大小、孔的数量等并无特别限定。所迷孔大小可通过中值孔径来量化。本发明所述的多孔树脂珠的中值孔径并无特别限定，大小优选为l-1000nm,更优选为5-500nm,且还更优选为10-200nm。若所述多孔树脂珠的中值孔径过小，当本发明所述的多孔树脂珠被用作化学反应用栽体时，则有反应区域降低至使得期望的反应不太可能发生的程度的危险，而且核酸合成中的碱基序列数容易小于所期望的数。相反，若所述多孔树脂珠的中值孔径过大，则所述珠表面(其用作上述反应的区域)上的羟基和反应中涉及的物质之间的接触机会下降，这对于栽体是潜在地不利的。所迷多孔树脂珠的中值孔径通过水银孔隙率测定法来测定。特别地，将约0.2g样品放入水银孔隙率测定仪PoreMaster60-GT(QuantaChromeCo.)中，并通过水银注射加压法在140。的水银接触角和480dyn/cm的水银表面张力条件下进行测量。制备本发明所述多孔树脂珠的方法的选择并无特别限定。以下描述的是其一种制备方法，包含悬浮-共聚各个单体，并水解所得共聚物。在该制备方法中，首先利用有机溶剂和水，对第一芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体和(甲基)丙烯酰胺衍生物单体(和根据需要，具有被保护的能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的第二芳香族单乙烯基化合物单体)进行悬浮-共聚，以获得芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。随后水解该共聚物，并根椐需要对含有的具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的第二芳香族单乙烯基化合物进行脱保护，由此获得多孔树脂珠。作为用于上述悬浮共聚中的第一芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体、(甲基)丙烯酰胺衍生物单体和第二芳香族单乙烯基化合物单体，可以提及以上提到的用以例示构成本发明所述多孔树脂珠的各共聚物的结构单元的化合物。所述第二芳香族单乙烯基化合物单体中含有的能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团优选被保护。根据官能团的种类来选择适当种类的保护基团。例如,当所述官能团是羟基时，优选使用酰氧基作为保护基。酰氧基是由式X-CO-O-表示的基团(其中，X为烷基)；优选由X表示的烷基部分具有l-5个碳原子的酰氧基，优选乙酰氧基。上述悬浮共聚中使用的第二芳香族单乙烯基化合物单体的优选具体实例包括对乙酰氧基苯乙烯、对笨甲酰氧基苯乙紼等。也可以不保护所述第二芳香族单乙烯基化合物而制备本发明所述多孔树脂珠的用于固相合成的载体。但是，由于具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的未被保护的第二芳香族单乙烯基化合物(例如,羟基苯乙烯等)是不稳定的单体，因而操作和保存不容易。由于该原因，优选上述的方法，其中，对具有被保护的能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的第二芳香族单乙彿基化合物进行悬浮-共聚，并对如此得到的共聚物进行水解。在所述悬浮共聚中，加入的第一芳香族单乙烯基化合物单体的量，相对于第一芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体和(曱基)丙烯酰胺衍生物单体(以及根椐需要使用的第二芳香族单乙烯基化合物单体)的总量，通常为卜9.5mmol/g，优选2-9mmol/g，更优选3-8mmol/g,且还更优选4-7mmol/g。在所述悬浮共聚中，加入的二乙烯基化合物单体的量，相对于第一芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体和(曱基)丙烯酰胺衍生物单体(以及根据需要使用的第二芳香族单乙烯基化合物单体)的总量，通常为0.1-2mmol/g，优选0.2-lmmol/g,且更优选0,3-0.8mmol/g。在所述悬浮共聚中，加入的(曱基)丙烯酰胺衍生物单体的量，相对于第一芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体和(曱基)丙烯酰胺衍生物单体(以及根据需要使用的第二芳香族单乙烯基化合物单体)的总量，通常为0.3-4mmol/g,优选0.4-3.5mmol/g,且更优选0.6-3mmol/g。在所迷悬浮共聚中，当使用第二芳香族单乙烯基化合物单体时，加入的第二芳香族单乙烯基化合物单体的量，相对于第一芳香族单乙烯基化合物单体、二乙烯基化合物单体、(曱基)丙烯酰胺衍生物单体以及第二芳香族单乙烯基化合物单体的总量，通常为0.05-lmmol/g,优选0.1-0.8mmol/g，且更优选0.2-0.7mmol/g。上述悬浮共聚通过在水中搅拌并乳化上述单体和有机溶剂的混合物来进行。如在此处所使用的那样，术语"有机溶剂"指的是悬浮共聚系统中的除水之外的溶剂。在本发明中，上迷有机溶剂包括烃和醇。有用的烃包括脂肪族饱和或不饱和烃和芳族烃，优选具有5-12个碳原子的脂肪族烃，更优选正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、十一烷、十二烷等。在悬浮共聚过程中醇的存在使得所得珠为多孔性的。醇的实例包括脂肪族醇，在其烷基中的碳原子数优选为5-12;更优选的醇包括2-乙基己醇、叔戊醇、壬醇、2-辛醇、癸醇、月桂醇、环己醇等。上述烃和醇的重量比取决于所用的烃和醇的选择而适当可以变化。根据该重量比,所得多孔树脂珠的比表面积是可变的。在所述悬浮共聚中，有机溶剂的重量，相对于单体的总重量，优选为0.5-2.5倍，更优选为0.8-2.0倍。若该值过大或过小，则所得多孔树脂珠的比表面积降低，其进而使得化学地合成的反应产物的量降低。在本发明中，可通过本身已知的方法来进行悬浮共聚。特别地，在悬浮共聚中，可使用已知的分散体稳定剂和过氧化物比如过氧化苯甲酰(聚合引发剂)。上述分散体稳定剂的其它实例包括，但不限于亲水性的护胶剂比如聚乙烯醇、聚丙烯酸、明胶、淀粉和羧甲基纤维素；或不溶性粉末比如碳酸钩、碳酸镁、磷酸钙、硫酸钡、疏酸钙和膨润土等。所添加的分散体稳定剂的量并无特别限定，相对于悬浮聚合系统中水的重量，该量优选0.01-10重量％。若该值过小，则悬浮聚合中分散体稳定性可能降低，这可能导致产生大量的聚集体。若该值过大，则可能导致产生大量微珠。上述聚合引发剂的实例包括，但不限于本领域技术人员已知的引发剂，包括过氧化物比如过氧化二笨曱酰、过氧化二月桂酰、过氧化二硬酯酰、1,1-二(叔丁基过氧基)-2-甲基环己烷、1,1-二(叔己基过氧基)-3，3,5-三甲基环己烷、l,l-二(叔己基过氧基)环己烷、l,l-二(叔丁基过氧基)环己烷、二叔己基过氧化物、叔丁基异丙苯基过氧化物、二叔丁基过氧化物、己酸1,1，3,3-四甲基丁基过氧基-2-乙基酯、己酸叔己基过氧基-2-乙基酯、己酸叔丁基过氧基-2-乙基酯和叔丁基过氧基异丙基单碳酸酯；和偶氮化合物比如2,2，-偶氮双异丁腈、2,2，-偶氮双-2-甲基丁腈和2，2，-偶氮双-2，4-二曱基戊腈。用于所迷悬浮共聚的反应条件可以适当设定；例如可提及在60-90。C搅拌30min-48hr。可使用本领域技术人员已知的程序和条件实现水解，该水解用以对共聚物中被保护的基团进行脱保护。例如，可使用酸催化剂或碱催化剂通过水解将酰氧基转化为羟基。应注意的是在水解处理中，并不是所有保护基团都必须被除去。通过上述处理，可获得本发明所述的多孔树脂珠。在该方法中，可适当进行进一步的处理比如干燥和分级。本发明所述的多孔树脂珠可作为栽体用于各种化学合成反应，并且可以特别有效地用在核酸合成中。此处所用术语核酸指的是线型化合物(寡核苦酸)，其中核苷酸经由磷酸二酯键连接，并且被认为包括DNA,RNA等。所述核酸可以为单链的或双链的。因为其允许使用核酸合成仪有效合成，所以所述核酸优选为单链的。本发明所述的多孔树脂珠可以很好地作为核酸，特别是RNA的合成用固相栽体。使用本发明所述的多孔树脂珠作为固相栽体，使得能够在极高产率和純度下合成期望的RNA。尽管尚不完全清楚为何本发明所述的多孔树脂珠适于RNA合成，但是可能与(曱基)丙烯酰胺衍生物的亲水性有关。此处所用核酸合成反应特别指的是核酸延长反应。特别地，将核苷酸结合到各自通过可裂解的连接体结合到本发明所述的多孔树脂珠上的核苷、核苷酸或多核苷酸上，由此得到延长的多核苷酸。连接体指的是通过共价键连接两个分子的分子。有用的连接体包括在固相核酸合成中本身已知的用于连接载体和核酸的那些。优选的连接体包括下式所示的核苷-琥珀酰连接体(洗涤)对所得聚合产物进行过滤和使用蒸馏水和丙酮(WakoPureChemicalIndustries)洗涤，并分散于丙酮中以使总体积为约2L。使用超声均化器分散该聚合产物，之后对分散体进行过滤和使用蒸馏水和丙酮洗涤，并将产物分散在丙酮中以使总体积为约1L。实施例4进行与实施例1相同的程序，除了使用37g的苯乙烯(WakoPureChemicalIndustries),4g(0.41mmol/g)的对乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)，7g(0.49mmol/g)的二乙烯基苯(55°/0含量，WakoPureChemicalIndustries)和12g(1.55mmol/g)的N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺(WakoChemical)作为单体，和使用55g的2-乙基己醇(WakoPureChemicalIndustries)和25g的异辛烷(WakoPureChemicalIndustries)作为有机溶剂，由此获得由对轻基苯乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯-N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺共聚物组成的多孔树脂珠的固相合成用栽体。实施例5进行与实施例1相同的程序，除了使用25g的苯乙烯(WakoPureChemicalIndustries),4g(0.41mmol/g)的对乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)，7g(0.49mmol/g)的二乙烯基苯(55%含量，WakoPureChemicalIndustries),12g(1.77mmol/g)的N-异丙基丙烯酰胺(WakoPureChemicalIndustries)和12g的曱基丙烯腈(WakoPureChemicalIndustries)作为单体，和使用72g的l-癸醇(WakoPureChemicalIndustries),由此获得由对羟基苯乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯-N-异丙基丙烯酰胺-曱基丙烯腈共聚物组成的多孔树脂珠的固相合成用栽体。实施例6进行与实施例1相同的程序，除了使用40g的笨乙烯(WakoPureChemicalIndustries)，6g(0.62mmol/g)的对乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)，9g(0.52mmol/g)的二甲基丙烯酸三甘醇酯(Shin-NakamuraChemicalCo.，Ltd.,商品名NKEster3G)和5g(0.84mmol/g)的N,N-二甲基丙烯酰胺(WakoPureChemicalIndustries)作为单体，和使用84g的l-癸醇(WakoPureChemicalIndustries)作为有机溶剂，由此获得由对羟基苯乙烯-苯乙烯-二甲基丙烯酸三甘醇酯-N,N-二甲基丙烯酰胺共聚物组成的多孔树脂20珠的固相合成用载体。比较例1进行与实施例1相同的程序，除了使用49g的苯乙烯(WakoPureChemicalIndustries),4g(0.41mmol/g)的对乙酰氧基苯乙烯(Aldrich)和7g(0.49mmol/g)的二乙烯基苯(55%含量，WakoPureChemicalIndustries)作为单体，和使用52g的2-乙基己醇(WakoPureChemicalIndustries)和23g的异辛烷(WakoPureChemicalIndustries),由此获得由对羟基苯乙烯-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物组成的多孔树脂珠的固相合成用载体。(RNA合成和评价)使用实施例l-6和比较例1中所得多孔树脂珠的固相合成用栽体，如下合成RNA和评价。混合1克的各固相合成用栽体、0.095g的DMT-dT-3，-琥珀酸酯(BeijingOMChemicals)、0'045g的HBTU(Novabiochem)、0細ml的N,N-二异丙基乙基胺(Aldrich)和10ml的乙腈(WakoPureChemicalIndustries),并在室温下搅拌该混合物12hr以引起反应。过滤反应产物并用乙腈洗涤，之后干燥载体。将其与2.5ml的CapA(20。/。乙酸酐/800/0乙腈)、2.5ml的CapB(20。/。N-甲基咪唑/30。/o吡啶/50。/o乙腈)、0.025g的4-二甲基氨基吡啶(Aldrich)和5ml的乙腈(WakoPureChemicalIndustries)混合，并在室温下在搅拌下使该混合物反应12hr。过滤反应产物并用乙腈洗涤，之后在减压下干燥载体，以获得DMT-dT-3，-琥珀酸酯结合于其上的固相合成用栽体。经由针对使用对甲苯磺酸/乙腈溶液脱保护的DMT基团的吸光测定(412nm)，计算鍵合的DMT-dT-3，-琥珀酸酯的量。将10mg如此获得的其中DMT-dT-3，-琥珀酸酯结合于其上的固相合成用栽体置于合成柱中，并应用于AppliedBiosystems3400DNA合成仪(AppliedBiosystems)，由此，在l^imol合成规模和去DMT(DMT-off)的条件下，合成核酸(d丁xlmer+rA、rG、rC和rUx21mer的混合序列)。在合成完成之后，对柱进行干燥；之后将核酸从固相合成用载体切掉，对碱基氨基基团进行脱保护，通过过滤分离固相合成用载体。对所得滤液进行UV吸光测定(260nm),测定核酸的OD结果(ODyield)(相当于合成的核酸的量)。接下来，干燥滤液，对所得RNA的2'羟基进行脱保护，并通过HPLC(Waters)来计算全长。/。(具有期望序列长度的RNA的比例)。结果示于表1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由表清楚可知，所有本发明所述多孔树脂珠的固相合成用栽体均比比较例显示更高数值的OD结果(合成的RNA的量)和全长％(合成純度)。工业实用性本发明提供多孔树脂珠，其当在核酸合成中用作固相合成用栽体时，允许实现核酸的大量合成而不降低其合成纯度。本发明所述多孔树脂珠的使用，使得即便是对于难以化学地合成的核酸如RNA，也可以避免合成量的降低和合成纯度的降低。相关申请的交叉引用本申请以在日本提交(提交日2008年06月25日)的专利申请No.2008-165379为基础，其内容通过该引用全部整合于此。引用目录专利文献1:JP-A-3-68593专利文献2:JP-A-2005-325272非专利文献1:CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(2000)权利要求1.多孔树脂珠，包含第一芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。2.权利要求1的多孔树脂珠，其中所述共聚物进一步包含具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团的第二芳香族单乙烯基化合物作为结构单元。3.权利要求1的多孔树脂珠，其中在所述共聚物中所述(甲基)丙烯酰胺衍生物单元的含量是0.3-4mmol/g。4.权利要求2的多孔树脂珠，其中存在于所述第二芳香族单乙烯基化合物中的所述官能团是氨基或羟基。5.权利要求4的多孔树脂珠，其中在所述共聚物中所迷氨基或羟基的含量是0.05-1mmol/g。6.权利要求l的多孔树脂珠，其中所述(曱基)丙烯酰胺衍生物选自由N-烷基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺、N-烷氧基(曱基)丙烯酰胺、2-(甲基)丙烯酰胺链烷磺酸、N-羟烷基(甲基)丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺和丙烯酰基吗啉组成的组。7.权利要求1的多孔树脂珠，其中所述二乙烯基化合物是二乙烯基苯。8.用于制备核酸的方法，包括将核苷酸结合到各自通过可裂解的连接体结合到权利要求l-7任一项的多孔树脂珠上的核苷、核苷酸或多核苷酸上以得到延长的多核苷酸。全文摘要本发明涉及多孔树脂珠和利用其制备核酸的方法。本发明提供含有芳香族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物的多孔树脂珠。优选所述共聚物进一步包含第二芳香族单乙烯基化合物作为结构单元，所述第二芳香族单乙烯基化合物具有能够通过脱水缩合反应结合到羧基的官能团。文档编号C08F212/00GK101613430SQ20091015087公开日2009年12月30日申请日期2009年6月25日优先权日2008年6月25日发明者前田惠里,小西达也,森健二郎申请人:日东电工株式会社