专利名称：利用异相形核剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，特别是利用异相形
核剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法。
背景技术：
文献"Thakur A. S. ， Robin G. ， Guncar G. ， Saunders N. F. W. ， Newman J. ， et al (2007)ImprovedSuccess of Sparse Matrix Protein Crystallization Screening with Heterogeneous Nucleating Agents. PLoS ONE 2(10) :el091. doi :10. 1371/journal, pone. 0001091"公开了一种利用形核剂来提高蛋白质结晶筛选成功率的方法，将玻璃丝、羟 基磷灰石、纤维素、马毛、干藻以及其混合物作为筛选形核剂添加到蛋白溶液中，再将蛋白 溶液与沉淀剂混合，进行蛋白质晶体生长。这种方法可以提高结晶的成功率，但仍然存在不 足，体现在(l)由于先将形核剂与蛋白溶液混合，导致蛋白溶液的量吸取的不准确，(2)蛋 白质筛选成功率提高不明显，如以Hampton公司的96条件筛选试剂Crystal Screen HT作 为筛选条件，六种形核剂使溶菌酶结晶的成功率提高到5. 2%、6. 3%、7. 3%、6. 3%、9. 4%、 9. 4%，过氧化氢酶结晶的成功率提高到5. 2%、6. 3%、5. 2%、7. 3%、6. 3%、9. 4%，竹芋蛋 白结晶的成功率提高到5. 2%、7. 3%、7. 3%、7. 3%、6. 3%、9. 4%。筛选成功率在5. 2% 9. 4%之间。
发明内容
为了克服现有技术生物大分子结晶条件筛选技术结晶成功率低的问题，本发明提 供一种利用异相形核剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，采用无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、及四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球作为 异相形核剂，可以提高生物大分子结晶条件筛选的成功率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为一种利用异相形核剂提高生物大分
子结晶条件筛选成功率的方法，其特点是包括下述步骤 (a)将异相形核剂用超纯水溶解，调节浓度至50mg/ml ; (b)取步骤(a)所述混合溶液1 P l，加入至结晶孔板小孔中，在30°C 6(TC温控 箱中放置2 6小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔板；
(c)配制生物大分子溶液； (d)将筛选试剂滴入步骤(b)得到的异相形核结晶筛选孔板中，将生物大分子溶 液滴入所述结晶筛选孔板中，使筛选试剂与异相形核剂实现界面接触，获得具有异相形核 剂的结晶溶液体系； (e)将步骤(c)得到的结晶溶液体系放置于温控环境中生长，取出在显微镜下观 察，统计获得晶体的条件数目。 所述异相形核剂是无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯
3微球、四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球任一种或任几种。 本发明的有益效果是(l)采用新的异相形核剂，包括无孔聚苯乙烯/二乙烯基 苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球以及它们的混 合物，先制备成异相形核结晶筛选孔板，再将生物大分子溶液以及筛选试剂分别滴入上述 小孔中，可使生物大分子结晶筛选成功率由现有技术的3. 1% 13.5%提高到11.5% 34. 3% ; (2)不需要先将形核剂与生物大分子溶液混合，避免生物大分子溶液与筛选试剂之 间的配比不准确。 下面结合实施例对本发明作详细说明。
具体实施例方式
实施例1 :添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球作为筛选形核剂用于溶菌酶结晶 条件筛选。 第一步将无孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的结晶小孔中，在 6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔板。
第三步将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶 于pH为4. 60， 0. 2M的醋酸钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90 ii 1到母液池，添加0. 5 iil沉淀剂以及0. 5 iil蛋白溶液至结 晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系， 采用气相扩散坐滴法结晶。 第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系 统观察并统计出现溶菌酶晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球的溶菌酶结晶筛选 成功率20. 8%，与文献中添加形核剂得到的溶菌酶结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比有 大幅度提高。 实施例2 :添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球作为筛选形核剂用于溶菌酶结晶 条件筛选。 第一步将有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的结晶小孔中，在 6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔板。
第三步将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶 于pH为4. 60， 0. 2M的醋酸钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90 1到母液池，添加1 y 1沉淀剂以及1 P 1蛋白溶液至结晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系，采用 气相扩散坐滴法结晶。 第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系 统观察并统计出现溶菌酶晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球的溶菌酶结晶筛选 成功率25. 0%，与文献中添加形核剂得到的溶菌酶结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比，有 大幅度提高。 实施例3 :添加四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球作为筛选形核剂用于溶菌酶结晶 条件筛选。 第一步将四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的结晶小孔中，在 6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔板。
第三步将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶 于pH为4. 60， 0. 2M的醋酸钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90iU到母液池，添加1. 5iU沉淀剂以及1. 5iU蛋白溶液至结 晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系， 采用气相扩散坐滴法结晶。 第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系 统观察并统计出现溶菌酶晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球的溶菌酶结晶筛选 成功率20. 8%，与文献中添加形核剂得到的溶菌酶结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比，有 大幅度提高。 实施例4 :添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微 球混合物作为筛选形核剂用于过氧化氢酶结晶条件筛选。 第一步将无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球混 合物用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液liU加入96孔板的结晶小孔中， 在6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔 板。。 第三步将Sigma公司的货号为C40的过氧化氢酶，溶于pH为4. 60， 25mM的HEPES 钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90 1到母液池，添加0. 5 ill沉淀剂以及0. 5 ill蛋白溶液至结 晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系， 采用气相扩散坐滴法结晶。
第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系 统观察并统计出现过氧化氢酶晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球的混合物的过氧化氢酶结晶筛选成功率29. 1%，与文献中添加形核剂得到 的过氧化氢酶结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅度提高。 实施例5 :添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微 球的混合物作为筛选形核剂用于过氧化氢酶结晶条件筛选。 第一步将有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球混 合物用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液liU加入96孔板的结晶小孔中， 在6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔 板。。 第三步将Sigma公司的货号为C40的过氧化氢酶，溶于pH为4. 60， 25mM的HEPES 钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90 ii 1到母液池，添加0. 5 iil沉淀剂以及0. 5 iil蛋白溶液至结 晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系， 采用气相扩散坐滴法结晶。 第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系 统观察并统计出现过氧化氢酶晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三铁/聚 苯乙烯磁性微球混合物的过氧化氢酶结晶筛选成功率27. 1%，与文献中添加形核剂得到的 过氧化氢酶结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅度提高。 实施例6 :添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微 球混合物作为筛选形核剂用于过氧化氢酶结晶条件筛选。 第一步将无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球混 合物用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液liU加入96孔板的结晶小孔中， 在6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔 板。。 第三步将Sigma公司的货号为C40的过氧化氢酶，溶于pH为4. 60，25mM的HEPES 钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90iU到母液池，添加O. 5iU沉淀剂以及0. 5iU蛋白溶液至结 晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系， 采用气相扩散坐滴法结晶。 第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系统观察并统计出现过氧化氢酶晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球与四氧化三铁/聚 苯乙烯磁性微球混合物的过氧化氢酶结晶筛选成功率31.3%，与文献中添加形核剂得到的 过氧化氢酶结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅度提高。 实施例7 :添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球 以及四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球的混合物作为筛选形核剂用于竹芋蛋白结晶条件筛 选。
第一步将无孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球以及
四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球混合物用超纯水分散，并调节浓度为50mg/ml。 第二步用自动取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的结晶小孔中，
在6(TC温控箱中放置3小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔板。。 第三步将Sigma公司的货号为T7638的竹芋蛋白，溶于pH为4. 60， 25mM的HEPES 钠缓冲液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩阵筛选试剂盒的结晶缓冲液 对溶菌酶的结晶条件进行筛选。将第二步处理的异相形核结晶筛选孔板放在自动移液系统 上，系统设置为添加沉淀剂90 ii 1到母液池，添加0. 5 iil沉淀剂以及0. 5 iil蛋白溶液至结 晶小孔中，分别混合并与异相形核剂实现界面接触，获得采用异相形核剂的结晶溶液体系， 采用气相扩散坐滴法结晶。 第五步上述结晶溶液体系在2(TC温控箱中放置96小时后，利用自动显微拍照系 统观察并统计竹芋蛋白晶体的条件数目。 经过统计得到结果如下添加无孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球以及四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球混合物的竹芋蛋白结晶筛选成功率 13. 5%，与文献中添加形核剂得到的竹芋蛋白结晶筛选成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅 度提高。 除上述的实施例外，本发明方法也用于刀豆蛋白A、蛋白酶K以及糜蛋白酶原的结 晶条件筛选，得到的蛋白质结晶筛选成功率也有大幅度提高。
权利要求
一种利用异相形核剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，其特征在于包括以下步骤(a)将异相形核剂用超纯水溶解，调节浓度至50mg/ml；(b)取步骤(a)所述混合溶液1μl，加入至结晶孔板小孔中，在30℃～60℃温控箱中放置2～6小时后取出，使水分蒸发，得到的结晶孔板为异相形核结晶筛选孔板；(c)配制生物大分子溶液；(d)将筛选试剂滴入步骤(b)得到的异相形核结晶筛选孔板中，将生物大分子溶液滴入所述结晶筛选孔板中，使筛选试剂与异相形核剂实现界面接触，获得具有异相形核剂的结晶溶液体系；(e)将步骤(c)得到的结晶溶液体系放置于温控环境中生长，取出在显微镜下观察，统计获得晶体的条件数目。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述异相形核剂是无孔聚苯乙烯/ 二乙 烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球任一种或任 几种。
全文摘要
本发明公开了一种利用异相形核剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，采用无孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球作为异相形核剂，采用蒸发扩散坐滴法结晶。由于采用“无孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、四氧化三铁/聚苯乙烯磁性微球”作为异相形核剂，实现了自动化蛋白质大分子的异相形核，同时，这种方法避免了吸入蛋白量不准确以及避免筛选形核剂引起的自动移液系统堵针现象。蛋白质结晶条件稀疏矩阵筛选成功率由现有技术的3.1％～13.5％提高到11.5％～34.3％。
文档编号C08L25/06GK101748107SQ20091021949
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者刘永明, 尹大川, 王燕, 郭云珠, 马晓亮 申请人:西北工业大学