分子印记聚合物的制作方法

专利名称：分子印记聚合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及设计分子印记聚合物(MIP，molecularly imprinted polymer)的方法，上述聚合物可用于从各种生物工艺原料和废弃物中提取生物活性化合物。本发明进一步涉及通过本发明的方法设计的MIP。
背景技术：
可以将分子印记聚合物(MIP)设计成具有可变水平的交联以产生具有受控刚性或柔性的聚合物(取决于功能要求)，其包含可以设计成对任何目标分析物具有特异性的空腔(结合位点)。利用模板的纯样品，可以制备MIP，其对于模板化合物是特异的或对于具有类似化学结构的其它分子是选择性的。MIP是具有高选择性和特异性的聚合物网络，上述选择性和特异性可以被比喻为抗体对其抗原的选择性和特异性。MIP提供了如下优点， MIP可以增强对温度、极端pH条件、溶剂、蛋白酶、以及降解或变性过程的抗性，其使它们可以成为用于从复杂原料中预浓缩、提取以及分离潜在附加价值生物分子的可再利用材料。强有力的流行病学证据表明水果和蔬菜对心血管病、胃肠道癌、白内障以及其它疾病的健康益处。植物化学物质是对这种效应的主要部分作出贡献的候选物。虽然关于摄取机制、代谢以及在体内这些分子如何施加它们的生物效应的知识是不明确的，但由这些生物活性化合物提供的健康益处是广泛承认和接受的。具有相当大兴趣的一类植物化学物质是多酚，其中白藜芦醇是一个实例。其它有兴趣的类是查耳酮类、吲哚类、香豆素类、黄烷酮类和黄烷醇类、花色素苷类以及植物甾醇类和植物留烷醇类。关于白藜芦醇和它的类似物或植物留醇和它们的类似物，几乎没有发表的文献来检查产生具有所需要的特异性的MIP的方式。存在的文献仅主要强调分离的分析模式。在一种制备分离范围内试图使用所产生的MIP的情况下，并没有试图最优化MIP性能或解决较大规模使用所面临的一些关键挑战。例如，Xiang等1的工作是基于以下想法，非共价分子印记技术不适合于溶解在极性溶剂中的模板，如白藜芦醇，因此必要的是，丙烯酰胺用作单体，而在Ma等2的工作中并没有注意控制衍生MIP的选择性，其结果是，白藜芦醇衍生物、 反式虎杖苷以及大黄素更加有力地结合于MIP，尽管它们的葡糖苷化结构或修饰结构。Cao 等3的工作在很大程度上简单地重新叙述Xiang等1或Ma等2的相同结论，考虑到使用非常类似的方法和相同的一组测试化合物，出现上述情况并不奇怪。因此需要开发特异性MIP， 其已针对特定模板或模板类型进行修改(tailor)和最优化，具有适用于工业型应用的衍生的分子印记聚合物。具体来说，需要制备适宜的MIP，其相容于目前由制造业采用的系统， 允许分离在食品及同类行业中具有商业价值的目标化合物。

发明内容
本发明的发明人利用白藜芦醇作为模板已设计了白藜芦醇选择性MIP (在此文件中描述为MIP 8)。利用白藜芦醇类似物模板，包括白藜芦醇的亚胺类似物(本发明的发明人称作“绿色白藜芦醇”)、以及酰胺类似物，他们还设计了若干其它分子印记聚合物。他们已证明了他们的MIP 8在固相提取技术中的应用，其允许从葡萄籽和花生饼粉提取物选择性富集白藜芦醇。此结果可与借助于现有技术的MIP系统获得的低纯化系数形成对比，如由Ma等2、Xiang等1或Cao等3描述的那些系统。此外，他们已证明了按比例增加分子印记固相技术的能力，从而说明上述过程的可扩展性。在第一方面， 本发明提供了用于制备分子印记聚合物(MIP)的方法，其中分子印记聚合物对于化合物具有所期望水平的特异性，上述方法包括以下步骤在有模板分子和致孔剂(porogen)存在的情况下聚合包含一个或多个非共价键合位点的单体和交联剂，随后除去模板，其中模板在结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的部分，以及其中模板包含一个或多个非共价键合位点，其中所述非共价键合位点互补于单体的非共价键合位点，以及进一步其中模板具有比化合物更多或更少的非共价键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，MIP对于化合物具有不同水平的特异性。在一种实施方式中，本发明提供了用于制备分子印记聚合物(MIP)的方法，其中分子印记聚合物对于化合物具有所期望水平的特异性，上述方法包括以下步骤在有模板和致孔剂存在的情况下聚合包含一个或多个氢键合位点的单体和交联剂，随后除去模板， 其中模板在结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的部分，以及其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点，以及进一步其中模板具有比化合物更多或更少的氢键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比MIP对于化合物具有不同水平的特异性。在第二方面，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)的单体的选择的方法，其中分子印记聚合物将印记有(imprinted with)包含一个或多个非共价键合位点的模板，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤提供一组具有一个或多个非共价键合位点的单体， 其中非共价键合位点互补于模板的非共价键合位点，评估在单体组的每种单体和模板之间形成的复合物的生成能，以及利用复合物的生成能作为选择因素以从若干单体来选择所选单体。在一种实施方式中，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)的单体的选择的方法，其中分子印记聚合物将印记有包含一个或多个氢键合位点的模板，其中MIP 是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂以及随后除去模板来制备， 所述方法包括以下步骤提供一组具有一个或多个氢键合位点的单体，其中氢键合位点互补于模板的氢键合位点，评估在单体组的每种单体和模板之间形成的氢键合复合物的生成能，以及利用氢键合复合物的生成能作为选择因素以从若干单体选择所选单体。在第三方面，本发明提供了用于在分子印记聚合物(MIP)的制备中选择单体与模板的比率的方法，其中分子印记聚合物将印记有模板，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤评估在模板和不同数目的单体之间形成的复合物的生成能，以及利用复合物的生成能作为选择因素来选择单体与模板的比率。在第四方面，提供了一种用于制备MIP的预聚合复合物，其包含一种或多种单体以及一种模板，该些单体各自包含一个或多个非共价键合位点，其中模板包含互补于单体的一个或多个非共价键合位点的一个或多个非共价键合位点。在一种实施方式中，提供了一种用于制备MIP的预聚合氢键合复合物，其包含一种或多种单体以及一种模板，该些单体各自包含一个或多个氢键合位点，其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点。在第五方面，提供了按照第一方面的方法制备的MIP。在一种实施方式中，通过第二方面的方法来选择包含一个或多个非共价键合位点的单体。在第六方面，提供了通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板而制备的MIP，其中通过第二方面的方法来引导单体的选择或通过第三方面的方法来选择单体与模板的比率。在第七方面，提供了用于设计包含反式乙烯接头的化合物的类似物的方法，该方法包括用亚胺、酰胺或仲胺接头替代反式乙烯接头。优选地，用亚胺接头替代反式乙烯接头。亚胺接头结构上等效于乙烯接头，但合成
要简单得多。在第八方面，提供了用于制备MIP的方法，其中MIP对于具有反式乙烯接头的化合物具有特异性，上述方法包括以下步骤在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板，其中模板是化合物的类似物。在第九方面，本发明提供了印记有多酚或其类似物的分子印记聚合物(MIP)，其中 MIP包含聚合的4-乙烯基吡啶以及聚合的交联剂。在第十方面，本发明提供了用于制备按照第九方面的MIP的方法，所述方法包括以下步骤(i)在有多酚或其类似物以及致孔剂存在的情况下聚合MIP ；以及(ii)从MIP除去多酚或其类似物。在第十一方面，本发明提供了用于从样品提取一种或多种多酚的方法，其中通过将样品暴露于按照第一方面的MIP。在一种优选形式中，样品是基于植物，以及源自食物如葡萄和它们的种子、外皮、 以及果汁(和葡萄酒)，苹果、梨、浆果、以及其它水果，茶叶、花生(或花生饼粉)，以及谷物如小麦、玉米、稻米和它们的油，以及它们的副产物。在一种实施方式中，MIP被包封(encase，包围)在可渗透网(mesh)中。在第十二方面，本发明提供了用于通过层析法至少部分分离样品成分的方法，该方法包括以下步骤(i)制备包含按照第一方面的MIP的层析柱；(ii)使样品通过上述柱； 以及(iii)从上述柱收集样品的流分。在第十三方面，本发明提供了印记有一种或多种化合物的MIP，上述化合物选自由甾醇和留烷醇、以及它们的类似物或衍生物组成的组，其中所述MIP包含聚合单体。优选地，衍生物是多酚酯如阿魏酸酯或没食子酸酯。多酚提供氢键合和π-π键
6合位点。在第十四方面，本发明提供了用于制备按照第十三方面的MIP的方法，所述方法包括以下步骤(i)在有留醇或留烷醇、或它们的类似物或衍生物存在的情况下聚合MIP和致孔剂；以及(ii)从MIP中除去甾醇或甾烷醇、或它们的类似物或衍生物。在第十五方面，本发明提供了用于从样品提取一种或多种留醇或留烷醇、或它们的类似物或衍生物的方法，其中通过将样品暴露于按照第十三方面的MIP。在一种实施方式中，MIP被包住在可渗透网中。在第十六方面，本发明提供了通过层析法来至少部分分离样品成分的方法，该方法包括以下步骤(i)制备包含按照第十三方面的MIP的层析柱；(ii)使样品通过上述柱； 以及(iii)从上述柱收集样品的流分。在研究本发明的功能聚合物的过程中，本发明的发明人已制备了若干新颖和创造性的化合物。本发明的第十七方面涉及这些新颖化合物。在第十八方面，提供了用于至少部分分离样品的成分的方法，其中上述样品包含两种或更多种所述成分，所述方法包括将样品顺序地暴露于至少两种MIP，其中每种MIP已印记有不同的模板。在第十九方面，提供了包封在可渗透网中的MIP。在第二十方面，提供了用于从样品提取成分的方法，该方法包括将样品暴露于按照第十九方面的MIP。在第二十一方面，提供了一种印记有(E)-5_[(4-羟基-苯基亚氨基)_甲基]-苯-1，3- 二醇或3，5- 二羟基-N- (4-羟苯基)苯甲酰胺的MIP。在第二十二方面，提供了用于从样品提取白藜芦醇的方法，所述方法包括将样品暴露于按照第二十一方面的MIP。


图1.白藜芦醇-3-0-β-D-葡糖苷酸的结构。图2.生产用于形成“共价”MIP的(Ε)-544-(甲基丙烯酰氧基)苯乙烯基)_1， 3-亚苯基二甲基丙烯酸脂)。图3.白藜芦醇的结构(3Α)以及利用ΡΜ3计算显示电子特性和可能的相互作用位点获得的白藜芦醇表面的计算机生成的模型(3Β)。图4.分子模拟滴定结果，其示出在白藜芦醇和4VP簇之间的估计的相互作用能， 其中使用ΡΜ3几何形状优化计算，其示出在三当量(eq)4VP处的一个不同的最低值。图5.白藜芦醇复合物的空间填充图像，其中三个4VP单元通过每个芪羟基和吡啶基氮首基相互作用。计算并没有考虑到溶剂，所以应当仅用作引导。图6.对于在白藜芦醇和功能单体丙烯酰胺(AAM)(图6A)以及4_乙烯基苯甲酸 (4VBA)(图6B)之间的复合物的估计的净相互作用能(AEf)的模拟滴定数据，其中采用半经验计算并利用PM3力场。除此以外，还示出50mg聚合物在0. 5mM白藜芦醇乙腈溶液中的静态结合数据(图6C和6D)。
图7.在添加增加的摩尔当量(equivalents)的功能单体4VP以后，白藜芦醇的芳族-OH移动的低磁场移动。表明，正形成预聚合复合物，其可能通过与吡啶基N基团的H键合相互作用。图8.聚合物MIP UMIP 2、MIP 3和MIP 4以及相应NIP的重新结合数据，其示出来自白藜芦醇乙腈溶液(0.05mM)的白藜芦醇亲和力。图9.在使用0. 5mM白藜芦醇乙腈溶液的结合测定中，与聚合物MIP UMIP 2、MIP 3、MIP 4, NIP 1以及NIP 2的白藜芦醇结合亲和力。图 10.用以下 T FM XL 比率1 3 15 (MIP 8)、1 3 17 (MIP 10)、 1:3: 20 (MIP 9)、1 3 30 (MIP 2)以及 1 3 40 (MIP 5)制备的 MIP 以及它们的
各自的NIP对照材料的静态重新结合数据。图 11.多个 MIP 8 批次 A-J (LS3-37p84-17-4_08a-j)、K (LS3-26p62-l-4_08a)、 L(LS3-26p62-l-4-08b)以及M(ls2-6pl0-7-2-07)的静态结合数据，其示出在乙腈中MIP生
产和结合性能的再现性。重复进行所有测量。图12.在静态条件下在CAN中高达5mM的白藜芦醇浓度范围内，与MIP 8 (30mg) 的白藜芦醇结合能力。利用悬浮混合器并以大约40rpm，混合样品过夜(18小时)。然后离心样品，并通过HPLC来分析等份的上层清液以确定游离白藜芦醇浓度。图13.在静态条件下并在没有竞争的情况下，MIP 8对于在乙腈中的各种白藜芦醇类似物(0.5mM)的交叉反应性结合数据。图14.静态结合数据，其比较在白藜芦醇印记聚合物(MIP 8)和用白藜芦醇类似物模板化MIP之间的白藜芦醇亲和力。图15.来自MISPE结合测定的结果，其比较了在借助于用乙腈充分洗涤来除去非特异性结合以后并在动态SPE条件下交联量的影响以及在致孔剂(MIPe)中乙醇的影响。图16.在用A)装载溶液以及B)水中的2X20% (ν/ν)乙醇洗涤以后，在水性条件下，白藜芦醇(0. 5mM)与结合的白藜芦醇&111016/^聚合物)的MISPE结合。图17.在水性条件下，乙醇和水含量对白藜芦醇的保留/结合的影响。利用分别在20、50以及80%乙醇(ν/ν)中的白藜芦醇溶液(0. 5mM)，评估了与MIP 8的结合。所示数据是指在A)装载和B)洗涤物，其包含ImL装载溶液(即，20、50以及80%乙醇)，以及三个50%含水乙醇(ν/ν)的连续洗涤物以后，结合的初始白藜芦醇溶液的百分比。图18.说明，MIP 8能够从复杂原料浓缩白藜芦醇，其中复杂原料包含相对于可获得的结合位点的多种潜在竞争物。示意图Α)示出锥形(spiked)葡萄籽提取物的HPLC 示踪，其中提取物包含遮蔽白藜芦醇的大量未知物质；B)示出在施加白藜芦醇标准溶液 (0. 5mM)以后洗脱的白藜芦醇(RT 2. 735分钟)；C)示出在施加尖刺葡萄籽提取物以后洗脱自MISPE柱的白藜芦醇(RT 2. 735分钟)以及D)示出在尖刺葡萄籽施加于各自的NISPE 柱以后的结果导致在2. 735分钟处没有可观测峰，这表明没有保留白藜芦醇。图19.在利用非印记对照聚合物(NIP)作为固定相进行SPE处理以后，㈧未处理花生饼粉、(B)MISPE处理花生饼粉以及(C)花生饼粉提取物的色谱图。图20.在利用非印记对照聚合物(NIP)作为固定相进行SPE处理以后的色谱图 A)未处理花生饼粉，其中白藜芦醇浓度为大约0. 98yg/mL花生饼粉提取物，B)MISPE处理花生饼粉，其导致白藜芦醇浓度为大约19. 5 μ g/mL,以及C)花生饼粉提取物。
图21.胆固醇和常见的植物留醇β-谷留醇、豆留醇、菜油留醇和菜子留醇以及植物甾烷醇谷甾烷醇和菜油甾烷醇的化学结构。图22.存在于Y-谷维素(oryzanol)中的主要成分的化学结构。图23·ΜΙΡ19(黑色)和NIP19(灰色)(Ch:4_VP:交联剂)的性能。图M.MIP20(黑色)和NIP20(灰色)(Ch:MMA:交联剂)的性能。图25·ΜΙΡ20(黑色)和ΝΙΡ20 (灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。图沈』1 19(黑色)和ΝΙΡ19(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。图27.ΜΙΡ22(黑色)和ΝΙΡ22 (灰色)的性能，其中使用豆留醇作为再结合分子。图观』1 21(黑色)和ΝΙΡ21(灰色)的性能，其中使用豆甾醇作为再结合分子。图29. ΜΙΡ21 (黑色)和ΝΙΡ21 (灰色)的性能，其中使用胆固醇作为再结合分子。图30.ΜΙΡ20(黑色)和ΝΙΡ20 (灰色)的性能，其中使用胆固醇作为再结合模板以及2个循环的再结合。图31.植物甾醇转化成相应的阿魏酸酯。图32. ΜΙΡ23 (黑色)和ΝΙΡ23 (灰色)的性能，其中使用胆固醇阿魏酸酯作为再结合模板G-VP作为功能单体)。图33. ΜΙΡ24 (黑色)和NIPM (灰色)的性能，其中使用胆固醇阿魏酸酯作为再结合模板(甲基丙烯酸作为功能单体)。图34.共价聚合物(1 10 (FM EDGMA) :MIP7)(黑色)和ΝΙΡ7 (灰色)的性能。图35.混杂聚合物MIP 26 (黑色)和NIP 26 (灰色)的性能，其中使用胆固醇作为再结个底物(先前描述的)。图36.相对于功能单体的(E)-白藜芦醇的模拟滴定数据4-乙烯基吡啶0VP， ·)、丙烯酰胺(AAM，^)、甲基丙烯酸(MAA，·)、甲基丙烯酸甲酯(MMA，+)以及苯乙烯 (Sty, Δ )，其示出对于1-6当量的单体的预测Ei值。图37. (A)静态结合等温线，多批次，(E)-白藜芦醇和多批次Pl的结合。测量结果是基于重复测量，最少重复3次。误差条线表示标准平均误差(SEM)。(B)MIP对于(E)-白藜芦醇的选择性能力插图示出在&壯(^虹(1(34)方式中的结合数据。图38.在静态条件下，印记和非印记聚合物与(E)-白藜芦醇的结合性能。图39.来自单一分析物测定的静态结合，其示出MIP Pl (黑色)和NIP对照附(灰色)对于(E)-白藜芦醇1和7种多羟基二苯乙烯结构类似物的结合分析物的量/克聚合物。图40.烯烃1、酰胺2、以及亚胺3，与MIPkes的单一分析物选择基结合。图41.通过MIPKES、MIP_以及MIPws来识别￠)-白藜芦醇。图42.MIPKES与(E)-白藜芦醇的相对结合能力。将(E)-白藜芦醇标准溶液 (0. 5ymol)加载到 MIPkes (IOOmg)，分别在乙腈(黑色)或 Et0H/H20(l 1，ν/ν)(灰色) 中。随后利用装载溶剂洗涤每个柱并依据5点校正曲线确定留在柱上的(E)-白藜芦醇量。图43.花生饼粉提取物和MISPE洗脱液的RP-HPLC色谱图未处理花生饼粉提取物(前线)、来自MIPkes MISPE柱的洗脱液(中线)以及来自NISPE柱的洗脱液(背线)。 在321nm处获得色谱图。在= 12. 2分钟处洗脱(E)-白藜芦醇。图44. (A) (E)-白藜芦醇结合于MIPgffi的静态结合等温线；
9(B)MIPstis(A)和MIPkes(^)对于(E)-白藜芦醇的选择性亲和力的比较，表示为选择性 (MIP-NIP)。图45. MIPees, MIPgffi以及它们的各自的NIP对照聚合物对于(E)-白藜芦醇1、3， 5-二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺2、儿茶素3以及(E)-云杉新甙4的交叉反应性研究。图46.使用K0H/H20(8 2v/v)作为流动相溶剂B的RP-HPLC色谱图，其中UV-Vis 检测是在321nm处㈧花生饼粉提取物以及来自(B)MIPKES、(C)MIPgffi以及(D)NIPkes对照柱的洗脱液。在艮=12. 2分钟处洗脱(E)-白藜芦醇。通过LC-ESI-MS来证实(E)-白藜芦醇的鉴别。图47.示意性示出对获自复杂食物来源的提取物进行相继MISPE处理的构想，从而多种生物活性成分可以分离自单一来源。图48. RP-HPLC色谱图(A)在K0H/H20(1 lv/v)中的花生饼粉提取物 (10g/500mL)以及由(B)MIPkes然后由((鴻^^^捕获的分子的酸洗脱。通过在λ = 321nm 处的UV-Vis检测来获得色谱图。在= 17分钟处洗脱(E)-白藜芦醇。图49. RP-HPLC色谱图㈧白藜芦醇耗尽的花生饼粉提取物，获自第一轮MISPE 处理以及由(B)MIPkes然后由(C)MIPgtis捕获的分子的酸洗脱。通过在λ =321nm处的 UV-Vis检测来获得色谱图。在= 15分钟处进行A型原花青素洗脱。图50.示意性示出用于从供料提取物分离多种目标化合物的相继SPE方式MIP柱的构造。所有不想要的物质通过每个MIP柱并留下结合于它们的相自的MISPE柱的多种目标物质，然后可以对其洗脱以各自产生高纯度的各自的目标化合物。
具体实施例方式MIP的形成通常包括以下步骤将模板和单体(通常过量)混合在一起以形成预聚合复合物，其包含伴随有若干单体分子的单模板；然后通过借助于交联剂来聚合单体以将预聚合复合物交联成聚合物；以及随后从交联复合物除去模板。复合物的交联单体包含表面和空腔，其互补于模板的形状。通常在有致孔剂存在的情况下进行交联反应，其中致孔剂确保MIP具有包含若干孔的开放式结构。这些孔便于溶液的分子移动通过MIP以致分子能够相互作用于表面和空腔。具有和模板相同或类似形状的分析物将比溶液中的其它分子更加有力地相互作用于MIP，以致MIP可以用来捕获、浓缩和/或分离分析物。可以采用各种不同类型的制备方法，例如，(a)整体型制备、(b)通过研磨和筛分制备的颗粒、(c)沉淀聚合过程。本发明的发明人已合成了一系列基于白藜芦醇的化合物以产生化合物库，其可以存在于粗生物工艺原料中，以及其已用作模板来产生和研究MIP，其作为源自植物和其它生物来源的生物活性物质的特制的亲和吸附剂。可以合成所有这些分子以加入可变的功能特性(基于疏水性、亲水性以及其它物理化学参数)，从而产生具有限定物质组成的分子。可以设计、合成以及衍生这些化合物，使其具有各种不同的功能，从而包括(除了别的以外) 分布在各自的脚手架上的各种点的氨基、羧基、羟基、烷基或芳基取代基，进而产生化合物类似物的子集，其可以用作用于MIP的设计和表征的模板。可以基于立体效应和电子方面的考虑来选择这些功能。具有增加数目的极性官能团或“点”的化合物更有可能有益于探测和限定所产生的MIP空腔。在MIP模板化过程中，增加可用于相互作用于功能单体分子的点的数目会潜在地增加为任何限定模板形成的空腔的特异性。作为本发明的方法的一般性的说明，本发明的发明人还已说明了，当和甾醇或甾烷醇本身相比时，用多酚酸，如没食子酸和阿魏酸，酯化的留醇和留烷醇可以用作具有另外 “点”的模板。如本领域技术人员将明了的，所使用的技术适用于不同于白藜芦醇(甾醇和甾烷醇)的分子。因此，在第一方面，本发明提供了用于制备对于化合物具有所期望水平的特异性的分子印记聚合物(MIP)的方法，该方法包括以下步骤在有模板和致孔剂存在的情况下聚合包含一个或多个非共价键合位点的单体和交联剂，以及随后除去模板，其中模板结构上类似于上述化合物或包括结构上类似于上述化合物的部分，以及其中模板包含一个或多个非共价键合位点，其中所述非共价键合位点互补于单体的非共价键合位点，以及进一步其中模板具有比上述化合物更多或更少的非共价键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，对于上述化合物，MIP具有不同水平的特异性。术语‘非共价键合位点’是指能够非共价键合相互作用的分子的基团或区域。非共价键合相互作用的实例包括氢键合相互作用、η-η键合相互作用、李斯特(Lifshitz)力相互作用以及范德华相互作用。优选地，非共价键合位点是氢键合位点或π-π键合相互作用位点。更优选地，非共价键合位点是氢键合位点。术语“互补的”是指在模板上的位点能够经由非共价键合相互作用结合于在单体上的位点，以及反过来也一样。在模板包含结构上类似于化合物的一部分的情况下，非共价键合位点可以位于 (i)上述部分上，(ii)模板的其余部分上，或(iii)如果存在两个或更多非共价键合位点， 则位于上述部分上和模板的其余部分上。例如，如将在实施例中看到的，本发明的发明人已使用甾醇和甾烷醇的阿魏酸酯来制备根据本发明的MIP。这些化合物包含结构上类似于留醇或留烷醇的部分(即留醇或甾烷醇本身)，并且分子的其余部分提供非共价键合位点。阿魏酸部分提供两个氢键合位点和π-ji键合相互作用位点。在一种实施方式中，本发明提供了用于制备对于化合物具有所期望水平的特异性的分子印记聚合物(MIP)的方法，该方法包括以下步骤在有模板和致孔剂存在的情况下聚合包含一个或多个氢键合位点的单体和交联剂，以及随后除去模板，其中模板结构上类似于上述化合物或包含结构上类似于上述化合物的一部分，以及其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点，以及进一步其中模板具有比上述化合物更多或更少的氢键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，对于上述化合物， MIP具有不同水平的特异性。在一种实施方式中，模板的氢键合位点是酚式羟基基团。在另一种实施方式中，单体的氢键合位点是吡啶氮。在一种优选形式中，模板进一步包含一个或多个π-Ji键合相互作用位点以及单体进一步包含一个或多个互补的^I-JI键合相互作用位点。在一种实施方式中，模板的π-Ji键合相互作用位点是酚的芳环。在另一种实施方式中，单体的π-π键合相互作用位点是吡啶的芳环。本发明的发明人已发现，利用模板形成的MIP，其中上述模板结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的部分以及进一步其中模板包含比化合物更多的氢键合位点， 与如果将化合物本身用作模板相比，将倾向于对化合物(以及对具有非常密切相关结构的化合物)更具特异性。这是由于在模板上的另外的氢键合位点将会将更多单体单元吸引到预聚合复合物，以致通过模板形成的空腔将更紧密地符合模板，因而也更紧密地符合化合物，并在偶然空腔的打开使得模板的一个结合位点在聚合物中没有互补的结合位点的情况下补偿潜在结合位点的缺失。因此，在一种实施方式中，模板具有比化合物更多的氢键合位点，从而与如果化合物本身用作模板相比，对于化合物，MIP具有更高水平的特异性。另外，如果利用模板来形成MIP，其中模板结构上类似于化合物或包含结构上类似于化合物的一部分，以及模板包含比化合物更少的氢键合位点，那么与如果将化合物本身用作模板相比，MIP将倾向于对于化合物是较少特异的。虽然MIP对于化合物本身是较少特异的，但它对于化合物将仍然具有一定程度的特异性，从而同样用于具有一些结构相似性的化合物。这提供了一种方式，用于从复杂原料提取可能有用的化合物的类。必要时，包含上述化合物类的提取混合物可以经受进一步的纯化技术，如用更具选择性的MIP进行提取，以分离子类或单独的分子。因此，在另一种实施方式中，模板具有比化合物更少的氢键合位点，从而与如果将化合物本身用作模板相比，对于化合物，MIP具有更低水平的特异性。如本领域技术人员将明了的，本发明的方法便于形成MIP，其对于没有或具有很少氢键合位点的化合物显示改善水平的特异性，其中通过使用适当选择的确实具有更多氢键合位点的结构类似化合物作为模板。这提供了一种有用的方式来分离否则难以从复杂混合物提取的化合物。就相对丰度而言，在食物、精细化工和制药行业内的大多数作为高价值产物的感兴趣的化合物有可能包含至少一个氢键合位点。一些污染物，尤其是有毒或有害化合物，如多环芳族化合物，有可能属于那些缺乏氢键合位点的家族，因此在有些情况下必须开发分子间相互作用的其它方式。如本领域技术人员将明了的，氢键合的方式同样适用于其它类型的非共价键合并可以用来设计对于化合物如多环烃具有选择性的MIP。在第二方面，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)(其将印记有包含一个或多个非共价键合位点的模板)的单体的选择的方法，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂并随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤提供一组具有一个或多个非共价键合位点的单体，其中非共价键合位点互补于模板的非共价键合位点；评估在单体组的每种单体和模板之间形成的复合物的生成能；以及利用复合物的生成能作为选择因素来从若干单体选择所选单体。分子印记聚合物(MIP)的设计需要选择将有利地相互作用于所期望的模板物质的单体物质，以致在模板和单体之间形成预聚合复合物。工具的使用，如预聚合复合物的分子模拟和NMR光谱，便于选择适当的单体，其中通过进行'虚拟屏幕'，其可以减少为实现最优化MIP开发所需要的实际聚合物制备的数目。在一种实施方式中，本发明提供了用于引导用于分子印记聚合物(MIP)的单体的选择的方法，上述分子印记聚合物将印记有包含一个或多个氢键合位点的模板，其中MIP 是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂以及随后除去模板来制备， 所述方法包括以下步骤提供一组具有一个或多个氢键合位点的单体，其中上述氢键合位点互补于模板的氢键合位点；评估在单体组的每种单体和模板之间形成的氢键合复合物的生成能；以及利用氢键合复合物的生成能作为选择因素以从若干单体来选择所选单体。在第三方面，本发明提供了用于在将印记有模板的分子印记聚合物(MIP)的制备中选择单体与模板的比率的方法，其中MIP是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板来制备，所述方法包括以下步骤评估在模板和不同数目的单体之间形成的复合物的生成能；以及利用复合物的生成能作为选择因素来选择单体与模板的比率。在第二和第三方面的一种优选形式中，通过分子模拟技术来评估复合物的生成能。例如，PM3几何优化可以用来产生复合物的理论生成能值。在第二和第三方面的另一种优选形式中，通过NMR光谱技术来评估生成能。例如， 在酚式羟基基团的情况下，上述基团的1H NMR信号的低磁场移动的大小反映了氢键合相互作用的强度。通常，低磁场移动将是约0. 5至约1. 5ppm，虽然，如本领域技术人员将明了的， NMR溶剂的选择将是确定移动大小的重要因素。在第四方面，提供了用于制备MIP的预聚合复合物，其包含一种或多种单体，各自包含一个或多个非共价键合位点，以及模板，其中模板包含互补于单体的一个或多个非共价键合位点的一个或多个非共价键合位点。在一种优选形式中，通过按照第二方面的方法来选择单体。在另一种优选形式中，通过第三方面的方法来选择单体与模板的比率。在一种实施方式中，提供了用于制备MIP的预聚合氢键合复合物，其包含一种或多种单体，各自包含一个或多个氢键合位点，以及模板，其中模板包含互补于单体的一个或多个氢键合位点的一个或多个氢键合位点。在第五方面，提供了按照第一方面的方法制备的MIP。在一种实施方式中，通过第二方面的方法来选择包含一个或多个非共价键合位点的单体。在第六方面，提供了一种MIP，其是通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去模板来制备，其中通过第二方面的方法来引导单体的选择或通过第三方面的方法来选择单体与模板的比率。在本发明的方法和MIP中所使用的单体包括那些促进或便于氢键合相互作用和/ 或JI-JI键合相互作用的单体并且包括其中R选自由Ch烷基、酰胺、腈、羧酸、伯胺或仲胺、CO2Cy烷基、CyOH、丙烯酸羟烷基酯、苯、苄胺、萘、蒽、吡啶、嘧啶、嘌呤、N-咪唑组成的组；以及
权利要求
1.一种用于制备对于化合物具有所期望水平的特异性的分子印记聚合物(MIP)的方法，所述方法包括以下步骤在有模板和致孔剂存在的条件下聚合包含一个或多个非共价键合位点的单体和交联剂，以及随后除去所述模板，其中所述模板结构上类似于所述化合物或包含结构上类似于所述化合物的部分，以及其中所述模板包含一个或多个非共价键合位点，其中所述非共价键合位点互补于所述单体的非共价键合位点，以及进一步其中所述模板具有比所述化合物更多或更少的非共价键合位点，从而与如果将所述化合物本身用作所述模板相比，所述MIP对于所述化合物具有不同水平的特异性。
2.一种引导用在分子印记聚合物(MIP)中的单体的选择的方法，所述分子印记聚合物将印记有包含一个或多个非共价键合位点的模板，其中所述MIP将如下制备通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合所选单体和交联剂，并随后除去所述模板，所述方法包括以下步骤提供一组具有一个或非共价键合位点的单体，所述非共价键合位点互补于所述模板的非共价键合位点，评估在所述单体组的每种单体和所述模板之间形成的复合物的生成能，以及利用所述复合物的所述生成能作为在所述选择中的一个因素来从若干所述单体中选择所选单体。
3.一种用于在分子印记聚合物(MIP)的制备中选择单体与模板的比率的方法，其中所述分子印记聚合物将印记有所述模板，其中所述MIP将如下制备通过在有所述模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂，以及随后除去所述模板，所述方法包括以下步骤评估在所述模板和不同数目的所述单体之间形成的复合物的生成能，以及利用所述复合物的所述生成能作为在所述选择中的一个因素来选择单体与模板的比率。
4.一种用于制备MIP的预聚合复合物，包含各自包含一个或多个非共价键合位点的一种或多种单体以及模板，其中所述模板包含与所述单体的一个或多个非共价键合位点互补的一个或多个非共价键合位点。
5.一种根据权利要求1所述的方法制备的MIP。
6.一种通过在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂以及随后除去所述模板来制备的MIP，其中所述单体的选择是通过权利要求2所述的方法来引导的。
7.一种用于设计包含反式乙烯接头的化合物的类似物的方法，所述方法包括用亚胺、 酰胺或仲胺接头替代所述反式乙烯接头。
8.一种用于制备对于具有反式乙烯接头的化合物具有特异性的MIP的方法，所述方法包括以下步骤在有模板和致孔剂存在的情况下聚合单体和交联剂，并随后除去所述模板， 其中所述模板是所述化合物的类似物，以及进一步其中所述类似物是根据权利要求7所述的方法进行设计的。
9.一种印记有多酚或其类似物的分子印记聚合物(MIP)，其中，所述MIP包含聚合的 4-乙烯基吡啶以及聚合的交联剂。
10.一种用于制备根据权利要求9所述的MIP的方法，所述方法包括以下步骤(i)在有所述多酚或其类似物以及致孔剂存在的情况下聚合所述MIP ；以及( )从所述MIP中除去所述多酚或其类似物。
11.一种用于通过将样品暴露于根据权利要求1所述的MIP以从所述样品中提取一种或多种多酚的方法。
12.一种用于通过层析法至少部分地分离样品的成分的方法，所述方法包括以下步骤(i)制备包含根据权利要求1所述的MIP的层析柱；(ii)使所述样品通过所述柱；以及 (iii)从所述柱中收集所述样品的流分。
13.一种用一种或多种化合物印记的MIP，所述化合物选自由留醇和留烷醇、以及它们的类似物或衍生物组成的组，其中所述MIP包含聚合的单体。
14.一种用于制备根据权利要求13所述的MIP的方法，所述方法包括以下步骤(i)在有所述留醇或留烷醇、或它们的类似物或衍生物、以及致孔剂存在的情况下，聚合所述MIP;以及( )从所述MIP中除去所述留醇或留烷醇、或它们的类似物或衍生物。
15.一种通过将样品暴露于根据权利要求13所述的MIP而从所述样品中提取一种或多种甾醇或留烷醇、或它们的类似物或衍生物的方法。
16.一种通过层析法至少部分地分离样品的成分的方法，所述方法包括以下步骤(i) 制备包含根据权利要求13所述的MIP的层析柱；(ii)使所述样品通过所述柱；以及(iii) 从所述柱中收集所述样品的流分。
17.—种如本文描述的新型化合物。
18.—种至少部分地分离包含两种或更多种成分的样品中的所述成分的方法，所述方法包括将所述样品顺序地暴露于至少两种MIP，其中每种MIP已印记有不同的模板。
19.一种包封在可渗透网中的MIP。
20.一种用于从样品中提取成分的方法，包括将所述样品暴露于根据权利要求19所述的 MIP。
21.—种印记有(E)-5-[(4-羟基-苯基亚氨基)-甲基]-苯-1，3-二醇或3，5_ 二羟基-N-(4-羟苯基)苯甲酰胺的MIP，其中所述MIP包含聚合的单体。
22.一种用于从样品中提取白藜芦醇的方法，所述方法包括将所述样品暴露于根据权利要求21所述的MIP。
全文摘要
本发明提供了用于设计分子印记聚合物(MIP)的方法，上述分子印记聚合物可用于从各种生物工艺原料和废弃物中提取生物活性化合物。本发明进一步涉及通过本发明的方法设计的MIP。
文档编号C08F26/06GK102369223SQ201080014560
公开日2012年3月7日 申请日期2010年1月29日 优先权日2009年1月29日
发明者亚米尔·乔杜里, 克利·路易斯·图克, 史蒂文·朗福德, 巴西尔·达尼勒克, 拉赫兰·施瓦茨, 米尔顿·T·W·赫尔恩, 维多利亚·塔玛拉·佩克约诺克, 西蒙·哈里斯, 赖因哈德·英厄马尔·博伊森 申请人:国家科学和工业研究组织, 莫纳什大学