专利名称：一种手性天冬氨酸拆分方法
技术领域：
本发明属于分子表面印迹技术领域，特别涉及一种手性拆分氨基酸对映体的印迹材料制备技术及其用于天冬氨酸外消旋体的分离工艺。
背景技术：
构成生命体的基本物质，如蛋白质、酶、抗体、激素、核苷酸、多糖等，几乎都毫无例外地具有手性，手性识别是生命过程的基本属性之一。氨基酸是组成蛋白质的基本单元，且存在于生命体内的游离态氨基酸，在有机体的代谢与机能调节中也发挥着很重要的作用。 在生命体内高度不对称的环境中，氨基酸两种对映体的生理作用是迥然不同的。具有生物活性的天然氨基酸均为L-型，而化学合成制备的氨基酸则一般为DL-型的外消旋体。显然， 在生命科学研究领域，氨基酸对映体的拆分具有十分重要的科学意义；另一方面，氨基酸在药物合成(手性药物前驱体的合成)、食品与饲料工业、日用化工品等领域中应用正在快速发展，对化学合成的氨基酸进行手性拆分，制备光学纯的氨基酸又具有重要的应用价值。目前，氨基酸对映体分离虽然已有一些方法，比如结晶法(经典法)、酶法、化学拆分法、膜分离法以及色谱法(包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE) 法及手性配基交换色谱(CLCE))等法。但前面几种非色谱方法，有的适用范围窄；有的步骤繁多、处理效率低；有的则成本高，放大过程成本昂贵；而各种色谱法，虽然分离效率高及选择性好(尤其是CLCE法)，但都局限于分析化学领域(以分离分析为目标)，难以达到工业化规模的拆分过程。因此，在氨基酸对映体的拆分方面，尽管人们做了大量的努力，但是在实现低成本、高效的规模化分离等方面依然存在着很大困难。因此，设计与发展识别选择性高、效率高、成本低的新型拆分方法，是一项极具挑战性的科技难题。如果能制备选择性地结合氨基酸的某一对映体的固体吸附剂，即可通过固相萃取，实现规模化的氨基酸对映体的高效拆分，但迄今为止，具有此性能的固体吸附剂是难以寻找的。分子印迹聚合物(MIPs)是被精心裁制的一类功能聚合物材料，其内部分布有大量模板分子的印迹空穴，这些空穴与模板分子在尺寸大小、空间结构、结合位点等方面高度地相匹配，使得分子印迹聚合物对模板分子具有特异的识别选择性与优良的结合亲和性， 被人们称为人工抗体或人工接受器。目前，分子印迹聚合物已被广泛地用于各种高科技领域，尤其在物质的分离、纯化与富集浓缩领域，以分子印迹聚合物为固体吸附剂的分子印迹固相萃取法(MISPE)应运而生，得到了广泛的应用。在手性氨基酸的拆分领域，虽然分子印迹聚合物也受到了很大关注，已有较多研究，但在这方面存在两个明显的局限制备印迹聚合物的方法大多为传统方法(包埋法)，该方法具有若干明显的缺点，所制得的印迹聚合物的性能较差；目前印迹聚合物大多只用作为色谱固定相，用来研究氨基酸对映体的(分离) 分析，其性能还远达不到固相萃取剂的水平，无法用于氨基酸对映体的规模化固相萃取。
发明内容
针对现有天冬氨酸手性拆分技术的不足，本发明拟解决的技术问题是提供一一种手性天冬氨酸拆分方法；本发明方法如下1.制备接枝微粒P4VP/Si& ；2.对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si&的制备称取0. Ig的接枝微粒P4VP/Si02，置于浓度为0. lOg/L^-O. 2(^/171的L-Asp水溶液中，P4VP/Si02*所接枝的单体4-乙烯基吡啶GVP)与L-Asp的摩尔比为1 0.8-2 ；用氢氧化钠溶液调节体系的PH值为3. 5-6 ；混合液置于恒温振荡器中，28-33°C恒温振荡2_4h， 滤出微粒，真空干燥；将1. Og饱和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. IOgAZ1-O. 20g/ L^L-Asp的水和乙醇混合溶剂，水和乙醇的体积比为1 0. 5-2，用NaOH溶液调节pH值为 3. 5-6，加入交联剂1，6_ 二溴己烷，1,6- 二溴己烷与P4VP/Si&中所接枝的单体4-乙烯基吡啶的摩尔比为1 2-4 ；30-45°C下搅拌反应6h ；NaOH溶液洗涤1次以上，除去L_Asp，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si02。所述1，6_ 二溴己烷与P4VP/Si&中4VP的摩尔比为1 3-4本发明方法2中pH值优选3. 5-5 ；pH值优选4。水和乙醇的体积比为1:1;本发明中方法2中所述氢氧化钠溶液浓度为0. 1-lmol/L ；3. L-Asp 分子表面印迹材料 MIP-P4VP/Si02 分离 L-Asp L-Asp印迹材料MIP_P4VP/Si&填充装柱后，用D和L型天冬氨酸混合溶液流经柱子，并使L-Asp吸附在柱子上，待检测L-Asp印迹材料MIP-P4VP/Si&饱和吸附L-Asp后， 用浓度为0. 08mol/L-0. 2mol/L的氢氧化钠解吸。本发明方法1中所述制备接枝微粒P4VP/Si&是在硅胶微粒表面接枝聚合功能单体4-乙烯基吡啶，过程如下采用5 %的盐酸溶液对硅胶进行活化处理；以乙醇与水的混合液为溶剂，使活化硅胶与偶联基甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)于50°C下反应Mh，制得表面改性的硅胶微粒(MPS-SiO2)；在装有电动搅拌器、回流冷凝管及温度计的四口烧瓶中加入160ml的无水乙醇、MPS-SiO2 (8g)和40ml的4-乙烯基吡啶，在氮气保护下将混合物升温至70°C，加入引发剂AIBN(AIBN是4-乙烯基吡啶质量的1. 2% )，恒温搅拌下进行接枝聚合反应，7小时后结束反应。产物微粒在索氏抽提器中用无水乙醇抽提Mh，以除去物理吸附的聚合物，真空干燥后即得接枝微粒P4VP/Si02。本发明中采用热失重法测定P4VP/Si&中4-乙烯基吡啶的含量。有益效果本发明中采用水和乙醇的合适比例，使交联剂1，6_ 二溴己烷良好地和混合溶剂相溶，便于其与接枝微粒P4VP/SiA上的吡啶氮发生季氨化反应；控制1，6_ 二溴己烷与 P4VP/Si02中4VP的摩尔比为1 2-4可以改变所制备的分子印迹材料MIP-P4VP/Si&中特征空穴的数量及其空间结构，从而实现其对L-Asp的良好吸附和识别能力。与现有技术相比，分子印迹材料MIP_P4VP/Si&对模板分子L-Asp具有良好的识别选择性与结合亲和性，相对于D-Asp，识别选择性系数为3. 31-3. 85，(识别选择性系数为分子印迹材料所吸附的L-Asp与D-Asp的比值)；对天冬氨酸的外消旋体具有良好的拆分性能。对所制备的分子印迹材料进行重复利用实验，结果证明该分离载体具有良好的重复使用能力，经15次重复使用其吸附能力及选择性改变不到10%。本发明天冬氨酸手性拆分方法具有工艺简单、成本低、不需要特殊设备、工业化实施容易、对环境影响较小等特
点ο
图1为接枝微粒P4VP/Si&结构示意图；图 2MIP_P4VP/Si& 结构示意具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1 结合图1和图2说明；(1)制备接枝微粒P4VP/Si& 采用5%的盐酸溶液对硅胶进行活化处理；以乙醇与水的混合液为溶剂，使活化硅胶与偶联基甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷 (MPS)于30°C下反应20h，将可聚合双键引入到硅胶微粒表面，制得表面改性的硅胶微粒 (MPS-SiO2)；在装有电动搅拌器、回流冷凝管及温度计的四口烧瓶中加入120ml的无水乙醇、MPS-SiO2(6g)和20ml的4-乙烯基吡啶，在氮气保护下将混合物升温至70°C，加入引发剂AIBN (AIBN是4-乙烯基吡啶质量的0. 8% )，恒温并在搅拌下进行接枝聚合反应，5小时后结束反应。产物微粒在索氏抽提器中用无水乙醇抽提Mh，以除去物理吸附的聚合物，真空干燥后即得接枝微粒P4VP/Si02。(2)对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si&的制备称取0. 06g的接枝微粒P4VP/Si02，置于浓度为0. lOg/L—1的L-Asp水溶液中，用0. 10mol/L的氢氧化钠溶液调节体系的PH值，使pH = 3. 5 ；，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)与L-Asp的摩尔比为 1:1;将混合液置于恒温振荡器中，恒温30°C振荡2h，使接枝的P4VP充分溶胀，且使接枝微粒对L-Asp的吸附达到饱和，滤出微粒，真空干燥.将1. Og饱和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. lOg/L^L-Asp的水和乙醇混合溶剂(V V = 1 2)中，用0. 10mol/L 的NaOH溶液调节体系的pH值，使pH = 3. 5，加入交联剂1，6- 二溴己烷，1,6- 二溴己烷与 P4VP/Si02中4VP的摩尔比为1 3 ；在30°C下搅拌反应Mi.反应结束后，用0. 10mol/L的氢氧化钠溶液反复洗涤，除去模板分子L-Asp，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脱方法如下将已饱和吸附L-Asp的印迹材料MIP_P4VP/Si& (1. 2g)填充装柱，在室温条件下，用浓度为0. 08mol/L的氢氧化钠作为洗脱液，以4BV · 的流速逆流通过填充柱，进行解吸，以2BV的间隔收集洗出液，测定洗出液中L-Asp的浓度，相对于D-Asp， L-Asp识别选择性系数为3. 31，对天冬氨酸的外消旋体具有良好的拆分性能。BV为有效柱体积。实施例2 (1)制备接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1(2)对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si&的制备称取接枝微粒P4VP/SiO2,置于浓度为0. Ug/L—1的L-Asp水溶液中，用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，使pH = 4,P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶GVP)与L-Asp的摩尔比为1 2 ；将混合液置于恒温振荡器中，31°C振荡池，使接枝的P4VP充分溶胀，且使接枝微粒对L-Asp的吸附达到饱和，滤出微粒，真空干燥.将1. Og饱和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. UgAZ1L-Asp的水和乙醇混合溶剂(V V = 1 1)中，NaOH溶液调节体系的pH值，使pH = 4，加入交联剂1，6_ 二溴己烷，1，6_ 二溴己烷与P4VP/Si02*4VP的摩尔比为1 4 ；在下搅拌反应7h.反应结束后，用氢氧化钠溶液反复洗涤，除去模板分子L-Asp，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得 L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脱方法如下将已饱和吸附L-Asp的印迹材料MIP_P4VP/Si& (1. 2g)填充装柱，在室温条件下，用浓度为0. lmol/L的氢氧化钠和作为洗脱液，以4BV 的流速逆流通过填充柱，进行解吸，以2BV的间隔收集洗出液，测定洗出液中L-Asp的浓度，相对于D-Asp， 识别选择性系数为3. 85，对天冬氨酸的外消旋体具有良好的拆分性能。实施例3 (1)制备接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1 ；(2)对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si&的制备称取接枝微粒P4VP/ SiO2,置于浓度为0. Ug/L—1的L-Asp水溶液中，用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，使pH = 4. 5，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)与L-Asp的摩尔比为1 0. 8。将混合液置于恒温振荡器中，振荡3. 5h，使接枝的P4VP充分溶胀，且使接枝微粒对L-Asp的吸附达到饱和，滤出微粒，真空干燥.将1. Og饱和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. UgA^1L-Asp的水和乙醇混合溶剂(V V= 1 1)中，用NaOH溶液调节体系的PH值，使pH = 4. 5，加入交联剂1，6- 二溴己烷，在40°C下搅拌反应讣，1，6- 二溴己烷与P4VP/Si02*4VP的摩尔比为1 2;反应结束后，用氢氧化钠溶液洗涤2次，除去模板分子L-Asp，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脱方法如下将已饱和吸附L-Asp的印迹材料MIP_P4VP/Si& (1. 2g)填充装柱，在室温条件下，用浓度为0. lmol/L的氢氧化钠和作为洗脱液，以4BV 的流速逆流通过填充柱，进行解吸，以2BV的间隔收集洗出液，测定洗出液中L-Asp的浓度，相对于D-Asp， 识别选择性系数为3. 51，对天冬氨酸的外消旋体具有良好的拆分性能。实施例4:(1)制备接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1 ；(2)对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP_P4VP/Si&的制备称取接枝微粒P4VP/ SiO2,置于浓度为0. Hg/L—1的L-Asp水溶液中，用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，使pH = 5，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)与L-Asp的摩尔比为1 0. 8。将混合液置于恒温振荡器中，30°C振荡3. 5h，使接枝的P4VP充分溶胀，且使接枝微粒对L-Asp的吸附达到饱和， 滤出微粒，真空干燥.将1. Og饱和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. HgAZ1L-Asp的水和乙醇混合溶剂(V V = 1 1)中，用NaOH溶液调节体系的pH值，使pH= 5，加入交联剂1，6_ 二溴己烷，1，6-二溴己烷与P4VP/Si02中4VP的摩尔比为1 3. 3;在45°C下搅拌反应7h.反应结束后，用氢氧化钠溶液反复洗涤，除去模板分子L-Asp，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脱方法如下将已饱和吸附L-Asp的印迹材料MIP-P4VP/Si&(1. 2g)填充装柱，在室温条件下，用浓度为0. 12mol/L的氢氧化钠和作为洗脱液，以4BV · h—1的流速逆流通过填充柱，进行解吸，以3BV的间隔收集洗出液，测定洗出液中L-Asp的浓度，相对于 D-Asp，识别选择性系数为3. 41，对天冬氨酸的外消旋体具有良好的拆分性能。实施例5 (1)制备接枝微粒P4VP/Si& 基本同例1 ；(2)对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP_P4VP/Si&的制备称取接枝微粒P4VP/ SiO2,置于浓度为0. leg/L—1的L-Asp水溶液中，用氢氧化钠溶液调节体系的pH值，使pH = 6，P4VP/Si02中4-乙烯基吡啶(4VP)与L-Asp的摩尔比为1 0. 8。将混合液置于恒温振荡器中，33°C振荡4h，使接枝的P4VP充分溶胀，且使接枝微粒对L-Asp的吸附达到饱和，滤出微粒，真空干燥.将1. Og饱和吸附了 L-Asp的接枝微粒置于含有0. lBg/L^L-Asp的水和乙醇混合溶剂(V V = 1 1)中，用NaOH溶液调节体系的pH值，使pH = 6，加入交联剂 1，6_ 二溴己烷，1，6-二溴己烷与P4VP/Si02中4VP的摩尔比为1 3. 2 ；在下搅拌反应7h.反应结束后，用氢氧化钠溶液反复洗涤，除去模板分子L-Asp，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si02。(3)洗脱方法如下将已饱和吸附L-Asp的印迹材料MIP-P4VP/Si&(1. 2g)填充装柱，在室温条件下，用浓度为0. 12mol/L的氢氧化钠和作为洗脱液，以4BV · h—1的流速逆流通过填充柱，进行解吸，以3BV的间隔收集洗出液，测定洗出液中L-Asp的浓度，相对于 D-Asp，识别选择性系数为3. 35，对天冬氨酸的外消旋体具有良好的拆分性能。
权利要求
1.一种手性天冬氨酸拆分方法，包括如下步骤(1)制备接枝微粒P4VP/Si02；(2)对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si&的制备称取接枝微粒P4VP/Si02，置于浓度为0. lOg/L^-O.的L-Asp水溶液中，P4VP/SiO2中所接枝的单体4-乙烯基吡啶与L-Asp的摩尔比为1 0. 8-2 ；调节pH值为3. 5-6 ；混合液置于恒温振荡器中，28-33°C恒温振荡2-4h，滤出微粒，真空干燥；将饱和吸附了 L-Asp 的接枝微粒置于含有0. lOg/L^-O. 20g/L-1L-Asp的水和乙醇混合溶剂，水和乙醇的体积比为1 0. 5-2，调节pH值为3. 5-6，加入交联剂1，6_ 二溴己烷，1，6_ 二溴己烷与P4VP/Si02 中所接枝的单体4-乙烯基吡啶的摩尔比为1 2-4;30-45°C下搅拌反应Mi;NaOH溶液洗涤1次以上，再用蒸馏水洗涤，真空干燥，即得L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si& ；(3)L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/Si&分离L-Asp L-Asp印迹材料MIP-P4VP/Si&填充装柱后，用D和L型天冬氨酸混合溶液流经柱子， L-Asp印迹材料MIP-P4VP/Sih饱和吸附L-Asp后，用浓度为0. 08mol/L-0. 2mol/L的氢氧化钠解吸。
2.如权利要求1所述的一种手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步骤O)中水和乙醇的体积比为1 1。
3.如权利要求1所述的一种手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步骤O)中1， 6- 二溴己烷与P4VP/Si&中4VP的摩尔比为1 3-4。
4.如权利要求1所述的一种手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步骤(2)中pH值为 3. 5-5。
5.如权利要求1所述的一种手性天冬氨酸拆分方法，其特征在于所述步骤(2)中pH值为4。
全文摘要
本发明公开了一种手性天冬氨酸拆分方法，本发明属于分子表面印迹技术领域，本发明方法如下1.制备接枝微粒P4VP/SiO2；2.对映体L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/SiO2的制备；3.L-Asp分子表面印迹材料MIP-P4VP/SiO2分离L-Asp使L-Asp吸附在柱子上，待检测L-Asp印迹材料MIP-P4VP/SiO2饱和吸附L-Asp后，用浓度为0.08mol/L-0.2mol/L的氢氧化钠解吸。MIP-P4VP/SiO2对模板分子L-Asp具有良好的拆分性能。本发明具有工艺简单、成本低、不需要特殊设备、工业化实施容易、对环境影响较小等特点。
文档编号C08F292/00GK102358719SQ20111026099
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者胡志勇, 郭建峰, 高保娇 申请人:中北大学