核酸合成的方法和设备与流程

技术特征：
1.一种生成至少一种有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包含：a.提供至少第一组和第二组3’末端结合于支持物的单链寡核苷酸，其中第一组和第二组结合于支持物的寡核苷酸各自具有预定序列，并且结合于一个或多个支持物的不同位点上，结合于支持物的第一组寡核苷酸各自5’末端所含序列区域与结合于支持物的第二组寡核苷酸5’末端序列区域互补；b.在链延伸反应中生成与所述第一组和第二组结合于支持物的寡核苷酸互补的至少第一组和第二组构建寡核苷酸，第一组构建寡核苷酸3’末端所含序列区域与第二组构建寡核苷酸的3’末端所含序列区域互补；c.在选定位点上提供3’末端结合于锚支持物的单链锚寡核苷酸组，其中，所述锚寡核苷酸的5’末端与第一组构建寡核苷酸的5’末端互补；d.使至少第一组和第二组构建寡核苷酸与结合于支持物的所述第一组和第二组寡核苷酸解离；e.将所述一个或多个支持物与锚支持物对齐；并且f.使至少第一组和第二组构建寡核苷酸与所述锚寡核苷酸组在锚支持物上杂交。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包含将第一组构建寡核苷酸从第一位点转移到所述选定位点，并且将所述第二组构建寡核苷酸从第二位点转移到选定位点，其中所述选定位点包含结合于支持物的锚单链寡核苷酸组。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(i)提供第三组结合于支持物的单链寡核苷酸，其中结合于支持物的第三组寡核苷酸各自具有预定序列，并且其3’末端结合到所述一个或多个支持物的第三不同位点上，结合于支持物的第三组寡核苷酸各自在其3’末端有与结合于支持物的第二组寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域；(ii)在链延伸反应中生成与第三组结合于支持物的寡核苷酸互补的第三组构建寡核苷酸；(iii)在选定位点上使至少第一、第二和第三组构建寡核苷酸与锚寡核苷酸组杂交；和(iv)将至少第一和第三组构建寡核苷酸连接，由此生成所述至少一种多核苷酸。4.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：(i)提供结合于支持物的第三组单链寡核苷酸，其3’末端所含序列区域与结合于支持物的第二组寡核苷酸3’末端序列区域互补，(ii)在链延伸反应中生成与第三组结合于支持物的单链寡核苷酸互补的第三组构建寡核苷酸；(iii)使所述第三组构建寡核苷酸与所述第二组构建寡核苷酸杂交；和(iv)将第三和第一组构建寡核苷酸连接，由此生成所述至少一种多核苷酸。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合于支持物的寡核苷酸组各自在其3’末端有引物结合位点。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物结合位点是通用引物结合位点。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包含将引物与至少第一组和第二组结合于支持物的寡核苷酸在促进引物延伸的条件下退火，由此形成延伸产物双链体。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物序列包含至少一个尿嘧啶。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述每组结合于支持物的寡核苷酸组合成或点样在所述一个或多个固体支持物上。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一个或多个支持物是微阵列设备。11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述不同位点处于促进引物延伸的条件。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包含：提供N组预定的3’末端结合于支持物的单链寡核苷酸，由此产生第一组构建寡核苷酸至第N组构建寡核苷酸，该第一组构建寡核苷酸3’末端所含序列区域与第二组构建寡核苷酸3’末端序列区域互补，其中第N组构建寡核苷酸所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸所含序列区域互补，N≥3，并且，当N为偶数时，第N组构建核苷酸的3’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补，当N为奇数时，第N组构建核苷酸的5’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补；和提供锚寡核苷酸组，所述锚寡核苷酸在其5’末端包含与第一组构建寡核苷酸5’末端所含序列区域互补的序列。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，生成与结合于支持物的单链寡核苷酸互补的N组构建寡核苷酸，并且其中所述N组构建寡核苷酸无缺口地跨越所述多核苷酸的全部序列。14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括解离所述延伸双链体，由此释放所述至少第一组和第二组构建寡核苷酸。15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除引物。16.一种生成有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包含：a.用权利要求1所述方法合成包含游离单链突出端的结合于支持物的双链多核苷酸组，所述多核苷酸序列组包含预定多核苷酸序列，其中所述单链突出端包含末端构建寡核苷酸N的序列；b.提供包含单链突出端的茎环寡核苷酸，其中所述单链突出端与所述末端构建寡核苷酸序列N互补；c.使所述茎环寡核苷酸与有预定序列的多核苷酸的游离突出端杂交；d.将所述茎环寡核苷酸与有预定序列的多核苷酸的游离突出端连接；和e.降解不含有所述末端构建寡核苷酸序列N的多核苷酸序列。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包含使含有N组构建寡核苷酸的构建寡核苷酸库与结合于支持物的锚单链寡核苷酸杂交，其中所述库中第一组构建寡核苷酸在其5’末端包含与所述锚寡核苷酸5’末端序列区域互补的序列区域，并且其中第N组构建寡核苷酸包含与第(N-1)组构建寡核苷酸序列区域互补的序列，N≥2，并且，当N为偶数时，第N组构建核苷酸的3’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补，当N为奇数时，第N组构建核苷酸的5’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补。18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还使用单链特异性外切核酸酶来降解不含有所述末端寡核苷酸序列的多核苷酸序列。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述外切核酸酶选自单链特异性3'外切核酸酶、单链特异性内切核酸酶、和单链特异性5'外切核酸酶。20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述茎环寡核苷酸包含II型限制性位点，并且所述方法还包括使用II型限制性内切核酸酶移除茎环寡核苷酸。21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述茎环寡核苷酸包含至少一个尿嘧啶核苷酸，并且所述方法还包括使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除所述茎环寡核苷酸。22.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增所述有预定序列的多核苷酸。23.如权利要求1或16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述支持物上释放所述多核苷酸。24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，使用II型限制性酶释放所述多核苷酸。25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物释放所述多核苷酸。26.一种合成有预定序列多核苷酸的方法，所述方法包含：a.提供支持物，其具有(i)第一组3’末端结合于支持物的锚寡核苷酸和(ii)第二组3’末端结合于支持物的锚寡核苷酸，其中所述第一组锚寡核苷酸的5’末端与第一构建寡核苷酸5’末端互补，所述第二组锚寡核苷酸的5’末端与末端构建寡核苷酸N互补；b.合成包含与第一组锚寡核苷酸杂交的第一构建寡核苷酸并包含5’单链突出端的结合于支持物的双链多核苷酸组，所述多核苷酸组包含所述预定多核苷酸序列，其中，所述5’单链突出端包含所述末端构建寡核苷酸N序列；和c.使所述多核苷酸处于杂交条件，由此使所述5’单链突出端与所述第二组锚寡核苷酸5’末端杂交，由此选出所述有预定序列的多核苷酸。27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括降解有游离3’或5’末端的多核苷酸序列。28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，用外切核酸酶降解所述多核苷酸序列。29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述支持物上释放所述有预定序列的多核苷酸。30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，使用II型内切核酸酶释放所述多核苷酸。31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物释放所述多核苷酸。32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述第一组锚寡核苷酸与所述第二组锚寡核苷酸相距一定的距离，所述距离对应于有预定序列的多核苷酸的长度。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述支持物还包含结合于支持物的间隔子单链寡核苷酸以设定所述第一和第二锚寡核苷酸之间的距离。34.如权利要求26所述的方法，其特征在于，使用结合于支持物的单链寡核苷酸组作为模板通过聚合酶链延伸合成单链构建寡核苷酸组，由所述单链构建寡核苷酸组组装形成结合于支持物的双链多核苷酸组。35.一种核酸阵列，所述阵列包含：a.固体支持物；b.与所述固体支持物相关联的不同位点，其中各位点包含有预定序列的3’末端结合于支持物的寡核苷酸组，其中第一组结合于支持物的寡核苷酸其5’末端所含序列区域与结合于支持物的第二寡核苷酸5’末端序列区域互补，其中当N是大于3的偶数，结合于支持物的寡核苷酸N组其5’末端所含序列与结合于支持物的寡核苷酸(N-1)组5’末端序列区域互补，或者，当N是大于或等于3的奇数，结合于支持物的寡核苷酸N组其3’末端所含序列与结合于支持物的寡核苷酸(N-1)组3’末端序列区域互补；和c.第一组3’末端结合于锚支持物的锚寡核苷酸，所述锚寡核苷酸在其5’末端包含与第一组结合于支持物的寡核苷酸序列内某区域相同的序列，并且，具有第二组锚寡核苷酸，所述第二锚寡核苷酸的5’末端与结合于支持物的寡核苷酸N组的3’末端相同，N是偶数。36.一种生成有预定序列的多核苷酸组的方法，所述方法包含：a.提供具有多个位点的第一和第二支持物，其中各位点包含有不同预定序列的3’末端结合于支持物的不同寡核苷酸；b.用结合于支持物的寡核苷酸作为模板生成有不同预定序列的第一组和第二组不同构建寡核苷酸组，所述第一组和第二组构建寡核苷酸有3’末端互补序列；c.提供具有多个位点的第三支持物，其中各位点包含3’末端结合于支持物的锚单链寡核苷酸组，其中锚寡核苷酸组的5’末端与第一组构建寡核苷酸的5’末端互补；d.将所述第一支持物与所述第三支持物对齐，并使所述第一组构建寡核苷酸与所述锚寡核苷酸杂交；e.将所述第二支持物与所述第三支持物对齐，并使所述第二组构建寡核苷酸与已与所述锚寡核苷酸杂交的所述第一组构建寡核苷酸杂交；f.产生第三组构建寡核苷酸并使其与经步骤(e)与第一组构建寡核苷酸杂交的所述第二组构建寡核苷酸杂交；和g.将第一和第三组构建寡核苷酸连接。37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，定义具有预定序列多核苷酸的构建寡核苷酸组各自在不同支持物上合成。38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸组在包含结合于支持物的锚寡核苷酸的第三支持物的不同位点上组装。39.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述生成第一组构建寡核苷酸的步骤包含有至少一个尿嘧啶的引物序列与第一组结合于支持物的寡核苷酸退火，所述退火条件促进引物延伸，和用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除所述引物。40.一种合成有预定序列的多核苷酸组的方法，所述方法包含：a.提供了有多个位点的第一支持物，其中各位点包含3’末端结合于支持物的锚单链寡核苷酸组；b.提供有多个位点的第二支持物组，其中各位点包含具有各自不同预定序列的单链结合于支持物的模板寡核苷酸组；c.用单链结合于支持物的模板寡核苷酸组作为模板通过聚合酶延伸生成第一组构建寡核苷酸，由此产生第一组构建寡核苷酸，该第一组构建寡核苷酸的5’末端与对应的锚寡核苷酸的5’末端互补；d.定位所述第一和第二支持物，以使第二支持物的各位点与所述第一支持物的相应位点对齐；e.在促进所述第一组寡核苷酸与对应锚寡核苷酸组杂交条件下于溶液中释放所述第一组构建寡核苷酸；和f.可选地，用包含结合于支持物的第二组寡核苷酸的第三支持物重复步骤b-e，由此产生第二组构建寡核苷酸，所述第一和第二组构建寡核苷酸有互补的3’末端序列。41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述生成第一组构建寡核苷酸的步骤包括：有至少一个尿嘧啶的引物序列与第一组结合于支持物的寡核苷酸退火，所述退火条件促进引物延伸，和用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除所述引物。42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述锚寡核苷酸与第二组构建寡核苷酸连接。43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第二支持物位于所述第一支持物的上面并与之相向。44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述于溶液中释放第一组构建寡核苷酸的步骤使第一组寡核苷酸得以向锚寡核苷酸扩散。45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述于溶液中释放第一组构建寡核苷酸的步骤在多孔膜存在下进行，使构建寡核苷酸向锚寡核苷酸垂直扩散。46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述多孔膜降低所述构建寡核苷酸的横向扩散。47.如权利要求40所述的方法，其特征在于，经步骤e)后，所述第一支持物的各位点包含具有3’游离突出端或5’游离突出端的双链。48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述双链具有5’游离突出端。49.如权利要求40所述的方法，其特征在于，在所述释放步骤中，第一组构建寡核苷酸与第二组构建寡核苷酸杂交，并且第一组寡核苷酸与锚寡核苷酸杂交。50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述溶液包含连接酶。51.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第一组构建寡核苷酸的化学计量高于锚寡核苷酸的化学计量。52.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法还包含在适于剪切含错配核苷酸的双链多核苷酸的条件下，用错配识别和剪切组分处理所述多核苷酸组。53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸组固定在所述支持物上或处于溶液中。54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述错配识别和剪切组分包含错配内切核酸酶。55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述错配特异性内切核酸酶是CELI酶。