专利名称：一种樟芝真菌的液体深层培养方法及樟芝真菌的多糖提取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，本发明具体涉及ー种樟芝真菌的液体深层培养方法及樟芝真菌的多糖提取方法。
背景技术：
樟芝生长于牛樟树的中空心木材内壁,故称其为牛樟芝或樟芝内燕，隶属真菌门，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌科，薄孔菌属多年生蕈类，是ー种珍稀、尚未开发的名贵食、药用真菌。樟芝具有疗效的起源，来自于早期台湾原住民，原住民皆将樟芝视为是最珍贵的药材。民间流传樟芝在治疗肝癌和子宫颈癌上特别有效，而一般性的应用则可用以治疗急性腹痛、抗过敏，并且在解酒的效カ上更是一流。近年来，研究得知樟芝能有效治疗肝病及其它方面如抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、降血脂、降血糖的疾病。樟芝作为台湾特有的菌种，自然环境中牛樟树是其唯一的寄主，一般真菌不能在其上生长。由于樟芝可造成牛樟树中心 空洞腐朽，加上人对牛樟树乱砍乱伐，致使牛樟树数量相当稀少，目前已被列为ー级保育树种。近百年来，牛樟树难得ー见，而能够长出牛樟芝的牛樟树则更少，其结果导致野生樟芝资源严重短缺。因此樟芝十分珍贵，在港澳台被称为“神芝”，台湾民间则称樟芝为“森林中的红宝石”。目前樟芝在台湾主要分布在桃园、苗栗、南投、台东和高雄等地，其余地域则十分少见；而它的生长期也仅限于毎年的六月至十月。由于樟芝极为稀少，长期以来，人们ー直看重的是那些形状突出，色彩丰富的伞状构造即子实体。但毕竟野生资源有限，天然樟芝子实体取材不宣，价格昂贵，人工栽培困难等的影响，一直无法为人们所熟悉。目前国内外对樟芝的研究还不是很透彻仅处于实验阶段，采取的主要培养法是固体发酵法。由于此法发酵周期长，劳动强度大，占地面积广，受季节限制，而且容易污染，不宜进行纯种发酵等缺点，导致樟芝发酵规模一直得不到扩大。况且人工栽培需要消耗大量的人力物力，栽培空间和设备，以及由接种到达子实体形成需数月的时间，周期太长无法满足社会的需求。为此，以生物技术方法进行天然樟芝液体深层发酵培养可以缩短培养时间，获得大量且纯正的菌丝体，成本低，可实现发酵エ业的连续化、自动化，提升生产效益，成为十分值得开发的途径。因此采用液体深层发酵培养技术直接生产樟芝菌丝体以代替人工栽培的樟芝子实体其效果相同甚至更好，是兼顾保育，安全及获得优质成分的唯一选择。并且樟芝主要作为ー种药用真菌，深层培养产生了大量的菌丝体和发酵夜，它们化学组成复杂，种类繁多，樟芝多糖是其有效成分。已有实验证明，樟芝菌丝体中含有的生物活性物质和子实体中的极其相似，具有相同的疗效，樟芝菌丝体完全取代子实体作为樟芝多糖生产的新资源。故在加强食用菇类的利用方面，以深层培养方式生产樟芝菌丝体及其他有用代谢产物，是ー个有巨大发展潜力的方向。公布日为2010. 09. 08、公布号为CN 101822170 A、名为“ー种基于固态表面培养生
产樟芝菌丝体的方法”的发明专利公开了ー种樟芝菌丝体的培养方法，该方法对樟芝的培养基组分进行了筛选，优化培养基中鼓舞原料配比，使培养基能牢固地吸附在培养器内壁或培养基表面上，便于樟芝菌表面培养；将樟芝菌接种于反应器的培养表面中，在一定温度和湿度的环境中进行培养，在表面培养过程中，每隔一定时间刘家培养基，使樟芝菌生长所需的营养成分及时得到补充，并使樟芝的生长环境接近天然培养的环境，直至形成大量菌丝体或大的菌落。培养结束后将将樟芝培养物进行快速低温干燥处理。这种培养方式采用固态培养的方法，由于固态培养具有发酵周期长，劳动強度大，占地面积广，受季节限制，而且容易污染，不宣进行纯种发酵等缺点，所以能够寻找ー种更加优化的樟芝培养方法对樟芝的生产具有很大影响。另外，目前对樟芝真菌多糖的提取エ艺复杂，且提取率不高，樟芝真菌的利用率较低导致了樟芝真菌不必要的浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养周期短、菌丝体含量纯、成本较低且可容易实现发酵连续化生产的樟芝真菌的液体深层培养方法，以得到菌丝体和发酵液。 本发明的另ー个目的是提供一种对樟芝真菌的液体深层培养产生的大量的菌丝体和发酵夜进行多糖提取的方法，以解决目前樟芝真菌樟芝培养所得产物的利用率。本发明的樟芝真菌的液体深层培养方法，包括以下步骤
(I)菌种活化在无菌条件下取保存的樟芝菌种接入活化培养基，接入量为活化培养基重量的O. 02、. 05%，25 30で下恒温培养7 12天，培养期间每隔两天将菌种转接一次，最后得到活化菌种，备用；
樟芝菌种接入量过大，会导致养分缺少，菌种长势不好，接入量过小，过导致菌种不够。(2)液体种子制备将活化菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接入量为液体种子培养基重量的4飞％，2扩35で下恒温振荡培养5 7天，得到樟芝菌种培养液，即为液体种子，备用；
(3)液体深层发酵培养将液体种子接入灭菌后的发酵基础培养基，接入量为发酵基础培养基重量的4. 5 5. 5%，27 33で下恒温振荡培养7 8天，得到樟芝真菌发酵培养液。樟芝菌种、活化菌种和液体种子的接入量过大，都会导致培养基养分缺少，菌种长势不好，接入量过小，菌种数量会达不到预定要求，且造成培养基浪费。作为优选，发酵基础培养基由以下方法制备而成将20g去皮切块的新鲜马铃薯，加水IOOmL煮沸40min,以4层纱布过滤,滤液稀释至IOOmL,得马铃薯浸汁备用；取4g玉米粉加水IOOmL煮沸40min，以4层纱布过滤，滤液稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁备用；将马铃薯浸汁和玉米粉浸汁合并后取IOOmL装于250mL摇瓶中，外加Ig酵母膏，O. 2g的磷酸ニ氢钾，O. 02g的硫酸镁，IOOmg维生素B1，调节pH为6. 5^7. O，再加入硫酸铵和麸皮各O. 5^0. 8g，摇瓶封好后常规灭菌20min，灭菌后立即取出。作为优选，选用液体种子培养基中的菌球直径达到O. 2^0. 3cm时得到的樟芝菌种培养液作为为液体种子。当液体种子培养基中的菌球直径达到O. 2^0. 3cm时，菌种正处于指数生长期，生长状态良好，达到液体中的要求，菌球直径过小，在下一步的发酵培养会出现生长缓慢的现象，军求直径过大
作为优选，活化培养基由以下方法制备而成取去皮切块的新鮮马铃薯200g，IOOOmL水中煮沸15 20min，双层纱布过滤，取滤液并补足IOOOmL,取IOOmL并在其中葡萄糖2g，琼脂I. 5 2g，维生素BI IOmg，调节pH为6. 8 7. 1，灭菌。作为优选，液体种子培养基由以下方法制备而成将3g玉米粉加IOOmL水煮沸30min，然后加水稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁，再加入玉米粉浸汁重量O. 5wt%酵母膏、O. lwt%磷酸ニ氢钾、O. 05wt%硫酸镁和IOmg维生素B1,装于250mL摇瓶内，摇瓶封ロ后灭菌20min，灭菌后立即取出，冷却至室温并镜检无杂菌污染后，得到液体种子培养基。本发明樟芝真菌的多糖提取方法，包括以下步骤
(I)分离将权利要求I制备的樟芝真菌发酵培养液进行分离得到菌丝体和发酵液；
由于菌丝体在粉碎前不易进行多糖提取操作，所以为了对菌丝体进行有效的多糖提取，首先将樟芝真菌发酵培养液分离成为菌丝体和发酵液，并对菌丝体进行粉碎以利于多糖提取。(2)胞外多糖的提取发酵液在7(T90°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的发酵液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对发酵液脱蛋白，将脱蛋白后的发酵液加3倍体积的95%こ醇，在5 10で下静置12 18h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞外多糖；
(3)胞内多糖的提取将菌丝体在6(T65°C干燥并粉碎至ΚΚΓ300目的粉体，粉体在水中抽提三次后合并抽提液，抽提液在7(T90°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的抽提液进行透析，直到透析液与Cu (OH) 2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对抽提液脱蛋白，将脱蛋白后的抽提液加3倍体积的95%こ醇，在5 10で下静置12 18h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞内多糖。作为优选，步骤(2)中透析所用透析袋的截留分子量20000Da，透析液为蒸馏水或双蒸水，透析时间为2(T24h。截留分子量20000Da可以达到对绝大部分多糖的提取。作为优选，抽提时粉体与水的比例为Ig :8(Tl20mL，提取温度为65 85°C，抽提时间为12 14h。作为优选，樟芝真菌发酵培养液的分离采用4(Γ100目筛进行过滤。作为优选，樟芝真菌发酵培养液的分离采用600(T8000r/min的离心机离心20mino本发明的樟芝真菌的液体深层培养方法具有培养时间短、成本低且易エ业连续化生产的效果，通过本方法可以培养出具有和天然樟芝真菌成分相同的的菌丝体和发酵液。本发明的樟芝真菌的多糖提取方法不仅对樟芝真菌的液体深层培养方法制备的菌丝体进行胞内多糖提取，而且对发酵液进行胞外多糖提取，得到的多糖的产率较高。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进ー步描述。实施例一
一种樟芝真菌的液体深层培养方法，包括以下步骤
(I)菌种活化在无菌条件下取保存的樟芝菌种接入活化培养基，接入量为活化培养基重量的O. 02%，30°C下恒温培养7天，培养期间每隔两天将菌种转接一次，最后得到活化菌种，备用；
菌种活化的活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，由以下方法制备而成取去皮切块的新鲜马铃薯200g，IOOOmL水中煮沸18min，双层纱布过滤，取滤液并补足IOOOmL,取IOOmL并在其中葡萄糖2g，琼脂2g，维生素B1 IOmg,调节pH为6. 8，灭菌；
(2)液体种子制备将活化菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接入量为液体种子培养基重量的6%，35 °C下恒温振荡培养5天后，液体种子培养基中的菌球直径达到O. 2"O. 3cm,得到的樟芝菌种培养液作为为液体种子。液体种子制备所用的液体种子培养基由以下方法制备而成将3g玉米粉加IOOmL水煮沸30min，然后加水稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁，再加入玉米粉浸汁重量0. 5wt%酵母膏、0. lwt%磷酸ニ氢钾、0. 05wt%硫酸镁和IOmg维生素BI，装于250mL摇瓶内，摇瓶封ロ后灭菌20min，灭菌后立即取出，冷却至室温并镜检无杂菌污染后，得到液体种子培养基；将活化菌种分割成直径为0. 5^0. 8cm大小的菌丝块，转接于液体种子培养基，35°C下恒温振荡培养5天； (3)液体深层发酵培养将液体种子接入灭菌后的发酵基础培养基，接入量为发酵基础培养基重量的5%，33°C下恒温振荡培养7天，得到樟芝真菌发酵培养液。液体深层发酵培养所用发酵基础培养基由以下方法制备而成将20g去皮切块的新鮮马铃薯，加水IOOml煮沸40min，以4层纱布过滤，滤液稀释至IOOmL,得马铃薯浸汁备用；取4g玉米粉加水IOOmL煮沸40min,以4层纱布过滤,滤液稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁备用；将马铃薯浸汁和玉米粉浸汁合并后取IOOmL装于250mL摇瓶中，外加Ig酵母膏，0. 2g的磷酸ニ氢钾，0. 02g的硫酸镁，IOOmg维生素B1，调节pH为6. 8，再加入硫酸铵和麸皮各0. 8g，摇瓶封好后灭菌20min，灭菌后立即取出。一种樟芝真菌的多糖提取方法，包括以下步骤
(O分离将上述方法制备的樟芝真菌发酵培养液进行分离得到菌丝体和发酵液；真菌发酵培养液的分离采用40目筛进行过滤，滤渣为菌丝体，滤液为发酵液。(2)胞外多糖的提取发酵液在70°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的发酵液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对发酵液脱蛋白，将脱蛋白后的发酵液加3倍体积的95%こ醇，在8°C下静置18h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞外多糖；透析袋的截留分子量20000Da,透析液为蒸懼水,透析时间为20h。(3)胞内多糖的提取将菌丝体在63°C干燥并粉碎至300目的粉体，粉体在水中抽提三次后合并抽提液，抽提液在70°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的抽提液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对抽提液脱蛋白，将脱蛋白后的抽提液加3倍体积的95%こ醇，在7°C下静置18h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞内多糖。透析袋的截留分子量20000Da，透析液为蒸馏水，透析时间为20h。抽提时粉体与水的比例为Ig :100mL，提取温度为85°C，抽提时间为12h。实施例ニ
一种樟芝真菌的液体深层培养方法，包括以下步骤
(I)菌种活化在无菌条件下取保存的樟芝菌种接入活化培养基，接入量为活化培养基重量的0. 05%，25°C下恒温培养10天，培养期间每隔两天将菌种转接一次，最后得到活化菌种，备用；菌种活化的活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，由以下方法制备而成取去皮切块的新鲜马铃薯200g，IOOOmL水中煮沸20min，双层纱布过滤，取滤液并补足IOOOmL,取IOOmL并在其中葡萄糖2g,琼脂I. 5g，维生素B1 IOmg,调节pH为7. 0，灭菌;
(2)液体种子制备将活化菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接入量为液体种子培养基重量的4%，29 °C下恒温振荡培养6天后，液体种子培养基中的菌球直径达到O. 2"O. 3cm,得到的樟芝菌种培养液作为为液体种子。液体种子制备所用的液体种子培养基由以下方法制备而成将3g玉米粉加IOOmL水煮沸30min，然后加水稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁，再加入玉米粉浸汁重量0. 5wt%酵母膏、0. lwt%磷酸ニ氢钾、0. 05wt%硫酸镁和IOmg维生素B1,装于250mL摇瓶内，摇瓶封ロ后灭菌20min，灭菌后立即取出，冷却至室温并镜检无杂菌污染后，得到液体种子培养基；将活化菌种分割成直径为0. 5^0. 8cm大小的菌丝块，转接于液体种子培养基，29°C下恒温振荡培养6天；
(3)液体深层发酵培养将液体种子接入灭菌后的发酵基础培养基，接入量为发酵基础培养基重量的5. 5%, 27°C下恒温振荡培养8天，得到樟芝真菌发酵培养液。液体深层发酵培养所用发酵基础培养基由以下方法制备而成将20g去皮切块的新鮮马铃薯，加水IOOml煮沸40min，以4层纱布过滤，滤液稀释至IOOmL,得马铃薯浸汁备用；取4g玉米粉加水IOOmL煮沸40min,以4层纱布过滤,滤液稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁备用；将马铃薯浸汁和玉米粉浸汁合并后取IOOmL装于250mL摇瓶中，外加Ig酵母膏，0. 2g的磷酸ニ氢钾，0. 02g的硫酸镁，IOOmg维生素B1，调节pH为7. 0，再加入硫酸铵和麸皮各0. 5g，摇瓶封好后灭菌20min，灭菌后立即取出。一种樟芝真菌的多糖提取方法，包括以下步骤
(O分离将上述方法制备的樟芝真菌发酵培养液进行分离得到菌丝体和发酵液；真菌发酵培养液的分离采用100目筛进行过滤，滤渣为菌丝体，滤液为发酵液。(2)胞外多糖的提取发酵液在80°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的发酵液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对发酵液脱蛋白，将脱蛋白后的发酵液加3倍体积的95%こ醇，在10°C下静置12h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞外多糖；透析袋的截留分子量20000Da，透析液为双蒸水，透析时间为22h。(3)胞内多糖的提取将菌丝体在65°C干燥并粉碎至100目的粉体，粉体在水中抽提三次后合并抽提液，抽提液在80°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的抽提液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对抽提液脱蛋白，将脱蛋白后的抽提液加3倍体积的95%こ醇，在10°C下静置12h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞内多糖。透析袋的截留分子量20000Da，透析液为双蒸水，透析时间为23h。抽提时粉体与水的比例为Ig :120mL，提取温度为65°C，抽提时间为13h。实施例三
一种樟芝真菌的液体深层培养方法，包括以下步骤
(I)菌种活化在无菌条件下取保存的樟芝菌种接入活化培养基，接入量为活化培养基重量的0. 04%，28°C下恒温培养12天，培养期间每隔两天将菌种转接一次，最后得到活化菌种，备用；
菌种活化的活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，由以下方法制备而成取去皮切块的新鲜马铃薯200g，IOOOmL水中煮沸15min，双层纱布过滤，取滤液并补足IOOOmL,取IOOmL并在其中葡萄糖2g,琼脂I. 7g，维生素B1 IOmg,调节pH为7. 1，灭菌;
(2)液体种子制备将活化菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接入量为液体种子培养基重量的5%，33 °C下恒温振荡培养7天后，液体种子培养基中的菌球直径达到O. 2"O. 3cm,得到的樟芝菌种培养液作为为液体种子。液体种子制备所用的液体种子培养基由以下方法制备而成将3g玉米粉加IOOmL水煮沸30min，然后加水稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁，再加入玉米粉浸汁重量0. 5wt%酵母膏、0. lwt%磷酸ニ氢钾、0. 05wt%硫酸镁和IOmg维生素B1,装于250mL摇瓶内，摇瓶封ロ后灭菌20min，灭菌后立即取出，冷却至室温并镜检无杂菌污染后，得到液体种子培养基；将活化菌种分割成直径为0. 5^0. 8cm大小的菌丝块，转接于液体种子培养基，32°C下恒温振 荡培养7天；
(3)液体深层发酵培养将液体种子接入灭菌后的发酵基础培养基，接入量为发酵基础培养基重量的4. 5%，30°C下恒温振荡培养7天，得到樟芝真菌发酵培养液。液体深层发酵培养所用发酵基础培养基由以下方法制备而成将20g去皮切块的新鮮马铃薯，加水IOOml煮沸40min，以4层纱布过滤，滤液稀释至IOOmL,得马铃薯浸汁备用；取4g玉米粉加水IOOmL煮沸40min,以4层纱布过滤,滤液稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁备用；将马铃薯浸汁和玉米粉浸汁合并后取IOOmL装于250mL摇瓶中，外加Ig酵母膏，0. 2g的磷酸ニ氢钾，0. 02g的硫酸镁，IOOmg维生素B1，调节pH为6. 5，再加入硫酸铵和麸皮各0. 7g，摇瓶封好后灭菌20min，灭菌后立即取出。一种樟芝真菌的多糖提取方法，包括以下步骤
(O分离将上述方法制备的樟芝真菌发酵培养液进行分离得到菌丝体和发酵液；真菌发酵培养液的分离或采用7000r/min的离心机离心20min，沉淀物为菌丝体，上清液为发酵液。(2)胞外多糖的提取发酵液在90°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的发酵液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对发酵液脱蛋白，将脱蛋白后的发酵液加3倍体积的95%こ醇，在5°C下静置15h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞外多糖；透析袋的截留分子量20000Da,透析液为蒸懼水,透析时间为24h。(3)胞内多糖的提取将菌丝体在60°C干燥并粉碎至200目的粉体，粉体在水中抽提三次后合并抽提液，抽提液在90°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的抽提液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对抽提液脱蛋白，将脱蛋白后的抽提液加3倍体积的95%こ醇，在5°C下静置16h，沉淀物分别用无水こ醇、丙酮和こ醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞内多糖。透析袋的截留分子量20000Da，透析液为蒸馏水，透析时间为24h。抽提时粉体与水的比例为Ig :80mL，提取温度为75 °C，抽提时间为14h。通过检测显示，三个实施例中樟芝真菌发酵培养液中多糖的含量分别为42. I μ g/mL、44. 9μ g/mL、45. 2μ g/mL，三个实施例中胞外多糖和胞外多糖的纯度分别为91. 8%和92. 5,90. 3%和91. 9,92. 1%和92. 6%，胞外多糖和胞 外多糖的提取率均在95%以上。
权利要求
1.一种樟芝真菌的液体深层培养方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)菌种活化在无菌条件下取保存的樟芝菌种接入活化培养基，接入量为活化培养基重量的O. 02、. 05%，25 301下恒温培养7 12天，培养期间每隔两天将菌种转接一次，最后得到活化菌种，备用； (2)液体种子制备将活化菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接入量为液体种子培养基重量的4飞％，29 35°C下恒温振荡培养5 7天，得到樟芝菌种培养液，即为液体种子，备用； (3)液体深层发酵培养将液体种子接入灭菌后的发酵基础培养基，接入量为发酵基础培养基重量的4. 5 5. 5%，27 331下恒温振荡培养7 8天，得到樟芝真菌发酵培养液。
2.根据权利要求I所述的一种樟芝真菌的液体深层培养方法，其特征在于，所述发酵基础培养基由以下方法制备而成将20g去皮切块的新鲜马铃薯，加水IOOmL煮沸40min，以4层纱布过滤，滤液稀释至IOOmL,得马铃薯浸汁备用；取4g玉米粉加水IOOmL煮沸40min,以4层纱布过滤，滤液稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁备用；将马铃薯浸汁和玉米粉浸汁合并后取IOOmL装于250mL摇瓶中，外加Ig酵母膏，O. 2g的磷酸二氢钾，O. 02g的硫酸镁，IOOmg维生素B1，调节pH为6. 5^7. O,再加入硫酸铵和麸皮各O. 5^0. 8g，摇瓶封好后常规灭菌20min，灭菌后立即取出。
3.根据权利要求I或2所述的一种樟芝真菌的液体深层培养方法，其特征在于，选用液体种子培养基中的菌球直径达到O. 2^0. 3cm时得到的樟芝菌种培养液作为为液体种子。
4.根据权利要求I或2所述的一种樟芝真菌的液体深层培养方法，其特征在于，所述的活化培养基由以下方法制备而成取去皮切块的新鲜马铃薯200g，IOOOmL水中煮沸15^20min,双层纱布过滤，取滤液并补足IOOOmL,取IOOmL并在其中葡萄糖2g，琼脂I. 5^2g,维生素B1 IOmg,调节pH为6. 8 7. I,灭菌。
5.根据权利要求I或2所述的一种樟芝真菌的液体深层培养方法，其特征在于，液体种子培养基由以下方法制备而成将3g玉米粉加IOOmL水煮沸30min，然后加水稀释至IOOmL,得玉米粉浸汁，再加入玉米粉浸汁重量0. 5wt%酵母膏、0. lwt%磷酸二氢钾、0. 05wt%硫酸镁和IOmg维生素B1,装于250mL摇瓶内，摇瓶封口后灭菌20min,灭菌后立即取出，冷却至室温并镜检无杂菌污染后，得到液体种子培养基。
6.一种樟芝真菌的多糖提取方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)分离将权利要求I制备的樟芝真菌发酵培养液进行分离得到菌丝体和发酵液； (2)胞外多糖的提取发酵液在7(T90°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的发酵液进行透析，直到透析液与Cu(OH)2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对发酵液脱蛋白，将脱蛋白后的发酵液加3倍体积的95%乙醇，在5 1(TC下静置12 18h，沉淀物分别用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞外多糖； (3)胞内多糖的提取将菌丝体在6(T65°C干燥并粉碎至100 300目的粉体，粉体在水中抽提三次后合并抽提液，抽提液在7(T90°C下浓缩至原体积的五分之一，再将浓缩后的抽提液进行透析，直到透析液与Cu (OH) 2反应无红色沉淀产生，按Sevag法对抽提液脱蛋白，将脱蛋白后的抽提液加3倍体积的95%乙醇，在5 1(TC下静置12 18h，沉淀物分别用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤后，真空抽干，然后置于P2O5干燥器中干燥，得到胞内多糖。
7.根据权利要求6所述的樟芝真菌的多糖制备方法，其特征在于，步骤(2)中透析所用透析袋的截留分子量20000Da，透析液为蒸馏水或双蒸水，透析时间为2(T24h。
8.根据权利要求6所述的樟芝真菌的多糖制备方法，其特征在于，所述抽提时粉体与水的比例为Ig :8(Tl20mL，提取温度为65 85°C，抽提时间为12 14h。
9.根据权利要求6或7所述的樟芝真菌的多糖制备方法，其特征在于，樟芝真菌发酵培养液的分离采用4(Γ100目筛进行过滤。
10.根据权利要求6或7所述的樟芝真菌的多糖制备方法，其特征在于，樟芝真菌发酵培养液的分离采用6000 8000r/min的离心机离心20min。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，是一种樟芝真菌的液体深层培养方法及樟芝真菌的多糖提取方法，樟芝真菌的液体深层培养是将保存的樟芝真菌进行菌种活化然后在液体种子培养基中制备液体种子，最后将液体种子接入发酵基础培养基制备得到樟芝真菌发酵培养液；樟芝真菌的多糖提取方法是将制备得到的樟芝真菌发酵培养液分离成为菌丝体和发酵液，然后对菌丝体和发酵液分别进行胞内多糖提取和胞外多糖提取。本发明可以用于樟芝真菌的制备以及樟芝真菌多糖的提取。
文档编号C08B37/00GK102687640SQ20121011856
公开日2012年9月26日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者付万冬, 傅光明, 周宇芳, 孟志娟, 廖妙飞, 杨会成, 许丹, 郑斌, 钟明杰 申请人:浙江省海洋开发研究院