专利名称：猫棒束孢粗多糖作为制备抗肿瘤药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌提取物的抗肿瘤药物开发，具体为一种猫棒束孢粗多糖(以下简称IFP)作为制备抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
猫棒束孢(Jsaria)是从天 然冬虫夏草子实体中经菌种分离培养获得的一种菌株，在分类上属于半知菌纲、丛梗孢目、棒束孢属。经中国科学院微生物研究所鉴定为Isaria felina (DC. :Fr. ) Fr.,该菌种已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(保藏号CGMCC NO. 0706)，并取得国家发明专利(ZL02103669. I)。DeffieuxGerard 等人(J Antibiot (Tokyo). 1981, 34(10): 1261-1265.)从 Jsaria中提取分离得到环羧酹酸肽结构的杀虫剂Isariins B、C和D,并对Isariins B、C和D的结构进行了鉴定(J Antibiot (Tokyo). 1981，34(10) : 1266-1270.)。郭永霞从猫棒束孢菌丝体中分离纯化得到具有抗真菌作用的环缩肽isarfelin,并对isarfelin进行了理化性质的分析、结构鉴定，并发现isarfelin具有抑制细菌、抵抗真菌的活性(郭永霞关于猫棒束孢菌抗真菌多肽和巨大口蘑抗真菌蛋白的分离纯化及特性的研究[博士论文]北京，中国农业大学，2005)。Ikumoto等研究发现冬虫夏草、蛹虫草及猫棒束孢的浸出液对离体心房有负收缩效应，同时对电刺激回肠的收缩反应及人血小板的凝结有抑制作用(Journal ofthe Pharmaceutical Society of Japan, 1991, 111 (9) 504-509)。专利 ZL02103669. I 公开了猫棒束孢的抗肿瘤活性功能，但是目前并没有任何研究从猫棒束孢中发现其抗肿瘤活性成分。
发明内容
本发明为了解决目前未发现猫棒束孢中抗肿瘤活性成分的问题，提供了猫棒束孢中的抗肿瘤成分，即猫棒束孢粗多糖作为制备抗肿瘤药物的应用。猫棒束孢粗多糖，其是由如下步骤制得的取菌丝粉，加入3-5倍菌丝粉重量的蒸懼水，沸水浴提取70-110min, 3000r/min转速下离心4_6min ;于沉淀中继续加入3_5倍菌丝粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min转速下离心4_6min ;于沉淀中继续加入3-5倍菌丝粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min离心4_6min ;合并三次提取的上清液，水浴浓缩至800-1000mL，得混合液；加入3_4倍混合液体积的95%乙醇(优选为混合液体积的3. 75倍)充分混匀，沉淀过夜；取沉淀，于70°C烘干得猫棒束孢粗多糖。上述制得的猫棒束孢粗多糖可应用于制备抗肿瘤药物中。本发明采用SPF级昆明小鼠、SPF级裸鼠进行动物实验，对昆明小鼠分别接种小鼠H22肝癌细胞、小鼠S180肉瘤细胞、小鼠EAC腹水癌细胞后分别注入多种剂量的IFP、以及注入蒸馏水(阴性对照组)、注射用丝裂霉素、鸦胆子油口服乳液作为对照组，实验结果表明IFP与阴性对照组相比具有统计学差异，说明猫棒束孢粗多糖对H22移植瘤、S180移植瘤有很好的抑制效果并对腹水癌EAC小鼠有生命延长作用；对裸鼠分别接种人HepG2肝癌细胞、人Hela宫颈癌细胞后分别注入多种剂量的IFP、以及注入蒸馏水(阴性对照组)、注射用丝裂霉素、鸦胆子油口服乳液作为对照组，实验结果表明IFP与阴性对照组相比具有统计学差异，说明猫棒束孢粗多糖对HepG2移植瘤、Hela移植瘤有很好的抑制效果。综上所述，IFP有显著的抑制肿瘤的作用，可广泛适用于制备抗肿瘤药物中。
具体实施例方式实施例I :下面对猫棒束孢粗多糖的抗肝癌作用进行实验研究
I.材料和方法
1.1动物
SPF (specific pathogen free)级昆明小鼠54只，体重20_22g,雄性，由山西省肿瘤研究所动物实验室繁殖，实验动物生产许可证号=SCXK (晋)2007-0001 ;实验动物使用许可 证号SYXK (晋)2007-0002 οSPF级BALB/c-nu裸鼠54只，体重16_18g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(京)2009-0017 ;实验动物饲养在清洁级屏障环境动物实验室，实验动物使用许可证号SYXK (晋)2007-0002。药品与试剂
猫棒束孢是从天然冬虫夏草子实体中经菌种分离后培养得到，其培养方法如下将500ml培养基(蛋白胨O. 6 %，酵母膏I. 2 %，蔗糖2. 4 %，MgSO4O. 05 %，用O. I 0MH2PO4调整pH为6. 5-7. O)装于3000mL三角瓶中，牛皮纸封口，125°C高压灭菌40min，冷却至室温，接入菌种，置于180r ^irT1摇床上，于23_27°C条件下旋转发酵培养72h，收集发酵液，将发酵液于2000r · mirf1离心5min,收集菌丝体,将菌丝体于8CTC烘干后粉碎,过100目筛。猫棒束孢粗多糖，其是由如下步骤制得的取300g上述菌丝粉，加入1200ml蒸懼水，沸水浴提取90min, 3000r/min离心5min ;于沉淀中继续加入1200ml蒸懼水,沸水浴提取30min, 3000r/min离心5min ;于沉淀中继续加入1200ml蒸懼水,沸水浴提取30min,3000r/min离心5min ;合并三次提取的上清液，水浴浓缩至900mL，得混合液；加入3. 75倍混合液体积的95%乙醇，充分混匀，沉淀过夜；取沉淀，于70°C烘干备用。瘤株小鼠H22肝癌细胞，购于河北医科大学实验动物中心；人!1印62肝癌细胞，由山西大学生物技术研究所馈赠。注射用丝裂霉素常用的西药抗癌药物，由浙江海正药业股份有限公司生产，产品批号为110601。鸦胆子油口服乳液常用的中药抗癌药物，由沈阳药大药业有限责任公司生产，生产批号为1103112。实验方法
将生长良好的小鼠H22肝癌组织瘤块，在无菌条件下加生理盐水，用消毒的玻璃研磨器制成浓度为I X IOVmL的细胞悬液，过滤后分别接种于所有昆明小鼠的右腋下皮下，每只昆明小鼠接种O. 2mL瘤液。将生长良好的人！fepG2肝癌组织瘤块，在无菌条件下加生理盐水，用消毒的玻璃研磨器制成浓度为5 X IOVmL的细胞悬液，过滤后分别接种于所有裸鼠的右腋下皮下，每只裸鼠接种O. 2mL瘤液。
昆明小鼠接种小鼠H22肝癌细胞24 h后，将其随机分为6组，分别为阴性对照组、丝裂霉素组、鸦胆子油组、IFP高剂量组、IFP中剂量组、IFP低剂量组，每组9只动物。阴性对照组小鼠每天灌胃给予蒸馏水O. 2mL，鸦胆子油组小鼠每天灌胃给予鸦胆子油口服乳液8mL/kg，IFP高剂量组小鼠每天灌胃给予IFP 200 mg/kg, IFP中剂量组小鼠每天灌胃给予IFP 100 mg/kg，IFP低剂量组小鼠每天灌胃给予IFP 50 mg/kg ;丝裂霉素组小鼠腹腔注射丝裂霉素I mg/kg，分别于实验第2d、第6d各注射一次，共注射2次。灌胃给药10d，每3天称量一次小鼠体重，末次给药24 h后颈椎脱白法处死小鼠，剖取瘤块并称重，计算瘤重、抑瘤率(％)。裸鼠接种人!fepG2肝癌细胞24 h后，也将其随机分为6组，分别为阴性对照组、丝裂霉素组、鸦胆子油组、IFP高剂量组、IFP中剂量组、IFP低剂量组，每组9只动物。灌胃给药剂量同上，连续灌胃给药20d，实验观察50d，于实验第51d称重并处死动物，剥离瘤块称湿重，计算瘤重、抑瘤率(％ )。数据处理方法
采用SPSS17. O统计软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析(AN0VA)，两组间比较采用最小显著差异法(LSD)，实验数据以
z±s表不，/*〈0. 05表不具有统计学差异。实验结果
2.I IFP对小鼠移植性肝癌H22的抑制作用 下表I是各组昆明小鼠的瘤重、抑瘤率
表I IFP对小鼠移植性肝癌H22的抑制作用
权利要求
1.猫棒束孢粗多糖作为制备抗肿瘤药物的应用，其中所述猫棒束孢粗多糖是由如下步骤制得的取猫棒束孢菌丝粉，加入3-5倍菌丝粉重量的蒸馏水，沸水浴提取70-110min，3000r/min转速下离心4_6min ;于沉淀中继续加入3_5倍菌丝粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min转速下离心4_6min ;于沉淀中继续加人3_5倍菌丝粉重量的蒸懼水，沸水浴提取20-40min，3000r/min离心4_6min ;合并三次提取的上清液，水浴浓缩至800-1000mL，得混合液；加入3_4倍混合液体积的95%こ醇，充分混匀，沉淀过夜；取沉淀，于70°C烘干得猫棒束孢粗多糖。
全文摘要
本发明涉及真菌提取物的抗肿瘤药物开发，具体为一种猫棒束孢粗多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，解决了目前未发现猫棒束孢中抗肿瘤活性成分的问题。本发明采用昆明小鼠、裸鼠进行实验，对昆明小鼠分别接种小鼠H22肝癌细胞、小鼠S180肉瘤细胞、小鼠EAC腹水癌细胞后分别注入多种剂量的IFP，实验结果说明IFP对H22移植瘤、S180移植瘤有很好的抑制效果并对腹水癌EAC小鼠有生命延长作用；对裸鼠分别接种人HepG2肝癌细胞、人Hela宫颈癌细胞后分别注入多种剂量的IFP，实验结果说明IFP对HepG2移植瘤、Hela移植瘤有很好的抑制效果。说明IFP有显著的抑制肿瘤的作用，可广泛适用于制备肿瘤药物中。
文档编号C08B37/00GK102813669SQ20121029410
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月18日 优先权日2012年8月18日
发明者杨喜花, 任连生, 张蕻 申请人:山西省肿瘤医院