本申请基于日本专利申请2011-025234(2011年2月8日申请)主张优先权，日本专利申请2011-025234的内容通过参考并入本申请。
技术领域
本发明涉及用于基因导入的病毒载体的制造方法。
背景技术：
因为人副流感2型病毒(human parainfluenza type2virus)(hPIV2)有可能感染人气管粘膜、诱导粘膜免疫，故而期待其作为疫苗用载体应用。为了将该载体作为医药品实用化，必须使得病毒载体具有感染人细胞的能力、且感染后在人体内不产生传播性病毒(表示为非增殖性载体)。即，对细胞·组织进行单次感染，但在感染细胞·组织中不产生传播性病毒、不引起多次感染的系统是必要的。为了构建该系统，通常采用下述系统：使得病毒基因组上的基因一部分缺陷、制造表达该缺陷基因产物的细胞、通过在该细胞中向缺陷型病毒反式供给缺陷基因产物、制作非增殖型载体。对于DNA病毒，向腺病毒中导入了该系统(例如WO94/28152)，对于RNA病毒，向逆病毒中导入了该系统(例如WO2006/084746)。另外，关于人副流感2型病毒所属的副粘病毒科病毒，提出了F基因等缺陷的仙台病毒载体(WO2000/070070)。另外，有报道称，发现下述结核发病预防疫苗具有强的结核菌增殖抑制效果，所述结核发病预防疫苗使用引入了来自定型抗酸菌的堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)或牛结核杆菌(Mycobacterium bovis)BCG的α抗原(Ag85B)基因的人副流感病毒2型病毒的非增殖性基因重组型载体(PCT/JP2010/069435)。
F基因缺陷型人副流感2型病毒不存在人副流感2型病毒的融合蛋白(以下记为“F蛋白”)，该融合蛋白是单独通过侵入宿主细胞后的该病毒的复制·转录步骤、使病毒包膜与细胞膜融合、向宿主内导入病毒核壳蛋白时所必需的，因此，F基因缺陷型人副流感2型病毒不能构成保持自主增殖能力的病毒颗粒。因此，就制备虽然基因组上F基因缺陷、但载体包膜上含有F蛋白的非增殖型人副流感2型病毒载体而言，通过制造表达该病毒F蛋白的细胞、在该细胞中培养该缺陷型病毒，在从该细胞反式供给的F蛋白存在的情况下，使得F蛋白保持于病毒包膜上，从而构建具有感染能力的病毒颗粒。从通过该增殖系统制备的培养上清液回收的人副流感2型病毒颗粒的基因组中，F基因是缺失的。当预先向该F基因缺陷型人副流感2型病毒载体中引入治疗用基因、编码疫苗抗原的基因时，可获得作为医药品有用的病毒颗粒。
一般情况下病毒的膜蛋白质具有细胞毒性，因此以往必须要通过导入以病毒F基因等在诱导型启动子控制下表达的方式设计的载体来建立细胞株，平常时抑制F基因等的表达，仅在病毒感染表达F基因等的辅助细胞而被重构时才使得F基因等被诱导表达。例如，与上述仙台病毒载体相关的现有技术文献(WO2000/070070)中，使用了下述系统：其中使用Cre-loxP诱导系统，宿主细胞增殖时仙台病毒的F基因不表达，通过在细胞感染病毒时添加腺病毒来诱导表达。
但是，在病毒载体的商业制造中，必须有准备并添加腺病毒的步骤，故操作烦杂，另外，通过腺病毒的基因导入效率也不是一定的，因此存在医药品制造管理步骤复杂的问题。并且，在实际使用膜蛋白质的表达诱导系统制造病毒载体的步骤中，培养细胞使得病毒颗粒增殖的情况下，存在下述问题：因为表达膜蛋白质具有毒性，随着对宿主细胞进行传代，病毒的增殖能力降低，经约5代的传代，病毒的产生能力就基本消失了。
因此，作为能表达编码病毒中缺陷的膜蛋白质等的基因、且使缺陷型病毒载体增殖的细胞，人们在寻求能恒定地稳定地表达该蛋白的细胞系。并且，人们在寻求传代之后性质不变、具有牢靠性的宿主细胞系。
本说明书中引用的参考文献如下文所示。这些文献中记载的内容均通过参考并入本说明书。这些文献均不被认为是相对于本说明书的现有技术。
专利文献1：WO94/28152
专利文献2：WO2006/084746
专利文献3：WO2000/070070
专利文献4：PCT/JP2010/069435
技术实现要素：
本发明的目的在于作为使人副流感2型病毒的F基因缺陷的病毒增殖的细胞，提供一种能恒定地稳定地表达人副流感2型病毒的F蛋白的细胞系，以及提供利用上述细胞制造F基因缺陷型人副流感2型病毒载体的方法。
本发明的发明人等发现Vero细胞作为能感染人副流感病毒2型病毒F基因缺陷型病毒、产生病毒颗粒的包装细胞，具有优秀的性质。出人意料地确认到，Vero细胞对人副流感2型病毒F蛋白的容许性特别高，另外不表达干扰素，即使在使得人副流感2型病毒的F基因恒定表达的情况下也能稳定增殖，并且能高效产生病毒颗粒。
即，本发明提供了非增殖型人副流感2型病毒载体的制造方法。该方法包括下述各步骤：
将F基因缺陷的人副流感2型病毒与Vero细胞共培养，所述Vero细胞具有非诱导性表达人副流感2型病毒的F基因的形式，然后从培养上清液中分离病毒颗粒。
本发明的方法的优选的实施方式中，向F基因缺陷的人副流感2型病毒的基因中引入疫苗用基因或治疗用基因。
根据其他观点，本发明提供了以非诱导性表达的形式具有人副流感2型病毒的F基因的Vero细胞。
通过使用本发明的方法，能稳定、高效地制造非增殖型的人副流感2型病毒载体。
附图说明
[图1]图1表示人副流感2型病毒的颗粒构造及基因组。
[图2]图2表示：通过RT-PCR法确认到在长期培养后(1年左右)的F基因表达Vero细胞中F基因表达，F基因的表达被维持。
[图3]图3表示Western印迹图，其中确认到在F基因导入Vero细胞中F蛋白表达。
[图4]图4表示含有人副流感2型病毒(缺失F基因)的反义基因组cDNA及GFP基因的质粒结构的一部分。
[图5]图5表示Western印迹图，其中确认到保持有M2基因、F基因缺陷的hPIV2表达M2蛋白。
具体实施方式
本发明提供了使用Vero细胞(以非诱导性表达的形式具有人副流感2型病毒的F基因)、使F基因缺陷的人副流感2型病毒增殖的方法。
人副流感2型病毒是属于副粘病毒科的病毒，其基因组为约15,000个碱基的单顺反子单链负RNA。图1示出了人副流感2型病毒(hPIV2)的基本颗粒结构。核壳蛋白(NP)结合至该核酸，形成螺旋对称核糖核苷蛋白复合体(核壳RNP)。病毒基因组编码的蛋白质中，NP蛋白、P(磷酸)蛋白及L(大，Large)蛋白是RNP的形成所必需的。F(融合)蛋白及HN(血细胞凝集素·神经氨酸酶)蛋白是包膜蛋白，其对于对细胞的感染来说是重要的。M(基质)蛋白是支持包膜结构的膜蛋白。
人副流感2型病毒是在感染细胞的细胞质中增殖的RNA病毒，因此基因不被引入宿主细胞的染色体中。另外，已知该病毒感染人气管粘膜、通过诱导IgA的表达从而诱导粘膜免疫，并且迄今为止没有成人的重症报道病例，故而考虑将其作为疫苗用病毒载体或治疗用病毒载体是极为有用的。
将人副流感2型病毒改变为表达NP蛋白、P蛋白及L蛋白、但不表达F蛋白时，病毒颗粒能感染细胞1次，但在该细胞中不能产生具有感染能力的病毒颗粒。因此，作为治疗·疫苗用病毒载体具有安全性高的优点。
本发明的人副流感2型病毒的F蛋白表达Vero细胞，是有用的宿主细胞，其可用于使这样的病毒基因组的F基因缺陷型病毒增殖，制造F基因缺陷的病毒颗粒。
“Vero细胞”是全世界中广泛使用的细胞株，其是源自非洲绿猴的肾脏上皮的培养细胞，具有不产生干扰素的特征，多用于病毒感染实验·疫苗生产中等等。本发明中，也可使用任何市售的Vero细胞。
“F基因”是编码人副流感2型病毒的F蛋白的基因，本说明书中的该用语不限于病毒基因的基因组RNA，也用于表示具有对应的序列或其互补序列的任何DNA及RNA。
“非诱导性表达”是指被设计为进行并非诱导表达系统那样的表达、不施加诱导操作而表达。此处，诱导表达系统表示下述由宿主/载体和培养条件的组合而成的系统，其被设计为不进行诱导操作时或进行抑制操作时不表达、而仅在进行了诱导操作时或解除了抑制操作时表达。本技术领域中已知多种诱导表达系统。非诱导性表达表示不进行诱导操作或不进行抑制操作的解除而表达。典型地，虽然非诱导性表达为恒定表达，但本发明中的“非诱导性”的表达也包含在细胞分裂、细胞周期的特定时期表达被抑制的情况，以及培养温度、培养基组成、细胞密度等培养条件造成表达被抑制的情况。
为了制造本发明的F蛋白表达Vero细胞，首先制备具有F基因及标志物(例如药剂耐性)的重组质粒载体，将其转染进Vero细胞。F基因的序列是已知的，通过将F基因引入市售的合适质粒载体，能容易地来制造重组质粒载体。就转染而言，可使用各种市售的转染用试剂或通过电穿孔，根据既有方法进行。接着，利用标志物鉴定转化体、分离并扩大培养。可通过下述方法对转化的Vero细胞中F蛋白的表达进行分析：通过抗体的免疫染色、如下文实施例中所示那样通过Western印迹来分析蛋白质水平的表达或通过RT-PCR等来分析RNA水平的表达。或者，还可通过观察感染细胞的细胞融合中的多核体形成，来确认F蛋白的表达。“多核体形成”是指：通过F蛋白和受体结合蛋白HN(其为病毒不同的膜蛋白质)在相同细胞内的共同表达，邻接的细胞融合、形成多个细胞核聚集的巨大细胞。将含有HN基因的质粒转染进预期能导入F基因的Vero细胞，如果能够确认多核体形成，就能确认该细胞功能性表达F基因。由此，可对表达F基因的所期望的重组Vero进行克隆。
就本发明的其他观点而言，提供了F基因缺陷的非增殖型人副流感2型病毒载体的制造方法。该方法含有下述各步骤：将F基因缺陷的人副流感2型病毒与本发明的以非诱导性表达的形式具有人副流感2型病毒的F基因的Vero细胞共培养，然后从培养上清液分离病毒颗粒。
“病毒载体”是指：在已感染的细胞中应当表达的基因与病毒基因组基因一起被包装而成的病毒颗粒。
F基因缺陷的病毒基因组基因可如下构建：使用惯用的基因重组技术，从含有与hPIV2的全基因组基因对应的反义cDNA的质粒，使F基因的全部或一部分区域缺失、或向F基因的一部分中导入终止密码子突变，由此来构建。为了避免由于给予受试者的病毒载体突然突变而导致再度获得F基因功能，优选将F基因全部缺失。更优选地，本发明的非增殖型病毒载体被设计为含有用于引入各种治疗用基因的克隆位点。
为了由F基因缺陷的病毒基因组基因制造F基因缺陷型病毒颗粒，将以F基因缺陷的病毒基因组基因在T7启动子的控制下表达的方式构建而成的质粒，与表达hPIV2的F蛋白及聚合酶单元(NP蛋白、P蛋白及L蛋白)的4种载体一起转染进表达T7RNA聚合酶的细胞，或与表达T7聚合酶的质粒一起将hPIV2的聚合酶单元(NP蛋白、P蛋白及L蛋白)转染进表达F基因的Vero。培养感染的细胞3～6天后，可从培养上清液回收F基因缺陷型病毒颗粒。
用由此得到的F基因缺陷型病毒颗粒来使本发明的表达F基因的Vero细胞感染时，病毒颗粒在细胞内增殖，虽然是F基因缺陷型病毒颗粒，但是其自身产生在病毒包膜上具有F蛋白的感染性病毒颗粒。
在本发明的一种优选实施方式中，在基于F基因缺陷的人副流感2型病毒的病毒载体中引入治疗用·疫苗用基因，用根据本发明的方法获得的非增殖型病毒载体感染靶标细胞，由此能够来向靶标细胞中导入治疗用基因。治疗用基因是在感染的细胞中应当表达的基因，作为例子，可举出编码来自包括人在内的哺乳动物的蛋白或其部分的基因、编码癌抗原或其部分的基因、来自细菌或病毒的基因、编码治疗用抗体或其部分的基因、及这些基因的片段、以及向这些基因中导入了突变的基因。含有来自细菌或病毒的基因或其片段的病毒载体可作为疫苗使用。对于向人副流感2型病毒的基因中引入治疗用基因，可根据既有方法、使用惯用的重组DNA技术及逆向遗传学技术来进行。
典型地，根据本发明制造的病毒载体可作为喷雾剂给予包括人在内的哺乳动物细胞。喷雾剂可通过既有方法来制备。例如，可通过下述方法进行制备：根据需要对含有病毒载体的培养上清液进行浓缩，将其与合适的载体或赋形剂一起悬浮于PBS等缓冲液或生理盐水中，之后根据需要用过滤器等过滤灭菌，接着填充进无菌容器。还可以根据需要向喷雾剂中添加稳定剂、保存剂等。由此得到的表达载体可对受试者进行吸入给药。
在本说明书中使用时，通过“包含/含有/包括(comprising)”这样的表述表达的形式包含以“基本上由......组成(essentially consisting of)”的表述所表示的形式以及以“由......组成(consisting of)”的表述所表示的形式。
本说明书中明确引用的所有专利及参考文献的内容全部都通过参考引入本说明书中。
实施例
下文中通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1F基因表达Vero细胞的制造
向保持有新霉素耐性基因(Neo)并且保持有鸟β肌动蛋白启动子序列及兔β球蛋白polyA序列的质粒中导入从hPIV2的基因组基因中切割出的F基因，构建质粒pCXN2-F。作为对照，使用质粒pCAL-F，其被构建为能通过Cre-loxP诱导系统表达F基因。使用amaxa公司的Nucleofector，将上述质粒转染进Vero细胞。
在含有新霉素(1mg/m1)的培养基中培养经转染的细胞，通过新霉素药剂耐性进行筛选。从导入了pCXN2-F的细胞分离出20株药剂耐性菌落，从导入了pCAL-F的细胞分离出27株药剂耐性菌落，分析F基因的表达。此时，用pCAL-F作为质粒的情况下，感染保持Cre基因的腺病毒，通过用loxP序列除去不需要的基因片断，诱导F基因表达。
接着，确认了多核体形成。制作保持HN基因的质粒SRa-HN，使用Nucleofector，将该质粒转染进得到的新霉素耐性Vero细胞中。1天或2天后在显微镜下观察多核体形成，对形成多核体的细胞作为F基因表达细胞进行二次筛选。在从导入了pCXN2-F的细胞中分离出的20个克隆中，l2个克隆显示了形成多核的能力。
接着，通过RT-PCR在RNA水平上测定F基因的表达。作为其结果，从导入了pCXN2-F的细胞中分离出的20个克隆中，12个克隆显示了形成多核的能力，其中9个克隆在RT-PCR中为阳性。此外，从导入了pCAL-F的细胞中分离出的27个克隆中，9个克隆显示了形成多核的能力，其中7个克隆在RT-PCR中为阳性。另外，用通过pCXN2-F导入F基因并培养了1年的2×106个Vero细胞进行一步式(One-Step)RT-PCR(QIAGEN)。存在F基因缺陷型病毒基因组的情况下，将引物设定为在550bp附近获得PCR扩增产物来进行PCR。作为其结果，针对不同的3个克隆分别进行的PCR中，在550bp附近确认到PCR扩增产物的条带。能确认F基因依然在表达(图2)。即，能以与诱导表达F基因的Vero细胞相当的效率获得恒定表达F基因的Vero细胞，并且能长时间稳定地持续表达。这表明：Vero细胞对F蛋白的容许性高，即使是恒定地长时间表达F基因的情况下也能稳定地进行增殖。
接着，对F基因表达Vero细胞中的F蛋白表达进行确认。对于9.5×105个F基因表达Vero细胞，使用1ml的0.03％Sulfo-NHS-LC-生物素溶液，对细胞膜上存在的所有蛋白进行生物素化，在温和条件下制作500μl的细胞裂解液。接着以80μl的F蛋白质特异性抗体对300μl细胞裂解液进行免疫沉降法，仅F蛋白与抗体结合，对其进行选择性回收、浓缩。对该样品全部进行SDS-PAGE，转印到PVDF膜上。此时，F蛋白已经成为被生物素化的状态，通过亲和素-生物素复合体(avidin-biotin complex)法形成亲和素-生物素复合体。因为亲和素被辣根过氧化物酶(HRP)标记过，所以与ECL试剂反应、通过HRP的发光检测到了被生物素化的F蛋白(图3)。
实施例2F基因缺陷型反义hPIV2基因组的构建
使含有全部F基因编码区域的序列从质粒(该质粒在T7启动子下游含有对应于hPIV2的全基因组基因的反义cDNA)上完全缺失，构建了在NotI限制性位点引入了GFP(绿色荧光蛋白)基因的质粒(hPIV2-ΔF-GFP)(图4)。构建如下进行：以含有hPIV2的基因组基因的质粒作为模板、使用基于F基因上游区域和下游区域的序列设计的引物和从市售的含GFP的载体上切割出的GFP基因片断、通过多阶段PCR来进行的。
实施例3使用了F表达Vero细胞的F基因缺陷型病毒颗粒的回收
使用Lipofectamine或FUGENE6作为转染试剂，将实施例2中制造的质粒(hPIV2-ΔF-GFP)转染进表达T7RNA聚合酶的细胞。此时，一起转染了表达hPIV2的F蛋白及聚合酶单元(NP蛋白、P蛋白及L蛋白)的共计4种载体。
培养3天后，回收上清液，感染F基因表达Vero细胞或不表达F基因的通常的Vero细胞，感染6天后，观察GFP荧光。对于F基因表达Vero细胞，细胞全部都确认到GFP荧光。而另一方面，对于通常的Vero细胞，呈现GFP荧光的细胞数量与F基因表达Vero细胞相比要少得多。
接着，回收呈现GFP荧光的F基因表达Vero细胞的培养上清液，在培养皿上感染另外的F基因表达Vero细胞，回收该培养上清液。重复该操作3次后，取1.5ml培养上清液，以1000x g离心1分钟，除去残渣。将上清液以20,000x g离心30分钟，除去上清液，将沉淀物悬浮于20μl不含RNAase的水中。取0.5μl，对其进行一步式RT-PCR(QIAGEN)。PCR的结果，以在存在F基因缺陷型病毒基因组的情况下存在约400bp、在GFP基因插入的情况下存在约500bp的方式，分别设定引物。作为其结果，在分别的PCR中，于400bp附近和500bp附近确认到PCR扩增产物的条带。由此认为可回收F基因缺陷型的PIV2病毒。
将如上所述得到的GFP表达F基因表达Vero细胞的培养上清液通过0.45μm径的过滤器，除去了残渣。对该培养上清液顺次地进行10倍稀释，感染不表达F基因的Vero细胞。3天后确认到了呈现GFP的荧光的细胞。作为其结果，发现了呈现GFP荧光的细胞，GFP阳性细胞的数量与稀释成比例地减少。由此确认到F基因表达Vero细胞的培养上清液中存在F基因缺陷型hPIV2病毒，该病毒已感染了不表达F基因的Vero细胞。需要注意的是，从不表达F基因的Vero细胞的培养上清液中没有获得具有感染性的病毒颗粒。
另外，用保持GFP基因的F基因缺陷的hPIV2病毒感染小鼠NIH-3T3细胞之后，虽然观察到GFP阳性NIH-3T3细胞的存在，但感染效率比Vero细胞低。
实施例4表达流感病毒(influenza virus)的病毒M2蛋白的F基因缺陷型PIV2病毒的制造
与实施例2相同地，构建在F基因缺陷型反义hPIV2基因组的NotI限制性位点引入了存在于流感病毒的病毒脂质膜上的M2蛋白(M2离子通道)基因的质粒(hPIV2-ΔF-M2)。与实施例3相同地，使用Lipofectamine或FUGENE6作为转染试剂，转染进表达T7RNA聚合酶的细胞。此时，一起转染了表达hPIV2的F蛋白及聚合酶单元(NP蛋白、P蛋白及L蛋白)的共计4种载体。接着，以与实施例3相同的方法进行病毒回收，用保持M2基因且F基因缺陷的hPIV2感染表达了F基因的Vero细胞(2×106个)，2天后回收细胞，使用M2抗体对其进行Western印迹分析。作为其结果，能确认M2的表达(图5)。即，确认到即使除GFP以外的基因，也能回收F基因缺陷型的PIV2病毒。
从上述结果可知，通过使用表达F基因的Vero细胞，可回收F基因缺陷的非增殖型hPIV2病毒，该病毒可仅在F基因表达细胞中增殖，虽然在不表达F基因的细胞中能感染1次，但不产生感染性病毒。
产业上的利用可能性
本发明可用于基因治疗用的病毒载体的制造。