本实用新型涉及一种试剂盒，具体涉及一种检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
流行性感冒（influenza，简称流感）是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，临床上具有高热、乏力、全身肌肉酸痛和轻度呼吸道等症状，该疾病病程短，有自限性，中年人伴有慢性呼吸道疾病或心脏病患者易并发肺炎；流感病毒，尤其是甲型流感病毒极易变异，容易爆发大规模流行；其中甲型H1N1流感病毒传播速度快，可由人传染给猪，猪传染给人，也可在人群间传播；目前国内外检验确诊的方法主要有：1）甲型H1N1流感病毒的核酸扩增，2）细胞培养的方法分离鉴定甲型H1N1流感病毒，3）甲型H1N1流感抗原检查，4）血清学检查等，但这些方法都费时耗力，不适于快速的检验诊断；而目前对病毒检测最有效、最灵敏、最准确的方法就是荧光定量PCR(聚合酶链式反应 )；PCR技术已广泛应用于动物疫病检测，该技术主要是基于病原微生物核酸的特异性，针对靶标设计特异性引物对DNA或RNA片段进行指数扩增；实时荧光PCR技术由传统PCR技术发展而来，实时荧光PCR在反应体系中加入标记荧光基团的探针，在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序来即时分析DNA或RNA样本的拷贝数；实时荧光PCR与传统PCR法相比，一方面加入的TaqMan探针在反应中只与模板的特异序列结合，不进行延伸，减少错配，提高检测准确性和特异性；另一方面实时荧光PCR在封闭的体系中进行扩增和实时检测，无需电泳就可以对结果进行分析，避免了传统PCR产物的污染，自动化程度高，重复性好，检测周期短，广泛应用于科研和临床检测；因此，应用荧光PCR技术建立甲型H1N1流感病毒检测方法对于快速、准确的检测甲型H1N1流感病毒具有重要的意义。
技术实现要素：
为解决上述问题，本实用新型提出了一种检测试剂盒，能够对特异型体系的甲型H1N1流感病毒及通用型的甲型流感病毒进行双重检测，检测结果可信度更高。
本实用新型的检测试剂盒，包括试剂盒体；所述试剂盒体由PCR检测试剂存储仓及质控品存储仓构成；所述PCR检测试剂存储仓包括甲型流感病毒PT-PCR反应液存储管、甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液存储管、PT-PCR缓冲液存储管和酶混合液存储管；所述质控品存储仓由阴性质控品存储管、甲型H1N1阳性质控品存储管和甲型阳性质控品存储管组成；
所述甲型流感病毒PT-PCR反应液存储管中存放有甲型流感病毒PT-PCR反应液；所述甲型流感病毒PT-PCR反应液由甲型流感病毒特异引物和甲型流感病毒TaqMan荧光探针组成；所述甲型流感病毒特异引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物如Seq ID No.1所示序列；所述反向引物如Seq ID No.2所示序列；所述甲型流感病毒TaqMan荧光探针如Seq ID No.3所示序列；
Seq ID No.1：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
Seq ID No.2：5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
Seq ID No.3：5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMRA -3’；
所述甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液存储管中存放有甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液；所述甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液由甲型H1N1流感病毒特异引物和甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针组成；所述甲型H1N1流感病毒特异引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物如Seq ID No.4所示序列；所述下游引物如Seq ID No.5所示序列；所述甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针如Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.4：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
Seq ID No.5：5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
Seq ID No.6：5’-HEX-ACGACACCACGCCCCCTCAGATT-BHQ-3’；
所述PT-PCR缓冲液存储管中装有2×PT-PCR缓冲液；
所述酶混合液存储管中存放有酶混合液；所述酶混合液由聚合酶和逆转录酶组成；
所述阴性质控品存储管放置有阴性质控品；所述阴性质控品为不含有引物对扩增靶标序列片段的慢病毒的空载溶液；
所述甲型阳性质控品存储管放置有甲型阳性质控品；所述甲型阳性质控品为含有引物对扩增靶标序列片段的慢病毒溶液，靶标序列片段基因如Seq ID No.7所示序列；
Seq ID No.7：5’-AAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTG
TGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAA-3’；
所述甲型H1N1阳性质控品存储管放置有甲型H1N1阳性质控品；所述甲型阳H1N1性质控品为含有引物对扩增靶标序列片段的慢病毒溶液，靶标序列片段基因如Seq ID No.8所示序列；
Seq ID No.8：5’-TCAAAAGAAGTGAACGCCAAAATTGAACCATTCTTGAG
GACGACACCACGCCCCCTCAGATTGCCTGATGGGCCTCTTTGCCATCAGCGGTCAAAGTTCCTG-3’。
进一步地，所述甲型流感病毒TaqMan荧光探针其5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，其3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明；所述甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针其5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，其3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明。
进一步地，所述阴性质控品为灭菌焦碳酸二乙酯水。
进一步地，所述聚合酶为热启动Ex Taq酶。
进一步地，所述逆转录酶为PrimeScript逆转录酶。
再进一步地，所述酶混合液由热启动Ex Taq酶和PrimeScript逆转录酶以体积比1：1混合组成。
作为优选的实施方案，所述试剂盒体中还放置有ROX校正液存储管。
本实用新型的检测试剂盒置于-20~4℃保存。
本实用新型的检测试剂盒的使用方法如下：
每次检测可根据不同反应体系及PCR仪的需要，按比例配制试剂盒体中的各组份；且每次检测均设立相应的阳性对照和阴性对照；优选的，实时荧光RT-PCR检测的反应体系为50μL，包括2×RT-PCR缓冲液 25μL，甲型流感病毒TaqMan荧光探针 1μL，甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针 1μL，正向引物和反向引物各 1μL，上游引物和下游引物各1μL，热启动Ex Taq酶 1μL，PrimeScript逆转录酶 1μL，甲型H1N1 RNA模板溶液 4μL，ROX校正液 1μL，并加灭菌焦碳酸二乙酯水定容至50μL；
实时荧光定量PCR反应过程如下：反转录：42℃ 5分钟，反转录酶灭活：95℃ 10秒；40个循环：95℃ 5秒→60℃ 31秒；
荧光定量PCR检测，荧光定量RT-PCR结束后，PCR仪器将自动记录保存每个循环的荧光信号，分别选中荧光通道FAM、HEX进行阈值调整后，通过观察甲型流感病毒和甲型H1N1流感病毒的扩增曲线及Ct值进行结果判断。
本实用新型与现有技术相比较，本实用新型的检测试剂盒，能够对特异型体系的甲型H1N1流感病毒及通用型的甲型流感病毒进行双重检测，检测结果可信度更高；通过双重检测甲型H1N1流感病毒，检测结果相互印证，使检测结果更加可靠；通过使用本检测试剂盒可迅速准确检测甲型流感病毒及流行的甲型H1N1流感病毒，在开展早期大规模筛查及有效地控制疾病的迅速传播等方面，都具有重要意义。
附图说明
图1是本实用新型的整体结构示意图。
图2是本实用新型的实施例1中检测试剂盒的实时荧光PCR扩增曲线，
其中，A代表甲型流感病毒扩增曲线，B代表H1N1流感病毒扩增曲线，C代表灭菌焦碳酸二乙酯水曲线。
图3是本实用新型的实施例2中检测试剂盒的灵敏度检测结果示意图。
附图1中各部件标注为：1-试剂盒体，2-甲型流感病毒PT-PCR反应液存储管，3-甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液存储管，4- PT-PCR缓冲液存储管，5-酶混合液存储管，6-阴性质控品存储管，7-甲型H1N1阳性质控品存储管，8-甲型阳性质控品存储管，9-ROX校正液存储管。
具体实施方式
实施例1：
如图1所示的检测试剂盒，包括试剂盒体1；所述试剂盒体1由PCR检测试剂存储仓及质控品存储仓构成；所述PCR检测试剂存储仓包括甲型流感病毒PT-PCR反应液存储管2、甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液存储管3、PT-PCR缓冲液存储管4、酶混合液存储管5；所述质控品存储仓由阴性质控品存储管6、甲型H1N1阳性质控品存储管7和甲型阳性质控品存储管8组成；
所述甲型流感病毒PT-PCR反应液存储管2中存放有甲型流感病毒PT-PCR反应液；所述甲型流感病毒PT-PCR反应液由甲型流感病毒特异引物和甲型流感病毒TaqMan荧光探针组成；所述甲型流感病毒特异引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物如Seq ID No.1所示序列；所述反向引物如Seq ID No.2所示序列；所述甲型流感病毒TaqMan荧光探针如Seq ID No.3所示序列；
Seq ID No.1：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
Seq ID No.2：5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
Seq ID No.3：5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-TAMRA -3’；
所述甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液存储管3中存放有甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液；所述甲型H1N1流感病毒PT-PCR反应液由甲型H1N1流感病毒特异引物和甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针组成；所述甲型H1N1流感病毒特异引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物如Seq ID No.4所示序列；所述下游引物如Seq ID No.5所示序列；所述甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针如Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.4：5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’；
Seq ID No.5：5’-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3’；
Seq ID No.6：5’-HEX-ACGACACCACGCCCCCTCAGATT-BHQ-3’；
所述PT-PCR缓冲液存储管4中装有2×PT-PCR缓冲液；
所述酶混合液存储管5中存放有酶混合液；所述酶混合液由聚合酶和逆转录酶组成；
所述阴性质控品存储管6放置有阴性质控品；所述阴性质控品为不含有引物对扩增靶标序列片段的慢病毒的空载溶液；
所述甲型阳性质控品存储管7放置有甲型阳性质控品；所述甲型阳性质控品为含有引物对扩增靶标序列片段的慢病毒溶液，靶标序列片段基因如Seq ID No.7所示序列；
Seq ID No.7：5’-AAGACCAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGATTTG
TGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAA-3’；
所述甲型H1N1阳性质控品存储管8放置有甲型H1N1阳性质控品；所述甲型阳H1N1性质控品为含有引物对扩增靶标序列片段的慢病毒溶液，靶标序列片段基因如Seq ID No.8所示序列；
Seq ID No.8：5’-TCAAAAGAAGTGAACGCCAAAATTGAACCATTCTTGAG
GACGACACCACGCCCCCTCAGATTGCCTGATGGGCCTCTTTGCCATCAGCGGTCAAAGTTCCTG-3’。
所述甲型流感病毒TaqMan荧光探针其5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，其3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明；所述甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针其5’端的荧光基团为6-羧基荧光素，其3’端的淬灭剂为6-羧基四甲基若丹明。
所述阴性质控品为灭菌焦碳酸二乙酯水。
所述聚合酶为热启动Ex Taq酶。
所述逆转录酶为PrimeScript逆转录酶。
所述酶混合液由热启动Ex Taq酶和PrimeScript逆转录酶以体积比1：1混合组成。
所述试剂盒体1中还放置有ROX校正液存储管9。
本实用新型的检测试剂盒置于-20~4℃保存。
本实用新型的检测试剂盒的使用方法如下：
每次检测可根据不同反应体系及PCR仪的需要，按比例配制试剂盒体中的各组份；且每次检测均设立相应的阳性对照和阴性对照；优选的，实时荧光RT-PCR检测的反应体系为50μL，包括2×RT-PCR缓冲液 25μL，甲型流感病毒TaqMan荧光探针 1μL，甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光探针 1μL，正向引物和反向引物各 1μL，上游引物和下游引物各1μL，热启动Ex Taq酶 1μL，PrimeScript逆转录酶 1μL，甲型H1N1 RNA模板溶液 4μL，ROX校正液 1μL，并加灭菌焦碳酸二乙酯水定容至50μL；
实时荧光定量PCR反应过程如下：反转录：42℃ 5分钟，反转录酶灭活：95℃ 10秒；40个循环：95℃ 5秒→60℃ 31秒；
荧光定量PCR检测，荧光定量RT-PCR结束后，PCR仪器将自动记录保存每个循环的荧光信号，分别选中荧光通道FAM、HEX进行阈值调整后，通过观察甲型流感病毒和甲型H1N1流感病毒的扩增曲线及Ct值进行结果判断；
质量控制：阴性对照无荧光对数增长，未检测到Ct值；阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道FAM、HEX出现典型的扩增曲线；
本实用新型检测试剂盒结果判断：如图2所示，Ct值≥35.0或无Ct值时，为阴性；Ct值<35时，为阳性。
实施例2：
本实用新型的检测试剂盒的灵敏度检测，先采用传统的Trizol方法提取甲型H1N1流感病毒的RNA；接着，对提取的甲型H1N1流感病毒的RNA样品进行核酸浓度测定，并制备以十倍比稀释（10 0~10 7）的模板，然后按照实施例1的方法进行实时RT-PCR检测，2个重复；如图3所示，由左至右依次为稀释度为10 7~10 0的模板，7个稀释度均有明显的扩增曲线，而阴性对照没有扩增曲线，无Ct值；结果显示所建立的实时荧光定量PCR体系所能检测到至少2个拷贝的模板，具有较高的灵敏度。
甲型H1N1流感病毒RNA的提取方法，具体步骤如下：
第一步，200~400ul样本加入0.5ml Trizol(咽拭子来源或病毒培养液)，反复震荡，抽吸以利于细胞裂解，室温下孵育 5分钟；
第二步，加入0.1ml的氯仿并震荡至乳糜化，室温下孵育10分钟，4℃ 12000rpm下离心15分钟，取上清液，转移至另一个1.5mlEP管；
（3）加入0.1ml的异丙醇，室温下孵育10分钟，4℃ 12000rpm下离心15分钟；去掉上清液，将管倒置在吸水纸上，稍微风干；
（4）加入0.5ml的75%乙醇洗涤RNA，4℃ 7500rpm下离心5分钟，倒置于吸水纸上，除去上清液后室温下静置5分钟；
（5）用焦碳酸二乙酯水20ul溶解RNA，并置于-20~4℃保存备用。
实施例3：
本实用新型的检测试剂盒的特异性检测，对甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、B型临床分离样品及正常人体DNA分别用甲型检测试剂和甲型H1N1检测试剂进行检测，甲型试剂检测结果Ct值分别为 19、29.7、39及0；甲型H1N1试剂检测结果Ct值分别为 19.4、0、0及0；检测结果表明甲型H3N2流感病毒和甲型H5N1流感病毒均为甲型流感病毒阳性样本，但为甲型H1N1流感病毒阴性样本；B型临床分离样品和正常人体DNA为甲型流感病毒阴性样本，同时为甲型H1N1流感病毒阴性样本；甲型H1N1流感病毒为甲型流感病毒阳性样本，同时为甲型H1N1流感病毒阳性样本；结果显示，试剂盒具有良好的特异性，能够对特异型体系的甲型H1N1流感病毒及通用型的甲型流感病毒进行双重检测，检测结果可信度更高；通过双重检测甲型H1N1流感病毒，检测结果相互印证，使检测结果更加可靠。
上述实施例，仅是本实用新型的较佳实施方式，故凡依本实用新型专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本实用新型专利申请范围内。