本发明涉及样品中的HDL亚组分中的胆固醇的测定方法、测定用试剂以及测定用试剂盒。
背景技术：
高密度脂蛋白(HDL)为脂蛋白之一，具有1.063～1.210的比重。已知HDL中的胆固醇(HDL-C)是冠状动脉疾病(CHD)的负面危险因子。近年来，对于作为HDL的亚组分的HDL2和HDL3的临床意义的关注提高。HDL2为比重1.063～1.125的脂蛋白，HDL3为比重1.125～1.210的脂蛋白。从肝脏或肠道分泌出的新生HDL粘着在末梢的细胞膜上，并由此处摄取游离型胆固醇，所摄取的游离型胆固醇由于HDL表面上存在的LCAT(卵磷脂胆固醇酰基转移酶)的作用而转化成酯型胆固醇，得到以该酯型胆固醇为核心的球状的HDL3。HDL3进一步由于LCAT的作用而酯型胆固醇增加，成为HDL2。HDL2中的胆固醇通过两个途径代谢。一个是连同HDL2一起直接被摄入肝脏并以胆汁酸的形式排出的途径，另一个是HDL2中的酯型胆固醇由于CETP(胆固醇酯转移蛋白)的作用与极低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)等中性脂肪丰富的脂蛋白内的中性脂肪交换而转运至该中性脂肪丰富的脂蛋白中的途径(胆固醇逆向转运)。关于HDL亚组分中的胆固醇的测定方法，至今，已知有伴有HDL3与HDL2的分离步骤的沉淀法、没有伴有HDL3与HDL2的分离步骤的匀相法。作为沉淀法，已知：使用肝素、2价金属离子以及硫酸葡聚糖的、利用一个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法(例如，专利文献1、非专利文献1)；利用两个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法(例如，非专利文献2～4)等。利用一个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法是使样品中的HDL3以外的脂蛋白凝聚并分离除去而测定所得到的HDL3中的胆固醇的方法。利用两个阶段的分离操作的、样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法为如下方法：首先，使样品中的HDL以外的脂蛋白凝聚，通过离心分离除去HDL以外的脂蛋白，接着，使所得到的含有HDL的上清液中的HDL2凝聚，通过离心分离除去HDL2，回收上清液中包含的HDL3，测定所得到的HDL3中的胆固醇。作为匀相法，已知使用对HDL显示出高特异性的酶以及HLB值为17以上的非离子性表面活性剂的方法(例如，专利文献2)。正在寻求没有伴有离心分离等烦杂的操作的、简便并且准确的样品中的HDL亚组分中的胆固醇的测定方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2009-207463号公报专利文献2：日本特开2001-346598号公报非专利文献非专利文献1：ジャーナルオブリピッドリサーチ(JournalofLipidResearch)、49卷、5号、1130-1136页(2008年)非专利文献2：クリニカルケミストリ(ClinicalChemistry)、34卷、11号、2322-2327页(1998年)非专利文献3：クリニカルケミストリ(ClinicalChemistry)、36卷、2号、265-270页(1999年)非专利文献4：ジャーナルオブリピッドリサーチ(JournalofLipidResearch)、23卷、8号、1206-1223页(1982年)
技术实现要素：
发明要解决的问题本发明的目的在于提供简便并且准确地测定样品中的HDL亚组分中的胆固醇的方法、试剂以及试剂盒。用于解决问题的方法本发明人为了解决上述问题，反复进行了深入的研究，结果发现如下见解：通过使用胆固醇测定用酶、2价金属盐、特定的碱金属盐以及硫酸葡聚糖或其盐，能够在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定HDL3中的胆固醇，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]～[19]。[1]一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(1)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合或(2)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在水性介质中反应，在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定生成的物质或消耗的物质，上述水性介质含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。[2]如上述[1]所述的方法，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。[3]如上述[1]或[2]所述的方法，其中，硫酸葡聚糖或其盐在反应液中的浓度为0.75～2.6g/L。[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度为12～20毫摩尔/L，反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度为5～21毫摩尔/L。[5]一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定方法，其特征在于，包括以下的步骤：(1)测定样品中的高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇的步骤；(2)通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法测定样品中的HDL3中的胆固醇的步骤；和(3)从上述(1)步骤中测定的测定值中减去(2)步骤中测定的测定值的步骤。[6]一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定用试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，含有胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢测定用试剂、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。[7]一种样品中的HDL3中的胆固醇的测定用试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，含有胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐。[8]如上述[7]所述的试剂，其中，还含有还原型辅酶测定用试剂。[9]如上述[6]～[8]中任一项所述的试剂，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。[10]如上述[6]～[9]中任一项所述的试剂，其中，硫酸葡聚糖或其盐以在反应液中的浓度达到0.75～2.6g/L的含量含有。[11]如上述[6]～[10]中任一项所述的试剂，其中，2价金属盐以在反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度达到12～20毫摩尔/L的含量含有，碱金属盐以在反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度达到5～21毫摩尔/L的含量含有。[12]一种试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，在第一试剂中含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐，在第二试剂中含有胆固醇氧化酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有过氧化氢测定用试剂，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。[13]一种试剂盒，含有第一试剂和第二试剂，用于通过上述[1]～[4]中任一项所述的测定方法在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定样品中的HDL3中的胆固醇，其特征在于，在第一试剂中含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐，在第二试剂中含有胆固醇脱氢酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有氧化型辅酶，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。[14]如上述[13]所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂中的任意一者或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。[15]如上述[12]～[14]中任一项所述的试剂盒，其中，2价金属盐为镁盐或钙盐。[16]如上述[12]～[15]中任一项所述的试剂盒，其中，硫酸葡聚糖或其盐以在反应液中的浓度达到0.75～2.6g/L的含量含有。[17]如上述[12]～[16]中任一项所述的试剂盒，其中，2价金属盐以在反应液中的来自2价金属盐的2价金属离子的浓度达到12～20毫摩尔/L的含量含有，碱金属盐以在反应液中的来自碱金属盐的碱金属离子的浓度达到5～21毫摩尔/L的含量含有。[18]一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定用试剂盒，其特征在于，含有上述[6]～[11]中任一项所述的HDL3中的胆固醇测定用试剂和HDL胆固醇测定用试剂。[19]一种样品中的HDL2中的胆固醇的测定用试剂盒，其特征在于，含有上述[12]～[17]中任一项所述的HDL3中的胆固醇测定用试剂盒的第一试剂和第二试剂以及HDL胆固醇测定用试剂。发明效果通过本发明，能够提供简便并且准确地测定样品中的HDL亚组分中的胆固醇的方法、试剂以及试剂盒。具体实施方式<HDL3中的胆固醇的测定方法>本发明的样品中的HDL3中的胆固醇(以下记为HDL3-C)的测定方法，是无需利用离心分离等物理方法进行脂蛋白的分离除去的方法，而且是在HDL3-C的测定之前没有除去样品中的HDL3以外的脂蛋白中的胆固醇的情况下测定样品中的HDL3-C的方法。本发明的HDL3-C测定方法的特征在于，使样品与胆固醇测定用酶在含有(a)镁盐或钙盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的水性介质中反应，在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定生成的物质或消耗的物质。作为胆固醇测定用酶，可以列举例如：胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、以及胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合等。本发明的测定方法包括：(1)使样品与胆固醇测定用酶在含有(a)2价金属盐、(b)选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐和卤化物组成的组中的碱金属盐以及(c)硫酸葡聚糖或其盐的水性介质中反应的步骤；(2)在没有分离除去HDL3以外的脂蛋白的情况下测定通过步骤(1)的反应生成的物质或消耗的物质的步骤；(3)使预先使用已知浓度的HDL3-C制作的标准曲线与上述(2)中的测定值相关的步骤，其中，所述标准曲线表示HDL3-C浓度与来自该生成的物质或该消耗的物质的信息量的关系；以及(4)确定样品中的HDL3-C浓度的步骤。在此，作为步骤(1)中的胆固醇测定用酶，可以列举上述胆固醇测定用酶等。作为步骤(2)中的、通过步骤(1)的反应生成的物质，在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，可以列举过氧化氢等，在使用胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，可以列举还原型辅酶等。作为步骤(2)中的、通过步骤(1)的反应消耗的物质，在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，可以列举氧气分子等。本发明的测定方法中，通过样品与胆固醇酯水解酶以及胆固醇氧化酶的反应生成的过氧化氢，可以使用例如过氧化氢电极或后述的过氧化氢测定用试剂来测定。本发明的测定方法中，通过样品与胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶以及胆固醇脱氢酶的反应生成的还原型辅酶，可以使用例如吸光度法或后述的还原型辅酶测定用试剂来测定。作为吸光度法，只要是能够使用吸光度测定还原型辅酶的方法，则没有特别限定，可以列举例如：在还原型辅酶的最大吸收波长(λmax＝340nm)附近的波长处测定还原型辅酶的吸光度的方法等。消耗的氧气分子可以使用例如氧电极来测定。作为本发明的测定方法中使用的样品，可以列举例如全血、血浆、血清等，优选血浆以及血清。作为本发明中的胆固醇酯水解酶，只要是具有水解胆固醇酯的能力的酶，则没有特别限定，除了例如来自动物、植物或微生物的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。作为胆固醇酯水解酶，除了无修饰的胆固醇酯水解酶之外，也可以使用经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。另外，作为胆固醇酯水解酶，也可以使用市售品。作为市售的胆固醇酯水解酶，可以列举：胆固醇酯酶(COE-311；东洋纺织公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPL-311；东洋纺织公司制)、胆固醇酯酶(CHE“Amano”3；天野酶株式会社制)、胆固醇酯酶(EST“Amano”2；天野酶株式会社制)等。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇酯水解酶。作为在胆固醇酯水解酶的化学修饰中修饰该酶的基团(化学修饰基团)，可以列举例如：以聚乙二醇作为主要成分的基团、以聚丙二醇作为主要成分的基团、具有聚丙二醇与聚乙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基团等，优选为以聚乙二醇作为主要成分的基团。作为水溶性多糖类，可以列举例如葡聚糖、普鲁兰多糖、可溶性淀粉等。作为用于对胆固醇酯水解酶进行化学修饰的试剂(化学修饰剂)，可以列举同时具有上述化学修饰基团和能与酶的氨基、羧基、巯基等反应的官能团或结构的化合物等。作为能与酶中的氨基反应的官能团或结构，可以列举例如羧基、活性酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酰氯、醛、环氧化物基团、1,3-丙烷磺内酯、1,4-丁烷磺内酯等。作为能与酶中的羧基反应的官能团或结构，可以列举例如氨基等。作为与酶中的巯基具有反应性的基团或结构，可以列举例如马来酰亚胺基、二硫化物、α-卤代酯(α-碘酯等)等。作为化学修饰剂，也可以使用市售品。作为市售的化学修饰剂，可以列举：具有以聚乙二醇作为主要成分的基团和N-羟基琥珀酰亚胺基的サンブライトVFM-4101、サンブライトME-050AS、サンブライトDE-030AS(均为日油公司制)、具有以聚亚烷基二醇作为主要成分的基团和酸酐结构的サンブライトAKM系列(例如，サンブライトAKM-1510等)、サンブライトADM系列、サンブライトACM系列(均为日油公司制)、具有以聚乙二醇作为主要成分的基团和环氧化物基团的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均为SheawaterPolymers公司制)、具备具有螯合功能的基团和酸酐结构的二亚乙基三胺-N,N,N’,N”,N”-五乙酸二酐(DTPAanhydride；同仁化学研究所公司制)等。胆固醇酯水解酶的化学修饰，例如可以通过以下的方法进行，但不限于此方法。首先，将胆固醇酯水解酶溶解在pH8.0以上的缓冲液(例如HEPES缓冲液)中，在0～55℃下添加0.01～500倍摩尔量的化学修饰剂，搅拌5分钟～5小时。酶反应中，作为经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，不仅可以使用该反应液本身，也可以使用根据需要利用超滤膜等除去未反应的化学修饰剂等后而得到的物质。作为本发明的测定方法中的胆固醇酯水解酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.001～800kU/L，优选为0.01～300kU/L。作为本发明中的胆固醇氧化酶，只要是具有将胆固醇氧化而生成过氧化氢的能力的酶，则没有特别限定，例如，除了来自动物、植物或微生物的胆固醇氧化酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇氧化酶等，还可以使用胆固醇氧化酶(CHODI；协和发酵工业公司制)、胆固醇氧化酶(CHODI；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(CHO-CE；キッコーマン公司制)、胆固醇氧化酶(COO321；东洋纺织公司制)、胆固醇氧化酶(COO322；东洋纺织公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇氧化酶。胆固醇氧化酶可以为无修饰的酶，也可以为经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇氧化酶，例如可以使用上述的化学修饰剂通过上述的化学修饰方法来制备。作为本发明的测定方法中的胆固醇氧化酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.001～800kU/L，优选为0.01～300kU/L。作为本发明中的胆固醇脱氢酶，只要是具有在氧化型辅酶存在下将胆固醇氧化而生成还原型辅酶的能力的酶，则没有特别限定，例如，除了来自动物、植物或微生物的胆固醇脱氢酶之外，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇脱氢酶等。还可以使用胆固醇脱氢酶(CHDH“Amano”5；天野酶公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇脱氢酶。胆固醇脱氢酶可以为无修饰的酶，也可以为经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇脱氢酶，例如可以使用上述的化学修饰剂通过上述的化学修饰方法来制作。作为本发明的测定方法中的胆固醇脱氢酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.001～800kU/L，优选为0.01～300kU/L。在本发明的使用胆固醇脱氢酶的测定方法中，使用氧化型辅酶。作为氧化型辅酶，可以列举例如NAD、NADP、硫代-NAD、硫代-NADP等。作为本发明的测定方法中的氧化型辅酶的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，在反应液中的浓度通常为0.01～400毫摩尔/L，优选为0.1～100毫摩尔/L。作为本发明中的还原型辅酶，可以列举例如NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH等。作为本发明中使用的2价金属盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的2价金属盐，则没有特别限定，可以列举例如镁盐、钙盐、锰盐等，优选镁盐或钙盐。另外，本发明中，也可以使用2价金属盐的水合物等。作为镁盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的镁盐，则没有特别限定，可以列举例如氯化镁、硝酸镁、硫酸镁等。作为钙盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的钙盐，则没有特别限定，可以列举例如氯化钙、硝酸钙、硫酸钙等。作为本发明的测定方法中的2价金属盐在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，通常为12～20毫摩尔/L，优选为13～19毫摩尔/L。本发明的测定方法中的碱金属盐，为选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐以及卤化物组成的组中的碱金属盐，可以列举例如：硫酸锂、硝酸锂、碳酸锂、乙酸锂、氟化锂、氯化锂、溴化锂、碘化锂、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、乙酸钠、氟化钠、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硫酸钾、硝酸钾、碳酸钾、乙酸钾、氟化钾、氯化钾、溴化钾、碘化钾等。作为本发明的测定方法中的选自由硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、乙酸盐以及卤化物组成的组中的碱金属盐在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，通常为5～21毫摩尔/L，优选为6～18毫摩尔/L。本发明的测定方法中的硫酸葡聚糖或其盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的硫酸葡聚糖或其盐，则没有特别限定，优选分子量为4万～50万的硫酸葡聚糖或其盐。作为盐，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的盐，则没有特别限定，可以列举例如钠盐等。作为本发明的测定方法中的硫酸葡聚糖或其盐在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定的浓度，则没有特别限定，通常为0.75～2.6g/L，优选为1.0～2.3g/L。本发明中使用的水性介质，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的水性介质，则没有特别限定，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。本发明的HDL3-C测定方法中的pH，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的pH即可，可以列举例如pH4～10。在使用缓冲液作为水性介质的情况下，优选使用与设定的pH对应的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good's缓冲剂等。作为Good's缓冲剂，可以列举例如：2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。缓冲液的浓度只要是适于测定的浓度，则没有特别限定，优选为0.001～2.0摩尔/L，更优选为0.005～1.0摩尔/L。本发明的HDL3-C测定方法中的反应温度，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的温度，则没有特别限定，优选为10～50℃，更优选为30～40℃。通过广泛使用的自动分析装置设定的反应温度通常为37℃。本发明的HDL3-C测定方法中的反应时间，只要是能够进行本发明的HDL3-C测定方法的反应时间，则没有特别限定，优选为1～60分钟，更优选为2～30分钟。本发明的HDL3-C测定方法中，在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合作为胆固醇测定用酶的情况下，HDL3-C的测定可以通过测定由反应生成的过氧化氢的量来进行。生成的过氧化氢的量，可以使用例如过氧化氢电极或过氧化氢测定用试剂来测定。过氧化氢测定用试剂是用于将生成的过氧化氢转化为能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素、发光等，优选色素。在能够检测的物质为色素的情况下，过氧化氢测定用试剂含有氧化发色型色原体以及过氧化物酶等过氧化活性物质。作为氧化发色型色原体，可以列举例如后述的氧化发色型色原体。在能够检测的物质为发光的情况下，过氧化氢测定用试剂含有化学发光物质。作为化学发光物质，可以列举例如鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。在使用含有氧化发色型色原体以及过氧化物酶等过氧化活性物质的试剂作为过氧化氢测定用试剂的情况下，过氧化氢可以通过在过氧化活性物质存在下与氧化发色型色原体反应生成色素并测定生成的色素来进行测定。另外，在使用含有化学发光物质的过氧化氢测定用试剂的情况下，过氧化氢可以通过与化学发光物质反应产生光子并测定产生的光子来进行测定。作为氧化发色型色原体，可以列举例如无色型色原体、氧化偶联发色型色原体等。无色型色原体是能够在过氧化氢以及过氧化物酶等过氧化活性物质存在下单独转变成色素的物质。具体而言，可以列举四甲基联苯胺、邻苯二胺、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)、4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。氧化偶联发色型色原体是在过氧化氢以及过氧化物酶等过氧化活性物质存在下由两种化合物氧化偶联而生成色素的物质。作为两种化合物的组合，可以列举偶联剂与苯胺类的组合、偶联剂与酚类的组合等。作为偶联剂，可以列举例如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙等。作为苯胺类，可以列举N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-...