一种可应用于生物样品前处理的磁性碳纳米管表面分子印迹聚合物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种印迹载体具有功能单体作用、用替代模板技术避免模板泄露的磁性碳纳米管表面分子印迹材料的制备方法。制备过程主要包括四个步骤：磁性碳纳米管的制备、乙烯基修饰的磁性碳纳米管的制备，表面分子印迹聚合反应以及模板分子的洗脱。本发明提供的合成方法简便易行，制得的磁性碳纳米管表面分子印迹材料具有活性中心均匀、特异识别能力强、磁学性能优异、机械强度高、吸附容量大和结合动力学快速等特点。不仅可用于各类固相萃取技术的理想吸附剂或涂层材料、色谱分离填料，也可用于分子印迹传感器及芯片的制备，对喹诺酮类药物特异性识别和高灵敏度检测研究将具有重要意义。
【专利说明】一种可应用于生物样品前处理的磁性碳纳米管表面分子印迹聚合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于磁性碳纳米管表面分子印迹【技术领域】，特别涉及一种采用乙烯基化磁性碳纳米管同时作为功能单体和载体，用喹诺酮药物作为替代模板，通过表面分子印迹技术制备印迹聚合物的方法，该法制得的复合材料对喹诺酮类药物具有特异性识别作用。
【背景技术】
[0002]分子印迹技术是一种高选择性的分离技术，其基本思想源于人们对免疫学领域中抗体-抗原专一性识别作用的认识，利用具有分子识别能力的聚合物材料——分子印迹聚合物(MIP)，来分离、筛选、纯化化合物。分子印迹聚合物与常规的分离或分析介质相比，其突出的优势是对被分离物或分析物具有极高的选择性和亲和性；与生物活性材料相比，又具有制备方便、耐受性好、使用寿命长等长处。数十年来，分子印迹技术在分离提纯、免疫分析、模拟酶以及传感器等方面显示出巨大潜力，成为国内外分离分析科学研究的热点。
[0003]在合适的溶剂中，模板分子与功能单体依靠分子间的作用力形成主客体配合物，再加入交联剂和引发剂后，自由基引发聚合形成高分子聚合物；除去模板分子后，聚合物中留有对模板分子或其结构类似物具有可特异性结合，并且空间匹配的位点，当再次与模板分子或其结构类似物结合时，可以将其选择性识别和富集。目前，常用于制备印记聚合物的方法有:本体聚合、原位聚合、悬浮聚合、分散聚合、表面印迹等多种制备方法。经典方法制得的印迹聚合物有效印迹位点的密度很低，因此对目标分子的结合容量小，结合动力学慢。纳米结构的分子印迹材料具有较高的比表面积，印迹材料上大多结合位点位于或接近材料表面，具有对目标分子高亲和力，结合动力学快速等特点，是弥补传统分子印迹缺陷的极佳手段。
[0004]磁性碳纳米管作为一种新型的纳米复合材料，由磁性纳米粒子和碳纳米管复合而成，在很多领域具有广泛的应用价值，其中以四氧化三铁纳米粒子和碳纳米管的复合形式最具代表性。以磁性碳纳米管为载体的表面分子印记聚合物材料，可解决传统分子印迹技术遇到的困难:
[0005](1)磁性碳纳米管具有极高的比表面积，使得磁性碳纳米管为载体的表面分子印记聚合物大量的识别位点处于印迹薄层的表面，模板分子的洗脱和再结合将变得非常容易，从而减少传统分子印迹聚合物的模板泄漏，大大提高印迹结合效率，缩短分离萃取平衡时间。
[0006](2)磁性碳纳米管具有独特的机械强度和抗形变力，所以磁性碳纳米管表面印迹技术能够克服传统MIP易膨胀或收缩、印迹空间形状易变形、识别位点易移动等缺点，保证了印迹识别位点和印迹三维孔穴的稳定。用这类材料作为色谱柱填料时，高效液相色谱固定相能够耐高压，并且碳纳米管具有独特的网络结构，不同大小的孔穴体现了不同的筛分特征，样品中的组分在分离过程中会穿插浸入磁性碳纳米管的孔中，使色谱分离除了分子印迹作用以外，还有分子筛作用，有利于提高分离度和改善峰形。[0007](3)这种材料具有优异的磁性能，当应用于富集化合物时，可在外加磁场作用下，快速高效地与样品溶液分离，不需要进行过滤、离心等复杂的前处理过程。当用于微通道领域时，磁性碳纳米管可以通过外加磁场定位在分离管道中的预指定区域，便于调节固定相的填充长度以达到最佳拆分效果，还可以在使用后通过撤除外加磁场进行微通道的再生。这就使得磁性碳纳米管表面分子印迹材料在构型复杂，通道曲折的微芯片电色谱领域中具有独特的应用前景。
[0008]但是，普通的磁性碳纳米管载体表面分子印迹聚合物依然较多的缺陷和不足。这类材料在用于分离富集化合物时，由于聚合物活性中心不均匀，萃取重现性不高。这类材料在用作色谱分离材料时，由于聚合物活性中心不均匀、单位体积活性中心少，色谱峰拖尾、展宽。另外，选择性不太高、活性中心数量不足，使得普通的磁性碳纳米管载体表面分子印迹聚合物难以满足当前的检测需求，新型的载体和涂层材料的研究成为复杂基质中痕量药物监测分析的关键。
[0009]喹诺酮(quinolone)是一类人工合成的含4_喹诺酮基本结构，对细菌DNA螺旋酶具有选择性抑制的抗菌剂。目前，这类人工合成的抗菌剂在临床上大量被用于预防和治疗感染性疾病，基于药代动力学研究、构效关系研究、药物不良反应研究的需要，急需建立复杂基质中(如血样、尿样)中痕量喹诺酮类药物的分析方法。同时，由于这类药物被广泛应用于临床，它们随着环境物质循环过程，在食品、水域中残存，直接或间接影响人体的健康，更为重要的是，这类药物在环境中对致病微生物形成自然选择，使得抗药耐药致病微生物进化，对人类长期生存与发展构成潜在威胁，因此，对食品及环境复杂样品中痕量喹诺酮类药物的残留检测方法亟待建立。
【发明内容】
[0010]技术问题:
[0011]本发明的目的是克服传统分子印迹技术中的缺点以及弥补普通磁性碳纳米管表面分子印迹的不足，提供一种采用具有功能单体作用的磁性材料作表面分子印迹载体、用替代模板技术避免模板泄露的磁性碳纳米管表面分子印迹材料的制备方法，利用该方法制备出对喹诺酮类药物具有特异识别功能、结合动力学快速、吸附容量大、活性中心均匀、磁学性能优异、机械强度高的磁性碳纳米管表面分子印迹材料，从而实现对复杂样品中痕量喹诺酮类药物高选择性的分离富集和高灵敏度的检测。
[0012]技术方案:
[0013]1.本发明的技术解决方案为:
[0014]a.羧基化碳纳米管的制备:将多壁碳纳米管加入浓HNO3-浓H2SO4 (摩尔比:3/1)的混合溶液中，超声处理2h使其分散，再于80°C在磁力搅拌下回流12h，之后过滤分散液，将得到的颗粒用蒸馏水反复洗涤至中性，在65°C真空干燥过夜，备用；
[0015]b.溶剂热法制备磁性碳纳米管:将步骤a制得的羧基化碳纳米管、三氯化铁、乙酸钠和丙烯酸钠加入由乙二醇和二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应，反应结束后冷却至室温，用乙醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0016]c.乙烯基修饰磁性碳纳米管的合成:将步骤b制得的磁性碳纳米管溶解在乙醇和高纯水(体积比:5/1)混合溶液中，超声处理15min，再依次加入氨水和正硅酸四乙酯，在室温下连续搅拌反应12h，用外部磁场分离合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗，真空干燥后得到磁性碳纳米管表面二氧化硅，将其溶解于乙醇中，超声处理15min，剧烈搅拌混合物，加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，将混合物在室温下连续搅拌反应24h，用外部磁场分离合成的产物，用甲醇冲洗，真空干燥，备用；
[0017]d.将模板分子、功能单体加入溶剂中混合，振荡2h，得到预装配溶液，备用；将步骤c制得的乙烯基修饰磁性碳纳米管加入溶剂中超声分散，然后加入上述预装配溶液及交联剂，超声30min,得到预聚液,备用；
[0018]e.将分散剂溶解于溶剂中，然后加入预聚液及引发剂，于氮气氛围中一定温度条件下搅拌反应，然后分离聚合物，在超声波下用甲醇-乙酸混合液洗涤多次，直到用高效液相-阵列二极管紫外检测法检测不到模板分子，聚合物再用水洗涤数次，在60°C下干燥至恒重，得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0019]2.所述步骤b中，羧基化碳纳米管的浓度为4~20g/L，三氯化铁的摩尔浓度为0.05~0.5mol/L，乙二醇和二乙二醇的比例为1: 5~5: 1，反应温度为175~225°C，反应时间为6~24h。[0020]3.所述步骤c中，磁性碳纳米管的浓度为2~20g/L，氨水的加入量为反应体系总体积的0.5%~5%，正硅酸四乙酯的加入量为反应体系总体积的;磁性碳纳米管表面二氧化硅溶于乙醇的浓度为3~18g/L，3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的加入量为反应体系总体积的2%~12%，剧烈搅拌为500rpm~1200rpm的机械搅拌。
[0021]4.所述步骤d中，模板分子为喹诺酮类药物加替沙星(gatifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin,氟哌酸)、氧氟沙星(ofloxacin,氟嗪酸)、左氧氟沙星(levof 1xacin)、培氟沙星(pef 1xacin)、依诺沙星(enoxacin)、西诺沙星(cinoxaci)、环丙沙星(ciprofloxacin)、洛美沙星(1mefloxacin),甲横酸曲伐沙星(trovaf1xacinmesilate)，盐酸克林沙星(cl inaf 1xacinhydrochloride)，溶剂为二甲基亚讽、甲苯、乙腈、氯仿和水，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶，模板分子和功能单体的摩尔比为1: 2~1: 6，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，交联剂和模板分子的摩尔比为1: 10~1: 25。
[0022]5.所述步骤d中，乙烯基修饰磁性碳纳米管既是分子印迹聚合反应的聚合载体，同时也是功能单体。
[0023]6.所述步骤e中，溶剂为步骤d中所用溶剂与水的混合液，二者体积比为7: 3~9: 1，分散剂为聚乙烯吡咯烷酮，配制分散剂溶液浓度为I~16g/L;引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为0.02~0.2g ;聚合反应时间为6~36h，聚合反应一定温度条件是指50~75°C ;所用甲醇-乙酸混合液二者体积比为1: 9~9:1。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明制备的磁性碳纳米管表面分子印迹材料的合成路线及其在生物样品iu处理方面的应用不意图。
[0025]图2是本发明制得的分子印迹聚合物透射电镜图，其中㈧碳纳米管；⑶磁性纳米粒子；(C)磁性碳纳米管；⑶磁性碳纳米管表面分子印迹材料。[0026]图3是材料在室温下的磁滞回线及实际分离时的照片，其中(A)磁性碳纳米管和磁性碳纳米管表面分子印迹材料的磁滞回线；(B)外磁场从溶液中分离磁性聚合材料照片。
[0027]图4是本发明制得磁性碳纳米管表面分子印迹材料对鸡蛋样品中萃取四种氟喹诺酮类药物(培氟沙星，加替沙星，环丙沙星，诺氟沙星)的HPLC图谱，其中(A)磁性碳纳米管表面分子印迹材料萃取鸡蛋样品的HPLC图谱，(B)磁性碳纳米管表面非分子印迹材料萃取鸡蛋样品的HPLC图谱。
具体实施方案
[0028]以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
[0029]实施例1
[0030]将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；
[0031]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0032]将Ig上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0033]将Ig上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳米管，备用；
[0034]将1.0mmol氧氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol甲基丙烯酸，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜，超声处理5min，然后加入20mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: Lv/V)中，加热到60°C,300rpm搅拌溶液,加入预聚合溶液,通氮气驱赶氧气,加入0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应12h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸出:4,v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0035]取2g鸡蛋加入IOml离心管，然后加入IOOng的诺氟沙星，涡旋和超声波振荡下用IOml乙腈萃取lOmin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4,v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从95.2% ±3.2%至100.7% ±3.1%。[0036]实施例2
[0037]将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；
[0038]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0039]将1g上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0040]将Ig上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳米管，备用；
[0041]将1.0mmol诺氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol甲基丙烯酸，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜，超声处理5min，然后加入20mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: Lv/V)中，加热到60°C,300rpm搅拌溶液,加入预聚合溶液,通氮气驱赶氧气,加入0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应12h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸出:4,v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0042]取2g鸡蛋加入IOml离心管，然后加入IOOng的氧氟沙星，涡旋和超声波振荡下用IOml乙腈萃取lOmin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4,v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从97.2% ±1.6%至100.4% ±2.8%。
[0043]实施例3
[0044]将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；
[0045]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0046]将1g上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0047]将Ig上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳米管，备用；
[0048]将1.0mmol氧氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol甲基丙烯酸，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜，超声处理5min，然后加入20mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: 1，v/v)中，加热到60°C,300rpm搅拌溶液,加入预聚合溶液,通氮气驱赶氧气,加入0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应12h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸出:4，v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0049]取2g鸡蛋加入1Oml离心管，然后加入IOOng的诺氟沙星，涡旋和超声波振荡下用1Oml乙腈萃取1Omin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4, v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从99.2% ±3.2%至100.6% ±3.0%。
[0050]实施例4
[0051 ] 将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；
[0052]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0053]将1g上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0054]将1g上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳用米管，备用；
[0055]将1.0mmol氧氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol对乙烯基吡啶，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜,超声处理5min，然后加入20mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: 1，v/v)中,加热到60°C,300rpm搅拌溶液,加入预聚合溶液,通氮气驱赶氧气,加入0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应12h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸出:4，v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0056]取2g鸡蛋加入IOml离心管，然后加入IOOng的诺氟沙星，涡旋和超声波振荡下用IOml乙腈萃取lOmin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4, v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从98.5% ±3.0%至100.9% ±3.4%。
[0057]实施例5
[0058]将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；[0059]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0060]将Ig上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0061]将Ig上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳米管，备用；
[0062]将1.0mmol氧氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol对乙烯基吡啶，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜,超声处理5min，然后加入20mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: 1，v/v)中，加热到65°C,300rpm搅拌溶液,加入预聚合溶液,通氮气驱赶氧气,加入0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应12h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸出:4，v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0063]取2g鸡蛋加入IOml离心管，然后加入IOOng的诺氟沙星，涡旋和超声波振荡下用IOml乙腈萃取lOmin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4, v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从98.5% ±3.5%至100.9% ±2.1%。
[0064]实施例6
[0065]将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；
[0066]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；
[0067]将Ig上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0068]将Ig上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳米管，备用；[0069]将1.0mmol氧氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol甲基丙烯酸，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜，超声处理5min，然后加入20mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: Lv/V)中，加热到60°C,300rpm搅拌溶液,加入预聚合溶液,通氮气驱赶氧气,加入0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应18h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸出:4, v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
[0070]取2g鸡蛋加入IOml离心管，然后加入IOOng的诺氟沙星，涡旋和超声波振荡下用IOml乙腈萃取lOmin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4, v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从96.2% ±2.2%至100.0% ±2.4%。
[0071]实施例7
[0072]将0.5g多壁碳纳米管加入100mL体积比为1: 3的浓HNO3-浓H2SO4的混合溶液中，超声处理2h，再于80°C在磁力搅拌下回流12h。然后，减压抽滤，用蒸馏水反复洗涤至中性，于65°C真空干燥过夜，备用；
[0073]将0.4g上述制得的羧基化碳纳米管、2.4g三氯化铁、3.4g乙酸钠和3.4g丙烯酸钠加入由22.5ml乙二醇和22.5ml 二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应10h，反应结束后冷却至室温，用甲醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用；[0074]将Ig上述制得的磁性碳纳米管溶解在150ml乙醇和30ml高纯水中，超声处理15min,然后再依次加入2ml氨水和4ml正娃酸乙酯。将混合物在室温下连续搅拌反应12h。用一个外部磁场富集合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗六遍，真空干燥，备用；
[0075]将Ig上述制得的磁性碳纳米管表面二氧化硅溶解在150ml乙醇中，超声处理15min，然后剧烈搅拌混合物(600rpm)，加入6ml 3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)。将混合物在室温下连续搅拌反应24h。用一个外部磁场富集合成的产物，用甲醇冲洗六遍，真空干燥即可获得乙烯基修饰的磁性碳纳米管，备用；
[0076]将1.0mmol氧氟沙星溶解在IOml 二甲亚砜中，然后加入4mmol对乙烯基吡啶，搅拌30min制备预装配溶液。将Ig乙烯基修饰磁性碳纳米管溶解于4ml的二甲亚砜,超声处理5min，然后加入20mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)和预装配溶液，超声处理该混合物30min制备预聚液。将0.4g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解在100mL 二甲亚砜:水(9: l，v/v)中，加热到60°C，300rpm搅拌溶液，加入预聚合溶液，通氮气驱赶氧气，加入
0.1g偶氮二异丁腈，聚合反应12h。聚合后，分离聚合物，在超声波下用甲醇:乙酸(6: 4，v/v)洗涤多次。聚合物再用蒸馏水洗涤三次，在60°C下干燥，即得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。[0077]取2g牛奶加入IOml离心管，然后加入IOOng的诺氟沙星，涡旋和超声波振荡下用IOml乙腈萃取lOmin。匀浆在4000rpm下离心5min，收集离心管中的上清液，然后加入20mg磁性碳纳米管表面分子印迹材料。在室温下孵化Ih后，用永久磁铁将磁性碳纳米管表面分子印迹材料去除，用5ml水洗。然后用5ml甲醇/醋酸出:4, v/v)来洗脱诺氟沙星。洗脱液用吹氮气流进行浓缩，然后用三乙胺磷酸盐/乙腈(87/13，v/v)量化体积到0.5ml。以上生物样品处理平行试验三次，最后，用高效液相色谱对处理样品进行定量分析。结果显示，回收率范围从97.2% ±3.5%至100.8% ±3.7%。
【权利要求】
1.一种磁性碳纳米管表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于制备包括以下步骤: a.羧基化碳纳米管的制备:将多壁碳纳米管加入浓HNO3-浓H2SO4(摩尔比:3/1)的混合溶液中，超声处理2h使其分散，再于80°C在磁力搅拌下回流12h，之后过滤分散液，将得到的颗粒用蒸馏水反复洗涤至中性，在65°C真空干燥过夜，备用； b.溶剂热法制备磁性碳纳米管:将步骤a制得的羧基化碳纳米管、三氯化铁、乙酸钠和丙烯酸钠加入由乙二醇和二乙二醇组成的混合溶剂中，超声Ih得到黑色的混合溶液，将其转入聚四氟乙烯材质的反应釜中，密封，置于马弗炉中反应，反应结束后冷却至室温，用乙醇和水洗数次，于65°C真空干燥至恒重，备用； c.乙烯基修饰磁性碳纳米管的合成:将步骤b制得的磁性碳纳米管溶解在乙醇和高纯水(体积比:5/1)混合溶液中，超声处理15min，再依次加入氨水和正硅酸四乙酯，在室温下连续搅拌反应12h，用外部磁场分离合成的产物，用高纯水和乙醇冲洗，真空干燥后得到磁性碳纳米管表面二氧化硅，将其溶解于乙醇中，超声处理15min，剧烈搅拌混合物，加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，将混合物在室温下连续搅拌反应24h，用外部磁场分离合成的产物 ，用甲醇冲洗，真空干燥，备用； d.将模板分子、功能单体加入溶剂中混合，振荡2h，得到预装配溶液，备用；将步骤c制得的乙烯基修饰磁性碳纳米管加入溶剂中超声分散，然后加入上述预装配溶液及交联剂，超声30min,得到预聚液,备用； e.将分散剂溶解于溶剂中，然后加入预聚液及引发剂，于氮气氛围中一定温度条件下搅拌反应，然后分离聚合物，在超声波下用甲醇-乙酸混合液洗涤多次，直到用高效液相-阵列二极管紫外检测法检测不到模板分子，聚合物再用水洗涤数次，在60°C下干燥至恒重，得到磁性碳纳米管表面分子印迹材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤b中，羧基化碳纳米管的浓度为4~20g/L，三氯化铁的摩尔浓度为0.05~0.5mol/L,乙二醇和二乙二醇的比例为1: 5~5: 1，反应温度为175~225°C，反应时间为6~24h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤c中，磁性碳纳米管的浓度为2~20g/L，氨水的加入量为反应体系总体积的0.5%~5 %，正硅酸四乙酯的加入量为反应体系总体积的1%~10% ;磁性碳纳米管表面二氧化硅溶于乙醇的浓度为3~18g/L，3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的加入量为反应体系总体积的2%~12%，剧烈搅拌为500rpm~1200rpm的机械揽拌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤d中，模板分子为喹诺酮类药物加替沙星(gatifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin,氟哌酸)、氧氟沙星(ofloxacin,氟嗪酸)、左氧氟沙星(Ievofloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、西诺沙星(cinoxaci)、环丙沙星(ciprofloxacin)、洛美沙星(1mefloxacin),甲横酸曲伐沙星(trovaf loxacin mesilate),盐酸克林沙星(clinaf loxacin hydrochloride),溶剂为二甲基亚砜、甲苯、乙腈、氯仿和水，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶，模板分子和功能单体的摩尔比为1: 2~1: 6，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，交联剂和模板分子的摩尔比为1: 10~1: 25。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤d中，乙烯基修饰磁性碳纳米管既是分子印迹聚合反应的聚合载体，同时也是功能单体。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤e中，溶剂为步骤d中所用溶剂与水的混合液，二者体积比为7: 3~9: 1，分散剂为聚乙烯吡咯烷酮，配制分散剂溶液浓度为I~16g/L;引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为0.02~0.2g;聚合反应时间为6~36h，聚合反应一定温度条件是指50~75°C ;所用甲醇-乙酸混合液二者体积比为1: 9 ~9:1。
【文档编号】C08F226/06GK103910836SQ201310003785
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月7日 优先权日:2013年1月7日
【发明者】何华, 肖得力, 彭军, 何小梅, 袁丹华, 李卉, 戴昊, 皮埃尔·他目 申请人:中国药科大学