专利名称：一种叶下珠多糖的提取分离方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及一种叶下珠多糖TOLP III的提取分离方法。
背景技术：
珠^Phyllanthus urinaria L ),又名珍珠草、夜合草、阴阳草,属于大戟科(Euphorbi aceae)叶下珠属植物叶下珠的干燥全草，在民间广泛用于利水解毒、平肝清热。1988年，印度学者Thyagarajan等人[2]首次通过实验证明苦味叶下珠可以使59%患者的乙肝表面抗原(HBsAg)转阴，这一实验结果引起了国内外学者对叶下珠的关注。大量研究表明]叶下珠具有抗乙肝病毒、保肝降酶、抗肝纤维化、防止肝损伤和抗癌变的效果，且毒副作用低，是一种值得深入开发的治疗乙型肝炎的天然药材。叶下珠中含有多种化学成分，文献已经报道过的有木脂素、萜类、黄酮、糅质、生物碱等，包括正十八烷、去氢诃子次酸、阿魏酸、没食子酸、短叶苏木酚酸、丁二酸、甲氧基糅花酸、山茶素、老鹤草素、短叶苏木酸甲脂、短叶苏术酚酸乙脂、柯里拉京、去氢诃子次酸三甲月旨、多糖等等。多糖类化合物具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗消化性溃疡、抗凝血、降血糖、降血脂、抗辐射、抗血栓、抗水肿、抗毒物损伤等多种生物活性。乙型病毒性肝炎(HBV)是全球性的公共卫生问题，根据全球卫生组织(WHO)数据，全世界有3. 5 4. O亿乙肝病毒感染者，其中每年有近100万患者死于HBV感染引起的肝功能衰竭、肝硬化和肝癌_。目前应用于乙型肝炎治疗的药物主要是干扰素和核苷类似物，然而这些药物只能获得某种程度上的治疗效果，对大多数病人达不到完全治愈的目的，并且停药后会出现反跳的现象。所以开发研制高效、低毒、不“反跳”的乙肝治疗新药是一个刻不容缓的问题。在寻找乙肝治疗药物的过程中，中药多糖成分越来越受到人们的重视。叶下珠具有抗乙肝病毒，保肝，抗肿瘤等功效已得到普遍证实，并且相关学者也对其中的几种化学成分，如没食子酸、黄酮类及叶下珠素等做了结构和生物活性的研究，但对其中的多糖研究却很少。开展对叶下珠中多糖成分的提取分离，结构鉴定及生物活性的检测，有利于进一步确定叶下珠用于治疗乙型肝炎的药效物质基础，更好地开发叶下珠这一药用植物资源，为寻找乙肝治疗新药打下理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种叶下珠多糖TOLP III的提取分离方法，通过对叶下珠粗多糖的分离纯化，得到了纯净单一的叶下珠多糖成分。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明所述的叶下珠多糖PULP III的提取分离方法，包括如下步骤
O叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，干燥后，粉碎，用石油醚脱脂，乙醇脱小分子糖后，药渣用水浸提，浸提液离心分离，取滤液浓缩后加入一定体积的乙醇醇沉，取醇沉物即为粗总多糖；粗总多糖经2)除蛋白，3)洗涤，除杂和4)透析，干燥即得叶下珠精总多糖(PULP)，多糖含量在95%以上。5)总多糖各组分分离纯化经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精总多糖(PULP)，过离子交换柱，依次用适宜的NaCl梯度溶液洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，得洗脱曲线，从曲线上能够明显宣示出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，按照出峰的顺序分别记为I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。其中第2个、第3个两个洗脱峰较大，收集第3主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖I3ULP III纯组分。所述的叶下珠多糖TOIPIII，为土黄色片状固体，是一类不含有N、S元素酸性多糖，相对平均分子量为418793. 5 PULPIII单糖组成及其比例为鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc)为 O. 27:0. 28:0. 1:0. 35 ;主链由 Rha, Ara, Man 和 Glc 组成。各单糖通过吡喃糖苷键连接，糖苷键以I — 6连接为主，同时还存在I — 4和I — 3连接方式。上述步骤I)优选条件是粉碎的叶下珠粉末，用石油醚浸没药材且液面高出药材O. 5 1cm，在80°C和常压力回流提取3次，每次2小时，弃去回流液。药渣继续用50 100%乙醇按同样方法在80°C °C下回流提取3次，每次2小时，弃去回流液。药渣再用90 °〇水浸提3次，每次2小时，合并3次浸提液进行离心分离，离心速度4000r/min，取滤液浓缩至原体积1/4，加入4倍体积的95%乙醇，静置24h，离心，取醇沉物即为粗多糖。步骤2)除蛋白即用Sevag法脱蛋白将步骤I)得到的醇沉物用蒸馏水复溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液的优选体系是粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液以体积比计量是3 :1，混合液=氯仿正丁醇=4:1(体积比计量),磁力搅拌30min,充分静置分层，弃去沉淀。重复7 8次后直至界面无白色沉淀。步骤3)洗涤，除杂的优选条件是在除蛋白后的多糖溶液中加入4倍体积的95%乙醇沉淀24h，离心，弃滤液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重复3次。步骤4)透析， 干燥即醇沉洗涤后滤渣加适量蒸馏水，充分复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液(蒸馏水)体积比优选条件为1:20，8h换一次水，透析72h。透析完毕后将糖溶液放入冷冻干燥机中干燥得叶下珠总多糖(PULP)，经测定本发明总多糖(PULP)含量在95%以上。步骤5)的离子交换柱为DEAE-52阴离子交换树脂，使用前将DEAE-52纤维素填料进行处理，其优选条件使用蒸馏水浸泡48h，期间3h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱一酸一碱处理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，得到0!Γ型纤维素。湿法装柱(柱尺寸为500 X 50mm)，蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。步骤5)的较适宜NaCl的物质的量浓度的梯度范围=0 lmol/L的NaCl梯度溶液。步骤5)优选的NaCl的物质的量浓度的梯度溶液分别为0、0. U0. 25,0.5,O.75mol/L。步骤5)依次用适宜的NaCl梯度溶液洗脱，较优化的操作是每种NaCl的物质的量浓度溶液洗脱8小时，流速4mL/min，用管收集洗脱液，每IOmin收集一管。步骤5)所述的洗脱曲线是为以收集的管序(管数)为横坐标，溶液的光吸收度为纵坐标绘图而得到。本发明所述的叶下珠多糖TOIP III，具有一定的抗氧化、抗乙肝病毒活性。本发明的有益效果通过对叶下珠粗多糖的分离纯化，得到了纯净单一的叶下珠多糖成分。通过对多糖的纯组分PULP III的结构分析及体外抗氧化、抗病毒活性实验的研究，确证了叶下珠多糖是叶下珠治疗乙肝的有效成分，这为研究叶下珠多糖的抗乙肝病毒作用机制提供了理论基础；同时，对叶下珠多糖组分PULP III的理化性质，元素组成，官能团，单糖组成比例及糖苷键位置进行了初步分析，为以后叶下珠多糖分子结构的进一步深入研究提供理论基础。今后可在此基础上，结合多糖的构效关系，进一步开发以叶下珠多糖为原材料的抗乙肝病毒药物奠定基础。
图1是葡萄糖标准曲线。图2是多糖梯度洗脱曲线。图3是H印G2. 2. 2. 15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明
叶下珠多糖的提取
叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，50°C低温干燥后，粉碎，密封备用。其粉末为黄绿色。石油醚80 1回流脱脂一95%乙醇80 1回流脱小分子糖一90 °C水回流提取3次，合并3次滤液4000r/m in离心，浓缩至1/4体积一加入4倍体积的95%乙醇，静置24h，离心，蒸懼水复溶一sevag法除蛋白(氯仿正丁醇=4:1,多糖溶液混合液=3:1),磁力搅拌30min，充分静置分层，重复7 8次操作即可除去游离蛋白质一除蛋白后的多糖溶液加入4倍体积的95%乙醇沉淀24h —依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重复三次一透析72h —冷冻干燥得叶下珠总多糖(PULP)。葡萄糖标准液和样品供试液的制备
精密称取葡萄糖标准品(在105°C下干燥到重量不再发生变化)10mg，用蒸馏水溶解后，置于IOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成O. lmg/mL的葡萄糖标准液，备用。精密称取干燥至恒重的叶下珠多糖10mg，用蒸馏水溶解后，置于IOOmL容量瓶中加蒸懼水定容至刻度，摇勻，制成O. lmg/mL的样品供试液备用。吸收波长的确定
取葡萄糖标准液和样品溶液各I mL,分别加入ImL 5%苯酹溶液(取5g重蒸苯酹于IOOmL棕色容量瓶中加蒸馏水定容)，摇匀后，悬空垂直加入5mL浓硫酸，置沸水浴中加热15min，然后置冷水浴中冷却，在400 600 nm范围内全波长扫描，确定吸收波长。葡萄糖标准曲线制作
精密吸取葡萄糖标准液O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、ImL于IOmL具塞刻度试管中，依次添加水使终体积为ImL,空白对照为ImL水,然后加入ImL 5%苯酹溶液摇勻,迅速加入5mL浓硫酸(悬空垂直加入)，置沸水浴中加热15min,然后置冷水浴中冷却，于490nm处测定吸光度。以吸光度为Y轴，葡萄糖质量为X轴，绘制标准曲线，并计算回归方程。
糖含量的计算
精密吸取供试液lmL，于490nm处测定吸光度。按照公式计算糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%
C :由标准曲线查得的葡萄糖微克数 C0 :样品溶液的浓度(O.1 mg/mL)
V :测定时用的样品溶液体积(1. OmL)
多糖的提取率
多糖的提取率=多糖的质量/原材料的质量X 100 %
样品溶液和葡萄糖标准液的最大吸收峰波长都在490 nm左右处，所以选取490 nm作为多糖含量的测定波长。以吸光度为Y轴，葡萄糖微克数( μ g)为X轴，绘制标准曲线，如图1，可以看出在20 100 μ g范围内，葡萄糖量与吸光度有良好的线性关系。测得样品液的吸光度A为 O. 388，根据回归方程计算其相应葡萄糖的微克数为28. 27 μ g。根据公式得糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%=28. 27/(0. 1X1) X 100%=28. 27%
多糖的提取率==1. 5/100X 100 %=1. 5%
本实验通过石油醚脱脂，再以95%的乙醇脱去低聚糖等小分子物质，然后以水提醇沉法从叶下珠中分离出多糖，并采用sevag法脱蛋白，苯酚一硫酸法测定其含量，其最大吸收波长为490nm，多糖提取率为1. 5%，糖含量为28. 27%。叶下珠多糖的分离纯化 柱分离
DEAE-52填料预处理
DEAE-52纤维素填料用蒸馏水浸泡48h，期间4 5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱-酸-碱处理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸馏水洗至中性，得到0H_型纤维素。湿法装柱(柱尺寸为500 X 50mm)，蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。过DEAE-52层析柱分离纯化
称取640mg叶下珠总多糖溶于80mL重蒸水中(8 mg/mL),过O. 45 μ m滤膜后上样。依次用 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脱，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min ;苯酚-硫酸法跟踪检测，收集各主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖各组分。SephadexG-200葡聚糖凝胶过滤法
的预处理SephadexG-200填料加适量蒸懼水浸泡24h,期间4 5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后超声脱气直到凝胶液中没有气泡出现为止。湿法装柱(柱尺寸为500X25mm)，用O. 05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后备用。柱层析将上面收集的各组分配制成25mg/mL的样品液，上样2mL，用O. 05 mol/L的NaCl洗脱。自动部分收集器收集，每管5 mL,每30 min收集一管，苯酚-硫酸法跟踪检测。
HPLC高效液相色谱法
将纯化后的各组分多糖配制成lmg/mL的样品液,过O. 45 μ m的滤膜后进样。高效液相色谱条件
色谱柱PolySep-SEC 4000 Part No: 00H-3144-K0 Column Size :300 X 7. 8mm ；
检测器示差检测器；柱温30°C;流动相双蒸水；流速0. 8 mL/min ;进样量20 μ L。柱层析分离结果
经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精多糖(PULP)，过DEAE - 52离子交换柱，依次用O、O. U0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl溶液梯度洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，得如图2所示中洗脱曲线。由图2可以看出，TOLP经DEAE-52柱层析分离后，能够明显分离出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，记为I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。收集含量较大的组分PULP III做进一步分析。柱和HPLC纯度鉴定 SephadexG-200 柱结果
取叶下珠多糖组分I3ULP III过S印hadexG-200凝胶柱，NaCl洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，用吸光度值与洗脱管数作洗脱曲线，PULP III在Sephadex G-200柱上的洗脱曲线是对称的单一峰，说明TOLP III组分是分子量相对均一的多糖组分。HPLC法纯度鉴定
利用HPLC法检测叶下 珠多糖组分TOLP III的纯度时，结果显示，经DEAE-52纤维素柱分离纯化后的多糖组分PULP III，在高效液相图谱上峰型比较对称，且经过面积归一法计算其纯度达到95%以上，与S印hadex G-200凝胶色谱图结果相吻合，说明纯度比较高，可以用来做结构鉴定。水提醇沉脱蛋白后的叶下珠多糖经过DEAE-52纤维素柱分离纯化后得到四个组分，分别记为PULP1、PULP I1、PULP III和PULP IV。收集含量较大的组分PULP III，用SephadexG-200凝胶柱层析法和高效液相色谱法(HPLC)两种方法进行纯度鉴定，证明其组分相对均一，可以进一步做结构分析。III的理化性质及结构分析 状态、溶解性试验
称取适量分离纯化后的多糖组分PULP III溶解于纯水、无水乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等溶剂，观察其溶解性。却三酮反应
取1. Omg/mL样品溶液1. OmL于试管中，加入1. OmL O. 5%茚三酮试剂，沸水浴5min，冷却后观察颜色变化，若出现紫红色，则证明有蛋白质，反之则无。以蒸馏水和小牛血清溶液作为对照。Molish 反应
取1. Omg/mL样品溶液1. OmL于试管中，滴加两滴Molish试剂,摇勻。倾斜试管,沿管壁加入约ImL浓硫酸，小心竖直后，2 3min后仔细观察两层液面交界处的颜色变化，若有紫红色出现，则证明有糖类物质。以蒸馏水和淀粉溶液作为对照。苯酹一硫酸反应
取1. Omg/mL样品溶液1. OmL于试管中，加入ImL 5%的苯酹,再加入5mL浓硫酸,振荡，若呈橙黄色，说明含糖。以蒸馏水为对照。碘-碘化钾反应
取1. OmL1. Omg/mL的样品溶液，滴加250 μ L碘-碘化钾溶液后，若不显蓝色，说明此多糖为非淀粉类。以蒸馏水为阴性对照，O. 5%的淀粉指示液为阳性对照。硫酸一咔唑反应
取1. Omg/mL样品溶液1. OmL于试管中，在冰水浴中向管中加入6mL浓硫酸，摇匀后置于85°C水浴中20min，取出冷却至室温，加入O. 2mL 0.1%的咔唑液，室温下保持2h，若有紫红色物质出现，说明含有糖醛酸，是酸性糖，以蒸馏水为阴性对照。斐林反应
取1. Omg/mL样品溶液1. OmL于试管中,加入过量的斐林试剂,煮沸2 min,若产生红色的氧化亚酮沉淀，则证明含还原糖。三氯化铁试验
取1. Omg/mL样品溶液1. OmL于试管中，调节pH值为4 5，加入1%的三氯化铁水溶液，若出现蓝、墨绿或蓝紫色，则证明含有鞣质类或酚类。
硫酸基定性试验
取2mg多糖样品，加入1. OmL lmol/L HCl, 110°C密闭水解3h，然后滴加0. 5mL的氯化钡-明胶试剂，若有白色沉淀生成，说明含有硫酸基。法测定分子量 高效液相色谱条件
色谱柱PolySep-SEC 4000 Part No: 00H-3144-K0 Column Size :300 X 7. 8mm ；
检测器示差检测器；柱温30°C;流动相双蒸水；流速0. 8 mL/min ;进样量20 μ L。样品溶液的制备
将多糖组分PULP III配制成浓度为lmg/mL的溶液，以10000r/min离心10 min后，过0.45 μ m滤膜，备用。标准对照溶液
将各种已知分子量的葡聚糖标准品系列(T-10、T-20、T-110、T-500、T-2000)配制成浓度为lmg/mL的溶液，处理方法同样品溶液，备用。标准曲线的绘制
将各种已知分子量的葡聚糖标准品由小分子到大分子依次平均进样3次，记录相应的保留时间tK和色谱图，以保留时间tK为横坐标，分子量的对数值为纵坐标绘制标准曲线。I3ULP III相对分子质量的测定
将上面配制好的样品溶液各进样三次，HPLC色谱条件同标准品一样，记录相应的保留时间tK和色谱图，根据标准曲线得到的回归方程计算分子量。标准曲线的绘制
采用硫酸咔唑法测定糖醛酸含量。配制0. 2mg/mL的葡萄糖醛酸溶液25mL，依次量取 0. 25,0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5mL 上述溶液，定容于 IOmL 容量瓶中，制成 5、10、20、30、40、50 μ g/mL的标准溶液置4°C冰箱中备用。量取5mL硼砂硫酸溶液(0. 025 mol/L)于具塞试管中，冰浴，然后将ImL葡萄糖醛酸标准溶液小心加入酸液层上方，以蒸馏水作为空白对照，边摇匀(先轻轻摇匀，后剧烈摇晃)边冰浴冷却。然后将试管在沸水浴中加热lOmin，冷却至室温后加入O. 2mL咔唑溶液(O. 125%的无水乙醇溶液)，摇匀，沸水加热15min，冷却至室温，测定530nm处的吸光值，以葡萄糖醛酸的浓度为横坐标，吸光值纵坐标绘制标准曲线。样品中糖醛酸含量的测定
将多糖组分PULP III配成5 μ g/mL的溶液，操作同上，测定其在530nm处的吸光值。蛋白质和核酸测定
将纯化后的多糖组分PULP III配制成lmg/mL的多糖水溶液，用UV紫外分光光度计在200 400nm范围内扫描看其在260nm(核酸)，280nm (Pr)处是否有吸收峰，以判定有无蛋白质和核酸的存在。、H、N元素分析
分别称取两份完全干燥的PULP III样品2. 5mg,采用Elementar Vario EL III元素分析仪测定C、H、N的含量。IR)的检测
取2mg多糖样品，用溴化钾(KBr)压片后在400 4000CHT1波长范围内做红外光谱分析。采用糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法进行单糖组成测定。根据出峰时间可以确定样品的单糖组成成分，根据出峰面积可以确定单糖的组成比例。单糖糖腈乙酸酯衍生化分别称取鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)，甘露糖(Man)各10 mg，分别加入IOmg盐酸轻胺，O. 5 mL卩比唳振荡后，90 °C水浴30 min，并不时振荡，取出冷却至室温后，加入O. 5 mL乙酸酐，于90 °〇水浴中酰化30 mim，得到的产物即是糖腈乙酸酯衍生物，直接注入GC分析。多糖糖腈乙酸酯衍生化称取多糖10mg，加入2mol/L三氟乙酸5mL，110°C真空封管水解4h后，在40°C下减压浓缩至干，然后加入4mL甲醇，旋转蒸发至干，重复3 4次，以除去三氟乙酸。然后加入10 mg盐酸羟胺和O. 5 mL吡啶，放入90°C水浴加热反应30 min，并不时振荡取出后冷至室温，加入0.5 mL醋酸酐，在90°C水浴中继续反应30min进行乙酰化，反应产物可直接进行气相色谱分析
色谱条件
色谱柱0V1701 (30. O mXO. 32 ymXO. 25 μ m)毛细管柱；
进样口温度250 V ；(FID )检测器温度240 V ；
载气压力0.4 MPa;程序升温150 °C下保持4 min，然后以10 °C /min升至200 °C,保持 8 min,再以 15 °C/min 升至 280min。取20mg PULP III多糖组分，用2mL O. 05mol/L三氟乙酸进行部分酸水解，水解16h后离心，沉淀进行GC分析。上清液中加入甲醇旋转蒸发，重复3 4次除去三氟乙酸，然后用水复溶后，透析袋(分子截留量3500)透析。透析结束后，袋外部分真空干燥后进行GC分析；袋内部分加入4倍体积的乙醇醇析，上清部分和醇沉部分分别真空干燥后进行GC分析。smith 降解
高碘酸钠标准曲线的制作 取6支干燥试管，按下表操作制作标准 曲线
权利要求
1.一种叶下珠多糖PULP III的提取分离方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤O叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，干燥后，粉碎，用石油醚脱脂，乙醇脱小分子糖后，药渣用水浸提，浸提液离心分离，取滤液浓缩后加入乙醇醇沉，取醇沉物即为粗总多糖；粗总多糖经2)除蛋白，3)洗涤，除杂和4)透析，干燥即得叶下珠精总多糖，多糖含量在95%以上；5) 多糖各组分分离纯化经过脱蛋白，透析处理后的叶下珠精总多糖，过离子交换柱，依次用适宜的NaCl梯度溶液洗脱，苯酚一硫酸法跟踪检测，得洗脱曲线，从曲线上能够明显宣示出四个峰形对称的洗脱峰，分别代表四个组分，按照出峰的顺序分别记为PULP I ,PULP I1、 PULP III和I3ULP IV ;其中第2个、第3个两个洗脱峰较大，收集第3主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖I3ULP III纯组分。
2.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤I)粉碎的叶下珠粉末，用石油醚浸没药材且液面高出药材O. 5 1cm，在70 90°C和常压力回流提取2 4次，每次I 3小时，弃去回流液；药渣继续用质量分数为50 100%的乙醇溶液按同样方法在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小时，弃去回流液；药渣再用 60 95°C水浸提3次，每次I 3小时，合并3次浸提液进行离心分离，离心速度2000 6000r/min，取滤液浓缩至原体积1/4，加入4倍体积的质量分数为90 100%的乙醇溶液， 静置24h，离心，取醇沉物即为粗多糖。
3.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤2)除蛋白即用Sevag法脱蛋白将步骤I)得到的醇沉物用蒸馏水复溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，其中粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液的体积比为I 6 :1 3 ;混合液中氯仿正丁醇的体积比为I 4 :1 4 ;磁力搅拌20 40min,充分静置分层，弃去沉淀；重复I 10后直至界面无白色沉淀。
4.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤3)洗涤，除杂在除蛋白后的多糖溶液中加入3 6倍体积的质量分数为75 100%的乙醇溶液沉淀12 36h，离心，弃滤液，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重复2 5次。
5.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤4)透析，干燥即醇沉洗涤后滤渣加适量蒸馏水，充分复溶后透析，透析在磁力搅拌下进行，样品液与透析液即蒸馏水的体积比为1:10 30，4 8h换一次水，透析12 120h ;透析完毕后将糖溶液放入冷冻干燥机中干燥得叶下珠精总多糖，含量在95%以上。
6.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤5)的离子交换柱为DEAE-52阴离子交换树脂，使用前将DEAE-52纤维素填料用蒸馏水浸泡48h， 期间4 5h换一次水，并用倾泻法除去悬浮杂质，然后进行碱一酸一碱处理；先用O. 5 mol/ L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min 后蒸懼水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性,得到 0!1_型纤维素；湿法装柱，柱尺寸为500 X 50mm，蒸馏水平衡48h，装柱过程中避免气泡及断层现象。
7.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤5)的 NaCl梯度溶液的物质的量浓度为O 3mol/L。
8.根据权利要求7所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤5)的 NaCl梯度溶液的物质的量浓度分别为0、0. 1,0.25,0. 5,0. 75mol/L。
9.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤5)依次用适宜的NaCl梯度溶液洗脱，每种NaCl的物质的量浓度溶液洗脱8小时，流速4mL/min， 用管收集洗脱液，每IOmin收集一管。
10.根据权利要求1所述的叶下珠多糖PULPIII的提取分离方法，其特征在于步骤5) 洗脱曲线为以收集的管序为横坐标，溶液的光吸收度为纵坐标绘图而得到。
全文摘要
本发明公开了一种叶下珠多糖PULPⅢ的提取分离方法，包括如下步骤叶下珠全草蒸馏水洗涤去土，干燥后，粉碎，用石油醚脱脂，乙醇脱小分子糖后，药渣用水浸提，浸提液离心分离，取滤液浓缩后加入乙醇醇沉，醇沉物经除蛋白，洗涤，除杂和透析后干燥即得叶下珠精总多糖，经过脱蛋白，透析处理后，过离子交换柱，依次用适宜的NaCl梯度溶液洗脱，苯酚－硫酸法跟踪检测，得洗脱曲线，收集第3主峰组分，浓缩，重蒸水透析48h，冷冻干燥得叶下珠多糖PULPⅢ纯组分。本发明通过对叶下珠粗多糖的分离纯化，得到了纯净单一的叶下珠多糖成分。
文档编号C08B37/00GK103044567SQ20131000570
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者李清禄, 李宇翔, 李凌峰, 张丽丽, 谢勇平, 周学酬, 黄志坚 申请人:福建农林大学