用于预防骨关节炎的低分子量生物技术6-硫酸软骨素的制作方法
【专利摘要】本申请公开了通过用生物技术得到的未硫酸化软骨素骨架的化学硫酸化和随后的解聚而生产的低分子量(1000-5000道尔顿)硫酸软骨素(CS)。所述的CS基本上是单硫酸化的(主要在6-位)，具有非常少量的4-位硫酸化，并且具有与天然CS类似的单/双硫酸化二糖比率和电荷密度。所述生物技术6-硫酸软骨素(C6S)可用于治疗和预防骨关节炎以及急性和慢性炎症过程。
【专利说明】用于预防骨关节炎的低分子量生物技术6-硫酸软骨素
[0001] 发明简述
[0002] 本发明涉及通过生物工程技术获得的未硫酸化软骨素骨架的化学硫酸化和随后 解聚而生产的或者通过初始特征为低分子量的生物技术来源的多糖硫酸化而生产的极低 分子量（1000-5000道尔顿）的硫酸软骨素（CS)，以及所述CS在治疗和预防骨关节炎以及 急性和慢性炎症过程中的用途。具体地讲，本发明涉及生物技术CS，其基本上是被单硫酸 化的（主要在6-位），几乎没有或者没有4-硫酸根，并且就单/双硫酸化二糖比率、无三 硫酸化和多硫酸化的二糖、电荷密度和所显示的生物活性方面，其与天然CS是一致的。根 据本发明的6-硫酸软骨素（C6S)具有比源自陆栖动物（牛、猪和鸟）的动物组织提取的特 征为14, 000-26, 000道尔顿分子量的硫酸软骨素和源自海生动物（鲨鱼、乌贼、鳐（skate) 和硬骨鱼）的动物组织提取的都具有>50, 000道尔顿分子量的硫酸软骨素更低的分子量 (1000-5000道尔顿）。根据本发明的C6S还具有比已知类型的低分子量CS甚至更低的分 子量。所述特征赋予根据本发明的6-硫酸软骨素更好的生物利用度，并由此赋予其更大的 效力。
[0003] 低分子量生物技术6-硫酸软骨素（C6S)在骨关节炎的治疗和预防中的用途被其 在通常用于研究关节炎和相关症状的众所周知的动物模型中抗炎活性的试验验证所支持。 所述的低分子量生物技术C6S还显示良好的耐受性，如在根据用于药品的OECD指南进行的 毒理学研究所证实。
[0004] 发明背景
[0005] 基于众多临床结果和多种临床试验的兀分析（meta-analyses)，EULAR(欧洲风 湿病防治联合会（EuropeanLeagueagainstRheumatism))目前将硫酸软骨素（CS)推荐 作为骨关节炎的症状慢作用药物（SYSAD0A)用于治疗膝盖（JordanKM等人，Ann.Rheum. Dis. 62,1145, 2003)、髋部（JordanKM等人，Ann.Rheum.Dis. 62,1145, 2003)和手（ZhangW 等人，Ann.Rheum.Dis. 66, 377, 2007)的骨关节炎。最近临床试验也已显示CS修饰人软骨组 织的细胞外结构（ReginsterJY，HeraudF，ZegelsB，Bruyere0·MiniRevMedChem7， 1051,2007。KahanA,UebelhartD,DeVathaireF,DelmasPD,ReginsterJY.Arthritis Rheum60, 524, 2009)。CS还单独或与其他成分联合地广泛用作营养制品（McAlindonTE 等人，JAMA283,1469, 2000。VolpiN等人，FoodAnalMeth1，195, 2008。VolpiN等人， SeparationSc1,22,2009)〇
[0006] 硫酸软骨素（CS)是存在于脊椎动物和无脊椎动物中的属于糖胺聚糖（GAG)类的 天然多糖，其由通过β1-3键相互连接并在不同位置硫酸化的交替的葡糖醛酸（GlcA)和 N-乙酰基-D-半乳糖胺（GalNAc)残基形成的二糖序列组成。
[0007]CS存在于动物组织中，具有结构功能和生理学功能。根据其来源，CS主要由不同 百分比的在GalNAc的4位或6位单硫酸化的两种类型的二糖单元（分别为二糖A和C)构 成。CS骨架还含有通常少量的未硫酸化的二糖。根据具体的动物来源，含有通过氧原子在 不同位置例如GlcA的2位和GalNAc的6位（二糖D)、GlcA的2位和GalNAc的4位或者 GalNAc的4位和6位（二糖E)连接的两个硫酸根基团的二硫酸化二糖可以以不同百分比存 在于CS骨架中（VolpiN.J.Pharm.Pharmacol. 61，1271,2009。VolpiN.J.Pharm.Sci. 96， 3168,2007。VolpiN.Curr.PhaimDes12,639, 2006)。GlcA的 3 位硫酸化的存在是可能 的，但是以极少的量；所述存在在陆栖动物来源的CS中是罕见的，并更可能存在于海生动 物来源的高度硫酸化类型中（FongmoonD等人.JBiolChem282, 36895, 2007)。
[0008]CS的重复二糖单元的化学式如下：
[0009]
【权利要求】
1. 具有抗炎和抗关节炎生物活性的、具有1000-5000道尔顿分子量的硫酸软骨素，其 特征为：等于或大于65%百分比的6-单硫酸二糖、〈1%百分比的4-单硫酸二糖、低于或 等于20 %百分比的2, 6-二硫酸二糖、小于5 %百分比的4, 6-二硫酸二糖、〈1 %百分比的 2, 4-二硫酸二糖、〈15%百分比的未硫酸化二糖以及1-1. 25的电荷密度值。
2. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素，其如下获得：在利用水解除去果糖残基后，将大 肠杆菌荚膜多糖K4化学硫酸化以及随后进行酸或游离基解聚。
3. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素，其通过在利用水解除去果糖残基后，进行大肠 杆菌荚膜多糖K4的低分子量天然流分的化学硫酸化而得到。
4. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素,其通过大肠杆菌菌株DSM23644生产的本来无果 糖残基的荚膜多糖（K4-d)的化学硫酸化以及随后的酸或游离基解聚而得到。
5. 根据权利要求1所述的硫酸软骨素,其通过大肠杆菌菌株DSM23644生产的本来无果 糖残基的荚膜多糖（K4-d)的低分子量流分的化学硫酸化而得到。
6. 根据权利要求1-5的硫酸软骨素，其用于预防和治疗急性或慢性炎症疾患和/或用 于保持人和动物的肌骨骼健康。
7. 根据权利要求6所述的硫酸软骨素，其中炎症疾患是骨关节炎。
8. 组合物，其含有作为活性成分的权利要求1-5所述的硫酸软骨素，以及药学和营养 学上可接受的赋形剂，和任选的其他活性成分。
9. 根据权利要求8所述的组合物，其中其他活性成分选自盐酸葡糖胺、硫酸葡糖胺、 N-乙酰葡糖胺、透明质酸、氨基酸、胶原、水解的胶原、多不饱和脂肪酸类、角蛋白、皮肤素、 甲基-磺酰基甲烷（MSM)、叶酸、还原叶酸、维生素、B族维生素、S-腺苷甲硫氨酸（SAMe)、抗 坏血酸或抗坏血酸锰。
10. 根据权利要求8或9所述的组合物，其为胶囊、软凝胶胶囊、片剂、液体形式的饮剂 或待被溶解的粉状饮剂形式的。
【文档编号】C08B37/00GK104411363SQ201380026473
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2012年5月22日
【发明者】N·米拉利亚, D·比安基, E·瓦洛蒂, A·特兰廷, A·特里利, I·布希尔罗, M·阿格斯蒂内托, P·巴扎, M·瓦莱蒂 申请人:诺西斯有限公司