一种三臂星形亲水性共聚物及其合成方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种三臂星形亲水性共聚物及其合成方法和应用，利用三元伯胺内核引发γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐开环聚合反应，利用碳二亚胺法将小分子RAFT聚合链转移剂键接于该星形聚合物的三个端氨基上，获得大分子RAFT链转移剂；再以N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺为单体，实施RAFT聚合，最后利用共聚物中N-羟甲基丙烯酰胺组分的羟基与异氰酸酯化端甲基聚乙二醇反应，实现经二硫键连接聚乙二醇，再经肼解处理后获得所需的三臂星形亲水性共聚物。该方法能够灵活控制各聚合物组分分子量大小和链长度、反应条件温和、原料易得，合成的聚合物能够提高药效，降低毒副作用，同时装载阿霉素和基因药物，实现协同抗肿瘤治疗效果。
【专利说明】一种三臂星形亲水性共聚物及其合成方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种三臂星形亲水性共聚物及其合成方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 基于细胞毒药物的化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要策略之一。然而，细胞毒药物 通常细胞毒性大、水溶性差且无生物选择性，可同时杀死肿瘤细胞和正常细胞，毒副作用严 重。由于化疗疗效和毒副作用均与药物剂量强烈正相关，因此很难通过提高药物浓度改善 治疗效果。更为严重的是，细胞毒药物在化疗过程中，肿瘤细胞几乎都会出现多药耐药性。 这些成为制约化疗成功的主要障碍。近年许多研究表明，利用生物相容性和生物可降解性 高分子材料等生物材料负载化疗药物，可有效增加肿瘤组织局部药物浓度，提高药物生物 利用度，实现增强治疗效果、降低对正常细胞毒副作用的目的。目前，药物载体材料研究最 多的是生物相容性好、可生物降解的聚酯材料，如聚丙交酯、聚乙丙交酯、聚己内酯等。这 些疏水性聚酯材料可有效装载疏水性的细胞毒药物，但它们主要通过水解降解方式释放药 物，速度较慢，影响药效发挥，可见它们并非是理想的药物载体材料。因此，合成新型药物 载体材料的和开发新型药物释放机制一直都是研究热点。近几年，聚氨基酸如聚谷氨酸和 聚赖氨酸因具有良好的生物相容性和生物可降解性，在药物递送领域引起兴趣。聚氨基酸 是一类通过肽键连接的、由氨基酸及其衍生物构成的均聚或共聚高分子材料。不同氨基酸 呈现不同的侧基、荷电性质和亲疏水性，可灵活调节聚氨基酸理化性质，如降解性能、生物 相容性、自组装行为等。此外，聚氨基酸的降解产物为近中性的氨基酸，可避免传统聚酯材 料酸性降解产物带来的炎性反应等副作用。可见，聚氨基酸及其衍生物在药物递送方面具 有广阔的开发前景。如申请号为201110132965. 2的中国专利公开了利用端氨基聚乙二醇 引发L-色氨酸聚合制备两亲性嵌段共聚物的制备方法，所得共聚物可形成胶束，用于紫杉 醇等药物的装载。再如申请号为201110200449. 9的中国专利公开了一种还原敏感性的嘌 呤-聚天冬酰亚胺前药，其中含有的二硫键可在肿瘤细胞内谷胱甘肽还原作用下发生降 解，释放药物，具有降低毒副作用和提高疗效的作用。
[0003] 不管是聚酯或是聚氨基酸用作化疗药物载体时，都必须将其与亲水性聚乙二醇形 成两亲性嵌段共聚物，以便能在水中自组装成具有疏水内核和亲水外壳的纳米胶束。其中， 疏水性内核用于包裹疏水性化疗药物，亲水性外壳可使纳米载体稳定、防止胶束聚并，免受 免疫系统调理作用，实现体内长循环。相对于传统的小分子脂质体胶束而言，两亲性嵌段共 聚物具有更低的临界胶束浓度，在血液中的稳定性更好，并可经肿瘤组织特殊的'增强的渗 透和滞留效应'实现被动靶向，将药物有效富集于肿瘤组织内部，促进肿瘤细胞对载体-药 物的摄取。然而，单纯依靠两亲性嵌段共聚物自组装形成的纳米胶束，当注射进入体内后由 于稀释效应，仍存在胶束解离提前释放药物的风险。
[0004] 近年，基因治疗被视为治疗恶性肿瘤的很有前景的新策略，它通过将外源性的治 疗性基因导入肿瘤细胞中，以纠正缺陷基因或抑制/促进某种基因/蛋白质表达，从而达到 治疗疾病的目的。同时，基因治疗也是克服化疗中肿瘤细胞多药耐药性的有效途径。为克 服基因治疗中病毒类载体存在的安全性、装载能力有限、潜在免疫反应及致癌作用等问题， 对于非病毒类载体的研究已成为新的热点。非病毒类载体具有安全性高、免疫原性低、携带 量大、易批量生产等优点，主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两类。其中，阳离子聚合 物是研究主体，可经静电作用与基因物质形成稳定的复合物，有效压缩基因物质，协助基因 穿过胞膜。聚乙烯亚胺是最经典的阳离子聚合物载体，具有原料易得、压缩比高、缓冲能力 强和转染效率高等优点，研究最为集中。然而，聚乙烯亚胺由于不可降解且细胞毒性大，制 约着其应用范围。
[0005] 目前，利用不同作用机制和不同类型药物联合治疗恶性肿瘤已成为发展趋势，尤 其是基于纳米载体的联合治疗更被寄予厚望。然而，基于纳米载体的联合治疗最大的瓶颈 问题是合成出理想的可同时装载不同药物的载体材料。申请号为201210114241. X的中国 专利公开了由聚乙二醇、聚乳酸和聚精氨酸构成的三嵌段共聚物，其中聚酯段和聚精氨酸 段分别用于装载疏水性药物和基因物质，具有良好的生物安全性和药物递送能力。但该嵌 段共聚物的段间通过酯键和氨酯键连接，没有刺激响应性的解离机制，药物释放速度较慢， 难以充分发挥药物疗效。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种三臂星形水溶性共聚物及其合成方法和应用，该方法 能够灵活控制各聚合物组分分子量大小和链长度、反应条件温和、原料易得，合成的聚合物 能够提高药效，降低毒副作用，同时装载阿霉素和基因药物，实现协同抗肿瘤治疗效果。
[0007] 为达到上述目的，本发明三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于，包括如 下步骤：
[0008] 1)三臂聚（L-谷氨酸-Y -苄酯）大分子RAFT链转移剂的合成：
[0009] 将除水后的三臂聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）溶于无水有机溶剂中，然后在氮气气氛 下于0°C?4°C加入带一个羧基的RAFT链转移剂、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺，再 在室温反应24小时?72小时后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到三臂聚（L-谷氨 酸-Y -苄酯）大分子RAFT链转移剂；其中，除水后的聚（L-谷氨酸-γ -苄酯）、带一个羧 基的RAFT链转移剂、4-二甲氨基吡啶以及二环己基碳二亚胺的摩尔比为1 : (6?20) :3 : (6 ?60);
[0010] 2)三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺） 的合成：
[0011] 将三臂聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）大分子RAFT链转移剂、N-(3-二甲胺丙基）甲 基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺溶于无水二氧六环中，然后在无氧环境下加入引发剂，于 60°C?65°C反应36小时?72小时，反应结束后浓缩得到的反应体系，再用二氯甲烷溶 解后在冷乙醚中沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到三臂星形聚（L-谷氨酸-γ -苄酯）-聚 (N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）；其中，三臂聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）大分子RAFT链 转移剂、N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺以及N-羟甲基丙烯酰胺的摩尔比为1 :(72? 290) : (3. 6 ?14. 4);
[0012] 3)三臂星形聚（L-谷氨酸-γ -苄酯）-聚（N- (3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚 乙二醇共聚物合成：
[0013] 将除水后的三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯 酰胺）溶解于无水氯仿中，然后加入2, 2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的端甲基聚乙二醇， 于60°C?65°C反应36小时?72小时，反应结束后浓缩得到的反应体系，并用乙醚沉淀，接 着在蒸馏水中透析，最后冻干，得到三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺 丙基）甲基丙烯酰胺）_聚乙二醇共聚物；其中，异氰酸酯化的端甲氧基聚乙二醇和除水后 的三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）的摩尔比 为（9 ?36) :1 ;
[0014] 4)三臂星形亲水性共聚物的合成：将三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）_聚 (Ν- (3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚乙二醇共聚物肼解脱除苄基，得到三臂星形亲水性 共聚物。
[0015] 所述的步骤1)中的聚（L-谷氨酸-Υ-苄酯）是采用以下方法制得的：将无水的 三（2-氨基乙基）胺溶于无水有机溶剂中，在氮气气氛下加入γ-苄酯-L-谷氨酸-Ν-羧基 环内酸酐，搅拌形成均匀溶液，然后于25°C?40°C反应48小时?72小时，反应结束后将得 到的反应液用冷乙醚沉淀和乙醇洗涤，真空干燥后得到聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）；其中，无 水的三（2-氨基乙基）胺和γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的摩尔比为（1:30)? (1:120)，且步骤1)和步骤4)中的无水有机溶剂为无水二甲基甲酰胺、无水氯仿或无水四 氢呋喃。
[0016] 所述的无水的三（2-氨基乙基）胺是经氢化钙回流，氮气气氛下减压蒸馏得到的。 [0017] 所述的苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐由以下步骤合成：将L-谷氨 酸-Y -苄酯加入无水四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50°C反应至形成澄 清溶液后浓缩，最后向浓缩后得到的反应体系中加入无水正己烷使沉淀，将得到的沉淀用 无水正己烷重结晶，得到Y -苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ -苄 酯与三光气的摩尔比为1 : (〇. 35?0. 4)。
[0018] 所述的步骤4)肼解脱除苄基的方法为：将三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚 (N- (3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚乙二醇共聚物溶于无水有机溶剂中，滴加无水肼后 于30°C?40°C反应18小时?48小时，反应结束后将得到的反应体系在质量浓度为0. 25% 的氨水中透析，最后冻干，得到三臂星形亲水性共聚物；其中，无水肼与三臂星形聚（L-谷 氨酸-γ-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚乙二醇共聚物中苄基保护基 的摩尔比为（3?20) :1。
[0019] 所述的步骤1)中带一个羧基的RAFT链转移剂为S-1-十二烷基-S'-(a，α'-二 甲基-a "-乙酸）三硫代碳酸酯、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基）硫烷基]戊酸、 4_氰基_4-(硫代苯甲酰）戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
[0020] 所述的步骤2)中的引发剂为偶氮二异丁腈或4, 4'-偶氮双（氰基戊酸），且三臂 聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）大分子RAFT链转移剂与引发剂的摩尔比为1 :(0.36?1.44)。
[0021] 所述的步骤3)中2, 2' -二硫代二乙基异氰酸酯改性的端甲基聚乙二醇是采用 如下方法合成的：将分子量为800?4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和 2, 2' -二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，于85°C氮气氛下反应48小时，向得到的反 应体系中加入无水正己烷使沉淀，收集沉淀并真空干燥，即得到2, 2' -二硫代二乙基异氰 酸酯改性的端甲基聚乙二醇；其中，端甲基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2, 2'-二硫代二 乙基异氰酸酯的摩尔比为1 : (〇. 02?0. 08) : (3?8)。
[0022] -种采用所述的方法合成的三臂星形亲水性共聚物，其化学名称为三臂星形聚 (L-谷氨酸-Y-酰肼）_聚（N-(3_二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）_聚乙二醇共聚物，化学结 构为：
[0023]
【权利要求】
1. 一种三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 三臂聚（L-谷氨酸-γ -苄酯）大分子RAFT链转移剂的合成： 将除水后的三臂聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）溶于无水有机溶剂中，然后在氮气气氛下 于0°C?4°C加入带一个羧基的RAFT链转移剂、4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺，再 在室温反应24小时?72小时后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到三臂聚（L-谷氨 酸-Y -苄酯）大分子RAFT链转移剂；其中，除水后的三臂聚（L-谷氨酸-γ -苄酯）、带一 个羧基的RAFT链转移剂、4-二甲氨基吡啶以及二环己基碳二亚胺的摩尔比为1 : (6?20): 3 : (6 ?60); 2) 三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）的合 成： 将三臂聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）大分子RAFT链转移剂、N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯 酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺溶于无水二氧六环中，然后在无氧环境下加入引发剂，于60°C? 65°C反应36小时?72小时，反应结束后浓缩得到的反应体系，再用二氯甲烷溶解后在冷 乙醚中沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二 甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）；其中，三臂聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）大分子RAFT链转移剂、 N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺以及N-羟甲基丙烯酰胺的摩尔比为1 : (72?290): (3. 6 ?14. 4); 3) 三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚乙 二醇共聚物合成： 将除水后的三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰 胺）溶解于无水氯仿中，然后加入2, 2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的端甲基聚乙二醇，于 60°C?65°C反应36小时?72小时，反应结束后浓缩得到的反应体系，并用乙醚沉淀，接着 在蒸馏水中透析，最后冻干，得到三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）_聚（N-(3-二甲胺丙 基）甲基丙烯酰胺）_聚乙二醇共聚物；其中，异氰酸酯化的端甲氧基聚乙二醇和除水后的 三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）的摩尔比为 (9 ?36) :1 ; 4) 三臂星形亲水性共聚物的合成：将三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二 甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚乙二醇共聚物进行肼解脱除苄基，得到三臂星形亲水性共聚 物。
2. 根据权利要求1所述的三臂星形亲水性共聚物及合成方法，其特征在于，所述的步 骤1)中的聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）是采用以下方法制得的：将无水的三（2-氨基乙基） 胺溶于无水有机溶剂中，在氮气气氛下加入Y -苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐，搅拌形 成均匀溶液，然后于25°C?40°C反应48小时?72小时，反应结束后将得到的反应液用冷 乙醚沉淀和乙醇洗涤，真空干燥后得到聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）；其中，无水的三（2-氨基 乙基）胺和苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的摩尔比为（1:30)?（1:120)，且步骤 1)和步骤4)中的无水有机溶剂为无水二甲基甲酰胺、无水氯仿或无水四氢呋喃。
3. 根据权利要求2所述的三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于：所述的无 水的三（2-氨基乙基）胺是经氢化钙回流，氮气气氛下减压蒸馏得到的。
4. 根据权利要求2所述的三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于，所述的 γ -苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐由以下步骤合成：将L-谷氨酸-γ -苄酯加入无水 四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50°C反应至形成澄清溶液后浓缩，最后向 浓缩后得到的反应体系中加入无水正己烷使沉淀，将得到的沉淀用无水正己烷重结晶，得 到Y -苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ -苄酯与三光气的摩尔比为 1 :(0· 35 ?0· 4)。
5. 根据权利要求1所述的三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于，所述的步 骤4)肼解脱除苄基的方法为：将三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-苄酯）-聚（N-(3-二甲胺丙 基）甲基丙烯酰胺）_聚乙二醇共聚物溶于无水有机溶剂中，滴加无水肼后于30°C?40°C 反应18小时?48小时，反应结束后将得到的反应体系在质量浓度为0. 25%的氨水中透 析，最后冻干，得到三臂星形亲水性共聚物；其中，无水肼与三臂星形聚（L-谷氨酸-Y -苄 酯）_聚（N-(3-二甲胺丙基）甲基丙烯酰胺）-聚乙二醇共聚物中苄基保护基的摩尔比为 (3 ?20) :1。
6. 根据权利要求1所述的三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于：所述的步 骤1)中带一个羧基的RAFT链转移剂为S-1-十二烷基-S'_(a，α'-二甲基-α "-乙酸） 三硫代碳酸酯、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基）硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯 甲酰）戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
7. 根据权利要求1所述的三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于：所述的 步骤2)中的引发剂为偶氮二异丁腈或4, 4'-偶氮双（氰基戊酸），且三臂聚（L-谷氨 酸-Y-苄酯）大分子RAFT链转移剂与引发剂的摩尔比为1 :(0.36?1.44)。
8. 根据权利要求1所述的三臂星形亲水性共聚物的合成方法，其特征在于，所述的步 骤3)中2, 2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的端甲基聚乙二醇是采用如下方法合成的：将分 子量为800?4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2, 2' -二硫代二乙基异氰 酸酯溶于无水甲苯中，于85°C氮气氛下反应48小时，向得到的反应体系中加入无水正己烷 使沉淀，收集沉淀并真空干燥，即得到2, 2' -二硫代二乙基异氰酸酯改性的端甲基聚乙二 醇；其中，端甲基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2, 2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为 1 : (0· 02 ?0· 08) : (3 ?8)。
9. 一种采用权利要求1?8中任意一项权利要求所述的方法合成的三臂星形亲水性共 聚物，其特征在于，其化学名称为三臂星形聚（L-谷氨酸-Y-酰肼）_聚（N-(3-二甲胺丙 基）甲基丙烯酰胺）_聚乙二醇共聚物，化学结构为：
10. 如权利要求9所述的三臂星形亲水性共聚物作为装载阿霉素和基因药物的载体的 应用。
【文档编号】C08G69/48GK104045837SQ201410267395
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】钱军民, 徐明辉, 胥伟军, 刘茸茸, 王红洁 申请人:西安交通大学