本发明是在由NIH拨款的基金号R01EY021374和R01EY018660的政府支持下完成。政府拥有本发明中的某些权利。在本申请通篇中引用了各种出版物。这些出版物的公开内容在此以引用方式整体并入本申请中，以更全面地描述本发明所属的现有技术状况。
背景技术：
不可逆失明的主要原因包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、色素性视网膜炎、青光眼和视网膜血管病，所述视网膜血管病引起视网膜中的RPE、光感受器、视网膜神经节细胞(RGC)和支持细胞的损失。一种潜在的治疗方法是通过移植健康的视网膜细胞以替代损失的视网膜细胞来恢复视觉功能。在最近几十年里，尝试使用从人胎儿或成人视网膜组织分离的原代视网膜祖细胞获得了有限的成功1，这是由于成体祖细胞的低扩张能力和分化潜力或获得充足的人胎儿视网膜祖细胞的困难，引发了伦理问题。人多能干细胞(hPSC)(包括人胚胎干细胞(hESC)和诱导性多能干细胞(iPSC))代表了用于基于细胞的替代疗法的有前景的可再生供体来源。然而，hPSC自身并不适于临床应用中的直接移植，这是由于它们形成畸胎瘤的倾向和它们在体内用期望的重编程细胞类型重建宿主组织方面的低效率。因此，主要努力集中于产生hPSC的分化衍生物，如神经视网膜祖细胞2,3、视网膜色素上皮(RPE)4-6和光感受器7-9。虽然hESC来源的RPE移植体现已进展到关于治疗患有斯塔加特氏黄斑营养不良(Stargardt’smaculardystrophy)和AMD的患者的临床试验10，但如果已经损失了大多数的光感受器，则RPE移植物的有效性可能有限。因此，非常期望研发一种可再生的视网膜干细胞产品，其具有重建变性的视网膜中的RPE和光感受器两者的潜力，但不构成形成肿瘤的风险。此类产品将在多种细胞类型受影响的病况中替代受损细胞并恢复视觉回路。
技术实现要素：
本发明提供用于产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的体外方法，其包括：(a)在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基(feeder-conditionedmedium)或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的胚胎干细胞(ESC)以产生并生长所述分离的ESC的培养物；和(b)使这样生长的所述分离的ESC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使(a)的所述分离的ESC分化成原始视网膜干细胞，由此产生分离的哺乳动物pRSC。本发明进一步提供用于产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的体外方法，其包括：(a)在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的多能干细胞(PSC)以产生并生长所述分离的PSC的培养物；和(b)使这样生长的所述分离的PSC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使所述分离的PSC分化成原始视网膜干细胞，由此产生分离的哺乳动物pRSC。本发明还进一步提供用于产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的体外方法，其包括：(a)在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的诱导性多能干细胞(iPSC)以产生并生长所述分离的iPSC的培养物；和(b)使这样生长的所述分离的iPSC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使所述分离的iPSC分化成原始视网膜干细胞，由此产生分离的哺乳动物pRSC。本发明另外提供用于产生分离的哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)的体外方法，其包括：(a)在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的原始视网膜干细胞(pRSC)以产生并生长所述分离的pRSC的培养物；和(b)使这样生长的所述分离的pRSC的所述培养物与Wnt、Notch或VEGFR信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使所述分离的pRSC分化成分离的哺乳动物RGC，由此产生分离的哺乳动物RGC。本发明还提供用于由分离的哺乳动物pRSC产生分离的哺乳动物光感受器的方法，其包括：(a)将来自哺乳动物的解离的pRSC在包含TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5或ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch或Wnt信号传导的一种或多种抑制剂或刺猬信号传导激活剂的神经诱导培养基中培养并生长足够时间以将pRSC诱导成无可见的形态变化或无光感受器特异性标志物表达的光感受器细胞谱系命运(fate)；和(b)之后，在包含视黄酸或牛磺酸或两者的神经诱导培养基中培养并生长步骤a)的pRSC以使所述哺乳动物pRSC分化成光感受器，由此产生分离的哺乳动物光感受器；其中所述培养基不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清。进一步另外，本发明提供用于产生非神经的分离的哺乳动物视网膜色素上皮(RPE)或分离的哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)的方法，其包括：(a)将来自哺乳动物的pRSC在不存在SMAD信号传导抑制剂的包含烟酰胺或激活素A或两者的培养基中培养足够时间以将pRSC引向RPE命运；和(b)在包含N1培养基补充物、牛磺酸、氢化可的松(hydrocortisone)或三碘甲状腺原氨酸(triiodo-thyronin)中的一种或多种的培养基中培养所述pRSC，以使所述哺乳动物pRSC分化成哺乳动物RPE或RPEs，由此产生分离的哺乳动物RPE或RPEs，其中所述培养基不含饲养细胞或饲养层条件化培养基。本发明更进一步提供用于由分离的人胚胎干细胞(hESC)产生分离的人原始视网膜干细胞(hpRSC)的方法，其包括：(a)将分离的hESC在具有不存在饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的培养基的固体支持物上培养足够时间以生长得接近汇合，优选生长到约80％细胞汇合；(b)将这样生长的所述分离的hESC在固体支持物上在包含碱性FGF(bFGF)的培养基中培养足够时间以生长得接近汇合；(c)在具有包含Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的培养基的固体支持物上培养步骤(b)的所述分离的hESC以使所述分离的hESC分化成分离的人原始视网膜干细胞，由此产生分离的hpRSC。更进一步，本发明提供用于由分离的人多能干细胞(hPSC)产生分离的人原始视网膜干细胞(hpRSC)的方法，其包括：(a)将分离的hPSC在具有不存在饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的培养基的固体支持物上培养足够时间以生长得接近汇合，优选生长到约80％细胞汇合；(b)将这样生长的所述分离的hESC在固体支持物上在包含bFGF的培养基中培养足够时间以生长得接近汇合；(c)在具有包含Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的培养基的固体支持物上培养步骤(b)的所述分离的hPSC以使所述分离的hPSC分化成分离的人原始视网膜干细胞，由此产生分离的hpRSCs。本发明还提供用于由分离的人诱导性多能干细胞(iPSC)产生分离的人原始视网膜干细胞(hpRSC)的方法，其包括：(a)将分离的人iPSC在具有不存在饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的培养基的固体支持物上培养足够时间以生长得接近汇合，优选生长到约80％细胞汇合；(b)将这样生长的所述分离的iPSC在固体支持物上在包含bFGF的培养基中培养足够时间以生长得接近汇合；(c)在具有包含Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的培养基的固体支持物上培养步骤(b)的所述分离的iPSC以使所述分离的iPSC分化成分离的人原始视网膜干细胞，由此产生分离的hpRSC。本发明另外提供用于产生哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的化学成分确定的培养基中培养来自哺乳动物的胚胎干细胞(ESC)、多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)的说明书以及针对使用Wnt信号传导或TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂或Wnt信号传导和TGF-β/BMP信号传导两者的抑制剂的说明书。附图说明图1.由hESC诱导hpRSC。(a)体外由人多能干细胞定向诱导人视网膜细胞命运的示意性图解。(b)在1周诱导后来源于hESC的hpRSC中的典型的早期眼区转录因子(typicalearlyeyefieldtranscriptionfactor)PAX6(绿色)和LHX2(红色)的免疫荧光标记的共焦图像。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。(c)针对神经祖细胞/干细胞标志物巢蛋白(白色)和增殖标志物Ki67(绿色)对hpRSC染色。(d)典型的早期眼区转录因子的诱导表达的实时qPCR分析。比例尺＝30μm。图2.hESC来源的hpRSC的转录组分析。hfRPC、hpRSC和hESC系HuES9中被差异调控的基因的表达的热图。细胞类型的无监督聚类显示hESC来源的hpRSC在hfRPC与亲本hESC系HuES9之间的过渡状态。(a)全基因组转录组分析。(b)多能性调控。(c)TGF-β超家族信号传导途径。(d)Wnt信号传导途径。红色，高表达；蓝色，低表达，相对于其它两种细胞类型。(e)hpRSC与hfRPC之间的成对散点图分析。显示hfRPC中相对于hpRSC中的转录物的信号强度。对角系指示两种细胞类型之间的基因中的相等表达水平。用*标记的基因对于hpRSC干性(stemness)和特化(specification)是重要的。图3.在化学成分确定的培养条件下hpRSC可以被特化为视网膜神经节细胞(RGC)的命运。(a)hpRSC可以高效率分化成RGC。在RGC诱导条件下培养两周后，分化细胞展示长的神经元突起并且表达典型的RGC标志物如BRN3(红色)和TUJ1(绿色)。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。(b)由hpRSC分化的细胞中的RGC特异性转录因子的表达的实时qPCR分析。图4.在成分确定的培养条件下hpRSC向神经元或非神经元视网膜细胞命运的分化的表征。(a-d)如通过恢复蛋白(recoverin)(a)、蓝色视蛋白(OPN1SW)(b)和视紫质(c)的免疫细胞化学检测以及光感受器特异性受体IRBP-GFP(d)的表达所证明的光感受器诱导；分化良好的光感受器显示具有长的外突起和短的内突起的典型形态(d，插图)。(e-g)RPE诱导；(e)如通过RPE65(绿色)的早期表达和RPE细胞(红色)的多边形形状的鬼笔环肽染色所证实的RPE形成；(f)在培养3周后观测到的升高的RPE65表达(红色)；(g)在培养中延长成熟后出现色素RPE。(a-f)用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。图5.新生裸大鼠中的被移植hpRSC的体内整合和分化。移植hpRSC后的视网膜的免疫组织化学染色冷冻切片的共焦图像。在接受者神经视网膜中观测到被移植的表达GFP(绿色)的人细胞的显著整合。与恢复蛋白(白色)阳性细胞共定位的一些表达GFP的细胞(a、c、e)；在许多被移植的表达GFP的细胞中检测到视网膜祖细胞标志物巢蛋白(红色)的免疫染色(b、d、f)。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。比例尺：a-d＝30μm；e-f＝15μm。图6.移植后两个月的RCS大鼠的光感受器层中的被移植hpRSC的整合和分化。(a)被移植细胞经受用HSA抗体(红色)进行的免疫细胞化学标记。一些被移植细胞接受表达恢复蛋白(绿色)的光感受器(箭头)的命运。(b)hpRSC来源的视锥(箭头)对红色/绿色视蛋白(绿色)和HSA(红色)两者均为阳性。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。比例尺＝20μm。图7.hfRPC、HuES9和HuES9来源的hpRSC中参与FGF(a)、Notch(b)和刺猬信号传导途径(c)的基因的表达的代表性热图。已知用*标记的基因在视网膜发生(retinogenesis)中是重要的。图8.P21的裸大鼠中在不存在(a)或存在(b)HAMC水凝胶的情况下hpRSC的体内移植。在移植后6周处理视网膜切片。在不存在水凝胶的情况下，较少hpRSC存活并且经常被视网膜下空间中的瘢痕组织包围。在存在HAMC水凝胶的情况下，被移植的hpRSC扩散穿过视网膜下空间并进入神经视网膜层中。用人核抗原染色(绿色)标记被移植的hpRSC。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行复染。具体实施方式除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。本文引用的所有专利、申请、公开申请和其它出版物均以引用方式整体并入。必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“一制剂”的指代包括多种化合物。当在数字名称(例如，温度、时间、量、浓度和此类其它名称，包括范围)前使用时，如本文所用的术语“约”指示可以变化(+)或(-)10％、5％或1％的近似值。本发明的方法用于产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的方法本发明提供用于产生分离的哺乳动物pRSC的体外方法。本发明的方法的优点包括能够以足够的数量和质量产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞，以适于向受试者的眼中进行细胞移植(transplantation或grafting)，而不需要在细胞移植前进行细胞分级分离或细胞纯化。如本文所用的，分离的pRSC意指例如与污染物(例如，如不为pRSC的细胞)基本上分开的pRSC。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的胚胎干细胞(ESC)以产生并生长所述分离的ESC的培养物；和使所述分离的ESC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使所述分离的ESC分化成原始视网膜干细胞，由此产生分离的哺乳动物pRSC。在一个实施方案中，Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种是Wnt和TGF-β/BMP信号传导抑制剂的组合。分离的PSC的培养物可以是贴壁培养物。在一个优选的实施方案中，所述分离的ESC的培养物是单层培养物。在一个实施方案中，使分离的ESC的培养物的培养物生长到接近汇合，然后与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种或Wnt和TGF-β/BMP信号传导抑制剂的组合接触。在一个优选的实施方案中，Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂是小分子抑制剂。如本文所用的，分离的ESC意指例如与污染物(例如，如不为ESC的细胞)基本上分开的ESC。如本发明的上下文中所用的，信号传导是指其中有一组细胞蛋白质参与控制一种或多种细胞功能的一种或多种信号传导途径。信号(例如配体)通过所述信号的受体激活信号传导途径，所述受体用作所述途径的第一成员；所述信号与其受体之间的这种相互作用引发一连串事件，所述事件导致下游成员的生物活性或生物状态的后续变化，并最终导致细胞功能的改变。因此，细胞功能的变化是信号激活与所述信号有关的信号传导途径的结果。信号还可以激活多于一种的信号传导途径，如例如在Wnt或TGF-β信号传导中。另外，信号传导途径可以显示通过两种或更多种途径内的共有成员的串扰(cross-talk)。经常，信号传导途径是针对激活所述途径的配体蛋白质或信号被命名，如分别于Wnt、TGF-β、骨形态发生蛋白(BMP)或刺猬信号传导中的Wnt、TGF-β、BMP或刺猬配体。例如，Wnt蛋白质配体在结合到其受体Frizzled后可以引发Wnt信号传导；TGF-β蛋白质配体或TGF-β配体超家族成员(包括激活素和BMP)在结合到TGF-βII型受体后可以引发TGF-β信号传导并且与I型受体组合参与TGF-β超家族配体的配体特异性信号传导；BMP在结合到骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)后可以引发BMP信号传导；并且刺猬蛋白质配体在结合到其受体Patched后可以引发刺猬信号传导。或者，信号传导途径可以针对信号或配体的接受者被命名，如Notch信号传导中的Notch受体，所述Notch信号传导在激活后，向下游传递其激活状态以控制一种或多种细胞功能，如控制基因表达。此外，在TGF-β信号传导中，TGF-β超家族配体(如TGF-β、激活素或BMP)与其各自的II型受体(如TGF-β受体II型、激活素受体II型或BMP受体II型)结合可以导致受体激活和7种I型受体中的一种的随后激活，所述7种I型受体分为两个不同的组：TGF-β/激活素亚组，包括TGF-β超家族I型受体激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7；和BMP亚组，包括ALK-1、ALK-2、ALK-3和ALK-6I型受体。这两个不同亚组均参与SMAD家族转录因子调控基因转录的调控。在本发明的上下文中，等同物是指可以发挥与被替代的化合物或物质相同或相似的功能的等同的化合物或代用品。此类等同性可以基于抑制或激活特定的信号传导途径(如被替代的化合物或被替代的优选或最优选化合物)的能力使用与用于表征所述化合物的测定法相似的测定法来确定。本发明的最优选的化合物是：用于抑制Wnt信号传导的IWP2、用于抑制TGF-β超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的SB431542、用于抑制BMPI型受体ALK-2和ALK-3的LDN-193189、用于抑制Notch信号传导的DAPT、用于抑制VEGFR信号传导的PD173074、用于抑制糖原合成酶激酶-3的CHIR99021、用于激活刺猬信号传导的嘌吗啡胺(purmorphamine)或用于激活视黄酸信号传导(如通过RAR复合物)的视黄酸。成分确定的培养基或化学成分确定的培养基是指所述培养基基本上不含不确定的组分如血清和饲养层条件化培养基的事实。化学成分确定的培养基可以利用化学组分(包括去离子水或蒸馏水)来产生。它可以包括纯化的蛋白质(如生长因子和血清蛋白质，如白蛋白，优选重组蛋白质)、氨基酸(必需氨基酸和/或非必需氨基酸)、维生素、盐、脂质、糖、丙酮酸盐、缓冲剂、痕量金属、还原剂和指示剂染料。此外，所述培养基可以补充有激素、受体配体、代谢物、氨基磺酸、抑制因子、形态发生素、细胞信号传导分子、和细胞信号传导或激酶活性的激活剂或抑制剂。使用成分确定的培养基或化学成分确定的培养基来培养细胞对于基于细胞的替代疗法是有利的。根据本发明的实践，单层培养物可以生长直到接近汇合的、接近汇合或汇合的。在一个实施方案中，接近汇合的或接近汇合可以是约70％汇合(confluence或confluency)，优选约80％汇合。约80％汇合的细胞培养物的进一步培养和此类培养物的生长可以被描述为接近汇合的或接近汇合，其中汇合可以是约90％或更大。在汇合时，细胞挤满被细胞覆盖的整个培养物表面且所有细胞彼此接触。此外，在本发明的一个实施方案中，培养的细胞可以使用固体支持物来培养或生长。任选地，固体支持物可以包被有或基膜。此外，或基膜可以是生长因子减少的或生长因子减少的基膜。在一个替代实施方案中，固体支持物可以包被有生长因子减少的基膜并且在包被有生长因子减少的(BDBiosciences)、不含LDEV的经hESC验证的生长因子减少的基膜基质或其等同物或混合物的组织培养板、托盘、烧瓶或微珠中生长。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的多能干细胞(PSC)以产生并生长所述分离的PSC的培养物；和使所述分离的PSC的所述培养物与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使所述分离的PSC分化成pRSC，由此产生分离的哺乳动物pRSC。在一个实施方案中，Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种是Wnt和TGF-β/BMP信号传导抑制剂的组合。分离的PSC的培养物可以是贴壁培养物。在一个优选的实施方案中，所述分离的ESC的培养物是单层培养物。在一个实施方案中，使分离的PSC的培养物的培养物生长到接近汇合，然后与Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种或Wnt和TGF-β/BMP信号传导抑制剂的组合接触。在一个优选的实施方案中，Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂是小分子抑制剂。根据本发明的实践，可以以相似的方式处理来自哺乳动物的诱导的多能干细胞(iPSC)代替分离的PSC以产生分离的哺乳动物pRSC。如本文所用的，分离的PSC意指例如与污染物(例如，如不为PSC的细胞)基本上分开的PSC。如本文所用的，分离的iPSC意指例如与污染物(例如，如不为iPSC的细胞)基本上分开的iPSC。在一个实施方案中，本发明的方法在例如用Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种或Wnt和TGF-β/BMP信号传导抑制剂的组合进行的约7天处理内，以大于约90％效率产生分离的哺乳动物原始视网膜干细胞。在一个优选的实施方案中，Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂是小分子抑制剂。小分子是小于900道尔顿、优选大约500道尔顿或更小的低分子量有机化合物。例如，在一些实施方案中，用于本发明中的小分子具有466.6道尔顿(IWP2)、384.39道尔顿(SB431542)、406.48道尔顿(LDN-193189)、465.34道尔顿(CHIR-99021)、432.46道尔顿(DAPT)、523.67道尔顿(PD173074)或520.62道尔顿(嘌吗啡胺)的分子量。小分子结合到特定蛋白质或核酸以改变所述蛋白质或核酸的活性或功能。因此，小分子具有生物活性并且可以调控生物过程。如本发明的上下文中所用的，小分子抑制剂是细胞信号传导途径的抑制剂。小分子抑制剂可通过与激活信号竞争，如配体或蛋白质配体与其受体的结合来起作用。它可以通过阻止激活信号的传播所需的蛋白质-蛋白质相互作用来起作用。它可以起作用以抑制信号传导途径中任一个成员的活性，以破坏通过所述途径传递激活信号。例如，小分子抑制剂如SB431542通过选择性地且有效地抑制在与激活素或TGF-β结合的II型受体下游的TGF-β超家族I型ALK-4、ALK-5和ALK-7受体的活性来进一步阻断激活素或TGF-β向SMAD2和SMAD3转录因子的信号传导。不同于小分子抑制剂，信号传导途径的小分子激活剂通过激活所述途径来调节所述信号传导途径，所述信号传导途径的小分子激活剂也被称作信号传导(例如，Wnt信号传导、TGF-β/BMP信号传导、Notch信号传导、VEGFR信号传导、刺猬信号传导或SMAD信号传导)的小分子激活剂。与信号传导或信号传导途径的小分子抑制剂相似，信号传导或信号传导途径的小分子激活剂可以通过所述途径的各种成员在所述途径的任何步骤或位置激活所述途径。虽然经常可能期望在信号传导途径开始时通过与特定受体的激动剂配体相互作用来激活所述途径，但这不一定必需是这种情况。在刺猬信号传导的小分子激活剂的情况下，嘌吗啡胺通过用作Smoothened(刺猬信号传导中的一种关键的组分)的激动剂来激活刺猬信号传导途径的下游。信号传导途径的调节剂可以是信号传导途径的激活剂或抑制剂。它可以是小分子。在本发明的实践中，信号传导或激酶的抑制剂、激活剂或调节剂的优选的实施方案是信号传导或激酶的小分子抑制剂、小分子激活剂或小分子调节剂。Wnt和TGF-β/BMP信号传导或信号传导活性的协同抑制是指抑制Wnt信号传导与抑制TGF-β和BMP信号传导的结果，其中所述结果不仅仅是只抑制Wnt信号传导的结果与只抑制TGF-β和BMP信号传导的结果的相加结果。协同作用可以由于Wnt信号传导组分与TGF-β和BMP信号传导组分之间的相互作用而产生，如例如在β-连环蛋白和Lef1/Tcf(Wnt信号传导的下游组分)与Smad4(coSMAD以及TGF-β和BMP信号传导的必需介体)之间形成转录因子复合物，导致靶基因的协同激活(Nishita等人，Nature403,781-785(2000))。Wnt信号传导的小分子抑制剂的实例包括但不限于Wnt产生抑制剂-1(IWP-1)、Wnt产生抑制剂-2(IWP2)、JW55、JW74、冈田酸(okadaicacid)、互变霉素、SB239063、SB203580、ADP-HPD、2-[4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基]-6-甲基嘧啶-4(3H)-酮、PJ34、cambinol、舒林酸(sulindac)、3289-8625、用于被设计成抑制Dishevelled蛋白质的系列类似物的支架A、用于被设计成抑制Dishevelled蛋白质的系列类似物的支架B、J01-017a、NSC668036、非律平(filipin)、IC261、PF670462、波舒替尼(Bosutinib)、PHA665752、伊马替尼(Imatinib)、ICG-001、依他尼酸(ethacrynicacid)、依他尼酸衍生物、PKF115-584、PNU-74654、PKF118-744、CGP049090、PKF118-310、ZTM000990、BC21、GDC-0941、Rp-8-Br-cAMP、LGK974、C59、Ant1.4Br/Ant1.4CI、氯硝柳胺、apicularen、巴弗洛霉素(bafilomycin)、XAV939、IWR1、扑蛲灵(pyrvinium)、NSC668036、2,4-二氨基-喹唑啉、槲皮素和PKF115-584以及其等同物和组合。仅仅作为实例，Wnt信号传导抑制剂可以是Wnt产生的小分子抑制剂-2或Dkk1类似物。Wnt产生的小分子抑制剂-2或Dkk1类似物的合适实例包括但不限于具有C22H18N4O2S3的化学式和以下化学结构的Wnt产生抑制剂-2(IWP2；CAS编号686770-61-6)或N-(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)-2-[(4-氧代-3-苯基-6,7-二氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫烷基]乙酰胺：TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂的合适实例包括但不限于SB431542(4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、SJN2511(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶)、D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉)、SB525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉)、SD208(2-(5-氯-2-氟苯基)-4-[(4-吡啶基)氨基]蝶啶)和LDN-193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)以及其等同物和组合。在一个实施方案中，TGF-β/BMP信号传导抑制剂还可以是转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5或ALK-7的小分子抑制剂。在一个优选的实施方案中，TGF-β/BMP信号传导抑制剂还可以是转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的小分子抑制剂。此外，转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的小分子抑制剂可以是或可以包括具有C22H16N4O3的化学式和的化学结构的SB431542(CAS编号301836-41-9)或4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺。另外，TGF-β/BMP信号传导抑制剂可以是或可以包括BMPI型受体ALK-2或ALK-3的小分子抑制剂或头蛋白(noggin)类似物。在一个优选的实施方案中，TGF-β/BMP信号传导抑制剂可以是或可以包括BMPI型受体ALK-2和ALK-3的小分子抑制剂或头蛋白类似物。而且，BMPI型受体ALK-2和ALK-3的小分子抑制剂或头蛋白类似物可以是或可以包括具有C25H22N6的化学式和的化学结构的LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉。此外，Wnt和TGF-β/BMP信号传导抑制剂的组合可以是或可以包括以下的组合：(a)一种或多种Wnt产生抑制剂-2或Dkk1类似物；(b)转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的一种或多种抑制剂；和(c)BMPI型受体ALK-2和ALK-3的一种或多种抑制剂或头蛋白类似物，其中所述组合包含至少两种信号传导途径的抑制剂或优选所有三种信号传导途径的抑制剂。所述抑制剂可以是小分子。更进一步，Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性抑制剂的组合可以是IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)和LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)中的至少两种且优选所有三种的组合或等同组合，其中所述组合产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制；或包含IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)和LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)中的至少两种且优选所有三种的组合或等同组合，其中所述组合产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制。在本发明的一个实施方案中，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞可以占总细胞群体的超过约90％，并且对于由眼区祖细胞表达的PAX6和LHX2转录因子两者均为阳性。在另一个实施方案中，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞可能对于PAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3和/或SIX6典型的早期眼区转录因子的表达为阳性。在又一个实施方案中，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞可能对于原始神经上皮干细胞的干性因子SOX2、巢蛋白和STAT3典型标志物的表达为阳性。在再一个实施方案中，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞可能对于Ki67(细胞增殖标志物)的表达为阳性。在又一个实施方案中，相较于ESC，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞下调ESC多能性转录因子POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4和TBX3基因以及TBF-β超家族基因SMAD1、SMAD2、TGF-β3、BMP3、BMP6、TGFBR1和BMPR1B的转录。在又一个实施方案中，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞将LIN28和SALL4转录因子基因的转录维持到与ESC中相同的水平，但显著高于胎儿视网膜祖细胞中的水平。在又一个实施方案中，相较于胎儿视网膜祖细胞，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞上调BMP4和BMP7基因以及OTX2、RAX、LHX2、SIX3和SIX6基因的转录。在又一个实施方案中，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞对于SRFP1和FZD3/5基因的转录为强阳性。在又一个实施方案中，相较于胎儿视网膜祖细胞，分离的哺乳动物原始视网膜干细胞下调FGFR1/2/3和FGF3/8基因的转录。在又一个实施方案中，使用小分子分化诱导剂使分离的哺乳动物pRSC在体外向特定的视网膜细胞命运定向分化。在又一个实施方案中，特定的视网膜细胞命运包括神经视网膜(neuroretinal)细胞和非神经元细胞。在又一个实施方案中，神经视网膜细胞包括视网膜神经节细胞(RGC)和光感受器。在又一个实施方案中，非神经元细胞包括视网膜色素上皮(RPE)细胞或视网膜色素上皮细胞(RPEs)。合适的细胞培养基的实例在一个实施方案中，具有或不具有补充物的一种或多种成分确定的培养基包含：DMEM/F12或等同培养基；谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；hESC补充物或等同物；牛血清白蛋白或等同物；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF-碱性)或等同物；和2-巯基乙醇或等同物。在另一个实施方案中，具有或不具有补充物的一种或多种成分确定的培养基包含：DMEM/F12或等同培养基；约2.3mM谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；1xhESC补充物或等同物；约1.8％牛血清白蛋白或等同物；约8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF-碱性)或等同物；和约0.1mM2-巯基乙醇或等同物。在再一个实施方案中，具有或不具有补充物的一种或多种成分确定的培养基可以是无血清的N2B27启动培养基(primingmedium)，其包含：DMEM/F12或等同培养基；N-2补充物或等同物；B-27无血清补充物或等同物；谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；牛血清白蛋白或等同物；MEM非必需氨基酸或等同物；和2-巯基乙醇或等同物。另外，所述培养基的一个实施方案是补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF-碱性)或等同物的无血清的N2B27启动培养基。此外，在另一个实施方案中，所述培养基可以包含DMEM/F12或等同培养基；1xN-2补充物或等同物；1xB-27无血清补充物或等同物；约2mM谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；约0.2％牛血清白蛋白或等同物；约0.1mMMEM非必需氨基酸或等同物；和约0.1mM2-巯基乙醇或等同物。另外，所述培养基的另一个实施方案是补充有约20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF-碱性)或等同物的无血清的N2B27启动培养基。在一个实施方案中，具有或不具有补充物的成分确定的培养基可以进一步包含IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)或LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或等同物。在一个优选的实施方案中，具有或不具有补充物的成分确定的培养基可以进一步包含IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)或LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)中的至少两种且优选所有三种或等同物。在一个实施方案中，具有或不具有补充物的一种或多种成分确定的培养基可以进一步包含约1μMIWP2、约5μMSB431542或约50nMLDN193189。在一个优选的实施方案中，具有或不具有补充物的一种或多种成分确定的培养基可以进一步包含约1μMIWP2、约5μMSB431542和约50nMLDN193189中的至少两种且优选所有三种。在另一个实施方案中，成分确定的培养基可以是无血清的N2B27启动培养基，其补充有Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种，或更优选Wnt和TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂的组合。此外，所述培养基可以含有或可以不含有补充物并且不含有饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清。更进一步，所述培养基可以另外包含Wnt和TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂的组合。在一个优选的实施方案中，所述培养基可以包含DMEM/F12或等同培养基；N-2补充物或等同物；B-27无血清补充物或等同物；谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；牛血清白蛋白或等同物；MEM非必需氨基酸或等同物；2-巯基乙醇或等同物；以及IWP2(CAS编号686770-61-6)或等同物、SB431542(CAS编号301836-41-9)或等同物、和LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或等同物中的一种或多种、优选至少两种的组合、最优选所有三种的组合。在一个更优选的实施方案中，成分确定的培养基是补充有Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种、或更优选Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的启动培养基，且进一步包含DMEM/F12或等同培养基；1xN-2补充物或等同物；1xB-27无血清补充物或等同物；约2mM谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；约0.2％牛血清白蛋白或等同物；约0.1mMMEM非必需氨基酸或等同物；约0.1mM2-巯基乙醇或等同物；以及约1μMIWP2(CAS编号686770-61-6)或等同物、约5μMSB431542(CAS编号301836-41-9)或等同物、和约50nMLDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或等同物中的一种或多种、优选至少两种的组合、最优选所有三种的组合。在一个实施方案中，可以在补充有本发明的Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的无血清的N2B27启动培养基中维持和/或扩增分离的哺乳动物pRSC。用于产生分离的哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)的体外方法本发明更进一步提供用于产生分离的哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)的体外方法。所述方法包括在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基中培养来自哺乳动物的分离的原始视网膜干细胞(pRSC)以产生并生长所述分离的pRSC的单层培养物；和使所述分离的pRSC的所述培养物与Wnt、Notch或VEGFR信号传导抑制剂中的一种或多种接触以使所述分离的pRSC分化成分离的哺乳动物RGC。在一个实施方案中，可以在固体支持物培养所述细胞。固体支持物可以包被有例如或基膜或等同物。或基膜可以是生长因子减少的或生长因子减少的基膜。在本发明的一个实施方案中，可以培养所述细胞并且使其生长并增殖超过两周。如本文所用的，分离的RGC意指例如与污染物(例如，如不为RGC的细胞)基本上分开的RGC。Wnt、Notch或VEGFR信号传导抑制剂可以是小分子抑制剂。在一个实施方案中，Wnt、Notch或VEGFR信号传导抑制剂中的一种或多种是至少两种信号传导途径的抑制剂的组合。任选地，组合可以包含所有三种信号传导途径的抑制剂。在一个实施方案中，所述分离的pRSC的培养物是单层培养物。此外，单层培养物可以是接近汇合的或汇合的。在一个实施方案中，不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的细胞培养基是化学成分确定的培养基。化学成分确定的培养基可以是不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的N2B27启动培养基或等同物。在一个实施方案中，Wnt、Notch和VEGFR信号传导抑制剂的组合可以分别是IWP2、DAPT和PD173074。IWP2、DAPT和PD173074可以约1μMIWP2、约10μMDAPT和约200nMPD173074的浓度使用。在一个实施方案中，可以将分离的哺乳动物pRSC在补充有Wnt、Notch和VEGFR信号传导的小分子抑制剂的化学成分确定的培养基中培养超过2周，以获得分离的哺乳动物RGC。在一个实施方案中，RGC前体特异性转录因子基因的上调可以在补充有Wnt、Notch和VEGFR信号传导的小分子抑制剂的化学成分确定的培养基中培养约前6天后发生。相较于ESC，RGC前体特异性转录因子基因的上调可以包括BRN3A、BRN3B、ISL-1和MATH5。在一个实施方案中，大多数培养中的细胞在补充有Wnt、Notch和VEGFR信号传导的小分子抑制剂的化学成分确定的培养基中2周后可能对于RGC的标志物为阳性。此外，大多数对于RGC的标志物为阳性的培养中的细胞可能对于TUJ1和BRN3为阳性。用于产生分离的哺乳动物光感受器的方法本发明还提供用于在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的化学成分确定的体外条件下由分离的哺乳动物pRSC产生分离的哺乳动物光感受器的方法，其中该方法可以包括在补充有TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5或ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch或Wnt信号传导的一种或多种抑制剂或刺猬信号传导激活剂的神经诱导培养基中培养并生长来自哺乳动物的解离的pRSC。例如，将解离的pRSC在神经诱导培养基中培养并生长足够时间可以将pRSC诱导成无可见的形态变化或无光感受器特异性标志物表达的光感受器细胞谱系命运。在一个实施方案中，可以在固体支持物上培养所述细胞。固体支持物可以包被有例如或基膜或等同物。或基膜可以是生长因子减少的或生长因子减少的基膜。在本发明的一个实施方案中，可以培养所述细胞并且使其生长并增殖约6天。如本文所用的，分离的光感受器意指例如与污染物(例如，如不为光感受器的细胞)基本上分开的光感受器。例如，TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5或ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch或Wnt信号传导的一种或多种抑制剂或刺猬信号传导激活剂可以是TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch和Wnt信号传导的抑制剂以及刺猬信号传导激活剂的组合，其可以包含至少两种信号传导途径的调节剂。任选地，且更优选地，组合可以包含所有五种信号传导途径的调节剂。在TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5或ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch或Wnt信号传导的抑制剂中的一种或多种的情况下，抑制剂中的一种或多种可以是TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch和Wnt信号传导的抑制剂的组合，其中所述组合包含至少两种信号传导途径的抑制剂或优选所有四种信号传导途径的抑制剂。TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch或Wnt信号传导的抑制剂或刺猬信号传导激活剂可以是小分子抑制剂。在该第一培养步骤后，所述方法进一步包括在补充有视黄酸或等同物、或牛磺酸或等同物、或两者的神经诱导培养基中培养所述细胞，以使哺乳动物pRSC分化成光感受器细胞，由此在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的成分确定的体外细胞培养条件下由来自哺乳动物的分离的pRSC产生分离的哺乳动物光感受器。在又一个实施方案中，可以将所述细胞培养约7天或更长或允许pRSC分化成光感受器细胞的时期。在一个优选的实施方案中，用于在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的化学成分确定的体外条件下由分离的哺乳动物pRSC产生分离的哺乳动物光感受器的方法可以包括：在包被有或基膜或等同物(其中或基膜是生长因子减少的)的固体支持物上在补充有TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch和Wnt信号传导的小分子抑制剂以及刺猬信号传导的小分子激活剂的神经诱导培养基中培养pRSC；和之后，在补充有视黄酸或等同物和牛磺酸或等同物的神经诱导培养基中培养；以使所述哺乳动物pRSC分化成光感受器，由此在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的成分确定的体外细胞培养条件下由来自哺乳动物的分离的pRSC产生分离的哺乳动物光感受器。在又一个优选的实施方案中，可以将所述细胞培养约6天，之后将细胞培养约7天或更长以使哺乳动物pRSC分化成光感受器细胞。在培养后，可以由pRSC获得光感受器。这样获得的光感受器可以表达全(pan)-光感受器标志物恢复蛋白、锥细胞特异性标志物OPN1SW或蓝色视蛋白、杆细胞特异性标志物视紫质和/或光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)。此外，光感受器可以展示细胞突起、短的内突起和/或长的延伸外突起。在一个实施方案中，分离的哺乳动物光感受器对于视紫质、视紫质激酶和/或transmucin为阳性。在一个替代实施方案中，分离的哺乳动物光感受器可以通过将来自哺乳动物的解离的pRSC在包含TGF-b/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5或ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch或Wnt信号传导的一种或多种抑制剂或刺猬信号传导激活剂的神经诱导培养基中培养并生长足够时间以将pRSC诱导成无可见的形态变化或无光感受器特异性标志物表达的光感受器细胞谱系命运，由分离的哺乳动物pRSC获得。使培养中的细胞与视黄酸或牛磺酸或两者接触以使哺乳动物pRSC分化成光感受器细胞。所述培养基不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清。使细胞在固体支持物上生长，所述固体支持物可以包被有或基膜，优选生长因子减少的或生长因子减少的基膜。神经诱导培养基的合适实例包括以下：神经诱导培养基可以包含AdvancedDMEM/F12培养基或等同物；培养基或等同物；N2补充物或等同物；B-27无血清补充物或等同物；谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(例如，)；牛血清白蛋白或等同物；和人白血病抑制因子(hLIF)或等同物。优选的神经诱导培养基可以包含AdvancedDMEM/F12:Neurobasal(约1:1)培养基或等同物；N2补充物(例如，约1xN2补充物)或等同物；B-27无血清补充物(例如，约1xB-27无血清补充物)或等同物；谷氨酰胺(例如，约1％谷氨酰胺)或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；牛血清白蛋白(例如，约5ug/mL牛血清白蛋白)或等同物；和人白血病抑制因子(hLIF)(例如，约10ng/mLhLIF)或等同物。在培养基中，TGF-β/激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、Notch和Wnt信号传导的小分子抑制剂以及刺猬信号传导的小分子激活剂的实例分别包括但不限于SB431542(CAS编号301836-41-9)或等同物、CHIR99021(CAS编号252917-06-9)或等同物、DAPT(CAS编号208255-80-5)或等同物、IWP2(CAS编号686770-61-6)或等同物、和嘌吗啡胺(CAS编号483367-10-8)或等同物。作为神经诱导培养基的补充物，可以添加下列中的任一种或多种：SB431542(CAS编号301836-41-9)或等同物、CHIR99021(CAS编号252917-06-9)或等同物、DAPT(CAS编号208255-80-5)或等同物、IWP2(CAS编号686770-61-6)或等同物、和嘌吗啡胺(CAS编号483367-10-8)或等同物。仅举例来说，所述补充物可以以下列浓度添加：约2μMSB431542(CAS编号301836-41-9)或等同物；约3μMCHIR99021(CAS编号252917-06-9)或等同物；约10μMDAPT(CAS编号208255-80-5)或等同物；约1μMIWP2(CAS编号686770-61-6)或等同物；和约100nM嘌吗啡胺(CAS编号483367-10-8)或等同物。在又一个实施方案中，视黄酸或等同物和牛磺酸或等同物可以用于以约500nM视黄酸或等同物和/或约100M牛磺酸或等同物的浓度补充神经诱导培养基。用于产生非神经的分离的哺乳动物视网膜色素上皮(RPE)或分离的哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)的方法本发明另外提供用于在没有饲养细胞或饲养层条件化培养基的情况下由分离的哺乳动物pRSC体外产生非神经的分离的哺乳动物视网膜色素上皮(RPE)的方法。任选地，所述方法可以用于在没有饲养细胞和饲养层条件化培养基的情况下由分离的哺乳动物pRSC体外获得分离的哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括在补充有烟酰胺或等同物、或激活素A或等同物、或两者的RPE诱导培养基中培养来自哺乳动物的单层pRSC；和之后，在补充有N1培养基补充物或等同物、牛磺酸或等同物、氢化可的松或等同物、或三碘甲状腺原氨酸或等同物的培养基中培养所述pRSC；以使所述哺乳动物pRSC在没有饲养细胞或饲养层条件化培养基的情况下由哺乳动物的分离的pRSC体外分化成哺乳动物RPE或RPEs。例如，可以将哺乳动物pRSC在不存在SMAD信号传导抑制的具有烟酰胺或激活素A或两者的培养基中培养足够时间以将pRSC引向RPE命运。如本文所用的，分离的RPEs意指例如与污染物(例如，如不为RPEs的细胞)基本上分开的RPEs。在一个实施方案中，可以在补充有N1培养基补充物、牛磺酸、氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸的RPE培养基中培养pRSC。在所述方法的一个实施方案中，可以在固体支持物上培养pRSC细胞(例如，来自哺乳动物)。固体支持物可以包被有或基膜或等同物。或基膜可以是生长因子减少的或生长因子减少的基膜。用于培养的培养基可以是不存在SMAD信号传导抑制剂的补充有烟酰胺或等同物、或激活素A或等同物、或两者的RPE诱导培养基，持续约7天以将pRSC引向RPE命运。在另一个实施方案中，可以将细胞在补充有N1培养基补充物或等同物、牛磺酸或等同物、氢化可的松或等同物或三碘甲状腺原氨酸或等同物的RPE培养基中培养约12天或更长。pRSC然后向RPE命运分化。在再一个实施方案中，可以将细胞在补充有烟酰胺或等同物和激活素A或等同物的RPE诱导培养基中培养约7天，之后在补充有N1培养基补充物或等同物、牛磺酸或等同物、氢化可的松或等同物和三碘甲状腺原氨酸或等同物的RPE培养基中培养约12天或更长。在补充有N1培养基补充物或等同物、牛磺酸或等同物、氢化可的松或等同物和三碘甲状腺原氨酸或等同物的RPE培养基中培养约12天或更长后，可以由pRSC获得RPE或RPEs。RPE或RPEs可以表达RPE65，形成多边形肌动蛋白束并且可以变得有色。在一个优选的实施方案中，用于在没有饲养细胞和饲养层条件化培养基的情况下由分离的哺乳动物pRSC体外产生非神经的分离的哺乳动物视网膜色素上皮(RPE)或分离的哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)的方法可以包括：在补充有烟酰胺或等同物和激活素A或等同物的RPE诱导培养基中培养单层pRSC；和之后，在补充有N1培养基补充物或等同物、牛磺酸或等同物、氢化可的松或等同物和三碘甲状腺原氨酸或等同物的RPE成熟培养基中培养；以使所述哺乳动物pRSC分化成哺乳动物RPE或RPEs，由此在没有饲养细胞和饲养层条件化培养基的情况下由哺乳动物的分离的pRSC体外产生分离的哺乳动物RPE或RPEs。在一个单独的实施方案中，用于在没有饲养细胞和饲养层条件化培养基的情况下由分离的哺乳动物pRSC体外产生非神经的分离的哺乳动物RPE或RPEs的方法可以包括：在不存在SMAD信号传导抑制剂的包含烟酰胺或激活素A或两者的培养基中培养来自哺乳动物的pRSC和使所述pRSC与N1培养基补充物、牛磺酸、氢化可的松或三碘甲状腺原氨酸中的一种或多种接触；以使所述哺乳动物pRSC分化成哺乳动物RPE或RPEs，由此在没有饲养细胞和饲养层条件化培养基的情况下由哺乳动物的分离的pRSC体外产生分离的哺乳动物RPE或RPEs。RPE诱导培养基和RPE培养基的合适实例包括以下：RPE诱导培养基可以包含格拉斯哥最低必需培养基(GlasgowMinimumEssentialMedium)(GMEM)或等同物；KnockOutTM血清替代物或等同物；MEM非必需氨基酸或等同物；丙酮酸钠或等同物；和β-巯基乙醇或等同物。RPE诱导培养基的优选实例包含格拉斯哥最低必需培养基(GMEM)或等同物；KnockOutTM血清替代物(例如，约10％KnockOutTM血清替代物)或等同物；MEM非必需氨基酸(例如，约0.1mMMEM非必需氨基酸)或等同物；丙酮酸钠(例如，约1mM丙酮酸钠)或等同物；和β-巯基乙醇(例如，约0.1mMβ-巯基乙醇)或等同物。烟酰胺或等同物和/或激活素A或等同物可以以例如约10mM烟酰胺或等同物和/或约100ng/mL激活素A或等同物的浓度存在于RPE诱导培养基中。RPE培养基可以包含最低必需培养基(αMEM)α改良培养基或等同物；胎牛血清或等同物；L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；MEM非必需氨基酸或等同物；和丙酮酸钠或等同物。RPE培养基的优选实例可以包含最低必需培养基(αMEM)α改良培养基或等同物；约5％胎牛血清或等同物；约2mML-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺()；约0.1mMMEM非必需氨基酸或等同物；和约1mM丙酮酸钠或等同物。在一个实施方案中，RPE培养基可以包含N1培养基补充物或等同物、牛磺酸或等同物、氢化可的松或等同物和三碘甲状腺原氨酸或等同物。此外，在一个优选的实施方案中，RPE培养基可以包含1xN1培养基补充物或等同物；约0.25mg/mL牛磺酸或等同物；约20ng/mL氢化可的松或等同物；和约0.013ng/mL三碘甲状腺原氨酸或等同物。用于产生分离的人原始视网膜干细胞(hpRSC)的方法本发明进一步提供用于在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的成分确定的体外细胞培养条件下由分离的人胚胎干细胞(hESC)、分离的人多能干细胞(hPSC)或分离的人诱导性多能干细胞(iPSC)产生分离的人原始视网膜干细胞(hpRSC)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)将分离的hESC、分离的hPSC或分离的人iPSC在包被有生长因子减少的Matrigel(BDBioscience)或其等同物的固体支持物上在不存在饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的StemProhESCSFM培养基(Invitrogen)或其等同物中培养到接近汇合，优选培养到约80％细胞汇合；(b)在补充有碱性FGF(bFGF)的启动培养基中培养足够时间以生长得接近汇合；(c)在补充有Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的启动培养基中培养，以使所述分离的hESC、分离的hPSC或分离的人iPSC分化成分离的人原始视网膜干细胞。在一个优选的实施方案中，用于产生分离的人原始视网膜干细胞(hpRSC)的方法可以包括：在包被有生长因子减少的(BDBioscience)或其等同物的固体支持物上在不存在饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的StemProhESCSFM培养基(Invitrogen)或其等同物中培养分离的hESC、分离的hPSC或分离的人iPSC；将接近约80％细胞汇合的StemProhESCSFM培养基转换为补充有约20ng/mLbFGF的无血清的N2B27启动培养基，其中所述无血清的N2B27启动培养基可以包含：DMEM/F12或等同物、1xN-2补充物或等同物、1xB-27无血清补充物或等同物、约0.2％BSA或等同物、约2mML-或等同物、约0.1mMMEM非必需氨基酸或等同物和约0.1mMβ-巯基乙醇或等同物)；在补充有bFGF的N2B27启动培养基中培养约1-2天；将hESC的接近汇合的单层培养物的在N2B27启动培养基中补充有bFGF的培养基转换为补充有Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的N2B27启动培养基，以使所述分离的hESC、分离的hPSC或分离的人iPSC分化成分离的人原始视网膜干细胞，由此在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的成分确定的体外细胞培养条件下由分离的hESC、分离的hPSC或分离的人iPSC产生分离的hpRSC。在一个实施方案中，所述培养基中的Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合可以是SB431542、LDN193189和IWP2(Wnt产生抑制剂-2)的组合；SB431542、头蛋白类似物和IWP2的组合；SB431542、LDN193189和Dkk1类似物的组合；SB431542、头蛋白类似物和Dkk1类似物的组合；或等同组合，其中所述组合产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制。在一个优选的实施方案中，SB431542、LDN193189和IWP2的组合可以包含约5μMSB431542、约50nMLDN193189和约1μMIWP2。在一个实施方案中，占总细胞群体超过约90％的分离的人原始视网膜干细胞可能对于由眼区祖细胞表达的PAX6、LHX2RAX、OTX2、SIX3和SIX6典型的早期眼区转录因子为阳性。在另一个实施方案中，分离的人原始视网膜干细胞可能对于原始神经上皮干细胞的干性因子SOX2、巢蛋白和STAT3典型标志物的表达为阳性。在再一个实施方案中，分离的人原始视网膜干细胞可能对于Ki67(细胞增殖标志物)的表达为阳性。在一个实施方案中，相较于hESC，分离的人原始视网膜干细胞可以下调hESC多能性转录因子POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4和TBX3基因以及TBF-β超家族基因SMAD1、SMAD2、TGF-β3、BMP3、BMP6、TGFBR1和BMPR1B的转录。在本发明的一个实施方案中，分离的人原始视网膜干细胞可以将LIN28和SALL4转录因子基因的转录维持到与hESC中相同的水平，但显著高于人胎儿视网膜祖细胞中的水平。在另一个实施方案中，相较于人胎儿视网膜祖细胞，分离的人原始视网膜干细胞可以上调BMP4和BMP7基因以及OTX2、RAX、LHX2、SIX3和SIX6基因的转录。在本发明的一个实施方案中，分离的人原始视网膜干细胞可以对于SRFP1和FZD3/5基因的转录为强阳性。在一个实施方案中，相较于人胎儿视网膜祖细胞，分离的人原始视网膜干细胞可以下调FGFR1/2/3和FGF3/8基因的转录。在一个实施方案中，可以在补充有本发明的Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合的无血清的N2B27启动培养基中维持和/或扩增分离的人pRSC。在另一个实施方案中，可以使用小分子分化诱导剂使分离的人pRSC在体外向特定的视网膜细胞命运定向分化。在一个实施方案中，特定的视网膜细胞命运可以包括神经视网膜细胞和非神经元细胞。神经视网膜细胞可以包括视网膜神经节细胞(RGC)和光感受器。非神经元细胞可以包括视网膜色素上皮(RPE)细胞。用于生成哺乳动物原始视网膜干细胞(hpRSC)、更为分化的视网膜祖细胞、视网膜神经元、视网膜神经节细胞、光感受器前体或视网膜色素上皮(RPE)的方法本发明进一步提供用于由受试者生成哺乳动物原始视网膜干细胞(hpRSC)、更为分化的视网膜祖细胞、视网膜神经元、视网膜神经节细胞、光感受器前体或视网膜色素上皮(RPE)的方法，其需要由所述受试者产生诱导性多能干细胞(iPSC)和通过本发明的所述方法由iPSC生成pRSC，和/或另外通过本发明的方法进一步诱导分化。用于治疗受试者的视网膜变性的方法本发明另外提供用于治疗有需要的受试者的视网膜变性的方法，其包括向患者的眼睛施用原始视网膜干细胞、视网膜神经节细胞、光感受器、视网膜色素上皮细胞和/或其组合。所述原始视网膜干细胞、视网膜神经节细胞、光感受器、视网膜色素上皮细胞可以以足够的量被施用以治疗所述受试者的视网膜变性并且可以通过本发明的方法产生。如本文所用的，术语“受试者”或“患者”可以互换使用并且是指可以被施用本发明的任何衍生组合物的任何活生物体。该术语包括但不限于人；非人动物，例如非人灵长类动物，如黑猩猩以及其它类人猿和猴种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养受试者，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。因此，意在涵盖不论是雄性还是雌性的成年和新生受试者以及胎儿。如本文所用的术语“有效量”是指例如需要延迟、降低或改善眼睛相关疾病或病症(例如，视网膜变性)的至少一种症状的本发明的细胞和/或组合物的量。例如，本发明的任何细胞的有效量是有效降低或抑制本发明的细胞的视网膜变性的量。因此，有效量也是足以阻止眼睛相关疾病症状的发展或减轻症状或降低症状进展速率的量。如本文所用的，术语“施用”和“引入”在本文中可互换使用并且是指通过使如本文所公开的本发明的细胞或组合物至少部分定位于期望部位的方法或途径将所述细胞或组合物放置到受试者中。本发明的细胞或组合物可以通过产生对所述受试者的有效治疗的任何适当的途径来施用。在一个实施方案中，在递送到患者的眼睛之前，待递送的细胞可以与基质(例如，水凝胶)组合或被包含在所述基质之上或之中。在一个实施方案中，水凝胶可以包含透明质酸和甲基纤维素或其盐和衍生物。此外，水凝胶可以包括具有生物活性肽的水凝胶。在一个实施方案中，基质可以是支持被移植细胞的细胞活力和功能的生物相容性聚合物或生物相容性聚合物的混合物、人工仿生基质、衍生自组织或器官基质的生物活性支架、基于胶原和N-异丙基丙烯酰胺共聚物的生物合成的细胞外基质、或经粘附分子、核纤层蛋白、生长因子、形态发生因子、存活因子、细胞外基质或片段或衍生物改性的支架。水凝胶可以包含平衡盐溶液中的约0.5％透明质酸钠(1400-1800kDa)和约0.5％甲基纤维素(100kDa)或它们的等同物。在一个实施方案中，可以向受试者的眼睛的视网膜下空间施用所述细胞。在一个实施方案中，视网膜变性可能与年龄相关性黄斑变性(AMD)、斯塔加特氏黄斑营养不良、色素性视网膜炎、青光眼、视网膜血管病、眼睛的病毒感染和已知或未知病因的其它视网膜/眼部疾病有关。根据本发明的实践，受试者可以是哺乳动物，如人。受试者还可以是哺乳动物，如猴、熊、大鼠、小鼠、水貂、兔、豚鼠、猪、狗、猫、山羊、绵羊、马或牛。在一个实施方案中，用于治疗有需要的受试者的视网膜变性的方法包括(a)从所述受试者获得含有PSC和体细胞的组织或细胞样品；(b)从所述样品分离出所述PSC和体细胞以获得分离的PSC和分离的体细胞；(c)培养分离的PSC以使所述分离的PSC生长；或将分离的体细胞重编程以获得iPSC并分离iPSC以获得分离的iPSC；(d)通过本发明的方法培养所述分离的PSC或分离的iPSC以产生pRSC；和(e)向所述受试者的眼睛以足够的量施用原始视网膜干细胞(pRSC)以治疗所述受试者的所述视网膜变性。在另一个实施方案中，用于治疗有需要的受试者的视网膜变性的方法包括(a)从所述受试者获得含有PSC和体细胞的组织或细胞样品；(b)从所述样品分离出所述PSC和体细胞以获得分离的PSC和分离的体细胞；(c)培养分离的PSC以使所述分离的PSC生长；或将分离的体细胞重编程以获得iPSC并分离iPSC以获得分离的iPSC；(d)培养所述分离的PSC或分离的iPSC以产生pRSC；(e)通过本发明的方法培养所述分离的pRSC以产生分离的RGC；和(f)向所述受试者的眼睛以足够的量施用这样产生的哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)以治疗所述受试者的所述视网膜变性。在又一个实施方案中，用于治疗有需要的受试者的视网膜变性的方法包括(a)从所述受试者获得含有PSC和体细胞的组织或细胞样品；(b)从所述样品分离出所述PSC和体细胞以获得分离的PSC和分离的体细胞；(c)培养分离的PSC以使所述分离的PSC生长；或将分离的体细胞重编程以获得iPSC并分离iPSC以获得分离的iPSC；(d)培养所述分离的PSC或分离的iPSC以产生pRSC；(e)通过本发明的方法培养所述分离的pRSC以产生分离的光感受器；和(f)向所述受试者的眼睛以足够的量施用步骤(e)的所述光感受器以治疗所述受试者的所述视网膜变性。在再一个实施方案中，用于治疗有需要的受试者的视网膜变性的方法包括(a)从所述受试者获得含有PSC和体细胞的组织或细胞样品；(b)从所述样品分离出所述PSC和体细胞以获得分离的PSC和分离的体细胞；(c)培养分离的PSC以使所述分离的PSC生长；或将分离的体细胞重编程以获得iPSC并分离iPSC以获得分离的iPSC；(d)培养所述分离的PSC或分离的iPSC以产生pRSC；(e)通过本发明的方法培养所述分离的pRSC以产生分离的RPEs；和(f)向所述受试者的眼睛以足够的量施用这样产生的哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)以治疗所述受试者的所述视网膜变性。用于向受试者递送人原始视网膜干细胞(hpRSC)、人原始视网膜神经节细胞(hpRGC)、人光感受器或人视网膜色素上皮细胞(hRPEs)的方法本发明进一步另外提供用于向有需要的患者或受试者递送人原始视网膜干细胞(hpRSC)、人原始视网膜神经节细胞(hpRGC)、人光感受器或人视网膜色素上皮细胞(hRPEs)的方法，其中向受试者的视网膜下空间中施用hpRSC、hpRGC、人光感受器或hRPEs于例如BSS/HAMC(约0.5/0.5％w/w)水凝胶溶液中的单细胞悬浮液。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的患者或受试者的视网膜变性的方法，其需要向所述有需要的患者或受试者的眼睛递送原始视网膜干细胞(pRSC)，其中所述pRSC可以通过本发明的方法产生。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的患者或受试者的视网膜变性的方法，其需要向所述有需要的患者或受试者的眼睛递送哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)，其中所述RGC可以通过本发明的方法产生。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的患者或受试者的视网膜变性的方法，其需要向所述有需要的患者或受试者的眼睛递送哺乳动物光感受器，其中所述光感受器可以通过本发明的方法产生。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗有需要的患者或受试者的视网膜变性的方法，其需要向所述有需要的患者或受试者的眼睛递送哺乳动物视网膜色素上皮(RPE)或哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)，其中所述RPEs可以通过本发明的方法产生。哺乳动物可以是人、猴、熊、大鼠、小鼠、水貂、兔、豚鼠、猪、狗、猫、山羊、绵羊、马或牛。受试者或患者可以是人。在一个实施方案中，受试者或患者可以是哺乳动物，如人、猴、熊、大鼠、小鼠、水貂、兔、豚鼠、猪、狗、猫、山羊、绵羊、马或牛。本发明还提供用于向患者递送人原始视网膜干细胞(hpRSC)、人视网膜神经节细胞(hpRGC)、人光感受器、人视网膜色素上皮(hRPE)或人视网膜色素上皮细胞(hRPEs)的方法。在一个实施方案中，hpRSC、hpRGC、人光感受器、hRPE或hRPEs可以作为于基质溶液或基质悬浮液中的单层细胞悬浮液或单细胞悬浮液被施用到受试者的视网膜下空间中。所述细胞可以通过本发明的方法产生。在一个实施方案中，hpRSC于BSS/HAMC(约0.5/0.5％w/w)水凝胶溶液中的单细胞悬浮液可以被施用到患者的视网膜下空间中。可以向有需要的受试者递送所述细胞并且递送所述细胞可以用于治疗视网膜变性。在一个实施方案中，基质是包含透明质酸和甲基纤维素或其盐和衍生物的水凝胶、具有生物活性肽的水凝胶、支持被移植细胞的细胞活力和功能的生物相容性聚合物或生物相容性聚合物的混合物、人工仿生基质、衍生自组织或器官基质的生物活性支架、基于胶原和N-异丙基丙烯酰胺共聚物的生物合成的细胞外基质、或经粘附分子、核纤层蛋白、生长因子、形态发生因子、存活因子、细胞外基质或片段或衍生物改性的支架。在一个实施方案中，本发明提供用于确定解释受试者的视网膜变性的发病机理的分子和细胞事件的方法，其需要通过本发明的方法由受试者生成人原始视网膜干细胞(hpRSC)、更为分化的视网膜祖细胞、视网膜神经元、视网膜神经节细胞、光感受器前体或视网膜色素上皮(RPE)，以获得“培养皿中的疾病(diseaseinadish)”模型，以便能够确定解释受试者的视网膜变性的发病机理的分子和细胞事件。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、人、猴、熊、大鼠、小鼠、水貂、兔、豚鼠、猪、狗、猫、山羊、绵羊、马或牛。在一个实施方案中，本发明提供用于预防或抑制与多能干细胞的使用有关的肿瘤以治疗患有视网膜变性的受试者的方法。所述方法包括将分离的多能干细胞诱导成分离的hpRSC和向所述受试者施用所产生的分离的hpRSC，其中所述分离的pRSC可以在向所述受试者的眼睛施用干细胞之前通过本发明的方法产生。在另一个实施方案中，所述方法包括将分离的多能干细胞诱导成分离的hpRSC，进一步使所述分离的hpRSC分化成分离的hpRGC、分离的人光感受器或分离的hRPEs和向所述受试者施用所产生的分离的hpRSC、分离的人光感受器或分离的hRPEs。本发明的组合物本发明提供包含通过本发明的方法产生的哺乳动物原始视网膜干细胞(hpRSC)和合适的载体的组合物。如本文所用的短语“合适的载体”意指参与将本发明药剂从身体的一个器官或部分携带或转运到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体都必须在与制剂的其它成分相容的意义上是“可接受的”，或是生物惰性的。此外，本发明提供包含通过本发明的方法产生的哺乳动物视网膜神经节细胞(RGC)和合适的载体的组合物。更进一步，本发明提供包含通过本发明的方法产生的哺乳动物光感受器和合适的载体的组合物。本发明还提供包含通过本发明的方法产生的哺乳动物视网膜色素上皮(RPE)或哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPEs)和合适的载体的组合物。在一个实施方案中，Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的小分子抑制剂的组合可以是IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)和LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)的组合或等同组合，其中所述组合可以产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制。或者，所述组合可以包含IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)和/或LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或等同组合，其中所述组合可以产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制。在一个实施方案中，哺乳动物是人、猴、熊、大鼠、小鼠、水貂、兔、豚鼠、猪、狗、猫、山羊、绵羊、马或牛。根据本发明的另一方面，提供试剂盒。根据本发明的试剂盒包括包含本发明的化合物或组合物的包装。短语“包装”意指含有本文所呈现的化合物或组合物的任何容器。在优选的实施方案中，包装可以是盒子或包装物(wrapping)。用于包装药物产品的包装材料是本领域技术人员所熟知的。试剂盒还可以含有不含于包装内但附着到包装外部的物品，例如，吸移管。试剂盒可以任选地含有关于向患有需要治疗的病况的受试者施用本发明的组合物的说明书。试剂盒还可以包括关于由管理机构如美国食品和药品管理局批准使用的本文中化合物的说明书。试剂盒可以任选地含有关于本化合物的标签或产品插页。包装和/或任何产品插页本身可以得到管理机构批准。试剂盒可以包含于包装中于固相或液相(如所提供的缓冲剂)中的化合物。试剂盒还可以包含用于制备进行所述方法的溶液的缓冲剂，以及用于将液体由一个容器转移到另一个容器的吸移管。试剂盒还可以任选地含有与如本文所描述的疗法组合使用的一种或多种其它化合物。在某些实施方案中，所述包装是用于静脉内施用的容器。在其它实施方案中，化合物被提供于吸入器中。在其它实施方案中，化合物被提供于聚合物基质中或以脂质体形式提供。在一个实施方案中，本发明提供用于产生受试者的哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的试剂盒，其需要使用不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清、但补充有Wnt或TGF-β/BMP信号传导抑制剂中的一种或多种或更优选补充有Wnt和TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂的组合的化学成分确定的培养基体外处理来自受试者的贴壁单层多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。本发明进一步提供用于产生哺乳动物原始视网膜干细胞(pRSC)的试剂盒，其中所述试剂盒包含针对在不含饲养细胞、饲养层条件化培养基或血清的化学成分确定的培养基中培养来自哺乳动物的胚胎干细胞(ESC)、多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)的说明书以及针对使用Wnt信号传导或TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂或Wnt信号传导和TGF-β/BMP信号传导两者的抑制剂的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含Wnt信号传导或TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂或Wnt信号传导和TGF-β/BMP信号传导两者的小分子抑制剂。在一个实施方案中，Wnt信号传导的小分子抑制剂可以包括具有C22H18N4O2S3的化学式的Wnt产生抑制剂-2(IWP2；CAS编号686770-61-6)或N-(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)-2-[(4-氧代-3-苯基-6,7-二氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫烷基]乙酰胺。在一个实施方案中，TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂可以是转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的小分子抑制剂。转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的小分子抑制剂可以是具有C22H16N4O3的化学式的SB431542(CAS编号301836-41-9)或4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺。在一个实施方案中，TGF-β/BMP信号传导的小分子抑制剂可以是BMPI型受体ALK-2和ALK-3的小分子抑制剂或头蛋白类似物。BMPI型受体ALK-2和ALK-3的小分子抑制剂或头蛋白类似物可以是具有C25H22N6的化学式的LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉。在一个实施方案中，Wnt信号传导和TGF-β/BMP信号传导两者的小分子抑制剂可以是IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)和LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)的组合或等同组合，其中所述组合可以产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制。或者，所述组合可以包含IWP2(CAS编号686770-61-6)、SB431542(CAS编号301836-41-9)和LDN-193189(CAS编号1062368-24-4)或等同组合，其中所述组合可以产生Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制。在一个实施方案中，试剂盒可以进一步包含来自哺乳动物的胚胎干细胞(ESC)、多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)。试剂盒可以进一步包含化学成分确定的培养基和/或补充物。在一个实施方案中，可以产生试剂盒，其包括使用说明书并且基于如本申请或权利要求书中所公开的本发明中所用的任何方法或组合物。此类试剂盒可以包括用于由本发明pRGC产生RPGs、光感受器、RPE或RPEs的试剂盒并且可以包含培养基、补充物、小分子抑制剂和/或小分子激活剂。以下实施例意在说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1方法细胞培养和分化.在无饲养层且无血清的条件下在包被有生长因子减少的Matrigel(BDBiosciences)的板上的StemProhESCSFM培养基(Invitrogen)中培养人胚胎干细胞H9(WA9,WiCell)和HuES9(http://grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm？id＝40)(第25-40段)。依照先前所述的程序45从知情同意和IRB批准的情况下获得的17周人胎儿视网膜分离人原代胎儿视网膜祖细胞并且进行培养。在未分化的hESC在培养中达到约80％汇合后，将培养基转换为补充有20ng/mlbFGF的无血清的N2B27启动培养基(DMEM/F12、N2、B27、0.2％BSA、2mML-GlutaMAX、0.1mMMEM非必需氨基酸和0.1mMβ-巯基乙醇)，持续1-2天。在补充有小分子抑制剂(5μMSB431542、50nMLDN193189和1μMIWP2)的N2B27启动培养基中进一步培养hESC的接近汇合的单层培养物。每天更换培养基，持续6天。可以在这一无血清的补充有抑制剂的启动培养基中维持并扩增hESC来源的hpRSC。为了由hpRSC诱导RGC分化，将细胞在补充有包含1μMIWP2、10μMDAPT和200nMPD173074的小分子抑制剂的新组合的启动培养基中培养超过两周。对于光感受器前体分化来说，将解离的hpRSC平铺于经Matrigel包被的板上并且在如先前18所述且补充有1μMIWP2、10μMDAPT和100nM嘌吗啡胺的神经诱导培养基中培养6天。随后，将培养物转移到补充有500nM视黄酸和100μM牛磺酸的神经诱导培养基中，再持续1周。对于RPE分化来说，向hpRSC的单层培养物中添加补充有10mM烟酰胺和100ng/ml激活素A的的RPE诱导培养基(GMEM、10％KnockOut血清替代物、0.1mMMEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和0.1mMβ-巯基乙醇)，持续1周。随后，使RPE前体在RPE培养基中成熟，所述RPE培养基由MEM-a改良培养基、5％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、0.1mMMEM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠组成且补充有N1和THT(牛磺酸、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸)46。PCR分析.使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从细胞提取总RNA，并且使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将cDNA反转录，两者均依照制造商说明书。使用基因特异性引物(表1)和PowerSYBRGreenPCRMasterMix在7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)上将转录物扩增40个循环并且对它们的水平进行定量。一式三份进行测量并且将其归一化为β-肌动蛋白水平。表1.用于实时qPCR的引物转录组和途径数据分析.将本研究(hfRPC和hpRSC)中产生的以及由GEO数据库47(HuES9、GSM100174848)获得的基因表达数据归一化并且使用Cluster3.0/TreeView软件包49进行平均连锁层次聚类。基于具有最高表达的样品与具有最低表达的样品之间的最低log2＝1.5距离，使用了4359个基因。样品之间的总距离(相似性)被计算为非中心皮尔逊相关系数(uncenteredPearsoncorrelationcoefficient)。对于热图中的每个基因来说，红色和蓝色分别表示相对于其它细胞的高表达和低表达。对于单个途径的分析来说，基于先前研究50-54来选择TGF-β超家族、Wnt途径、Notch途径、hESC多能性、刺猬途径和FGF途径中的基因子集。对于每个基因子集利用相同的参数单独地进行聚类。免疫细胞化学.用4％低聚甲醛将细胞固定20min，用0.3％TritonX-100-PBS透化5min，进行两次，并且在含有5％正常驴血清和0.3％TritonX-100％的PBS溶液中封闭，之后在一级抗体溶液中在4℃过夜培育。在PBS中洗涤三次后，再将细胞与Alexa荧光缀合二级抗体一起培育90min。在PBS中冲洗和洗涤后，用100ng/mlHoechst33342将细胞核复染10min。一级抗体和它们的工作稀释物如下：绵羊抗-Chx10(1:300,Exalpha)、兔抗-Pax6(1:600,Covance)、山羊抗-Lhx2(1:200,SantaCruz)、兔抗-恢复蛋白(1:2000,Millipore)、小鼠抗-视紫质(1:250,Millipore)、兔抗-红色/绿色视蛋白(1:300,Millipore)、山羊抗-OPN1SW(1:300,SantaCruz)和兔抗-GFP(1:1000,Invitrogen)或鸡抗-GFP(1:400,Invitrogen)。小鼠抗-HSA抗体是针对人特异性标志物TRA-1-85(1:100,R&DSystems)、人核抗原(1:300,Millipore)和人线粒体(1:100,Millipore)的单克隆抗体的混合物。所用的二级抗体是相应的Alexa-488、Alexa-555、Alexa-633或Alexa-647荧光标记的抗体(1:1000,Invitrogen)。用激光扫描共焦显微镜(Olympus)使标记的细胞成像。通过在相同的条件下用适当的视网膜组织作为阳性对照进行免疫染色来确认每种抗体的特异性免疫反应性。细胞移植.大鼠眼睛中的视网膜下移植改编自先前所述的方法55。简单地说，用StemProAccutase(Invitrogen)将hpRSC解离成单细胞并且在唯一的平衡盐溶液(BSS,Alcon)或BSS/HAMC(0.5/0.5％w/w)水凝胶溶液中浓缩到5x104/μL的密度56。为了制备HAMC水凝胶溶液，通过以0.1％w/v溶解于水(HyClone，细胞培养级，ThermoScientific)中并且通过0.22μm管顶真空过滤器(Corning)过滤将透明质酸钠(HA,1400-1800kDa，药物级150，Novamatrix)灭菌。然后在无菌条件下通过用0.22umPVDF过滤器(MillexGV,Millipore)覆盖所述管将所述溶液冷冻干燥。通过在冰浴中搅拌将甲基纤维素(MC,100kDa,MethocelA4MPremium,DowChemical)以0.3％w/v溶解于水中，然后与HA一样，无菌过滤并冻干。将无菌的HA和MC粉末再悬浮于生物安全柜中的BSS中(例如，对于0.5％/0.5％HAMC来说，将30mgHA和30mgMC溶解于6mLBSS中)，然后将所述悬浮液涡旋，在4℃静置过夜以溶解，并且在使用前再次涡旋。利用玻璃微量吸移管，将悬浮液中的1-2μlhpRSC(5-10x104个细胞)缓慢注射到裸大鼠或RCS大鼠的视网膜下空间中。在移植后的不同时间点，将动物处死，并且将眼睛摘出且包埋在组织冷冻培养基中，冷冻切片，并且共免疫染色，如上文所述。在获得批准的情况下并且在圣地亚哥的加利福尼亚大学公共机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeattheUniversityofCalifornia,SanDiego)的监督下执行动物程序。结果使用小分子由hESC诱导hpRSC.在脊椎动物胚胎发育的早期阶段期间，在Wnt和BMP信号传导梯度的影响下诱导眼区特化16,17。先前的研究表明Wnt信号传导梯度对于在早期发育期间建立前脑和中脑特性是重要的。Wnt信号传导的下调导致形成其中存在眼区的前脑。因此，用Dkk1(一种强效的Wnt抑制剂)和头蛋白(一种BMP拮抗剂)处理hESC来源的胚状体促进眼区的发育3,19。另外，在通过暴露于SB431542(转化生长因子－β(TGF-β)超家族I型激活素受体样激酶ALK-4、ALK-5和ALK-7的选择性和强效抑制剂)和LDN193189(BMPI型受体ALK-2和ALK-3的选择性抑制剂，一种头蛋白类似物)的双重SMAD抑制下，hESC可能变成强烈表达PAX6和LHX2的前脑/眼区前体20,21。因此，我们研发了一种化学成分确定的培养方案以使用小分子抑制剂IWP2(Wnt产生抑制剂-2，一种Dkk1类似物)22、LDN193189和SB431542(下文分别被称作IWP、LDN和SB)在Wnt和TGF-β/BMP信号传导活性的协同抑制下诱导hESC向hpRSC分化。将多能hESC平铺于经Matrigel包被的板上并且在无饲养层且无血清的条件下培养到接近汇合。随后，将培养物转换到补充有IWP-LDN-SB小分子混合剂的hpRSC启动培养基中，持续1周。在这种处理下，大多数hESC转化为紧密堆积的细胞。通过关键的早期眼区转录因子的免疫细胞化学标记来确认hpRSC的大量诱导3,23。超过90％的细胞对于PAX6和LHX2(由眼区祖细胞表达的两种关键转录因子)两者均为阳性(图1b)。多数hESC来源的hpRSC还表达巢蛋白(原始神经上皮干细胞的一种典型标志物)(图1c)。另外，hESC来源的hpRSC保留了如通过Ki67的强表达所证明的增殖活性(图1c)。通过实时PCR进一步确认hpRSC的诱导以评估典型的早期眼区转录因子基因(包括PAX6、RX、LHX2、SIX3和SIX6)的表达。我们发现在6天诱导后hpRSC中的这些视网膜祖细胞标志物的超过20到1200倍的增加表达(图1d)。这些基因的表达水平维持在培养中超过至少两次传代。hpRSC的转录谱.为了获得hpRSC特性的全局观点并研究其相对于其亲本细胞、未分化的hESC和更定向的(committed)视网膜祖细胞的分子标签(molecularsignature)，我们通过微阵列比较了hpRSC转录组与hESC和人17周胎儿视网膜祖细胞(hfRPC)的那些。数据表明hpRSC呈从多能hESC到神经视网膜命运限制性hfRPC的分化过程内的过渡状态(图2a)。在hpRSC中观测到关键hESC多能性转录因子如POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4和TBX3的显著下调。有趣的是，LIN28和SALL4(限定胚胎干细胞以及若干组织谱系中的干性的两种转录因子)24-26在hpRSC中以与在hESC中相似的水平表达，但在hfRPC中以显著降低的水平表达(图2b,2e)。此外，仅在hpRSC中检测到升高的SOX2表达(图2b)，表明hpRSC的原始神经外胚层状态27。根据与眼区形成有关的已知分子标签23，hpRSC展示TGF-β超家族中的一些基因如SMAD1、SMAD2、TGF-β3、BMP3、BMP6、TGFBR1和BMPR1B的降低表达(图2c)。值得注意的是，BMP4和BMP7(其对于RPE体内发育是足够的且必不可少的)28在hpRSC中比在hfRPC中具有更高的表达水平。与先前的研究17,29一致，WNT4和WNT11(其通常在眼区中受到抑制，但在后部边界以外升高)的表达在hpRSC中降低(图2d)。类似地，已知对于眼区形成很重要的SRFP1(一种内源性Wnt抑制剂)和FZD3/5(Wnt信号传导蛋白质的受体)30在hpRSC中强表达(图2d)。此外，hpRSC和hfRPC转录组的成对比较分析确认了hpRSC在眼区特化期间的过渡状态。除了在视网膜发生的过程中始终保持活性的PAX6之外，一组典型的早期眼区转录因子基因(包括OTX2、RAX、LHX2、SIX3和SIX6)在hpRSC中全部比在hfRPC中更显著地表达(图2e)。还观测到FGF信号传导途径的成员的下调，包括FGFR1/2/3和FGF3/8(图7a)，已知这两个成员促进视网膜神经发生31，表明hpRSC尚未定向于变成RPE或神经视网膜。数据证实由hESC衍生hpRSC可以重现(recapitulate)眼区特化并且hpRSC准备进入视网膜子谱系分化。由hESC来源的hpRSC定向分化视网膜神经节细胞.为了研究hESC来源的hpRSC是否具有在培养中生成不同的视网膜子谱系细胞类型的潜力，我们采取了一种基于小分子的方法来模拟早期眼睛发育的诱导指令(cue)。我们引导hpRSC在体外向特定的视网膜细胞命运分化。视网膜神经节细胞(RGC)是主要类型的视网膜神经元并且在将视觉信号从视网膜传递到大脑的若干区域中起关键作用。我们首先测试hESC来源的hpRSC是否可以被指示在化学成分确定的条件下分化成RGC。先前的结果证实，Notch和VEGFR信号传导的抑制对于RGC特化是重要的32,33。我们的转录谱分析表明，Notch和VEGFR信号传导途径的若干成员如NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、DLL1、DLL3、HES5和HES1的表达在hpRSC中显著上调(图7b)。因此，我们配制了包含IWP2、DAPT和PD173074的小分子抑制剂的混合剂，这些抑制剂可以分别抑制Wnt、Notch和VEGFR信号传导的活性。所述处理使hpRSC快速定向于RGC命运。在存在这三种小分子抑制剂的情况下诱导两周后，大多数细胞对于TUJ1和BRN3两者(RGC标志物)均为阳性(图3a)。定量PCR分析显示在前6天诱导后，RGC前体特异性转录因子基因如BRN3A、BRN3B、ISL-1和MATH5的显著上调(图3b)。由hESC来源的hpRSC定向分化光感受器.光感受器是视网膜中的主要细胞类型并且负责引发视觉信号转导。hpRSC以高于hESC和hfRPC的水平表达若干刺猬(HH)信号传导基因，如GLI2、GLI3和smoothened(SMO)(图7c)，表明hpRSC倾向于向光感受器分化。因此我们基于先前的研究7研发了一种改良的体外光感受器分化方法并且利用小分子来引导分化过程。已经利用两步法实现了对来自hpRSC的光感受器命运的限制7。在初始阶段期间，用小分子抑制剂SB、CHIR99021、DAPT和IWP2处理hpRSC以分别抑制ALK4/5/7、GSK-3、Notch和Wnt信号传导活性，并且利用嘌吗啡胺(Shh信号传导途径的小分子激活剂)处理hpRSC34。如先前35所述，在初始阶段期间观测到稳健的细胞生长和增殖，但未观测到光感受器特异性标志物的表达。在第二阶段期间，如先前报道中7所述，将培养物转移到补充有视黄酸和牛磺酸的培养基中，其在1周后诱导了形态变化，包括一些细胞中的细胞突起的延伸。为了鉴别这些分化细胞的命运，我们通过免疫细胞化学检查了光感受器特异性标志物的表达。到初始诱导后的第14天，检测到全-光感受器标志物恢复蛋白(图4a)、锥细胞特异性标志物OPN1SW或蓝色视蛋白(图4b)和杆细胞特异性标志物视紫质(图4c)。为了确定由hpRSC体外分化的光感受器是否也表达人光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)(杆光感受器和锥光感受器两者的标志物)36，我们用IRBP-GFP慢病毒感染hpRSC并且使转导的细胞向光感受器命运分化。这种方法已被显示特异性地标记转基因小鼠以及人、小鼠和鸡视网膜外植体中的光感受器37,38。在12天分化后，GFP阳性细胞开始出现。到第16天，成簇的表达GFP的光感受器明显可见(图4d)。在进一步成熟后，hpRSC来源的光感受器展示了类似于外节的典型形态特征，如短的内突起和长的延伸外突起(图4d，插图)。由hpRSC定向分化RPE.RPE(神经视网膜与脉络膜血管层之间的单层细胞)是出现于早期视杯的外层中的首个定向视网膜细胞类型28。为了测试hESC来源的hpRSC是否不仅能够分化成神经视网膜细胞，而且还能够分化成非神经元RPE细胞，我们从hpRSC的贴壁单层培养物中提取小分子抑制剂并且将其转移到RPE引发培养基中，如先前39所述。去除SMAD信号传导抑制和添加激活素A对于将hpRSC引向RPE命运是重要的，因为激活素A和BMP活性是RPE特化所需要的28,39,40。在RPE分化12天后，在上皮样细胞内部观测到RPE65(全反式视黄醇转化成11-顺式视黄醛以及视觉色素再生所需的RPE特异性异构酶)的低表达水平以及多边形肌动蛋白束的形成(图4e)。在进一步培养成熟后，出现了RPE65的增加表达(图4f)以及RPE的色素沉着(图4g)。hpRSC的移植.我们接下来确定hESC来源的hpRSC在被移植到鼠科动物眼睛的视网膜下空间中之后存活并分化成光感受器的能力。为了避免人细胞的免疫排斥，我们使用了无胸腺的裸大鼠用于移植。在移植约50,000个hpRSC后6周，在接受者眼睛的视网膜下组织中观测到被移植的人细胞，但人特异性抗原(HSA)阳性细胞的数目通常是有限的并且被瘢痕组织包围(图8a)。为了克服细胞聚集的倾向并增加在视网膜下移植后的细胞存活率，我们选择在由透明质酸和甲基纤维素(HAMC)构成的水凝胶中而不是在盐水中递送细胞。最近，已经证实向鼠科动物眼睛来源的视网膜祖细胞移植HAMC水凝胶可以改进被移植细胞的存活、分布和分化41,42。我们向裸大鼠的视网膜下空间中注射与HAMC(0.5/0.5％w/w)水凝胶混合的hpRSC。在移植后6周，增加数目的被移植人细胞存活并且广泛地分布于整个视网膜下区域(图8b)。因此，对于后续的移植实验来说，除非另有指明，否则我们在HAMC水凝胶中递送hpRSC。由于神经视网膜仍在新生动物中发育，因此它可以为被移植的hpRSC的整合和分化提供容许的环境。为了测试这一假说，我们向新生裸大鼠的视网膜下空间中注射带GFP标签的hpRSC并且在移植后6天观测到表达GFP的hpRSC在神经视网膜中的显著整合，包括外核层(ONL)和内核层(INL)(图5)。整合到ONL中的一些GFP阳性细胞与典型的光感受器标志物恢复蛋白共定位(图5a,5e,5f)。值得注意的是，许多被移植的GFP阳性细胞继续表达巢蛋白(图5b,5d,5f)(未定向hpRSC的一种标志物)，表明这些细胞尚未定向于特定的视网膜细胞命运。接下来，我们在视网膜变性的动物模型(皇家外科医师学会(RoyalCollegeofSurgeons)(RCS)大鼠)中测试了hpRSC是否具有分化成期望的细胞类型如光感受器的能力。RCS大鼠持有Mer受体酪氨酸激酶的突变，所述激酶通过缺陷型RPE吞噬作用引起光感受器变性43,44。我们向出生后第21天(P21)的RCS大鼠的视网膜下空间中注射hpRSC并且在两个月后检测分化和整合。将被移植眼睛的冷冻切片与针对HSA和光感受器标志物恢复蛋白(图6a)或红色/绿色视蛋白(图6b)的抗体共免疫染色。在毗邻ONL的区域中检测到多层移植的人细胞。许多恢复蛋白阳性细胞和红色/绿色视蛋白阳性细胞也对于HSA为阳性(图6)。双阳性标记细胞的存在表明一些被移植的hpRSC在变性中的视网膜中定向于光感受器命运。讨论这里我们使用了基于小分子的方法来重现从未分化的hESC体内视网膜发育的过程并且在化学成分确定的培养条件下产生了hpRSC。hESC来源的hpRSC展现出眼区的神经上皮细胞的典型特征。通过对未分化的hESC中的Nodal、BMP和Wnt信号传导的协同抑制以快速且有效的方式实现了诱导。hESC来源的hpRSC增殖且积极地表达典型的早期眼区转录因子(即PAX6、LHX2、RAX、OTX2和SIX3)以及干性因子(即SOX2、LIN28、SALL4和STAT3)。当提供有特异性分化指令时，这些原始视网膜干细胞可以被引导定向于神经元命运如RGC或光感受器或非神经元RPE。此外，我们证实被移植的hpRSC能够在体内整合、存活并分化成期望的细胞类型。令人鼓舞的是，在RCS大鼠(一种视网膜变性模型，其中光感受器于P14开始损失并且到大鼠3个月大时完全消失)中移植后两个月，一些被移植的hpRSC在剩余的ONL中明显分化成光感受器。此外，在我们到目前为止已经检查的被移植的动物中，我们未观测到来自被移植的hpRSC的任何肿瘤形成。我们的结果表明，以适于临床试验的按比例放大的方式在体外诱导和扩增hpRSC是可行的。另外，这种基于小分子的方法可以用于生成患者iPSC来源的hpRSC以及更为分化的视网膜祖细胞或视网膜神经元，这对于“培养皿中的疾病”建模以研究解释视网膜变性的发病机理的分子和细胞事件将具有重大意义。参考文献1Seiler,M.J.和Aramant,R.B.Cellreplacementandvisualrestorationbyretinalsheettransplants.ProgRetinEyeRes31,661-687,doi:10.1016/j.preteyeres.2012.06.003(2012).2Banin,E.等人Retinalincorporationanddifferentiationofneuralprecursorsderivedfromhumanembryonicstemcells.StemCells24,246-257(2006).3Lamba,D.A.,Karl,M.O.,Ware,C.B.和Reh,T.A.Efficientgenerationofretinalprogenitorcellsfromhumanembryonicstemcells.ProcNatlAcadSciUSA103,12769-12774(2006).4Klimanskaya,I.等人Derivationandcomparativeassessmentofretinalpigmentepitheliumfromhumanembryonicstemcellsusingtranscriptomics.CloningStemCells6,217-245,doi:10.1089/clo.2004.6.217(2004).5Vugler,A.等人ElucidatingthephenomenonofHESC-derivedRPE:anatomyofcellgenesis,expansionandretinaltransplantation.ExpNeurol214,347-361,doi:10.1016/j.expneurol.2008.09.007(2008).6Ukrohne,T.U.等人GenerationofretinalpigmentepithelialcellsfromsmallmoleculesandOCT4reprogrammedhumaninducedpluripotentstemcells.Stemcellstranslationalmedicine1,96-109,doi:10.5966/sctm.2011-0057(2012).7Osakada,F.等人Towardthegenerationofrodandconephotoreceptorsfrommouse,monkeyandhumanembryonicstemcells.NatBiotechnol26,215-224(2008).8Gonzalez-Cordero,A.等人Photoreceptorprecursorsderivedfromthree-dimensionalembryonicstemcellculturesintegrateandmaturewithinadultdegenerateretina.NatBiotechnol,doi:10.1038/nbt.2643(2013).9Lamba,D.A.等人Generation,PurificationandTransplantationofPhotoreceptorsDerivedfromHumanInducedPluripotentStemCells.PLoSONE5,e8763,doi:10.1371/journal.pone.0008763(2010).10Schwartz,S.D.等人Embryonicstemcelltrialsformaculardegeneration:apreliminaryreport.Lancet379,713-720,doi:10.1016/S0140-6736(12)60028-2(2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