NY-ESO-2在微卫星不稳定性肠癌的诊断和治疗中的应用的制作方法

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及NY-ESO-2在微卫星不稳定结直肠癌免疫治疗中的应用。

背景技术：

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在男性及女性中分别处于恶性实体肿瘤的第3位和第2位，位列癌症相关死亡原因第4。近年来，结直肠癌的发病率不断上升，而我国的上升速度是国际平均增速(2％)的2倍，尤其在上海等东南沿海发达城市，发病率达到实体肿瘤的第二位(30/10万)，严重威胁着人类的健康和生活质量。

目前，对于结直肠癌的治疗还是局限在手术、化疗和放疗，转移性结直肠癌目前主要的治疗方法仍是化疗，但2011版的《NCCN结直肠癌临床实践指南》中明确指出微卫星不稳定性(Microsatellite instability，MSI)结直肠癌患者不会从5-氟尿嘧啶(5-Fu)的辅助化疗中获益，因此，建议所有50岁以下的患者均应考虑进行MSI检测，具有MSI-H(High-frequency microsatellite instability，MSI-H)的患者不建议采用化疗。由于目前主要的结直肠癌化疗方案中，5-Fu是主要的基础化疗药物，因此探讨这类患者的新的临床治疗手段对于提高MSI结直肠癌患者的疗效具有重要意义。

技术实现要素：

本发明第一方面，提供了NY-ESO-2基因、蛋白或其检测试剂的用途，用于制备(a)诊断微卫星不稳定性肠癌；和/或(b)判断肠癌患者预后的试剂盒。

在另一优选例中，所述的NY-ESO-2基因来源于哺乳动物，较佳地，来源于小鼠、大鼠或人。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括：对NY-ESO-2蛋白或mRNA进行定量检测的检测试剂以及相应的标签或说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括对NY-ESO-1蛋白或mRNA进行定量检测 的检测试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括NY-ESO-2特异性引物、特异性抗体、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的检测试剂为NY-ESO-2特异性引物。

在另一优选例中，上述的试剂包括检测用芯片，包括核酸芯片和蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的微卫星不稳定性肠癌相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与NY-ESO-2基因或mRNA特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的微卫星不稳定性肠癌相关蛋白的特异性抗体包括抗NY-ESO-2蛋白的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的预后包括预测确诊肠癌患者的生存期。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

当检测对象的NY-ESO-2相对参照基因的mRNA表达量与癌旁组织的NY-ESO-2相对参照基因的mRNA表达量之比≥1，则提示该检测对象患微卫星不稳定性肠癌的几率高于普通人群，和/或

当确诊患有肠癌的患者NY-ESO-2相对参照基因的mRNA表达量与癌旁组织的NY-ESO-2相对参照基因的mRNA表达量之比≥1，则提示该确诊患有肠癌的患者预后好。

在另一优选例中，所述的肠癌包括结肠癌或直肠癌。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测人肠癌组织样品或血液样品。

本发明还提供了一种检测微卫星不稳定性肠癌的试剂盒，其中，所述的试剂盒含有NY-ESO-2基因、蛋白或其检测试剂，和相应的标签或说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有NY-ESO-2基因、蛋白作为阳性对照。

本发明第二方面，提供了一种NY-ESO-2基因、蛋白或其激动剂的用途，用于制备治疗肠癌的药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物是疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的激动剂包括5-氮杂-2’脱氧胞苷(DAC)、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体等。

在另一优选例中，所述的肠癌为微卫星不稳定性肠癌。

在另一优选例中，所述的药物组合物的制备可如下所述：

(A1)提供NY-ESO-2抗原；

(B1)将NY-ESO-2抗原和抗原提呈细胞共孵育，从而获得经NY-ESO-2致敏的抗原提呈细胞；

(C1)将(B1)中的产物与药学上可接受的载体混合，从而获得所述的药物组合物。

在另一优选例中，步骤(B1)还包括，将经NY-ESO-2致敏的抗原提呈细胞与T细胞进一步共孵育，从而获得经NY-ESO-2激活的具有抗肿瘤免疫活性的T细胞。

在另一优选例中，所述的抗原提呈细胞为树突状细胞。

在另一优选例中，所述的药物组合物的制备还可如下所述：

(A2)提供共表达抗NY-ESO-2抗体基因和T细胞活化基因的载体；

(B2)使用(A2)中的载体转染T细胞，从而获得嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)；

(C2)将(B2)中的产物与药学上可接受的载体混合，从而获得所述的药物组合物。

本发明第三方面，提供了一种筛选治疗肠癌的候选化合物的方法，包括步骤：

(i)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的肠癌细胞中NY-ESO-2的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中NY-ESO-2的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的NY-ESO-2的表达量和/或活性大于对照组，就表明该测试化合物是对NY-ESO-2的表达和/或活性有促进作用的治疗肠癌的候选化合物。

在另一优选例中，还可以包括步骤：

(ii)比较添加或不添加化合物的测试组或对照组的产物对T细胞的抗肿瘤免疫活性的刺激作用。

本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制微卫星不稳定性肠癌细胞的方法，包括步骤：将经NY-ESO-2激活的具有抗肿瘤免疫活性的T细胞和/或表达抗NY-ESO-2抗体的T细胞和/或表达具有识别NY-ESO-2表位的TCR的T细胞与肠癌细胞共孵育，从而抑制微卫星不稳定性肠癌细胞。

本发明还提供了一种治疗微卫星不稳定性肠癌的方法，包括步骤：向需要的对象施用经NY-ESO-2激活的具有抗肿瘤免疫活性的T细胞和/或表达抗NY-ESO-2抗体的T细胞和/或表达具有识别NY-ESO-2表位的TCR的T细胞，从而治疗微卫星不稳定性肠癌。

在另一优选例中，所述需要的对象为患有微卫星不稳定性肠癌的对象。

在另一优选例中，所述需要的对象为哺乳动物，包括小鼠、大鼠或人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了优选的NY-ESO-2的cDNA序列(SEQ ID NO.:1，提供原始cDNA序列即可，优化序列可指出具体位置和具体优化的密码子)；图1B显示了NY-ESO-2的氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)。

图2A显示了基因芯片分析结果中，NY-ESO-2在LS180-MSI-H/S模型MSI-H细胞中NY-ESO-2表达显著上调；图2B显示了qPCR分析结果中，NY-ESO-2在LS180-MSI-H/S模型MSI-H细胞中NY-ESO-2表达显著上调；图2C显示MSI-H结直肠癌细胞系中表达NY-ESO-1，NY-ESO-2，MAGEA4的平均水平高于3株MSS结直肠细胞系。

图3显示了NY-ESO-2在患者癌组织的表达情况。

图4显示了回顾性分析中，MSI-H患者(图4A)和MSS患者(图4B)中NY-ESO-2表达差异对于三年生存时间的影响。

图5A显示了LS180-MSI-H荷瘤裸鼠并进行多肽致敏的DC回输治疗后肿瘤的生长曲线；图5B显示了荷瘤裸鼠的生存曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，NY-ESO-2在微卫星不稳定性肠癌中高表达，利用NY-ESO-2作为肠癌的分子标记物，有助于对肠癌进行分型，从而指导不同类型的肠癌的治疗方案；此外，本发明人还发现，肠癌患者的预后和NY-ESO-2的表达有着强烈的相关性，微卫星不稳定性肠癌，NY-ESO-2高表达的患者能有更好的预后。本发明人还通过实验发现，经NY-ESO-2致敏后的DC细胞在体内能够更有效地激活T细胞的肿瘤免疫活性，从而达到治疗微卫星不稳定性肠癌的目的。在此基础上，完成了本发明。

微卫星不稳定性肠癌

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在男性及女性中分别处于恶性实体肿瘤的第3位和第2位，位列癌症相关死亡原因第4。近年来，结直肠癌的发病率不断上升，而我国的上升速度是国际平均增速(2％)的2倍，尤其在上海等东南沿海发达城市，发病率达到实体肿瘤的第二位(30/10万)，严重威胁着人类的健康和生活质量。

微卫星是指基因组中<10个核苷酸的简单重复序列，以两个核苷酸组成的重复序列最为丰富，重复次数为10～50次，主要包括在基因的非编码区，其序列短，多数<200bp，其重复单位数量的改变可以引起相当高的多态性。简单重复序列的增加或丢失即被称为MSI。通过检测微卫星的稳定性，CRC可划分为微卫星不稳定性(MSI)CRC及微卫星稳定性(MSS)CRC。

其中，微卫星不稳定性肠癌被确认为无法从化疗中获益。在本发明中，采用NY-ESO-2作为分子标记物，可以协助诊断微卫星不稳定性肠癌，而NY-ESO-2与肠癌患者的生存期也存在显著的相关性，利用NY-ESO-2可以有助于对肠癌患者进行预后，即NY-ESO-2高表达患者预后优于NY-ESO-2低表达患者。

NY-ESO-2及其编码多核苷酸

NY-ESO-2是癌-睾丸(cancer-testis)抗原基因家族中的重要一员，编码的蛋白质相对分子量为18kD左右，氨基酸数目为180个，其N端有一个甘氨酸富集区，C端含一个疏水氨基酸尾。其在肿瘤抗原中具有较强的免疫原性，但在正常组织中的表达仅限于睾丸和胚胎组织，已知NY-ESO-2在恶性黑色素瘤、肝细胞癌、卵巢癌等中表达。然而，在肠癌中，NY-ESO-2的表达却是不确定的，表达频率具有相当的差异性。

本发明人通过对大量不同肠癌细胞系的回顾性研究和实验验证发现，NY-ESO-2的表达与肠癌的微卫星稳定性分型具有良好的相关性。即NY-ESO-2多表达于微卫星不稳定性肠癌。由此，可以利用NY-ESO-2的表达量对肠癌进行分型，有助于治疗方案的指导。

此外，本发明人发现，采用NY-ESO-2作为抗原刺激抗原提呈细胞，从而刺激的T细胞，或表达抗NY-ESO-2抗体的T细胞或表达识别NY-ESO-2的TCR的T细胞具有良好的微卫星不稳定性肠癌抑制活性。而这种肿瘤抑制活性对微卫星稳定 性肠癌则较弱。

可用于本发明的抗NY-ESO-2抗体没有特别限制，可以为特异性结合NY-ESO-2的单克隆抗体。所述的单克隆可以通过常规方法获得，例如采用杂交瘤细胞产生。

产生肿瘤免疫活性的T细胞或表达抗NY-ESO-2抗体的嵌合抗原受体T细胞或表达识别NY-ESO-2的TCR的T细胞可以对微卫星不稳定性肠癌产生较强的肿瘤抑制作用。

本发明所用NY-ESO-2抗原或其编码核酸为分离的蛋白或其编码核酸。如本文所用，术语“NY-ESO-2蛋白”、“NY-ESO-2抗原”、“NY-ESO-2多肽”、“本发明分子标志物”可以互换使用，均指的是具有NY-ESO-2氨基酸序列的蛋白或多肽，所述的序列如SEQ ID NO.：2。编码NY-ESO-2氨基酸的优选多核苷酸序列如SEQ ID NO.：1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的NY-ESO-2蛋白或多肽”是指NY-ESO-2蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化NY-ESO-2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，NY-ESO-2蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。此外，本发明蛋白还可以与T细胞活化分子共表达，并转染T细胞，从而获得嵌合抗原受体T细胞，以NY-ESO-2为靶标进行肿瘤细胞的杀灭。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码NY-ESO-2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列； 成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码NY-ESO-2蛋白的多核苷酸。

本发明的人NY-ESO-2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或NY-ESO-2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发 明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的NY-ESO-2蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人NY-ESO-2蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人NY-ESO-2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主 细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抗原提呈细胞

抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)是指具有摄取、处理抗原并将抗原信息提呈给T淋巴细胞的一类细胞，又称为辅佐细胞。早期的医学研究发现，在胸腺依赖性抗原诱导B淋巴细胞产生抗体的过程中，不仅需要T、B淋巴细胞的协同作用，还需要另一类细胞的协助，遂将该类细胞称为辅佐细胞(accessory cells)。在机体的免疫识别、免疫应答与免疫调节中起重要作用。

可用于本发明的抗原提呈细胞没有特殊限制，为任何在免疫系统中起到抗原交叉提呈(或交叉致敏)并刺激T细胞产生免疫应答(尤其是肿瘤免疫应答)的抗原提呈细胞。优选地，所述抗原提呈细胞为树突状细胞，其作为免疫系统内功能最强的APC，优选成为采用本发明NY-ESO-2抗原致敏的抗原提呈细胞。

激动剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与NY-ESO-2蛋白发生相互作用的物质，尤其是激动剂等。

本发明NY-ESO-2蛋白的激动剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进NY-ESO-2蛋白的表达和/或活性，利用高表达的NY-ESO-2抗原，进而刺激T细胞产生肿瘤免疫活性，从而抑制微卫星不稳定性肠癌的生长或增殖。

本发明药物组合物可以由多种方法制备获得：

方法1：

(A1)提供NY-ESO-2抗原；

(B1)将NY-ESO-2抗原和抗原提呈细胞共孵育，从而获得经NY-ESO-2致敏的抗原提呈细胞；

(C1)将(B1)中的产物与药学上可接受的载体混合，从而获得所述的药物组合物。

在该药物组合物Y1中，含有经NY-ESO-2致敏的抗原提呈细胞和药学上可接受的载体。将所述的药物组合物施用于患有微卫星不稳定性肠癌的患者，可以

通常，可将这些激动剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明NY-ESO-2蛋白或其激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

检测方法和试剂盒

本发明还涉及定量和定位检测人NY-ESO-2蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人NY-ESO-2蛋白水平，可以用于诊断肠癌、肝癌。

一种检测样品中是否存在NY-ESO-2蛋白的方法是利用NY-ESO-2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与NY-ESO-2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在NY-ESO-2蛋白。

NY-ESO-2蛋白或其多核苷酸可用于NY-ESO-2蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗NY-ESO-2的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的NY-ESO-2蛋白。

本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有特异性扩增NY-ESO-2的引物对和/或NY-ESO-2特异性抗体。

筛选方法

本发明还提供了基于NY-ESO-2进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(促进)NY-ESO-2表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞。一种筛选方法可基于NY-ESO-2的mRNA的表达水平。

其中，代表性的癌细胞包括(但并不限于)：微卫星不稳定性肠癌细胞。

本发明优异效果：

1.利用NY-ESO-2的阳性表达，可以对肠癌的微卫星稳定性进行分型，灵敏度较高。

2.NY-ESO-2的表达对肠癌患者的预后有显著的相关性，即NY-ESO-2阳性表达者的生存时间更长。

3.通过采用NY-ESO-2致敏的DC细胞可以用于刺激T细胞产生抗肿瘤活性，然而这种抗肿瘤活性对微卫星不稳定性肠癌更有效。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 临床回顾性分析不同微卫星状态下NY-ESO-2的表达差异对于患者生存时间的影响

本实施例收集了2005-2009年186例临床样本，通过微卫星分型分析，确定其微卫星的状态，其中123例MSS，63例MSI-H患者，采用免疫组化的方法分析了其肿瘤组织中NY-ESO-2的表达情况，结果发现其中NY-ESO-2表达阳性的比例在MSI-H中为57.14％，显著高于MSS中表达比例。

采用回顾性分析不同微卫星状态下NY-ESO-2的表达差异对于患者生存时 间的影响。在MSI-H组中NY-ESO-2表达阳性的患者三年存活率为74.18％，而NY-ESO-2表达阴性的患者三年存活率为55.71％(图4A)；而在MSS组中，NY-ESO-2表达阳性的患者三年存活率也高于表达阴性患者(图4B)。

实施例2 NY-ESO-2在MSI结直肠癌中的高表达验证

基因表达谱分析：(1)通过RNA提取试剂盒，提取HCT116，LS180，LS174t三组MSI-H/S细胞模型中的RNA。

(2)分别检测RNA的浓度及纯度。

(3)靶标制备：首先制备Poly-A RNA Controls稀释液，合成First-Strand及Second-Strand cDNA，并从体外转录合成生物素标记cRNA，进一步进行cRNA纯化及片段化，随即进行下一步芯片杂交工作

(4)芯片杂交：取出芯片平衡芯片至室温，随即将杂交液置于加热块上，99℃，5min，期间注入相应体积的预杂交液于芯片中，置于杂交炉中，45℃，60rpm/min,10min，之后将99℃已温育5min的杂交液转入另一加热快中，45℃5min。温育结束后微型离心机最大转速离心5min，以除去杂交液中的不溶性物质。从杂交炉中取出芯片，吸出Pre-Hybridization Mix，然后注入相应的杂交液。最后将芯片平衡放置于杂交炉中，45℃，60rpm/min，杂交16hr。

(5)芯片的清洗、染色、扫描：杂交结束后，吸走杂交液，根据芯片类型不同注入相应体积的Wash Buffer A.打开扫描仪预热10min，将清洗完成的芯片贴上Tough-Spots，检查玻璃表面，保证表面清洁。将芯片放入到扫描仪中，进行扫描。

(6)所有样品中每个基因(probe set)的信号值均采用Robust Multichip Analysis(RMA)归一化方法，采用SAM(Significance Analysis of Microarrays)软件进行差异表达基因的筛选，SAM分析结果进行筛选后的数据显示差异表达基因(红色字体为上调基因，绿色字体为下调基因)SAM结果中非差异表达的基因(黑色字体)。上调大于2倍的基因(红色字体)，筛选标准为：q-value≤5％；Fold Change≥2；下调大于2倍的基因(绿色字体)，筛选标准为：q-value≤5％；Fold Change≤0.5；按照Fold Change列进行排序，Fold Change变化倍数越大，说明两组样品间的差别越大；按照q-value列排序，q-value越小，说明两组样品差异的显著性越大。挑选出的差异表达基因在MAS系统中进行了Pathway统计分析，结果显示差异表达基因所涉及到具有显著性意义的pathway分类，P value反映此pathway在实验结果中的重要性，P value越低提示与Pathway更相关。Q value的计算方法采用bootstrap方法，在分析pathway的统计结果时也可以综合考虑P value和Q value。如图2A所示。

蛋白表达谱分析：(1)调整细胞数量浓度1×10⁷/ml，取500ul置于直径10cm的细胞培养皿中，补足细胞培养基至10ml，细胞贴壁后，生理盐水清洗两遍，换肿瘤细胞无血清培养基，培养48h后，收集细胞上清，同时收集平皿中的细胞检测细胞的蛋白浓度。(2)于芯片中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30min，封闭定量抗体芯片。吸去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。吸去每个孔中的标准品或样品，用清洗液清洗芯片5次，150ul/孔，5min/次。离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。吸去每个孔中的检测抗体，用清洗液清洗芯片5次，150ul/孔，5min/次。离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。吸去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，用清洗液清洗芯片5次，150ul/孔，5min/次。最后采用激光扫描仪Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。结果如表1所示。

实时定量PCR分析：贴壁的肿瘤细胞胰酶消化，离心收集后用PBS洗2次，1×10⁶细胞，RNA提取试剂盒，提取细胞总RNA，最终进行浓度和纯度测定后保存于-80℃。取2μg细胞总RNA按照反转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，于42℃作用30分钟，经99℃作用5分钟灭活后加入16μl双蒸水稀释，可作qPCR反应的模板。分别用NY-ESO-2等分子以及Actin的定量PCR引物(F:5’-CAGACCACCGCCAACTGCA-3’(SEQ ID NO.:3)；R:5’-TGAGGGAGGCTGAGCCAAA-3’(SEQ ID NO.:4))，采用Green Realtime PCR Master Mix进行定量PCR扩增。如图2B所示。

流式细胞术分析：贴壁的肿瘤用胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞浓度1×10⁶/ml，取100ul置于1.5ml离心管中，2000r/min，4℃，离心5min，用冷PBS洗细胞两次，最后加入200-400ul的PBS重悬细胞，按照抗体说明书进行抗体标记，最终加入200ul PBS重悬细胞，准备上机。利用流式细胞术技术对3株MSI-H结直肠癌细胞系中其表达NY-ESO-2的平均水平进行检测，结果显示 MSI-H结直肠癌细胞系中表达NY-ESO-1，NY-ESO-2，MAGEA4的平均水平高于3株MSS结直肠细胞系。如图2C所示。

表1

实施例3 利用NY-ESO-2表达对肠癌微卫星进行分型

利用实施例1中已知微卫星分型的肠癌标本进行双盲测定，从而根据NY-ESO-2表达阳性情况对肠癌标本进行分型。结果表明，根据NY-ESO-2表达判断微卫星不稳定性肠癌的灵敏度为90％，特异性为78％。因此，可根据NY-ESO-2的表达来对肠癌进行微卫星稳定性分型。

实施例4 NY-ESO-2蛋白的制备

将pET28a/NY-ESO-2重组质粒转入BL21-DE3感受态细胞中，37℃，220rpm扩增至对数生长期，即540nm吸光度OD＝0.6-0.8。加入IPTG混匀，终浓度为1mM/L。37℃，220rpm诱导蛋白表达，16-24小时。5000rpm离心15分钟，收集菌液。缓冲液重悬菌液，超声60-70Hz破碎大肠杆菌10-15分钟，15000rpm离心30分钟，收集沉淀并进行变性、复性处理。利用亲和层析柱HisTrap对变性、复性处理后得到的蛋白溶液进行初步纯化，400-600mM/L咪唑对目的蛋白进行洗脱。利用离子交换柱Sepharose QFF对上步洗脱液进行进一步纯化，收集流穿和梯度洗脱液，浓缩，-20℃冷冻保存待用。

实施例5 NY-ESO-2蛋白的鉴定

通过SDS-PAGE胶电泳后，转膜PVDF膜上，丽春红染色后,剪取待测膜条用TBST清洗3遍，5min/遍。5％脱脂奶粉封闭2h，TBST清洗3遍，5min/遍。按合适的比例加入一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗3遍，5min/遍。按合适的比例加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，室温孵育2h。TBST清洗3遍，5min/遍，加入显色 液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

实施例6 MSI-H细胞肿瘤抗原致敏DC体外抗肿瘤效应

颈椎脱位法处死HLA-A2.1/Kb小鼠，无菌取股骨，无血清RPMI1640培养基冲洗出骨髓细胞，1000g×5分钟离心后小心吸弃培养基上清，3-5ml的Tris-NH4Cl溶液溶去红细胞，加入抗Ia、B220、CD4、CD8单抗(终浓度均为10μg/ml)及补体(10：1稀释)，37C水浴45分钟去除T、B及Ia+细胞，洗两次后，以1×10⁶细胞/孔加入24孔板培养，加10ng/ml mGM-CSF、1ng/ml mIL-4，培养3天后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入新鲜RPMI1640完全培养基及mGM-CSF、mIL-4，继续培养3天后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，收集后置新培养瓶培养，3天后收集悬浮细胞即为富集的骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)。

收集上述培养至第六天的小鼠DC，用小鼠DC培养基(RPMI1640完全培养基，10ng/ml mGM-CSF、1ng/ml mIL-4)调整细胞浓度为2×10⁶细胞/ml浓度，分入24孔板，每孔1ml，孔数与需免疫的小鼠的只数相同，按照实验分组分别加入10μg/ml NY-ESO-2多肽，NY-ESO-2多肽，MAGE-A4多肽，OVA多肽，并设置相同孔数的未加任何刺激的DC作为空白对照组，48小时后收集细胞，弃培养基上清，PBS离心洗涤细胞两次以除去原培养基中存在的刺激物，最后用PBS调整细胞浓度为1×10⁶细胞/100μl浓度，共200μl(其中100μl为将来填充注射器死体积以保证免疫的细胞数)，随即用于免疫小鼠。

末次免疫7天后，处死各组小鼠，无菌操作摘取小鼠脾脏，以无菌PBS漂洗残血后，浸泡在RPMI1640培养基中，用无菌注射器针芯轻轻在400目钢网上研磨得到单细胞悬液，并通过钢网过滤去除大的组织块。滤过的单细胞悬液1000×g离心5分钟后，弃去培养基上清，悬浮在低渗的NH₄Cl溶液(0.15M NH₄Cl，1M KHCO₃，0.1mM Na₂EDTA，pH 7.2)中3分钟，破坏红细胞，然后用RPMI 1640培养基离心洗涤两遍。将去红细胞的小鼠脾细胞悬浮在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，计数。

上述方法取得的小鼠脾细胞悬浮在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，用LS180-MSI-H，LS180-MSS，两种细胞用丝裂霉素终浓度1mg/ml，37℃，5％CO₂ 孵育1h，去增殖后作为刺激细胞，终浓度10ug/ml的OVA多肽作为对照刺激组，调整刺激细胞浓度为2×10⁵/ml，然后将细胞悬液分别加入已含有反应细胞的检测孔中，100μl/孔，参照IFN-γELISPOT检测试剂盒说明书的方法检测分泌IFN-γ的T细胞集落。以上每一检测均设3个复孔。可见NY-ESO-2/2致敏的DC细胞对MSI-H肠癌中分泌IFN-γ的T细胞刺激作用更强，而MSS肠癌中则较差。

将LS180-MSI-H，LS180-MSS，T2细胞作为靶细胞，用生理盐水调整靶细胞浓度为4×10⁷/ml，500ul，加入CFSE，终浓度2.5uM，37℃，10min后加入1640培养基5ml终止反应，PBS清洗细胞三遍，调整靶细胞浓度2×10⁶/ml，加入96孔圆底板中，100ul/孔，取抗原刺激后的小鼠淋巴细胞作为效应细胞，按效靶比5:1、10:1、20:1加入淋巴细胞，过夜培养后，收集细胞，PBS清洗细胞三遍，200ul PBS重悬细胞，加入PI终浓度2ug/ml，采用流式技术分析CFSE-PI双阳性的细胞比例，以未加刺激细胞的靶细胞CFSE-PI双阳性的细胞比例为空白对照，计算CTL的杀死率，计算公式如下。(以上每个梯度检测均设三个副孔)

杀伤率％＝(实验组CFSE-PI双阳性的细胞％－空白对照％)/(1－空白对照％)。

实施例7 MSI-H细胞肿瘤抗原致敏DC体内抗肿瘤效应

6-8周龄的雌性裸鼠共40只，分为5组，每组8只，在每只小鼠的右侧腹部皮下一点接种体外培养扩增的活力良好的LS180-MSI-H肿瘤细胞，剂量为2×10⁶细胞/鼠。于上述裸鼠接种肿瘤细胞5天后进行。实验分组依据上述免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠的分组。如前所述经收集各组免疫小鼠的脾细胞，PBS调整浓度，尾静脉回输至荷瘤裸鼠体内，数量为1×10⁸细胞/200μl·鼠，回输3次，每次间隔一周。观察肿瘤生长，绘制肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线。如图5所示。

然而，采用相同的DC细胞对MSS却无法达到相同的抑瘤效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。