本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在水稻抗白叶枯病基因定位或水稻遗传育种中的用途、一种水稻抗白叶枯病基因定位方法、以及一种水稻育种方法。
背景技术：
水稻(Oryza sativa)白叶枯病是一种世界性的重要病害。它是一种维管束病害，在自然条件下，病菌通常由水孔或伤口侵入，沿叶脉产生白色病斑。白叶枯病发生时可导致水稻减产20％～30％，严重时甚至绝收。为保证水稻高产、稳产，人们主要采用两种防治技术，一是用化学防治方法，二是培育和种植抗病品种。由于化学防治成本高且污染环境，因此培育和种植抗病品种成为水稻育种的主要目标。
传统抗病育种是根据分离群体的表现和育种者的经验进行选择，通常受环境条件、显隐性关系、基因上位等因素的影响，费时、费力、不准确，从鉴定一个植物抗病种到培育出抗病良种需花费十多年时间，而病原菌一旦侵袭，其扩散速度要比育种速度快得多。
近年来生物技术的发展，尤其是分子标记技术的应用给水稻遗传育种带来了巨大变化。分子标记辅助选择为育种者提供了对目标性状进行选择的有效手段，它大大加速了育种进程，提高了育种选择效率，同时减少了盲目选择和人力、物力的大量浪费，展示出极其广阔的应用前景。
目前已鉴定的抗白叶枯病基因达30多个，来自长药野生稻(Oryza longistaminata)的广谱抗白叶枯病Xa21基因和普通野生稻O.rufipogon的全生育期抗白叶枯病Xa23基因备受关注。
目前，虽然已经定位了一些与水稻抗白叶枯病相关的基因和数量性状位点(quantitative trait locus,QTLs)，但由于水稻抗白叶枯病的遗传机制较复杂，仍然缺乏足够数量的与抗白叶枯病性相关的QTLs及分子标记。随着基因组学和生物信息的发展，通过基因组测序，开发与抗白叶枯病紧密连锁的结构变异(Structure variation,SV)标记，将为水稻的遗传研究及育种开辟新的思路和方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供一种可用于PCR扩增与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记的引物对。
本发明的另一目的是提供一种筛选水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记的方法，其特征在于：1)获得纯合型父本、母本基因组；2)分别测序获得父本、母本基因组序列；3)比较父本、母本基因组序列，获得差异位点；4)构建遗传群体并收集表型数据(抗白叶枯病)；5)对群体中的个体进行基因型分析；6)结合基因型和表型数据，将抗白叶枯病基因定位在基因组上；7)在靠近目标基因的区段选择候选的分子标记。对筛选的水稻抗白叶枯病分子标记进一步做多态性及稳定性鉴定：在筛选的分子标记的上下游设计引物，进行PCR扩增，通过条带的不同进行多态性判断；利用重组自交系进行稳定性验证。
本发明的目的还包括一种水稻抗白叶枯病紧密连锁的分子标记的检测方法，包括步骤：在分子标记的核苷酸序列的上下游设计引物；以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增；判断扩增产物中是否存在该分子标记。
本发明的目的还包括提供一种包括上述分子标记的重组载体，以及含有该重组载体的重组细胞。
本发明的再一目的是提供上述分子标记在水稻抗白叶枯病基因定位、检测以及水稻辅助育种中的用途以及上述分子标记的检测方法。
本发明的目的还包括提供一种包括使用上述分子标记的水稻抗白叶枯病基因的定位方法，和使用所述分子标记的水稻辅助育种方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记含有Seq ID No.1所示序列；优选的所述分子标记具有Seq ID No.1所示序列。
本发明还公开了一种扩增与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记的引物对，所述引物对的引物1含有Seq ID No.2所示序列，引物2含有Seq ID No.3所示序列；优选的所述引物1具有Seq ID No.2所示序列，引物2具有Seq ID No.3所示序列；
本发明公开了一种筛选权利要求水稻抗白叶枯病分子标记的方法，其特征在 于：1)获得纯合型父本、母本基因组；2)分别测序获得父本、母本基因组序列；3)比较父本、母本基因组系列，获得差异位点；4)构建遗传群体并收集表型数据(抗白叶枯病)；5)对群体中的个体进行基因型分析；6)结合基因型和表型数据，将抗白叶枯病基因(目标基因)定位在基因组上；7)在靠近目标基因的区段选择候选的分子标记。对筛选的水稻抗白叶枯病分子标记进一步做多态性及稳定性鉴定：在筛选的分子标记的上下游设计引物，进行PCR扩增，通过条带的不同进行多态性判断；利用重组自交系进行稳定性验证。为了进一步验证抗白叶枯病这种表型与分子标记间的对应关系，公开了水稻白叶枯病菌接种实验结果。本发明还公开了一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记是由上述的引物对以抗白叶枯病的水稻基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
本发明还公开了一种与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记检测方法，包括步骤：在分子标记Seq ID No.1的核苷酸序列上下游设计引物，以被检测水稻基因组DNA为模板进行扩增，利用相同的引物对扩增的结果中抗白叶枯病的水稻比不抗白叶枯病的扩增分子大192bp，此分子大小为分子标记的大小。利用优选的引物Seq ID No.2，Seq ID No.3扩增抗白叶枯病的水稻与不抗白叶枯病的水稻基因组，扩增产物的大小分别为793bp、601bp。
在本发明的一个实施方案中，公开了用3730测序仪对各扩增产物进行测序验证的方法，所以本领域技术人员可理解，为了检测Seq ID No.1分子标记，在进行PCR扩增后可用电泳检测也可利用测序的方法进行检测。本领域的技术人员可以理解，检测分子标记序列是否存在的方法不局限于PCR凝胶电泳、测序，荧光定量PCR等方法亦可进行目标序列检测。本领域的技术人员也可以理解，检测目标序列的引物设计不局限与给出的引物序列，在目标序列的上下游设计引物进行PCR扩增，能达到凝胶电泳检测、或者测序或者荧光定量PCR检测的目的即可。
本发明还公开了一种载体，其含有本发明的分子标记。所述载体可以是插入有本发明的分子标记的表达重组载体或者克隆重组载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以理解，含有分子标记的片段的大小随着引物设计位置的不同而不同，同时本领域技术人员可以理解，根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还公开了一种含有所述重组载体的重组细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的Seq ID No.1的5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于Seq ID No.1的一个位置上，以致该控制序列指导Seq ID No.1编码的多肽的产生。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段)为水稻基因组中Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的Seq ID No.1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是水稻基因组中的序列，优选的，为水稻基因组中Seq ID No.1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测抗白叶枯病的水稻基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增得到含有Seq ID No.1所示的序列。Seq ID No.1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。
本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用抗白叶枯病的水稻的基因组DNA作为模板，以上述引物对进行PCR扩增，得到的793bp扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化的步骤。本领域的技术人员可理解，含有分子标记的PCR产物大小随引物设计位置的改变而改变。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。
本发明还公开了所述的分子标记在水稻抗白叶枯病基因定位或检测中的用途。
本发明还公开了一种水稻抗白叶枯病基因定位的方法，所述方法包括使用本发明的分子标记的步骤。
本发明还公开了所述的分子标记在水稻辅助育种中的用途。
本发明还公开了一种水稻辅助育种方法，所述方法包括检测本发明的分子标记或用分子标记引物对进行检测的步骤。
本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选水稻是否含有抗白叶枯病 的基因。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该水稻辅助育种方法具有简便、快速、高通量的优点。
在本发明中，具体地，所述水稻为801(抗白叶枯病)、R15(不抗白叶枯病)、801和R15的杂交后代F1及F1代通过单粒传法得到的重组自交系RIL群体。
发明的有益效果
本发明提供了与水稻抗白叶枯病基因紧密连锁的分子标记，该分子标记将基因组DNA序列与水稻抗白叶枯病基因联系起来，有利于水稻分子标记辅助育种体系的建立；所述分子标记与水稻抗白叶枯病基因的遗传紧密连锁距离为0.3cM。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于水稻育种实践和资源及品种鉴定。
附图说明
图1：利用分子标记引物(Seq ID No.2和Seq ID No.3)对父母本和RIL群体188个水稻单株进行PCR扩增的扩增产物的部分电泳检测结果图。其中：
泳道1-5为重组自交系RIL群体中5株抗白叶枯病的水稻单株的PCR扩增产物；泳道7-11为重组自交系RIL群体中5株不抗白叶枯病的水稻单株的PCR扩增产物。泳道6为marker，其为2000bp DNA Ladder；其分子量包括：2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp、100bp。
术语
如本文所用，分子标记(Molecular Markers)是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布 鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1：水稻F2代分离群体的构建
父本：801，抗白叶枯病；
母本：R15，不抗白叶枯病。
父本和母本杂交得到F1代，F1代通过单粒传法得到188个重组自交系RIL株系(F7代)。
801、R15及F1、重组自交系水稻种子均可在深圳华大农业与循环经济科技有限公司购买。
实施例2：父母本以及F2代、RIL群体个体基因组DNA的提取
用CTAB法分别提取实施例1中的父母本及获得的RIL群体单株的基因组DNA，具体方法如下：
(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。
其中1.5×CTAB配方如下(1L)：
加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2mL)的巯基乙醇。
(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。
(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。
(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。
(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。
(6)将得到的父母本及获得的RIL群体单株的基因组DNA存于-20℃备用。
实施例3：水稻白叶枯病菌接种鉴定
选用湖南省水稻白叶枯病菌优势致病型IV型菌(由湖南杂交水稻研究中心赠送)为代表菌株。将菌株用胁本哲氏马铃薯半合成培养基28℃恒温下培养72小时，用无菌水洗下菌苔，用麦式比浊法将细菌菌悬液稀释至108～109细胞/亳升菌液。培养基配方：马铃薯300克，蔗糖15克，蛋白胨5克，Ca(NO3)2.4H2O 0.5克，Na2HPO4.12H2O 2.0克，琼脂粉16克，蒸馏水调至1000亳升。
在植株苗期采用人工剪叶接种法进行接种，接种后14-20d，待感病品种病情趋于稳定时调查，以病斑长度作为抗感反应参数。如下：在植株苗期采用人工剪叶接种法进行接种，接种后14～20d，待感病品种病情趋于稳定时调查，>12cm为感病，6～12cm为抗病，<6cm为高抗。
接种结果：双亲与RIL群体的抗病性表现。白叶枯病菌菌液接种20d后，父本801的平均病斑长度为4.3cm，对白叶枯病表现为抗性反应。母本R15的平均病斑长度达到22.4cm，是典型的感病反应。188个重组自交系接种后，其叶片的病斑长度从最短2.8cm至最长23.6cm，在群体内呈连续的正态分布，其平均值为6.13cm，双向的超亲分离极其明显，并且分布区间广泛，表现出数量性状的遗传特点。
根据接种结果将RIL群体分为抗白叶枯病和不抗白叶枯病单株。
实施例4：遗传图谱构建、基因定位和分子标记开发
(1)遗传图谱构建
针对实施例2中获得的RIL个体的基因组DNA，基于RAD-seq的基因分型技术(http://www.bioon.com.cn/server/show_product.asp？id＝12291)对RIL群体的个体进行基因分型，获得RIL群体的基因型数据。
用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，S Lincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992，通过参照将其全文并入本文)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。
(2)基因定位
针对实施例1中获得的RIL群体，将RIL群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，从而将水稻抗白叶枯病基因定位在遗传连锁图谱上。结果显示，水稻抗白叶 枯病基因定位在11号染色体20802924bp至20806518bp区间内，长度约为3594bp。
(3)分子标记开发
将父本和母本分别进行全基因组重测序(10X)，然后根据RAD-seq的测序结果，利用SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找父母本基因组片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。
结果，选择靠近水稻抗白叶枯病基因所在区段的标记OSblb-SV2(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)作为候选分子标记。
OSblb-SV2的核苷酸序列如下(192bp)：
AACGAAAGAGAGTGGTCCACAAGGTGCTTGTAAAGATACGATCACGATCAGAGATGAGCGACTGAGGTAATCCATGAAGTCGGTGAATATGTTGCATGTAAGCTTCAGCCACATCCAAAGCTGTGAAAGGATGACTCAAGGGAACAAAATGGTTGTATTTCGAAAATTTGTCAACCACCACAAGTATGCAAT(SEQ ID NO：1)。
实施例5：分子标记的稳定性验证
对实施例3中确定的水稻抗白叶枯病相关分子标记OSblb-SV2(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)进行验证，具体如下：
针对上述分子标记设计引物，引物序列如下所示：
正向引物：5’-GCATCTGCTCCCGTTCATGTA-3’(SEQ ID NO：2)；
反向引物：5’-CGCATATGGATTGGCAATAAC-3’(SEQ ID NO：3)。
利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。
具体地，以实施例2中提取的父本、母本、RIL群体单株的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，其中，
PCR反应体系如下：
PCR反应程序如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物经纯化后于4℃下保存。
接着，将各PCR扩增产物取部分进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。如图1中所示，抗白叶枯病的单株均扩增出793bp的条带，不抗白叶枯病的单株均扩增出601bp大小的条带。由此，证明该分子标记OSblb-SV2(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)与水稻抗白叶枯病性状紧密相关。
然后，利用3730测序仪对各扩增产物进行测序，结果，父本及RIL群体中抗白叶枯病的单株扩增条带，与母本及RIL群体中不抗白叶枯病的单株扩增条带相比增加了一些序列，该序列即为分子标记OSblb-SV2(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)。从而表明该分子标记与抗白叶枯病基因连锁遗传的稳定性。
候选分子标记具有多态性、与抗白叶枯病基因连锁遗传的稳定性，所以该候选分子标记可作为抗白叶枯病基因的分子标记使用。多态性指的是：分子标记在抗白叶枯和不抗白叶枯病水稻基因组中的序列不同，可以区分。
实施例6：分子标记的制备
以抗白叶枯病的父本801或F1自交系后代抗白叶枯病的单株基因组作为模板按照如下反应提交进行PCR扩增
PCR反应程序如下：
94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。
将扩增产物纯化，得到含有分子标记的核苷酸序列。纯化后进行测序，结果如SEQ ID NO：4所示。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子标记。
对制备的含分子标记的核苷酸片段的(含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的DNA片段)5’端和/或3’端可操作地连接有人工序列和/或控制序列，例如启动子、增强子、终止子、酶切位点、引物序列等等。其中，术语“可操作地”在本发明中定义为一种如下构象，在该构象中，控制序列例如启动子被适当地置于Seq ID No.1的一个位置上，以致该控制序列指导Seq ID No.1编码的多肽的产生。
GCATCTGCTCCCGTTCATGTAACCAGTCCAACAGATCCTTTGACTGACAAGCAGATGTAGCCGACAGACCAAAATAGCGAGGTTTGTGCCCATACAATACCTCAAATGGTGTAGTACCCAAAGCCGAATGGAATGATGTATTGTACCAATACTCAGCCAGAGCGAGCCACCGACTCCATTGAGAAGGACAAGCGTGAACAAAGCAACGAAGATAGGTTTCAAGACATTGATTGGCATGCTCCGTTTGTCCATCCGTTTGCGGGTGATAAGAAGAACTCATCCGCAATTGTGTGCCAGCCAAACGAAAGAGAGTGGTCCACAAGGTGCTTGTAAAGATACGATCACGATCAGAGATGAGCGACTGAGGTAATCCATGAAGTCGGTGAATATGTTGCATGTAAGCTTCAGCCACATCCAAAGCTGTGAAAGGATGACTCAAGGGAACAAAATGGTTGTATTTCGAAAATTTGTCAACCACCACAAGTATGCAATTGAAAGTGGCAGACCGGGGAAGTCCCTCAATGAAATCTAGAGAGACAATCTGCCAGGCATGTGCAGGGACAGGGAGTAGTTGGAGCATACCAGGGTATTTAACATGTTCAGGCTTGGCTTGTTGACAAACTGTGCAGGACTGAACATATTGAGTAATGGAAGCACGAAGTCGAGGCCAAGCAAACAAATGTTGAACACGCTGGTAGGTTACCTGAATACCAGAATGGCCACCCACTGCCGAGGAGTGTAAATTGGCCAGAATTTTGTGCTGTAGAGAAGTGTTATTGCCAATCCATATGCG(SEQ ID NO：4)
其中两端加粗部分为引物设计区段，中间加粗部分为分子标记的序列
实施例7：分子标记克隆
将实施例6中扩增获得的793bp的片段克隆到pMD18-T载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌JM109中，挑单克隆，培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，所述质粒即重组载体，采用M13通用引物(序列信息参考TaKaRa商品目录)对克隆片段进行测序，结果显示，重组载体中含有本发明的分子标记(Seq ID No.1)。上述克隆、转化、培养、质粒提取等步骤参考《分子克隆实验指南第三版》，黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。