本发明涉及合成生物学领域中的人工合成的microRNA簇及其构建方法与所用合成microRNA单元。
背景技术：
：：RNA干扰(RNAinteference，RNAi)是一种在真核生物中普遍存在的由双链RNA介导的特异性的基因沉默现象，其介导基因沉默的主要方式是通过与靶基因mRNA互补配对并使其降解或通过与靶基因mRNA非完美配对引起翻译阻遏。基于该现象发展出的技术就是RNAi技术。可以介导RNAi的小RNA分子或质粒载体包括siRNA、shRNA和合成microRNA(miRNA)。其中，microRNAs(miRNAs)是一类长度为18-26nt的小RNA分子，在转录后(post-transcription)基因表达调控中发挥着重要作用。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中，成熟miRNA的生物发生(biogenesis)过程是在细胞核和细胞质中完成的。首先,在细胞核内，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成原初miRNA(primarymiRNA,pri-miRNA)，然后由Drosha和DGCR8(DiGeorgesyndromechromosomalregion8)蛋白复合物加工成长度约为65nt的具发夹环结构的前体miRNA(precursormiRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA在运转蛋白Exoportin5的作用下，从细胞核运输到细胞质中，然后在Dicer酶的作用下被切割成约18–26nt的具有miRNA:miRNA*结构(miRNA:miRNA*duplex)的双链小RNA分子。随后，双链小RNA解链，单链的成熟的miRNA分子被释放并装载进入RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)复合体中，通过碱基互补配对的原则与靶向mRNA结合，介导mRNA降解或翻译阻遏。合成miRNA与siRNA、shRNA相比，具有明显的优势：1、可以使用不同类型的启动子进行表达，包括RNA聚合酶PolII依赖型的启动子(Pol-II启动子)和RNA聚合酶PolIII依赖型的启动子(Pol-III启动子)；2、能够使用诱导型启动子在时间水平和表达水平上进行RNAi控制；3、使用Pol-II启动子可以产生组织和发育特异性的RNAi；4、与天然miRNA簇类似，可以使用同一个启动子同时表达多个合成miRNA；5、使用Pol-II启动子可以表达指示合成miRNA表达水平的标记蛋白(荧光蛋白或抗性基因)；6、合成miRNA可以降低对靶细胞的毒性。然而，由于siRNA、shRNA和miRNA需要经过的加工过程不同，根据实验验证有效的siRNA或shRNA设计的合成miRNA并不一定具有较高的基因沉默效率。近年来，基于RNAi的治疗(RNAitherapeutics)逐渐被用于癌症，病毒感染和遗传障碍等疾病的研究上。研究发现，在慢病毒载体系统中，在同一载体上由多个Pol-III表达3-6个shRNA，将会引起严重的序列丢失。因此，基于RNAi进行多基因敲除并使其稳定表达是一个亟待解决的问题。技术实现要素：本发明所要解决的一个技术问题是如何提高成熟miRNA的表达量并且使成熟miRNA对靶基因mRNA具有较高的敲低(knockdown)效率。为了解决上述技术问题，本发明提供了合成miRNA单元(SyntheticmiRNAelement，SME)及其相关生物材料，该合成miRNA单元能产生高表达量的成熟miRNA并且使成熟miRNA具有相对固定的加工特征从而达到对靶基因mRNA具有较高敲低效率。本申请中的合成miRNA单元是人工合成的pri-miRNA，是相对天然pri-miRNA而言的。本发明所提供的合成miRNA单元，是人工合成的pri-miRNA，其核苷酸序列是SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或SEQIDNo.3。SEQIDNo.1-3中的N为A或U或C或G。SEQIDNo.1-3中，第29-49位是靶向靶基因mRNA的miRNA的反义序列，第69-87位是靶向靶基因mRNA的miRNA的正义序列。上述合成miRNA单元的相关生物材料也属于本发明的保护范围。上述合成miRNA单元的相关生物材料可为M1)-M20)中任一种：M1)编码所述合成miRNA单元的DNA分子；M2)含有M1)所述DNA分子的表达盒；M3)含有M1)所述DNA分子的重组载体；M4)含有M2)所述表达盒的重组载体；M5)含有M1)所述DNA分子的重组微生物；M6)含有M2)所述表达盒的重组微生物；M7)含有M3)所述重组载体的重组微生物；M8)含有M4)所述重组载体的重组微生物；M9)含有M1)所述DNA分子的人或动物的转基因细胞系；M10)含有M2)所述表达盒的人或动物的转基因细胞系；M11)含有M3)所述重组载体的人或动物的转基因细胞系；M12)含有M4)所述重组载体的人或动物的转基因细胞系；M13)含有M1)所述DNA分子的人或动物的转基因组织；M14)含有M2)所述表达盒的人或动物的转基因组织；M15)含有M3)所述重组载体的人或动物的转基因组织；M16)含有M4)所述重组载体的人或动物的转基因组织；M17)含有M1)所述核酸分子的人或动物的转基因器官；M18)含有M2)所述表达盒的人或动物的转基因器官；M19)含有M3)所述重组载体的人或动物的转基因器官；M20)含有M4)所述重组载体的人或动物的转基因器官。上述生物材料中，M2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达编码所述合成miRNA单元的DNA分子的DNA片段，该DNA片段不但可包括启动编码所述合成miRNA单元的DNA分子转录的启动子，还可包括终止编码所述合成miRNA单元的DNA分子基因转录的终止子。本发明所要解决的另一个技术问题是如何得到没有明显的位置效应并具有低的脱靶效应的合成miRNA簇(syntheticmiRNAcluster，SMC)。为解决该技术问题，本发明提供了合成miRNA簇。本发明所提供的合成miRNA簇(SMC)，是由X个合成miRNA单元串联而成的RNA分子，所述合成miRNA单元是人工合成的pri-miRNA，所述X为4-18的一个自然数，所述X个合成miRNA单元特异靶向1个或1个以上且不超过所述X个的位点；每个所述合成miRNA单元是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；SEQIDNo.1-4中，第29-49位是靶向靶基因mRNA的miRNA的反义序列，第69-87位是靶向靶基因mRNA的miRNA的正义序列。上述合成miRNA簇中，所述X个合成miRNA单元可直接串联，也可由一个以上接头(adaptor)串联。在进行Sanger测序时，可根据所述接头设计引物进行编码所述合成miRNA簇的DNA片段的序列测定。上述合成miRNA簇的相关生物材料也属于本发明的保护范围。所述合成miRNA簇的相关生物材料具体可为A1)-A20)中的至少一种：A1)编码所述合成miRNA簇的DNA分子；A2)含有A1)所述DNA分子的表达盒；A3)含有A1)所述DNA分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述DNA分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述DNA分子的人或动物的转基因细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的人或动物的转基因细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的人或动物的转基因细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的人或动物的转基因细胞系；A13)含有A1)所述DNA分子的人或动物的转基因组织；A14)含有A2)所述表达盒的人或动物的转基因组织；A15)含有A3)所述重组载体的人或动物的转基因组织；A16)含有A4)所述重组载体的人或动物的转基因组织；A17)含有A1)所述核酸分子的人或动物的转基因器官；A18)含有A2)所述表达盒的人或动物的转基因组织；A19)含有A3)所述重组载体的人或动物的转基因组织；A20)含有A4)所述重组载体的人或动物的转基因组织。上述合成miRNA簇的相关生物材料中，A2)所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述合成miRNA簇的DNA片段，具体可包括启动子和由所述启动子驱动的编码所述合成miRNA簇的DNA片段，所述启动子是依赖于RNA聚合酶II的组成型启动子或诱导型启动子。上述合成miRNA簇的相关生物材料中，A2)所述表达盒可含有RNA剪接供体位点(splicingdonorsite)的编码DNA和RNA剪接受体位点(splicingacceptorsite)的编码DNA，所述RNA剪接供体位点的编码DNA和所述RNA剪接受体位点的编码DNA位于编码所述合成miRNA簇的DNA片段的两侧，所述RNA剪接供体位点的编码DNA位于所述启动子和编码合成miRNA簇的DNA片段之间，所述RNA剪接受体位点的编码DNA位于编码合成miRNA簇的DNA片段的下游。上述合成miRNA簇的相关生物材料中，A2)所述表达盒可含有报告基因和真核生物抗性筛选标记基因，所述启动子还可以驱动包括报告基因和真核生物抗性筛选标记基因在内的多个目的基因(Geneofinterest)的共表达。上述合成miRNA簇的相关生物材料的A2)所述表达盒中，所述编码合成miRNA簇的DNA片段还可含有一个以上接头(adaptor)。在进行Sanger测序时，可根据所述接头设计引物进行所述编码合成miRNA簇的DNA片段的序列测定。可用现有的载体构建含有所表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述转基因动物细胞系、转基因动物组织和转基因动物器官均不包括繁殖材料。本发明提供了下述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体(携带编码所述合成miRNA簇的DNA分子的重组载体)的方法。第一种方法构建了名称为pSMC-E-X的所述合成miRNA簇的重组表达载体，pSMC-E-X携带的编码所述合成miRNA簇的DNA分子编码串联的4-6个合成miRNA单元。第二种方法构建了名称为pSMC-B-X的所述合成miRNA簇的重组表达载体，pSMC-B-X携带的编码所述合成miRNA簇的DNA分子编码串联的4-18个合成miRNA单元。本发明所提供的构建名称为pSMC-E-X的所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法，是利用Goldengate体外组装编码所述合成miRNA簇的DNA分子，所述合成miRNA簇中所述X为4-6中的一个自然数，所述构建方法包括：在同一个反应体系内，用名称为限制性核酸内切酶E的IIs型限制性内切酶切割pSMC-E，得到名称为E粘性末端pSMC线性载体的双链DNA片段，所述E粘性末端pSMC线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸；用所述限制性核酸内切酶E切割X种pri-miRNA基因载体，得到X种名称为E粘性末端pri-miRNA基因的双链DNA片段，所述X种E粘性末端pri-miRNA基因两端均具有4个游离未配对核苷酸；所述E粘性末端pSMC线性载体和所述X种E粘性末端pri-miRNA基因通过粘性末端互补配对连接得到名称为pSMC-E-X的载体，所述pSMC-E-X为所述合成miRNA簇的重组表达载体；所述pSMC-E含有启动子，所述启动子是依赖于RNA聚合酶II的组成型启动子或诱导型启动子，所述pSMC-E在所述启动子下游含有两个所述限制性核酸内切酶E位点；所述X种pri-miRNA基因载体中每种pri-miRNA基因载体均携带一个不含所述限制性核酸内切酶E位点和限制性核酸内切酶B位点的pri-miRNA基因，所述X种pri-miRNA基因载体所携带的所述X种pri-miRNA基因的序列不同；每个所述pri-miRNA基因编码的pri-miRNA是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；所述每种pri-miRNA基因载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，两个所述限制性核酸内切酶E位点分别位于所述pri-miRNA基因的上游和下游；所述每种pri-miRNA基因载体经所述限制性核酸内切酶E切割后得到两端具有粘性末端的含所述pri-miRNA基因的DNA片段；所述X为4-6中的一个自然数。本发明所提供的构建名称为pSMC-B-X的所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法，利用Goldengate体外组装编码所述合成miRNA簇的DNA分子，所述合成miRNA簇中所述X为4-18中的一个自然数，所述构建方法包括：在同一个反应体系内，用限制性核酸内切酶B切割Z种亚SMC载体和pSMC-B并用连接酶进行连接，得到名称为pSMC-B-X的载体，所述pSMC-B-X即为所述合成miRNA簇的重组表达载体；所述Z种亚SMC载体按照如下方法构建：用所述限制性核酸内切酶E酶切X种pri-miRNA基因载体得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的所述X种pri-miRNA的编码基因片段；用所述限制性核酸内切酶E酶切Y种接头载体，得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的Y种DNA测序接头片段；用所述限制性核酸内切酶E酶切Z种pMM载体，得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的所述Z种pMM线性载体；将所述X种pri-miRNA的编码基因片段、所述Y种DNA测序接头片段和所述Z种pMM线性载体通过两端的4个游离未配对核苷酸的互补配对连接得到所述Z种亚SMC载体；在同一个反应体系内，对不超过6种所述pri-miRNA基因载体、2种所述接头载体和1种所述pMM载体进行所述酶切和所述连接；所述Z种亚SMC载体中，每种亚SMC载体由一种所述pMM线性载体、不超过6种所述pri-miRNA的编码基因片段和2种所述DNA测序接头片段连接而成，所述pMM线性载体含有两个所述限制性核酸内切酶B位点，不超过6种所述pri-miRNA的编码基因片段连在一起形成pri-miRNA基因簇，2种所述DNA测序接头分别位于所述pri-miRNA基因簇的两侧，所述两个所述限制性核酸内切酶B位点分别位于所述DNA测序接头片段的两侧；所述限制性核酸内切酶B和所述限制性核酸内切酶E为识别位点不同的IIs型限制性内切酶；所述X种pri-miRNA基因载体中每种pri-miRNA基因载体均携带一种不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点的pri-miRNA基因，所述X种pri-miRNA基因载体所携带的所述X种pri-miRNA基因的序列不同；每种所述pri-miRNA基因编码的pri-miRNA是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；所述每种pri-miRNA基因载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，两个所述限制性核酸内切酶E位点分别位于所述pri-miRNA基因的上游和下游；所述每种pri-miRNA基因载体经所述限制性核酸内切酶E切割后得到两端具有粘性末端的含所述pri-miRNA基因的DNA片段；所述X为4-18中的一个自然数；所述Y种接头载体中，所述Y的取值取决于所述X，如所述X除以6的数值为整数，将所述X除以6的数值以A表示，Y等于2A；如所述X不能被6整除，将所述X除以6的数值中的个位数以B表示，Y等于2×(B+1)；所述Y种接头载体中每种接头载体均携带一种不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点的DNA测序接头，所述Y种接头载体所携带的DNA测序接头的序列不同，所述每种接头载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，所述两个限制性核酸内切酶E位点分别位于所述DNA测序接头的上游和下游；所述每种接头载体经所述限制性核酸内切酶E切割后得到具有两个粘性末端并含有所述DNA测序接头的DNA片段；所述Z种pMM载体中，所述Z的取值取决于所述X，如所述X除以6的数值为整数，将所述X除以6的数值以A表示，Z等于A；如所述X不能被6整除，将所述X除以6的数值中的个位数以B表示，Z等于B+1；每种所述pMM载体均含有两个所述限制性核酸内切酶B位点和两个所述限制性核酸内切酶E位点；所述pSMC-B含有启动子，所述启动子是依赖于RNA聚合酶II的组成型启动子或诱导型启动子，所述pSMC-B在所述启动子下游含有两个所述限制性核酸内切酶B位点。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，每种所述pri-miRNA基因载体可按照如下方法制备：A11)制备名称为B粘性末端pre-miRNA基因的两端均为粘性末端的双链DNA和名称为pMR的载体；所述B粘性末端pre-miRNA基因编码1个特异于一个靶位点的pre-miRNA，所述pre-miRNA为成熟miRNA的前体，所述B粘性末端pre-miRNA基因的两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸；所述B粘性末端pre-miRNA基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点；所述pMR含有两个所述限制性核酸内切酶B位点、两个所述限制性核酸内切酶E位点、5’侧翼编码区、3’侧翼编码区；两个所述限制性核酸内切酶B位点分别位于所述5’侧翼编码区的下游和所述3’侧翼编码区的上游；两个所述限制性核酸内切酶E位点分别位于所述5’侧翼编码区的上游和所述3’侧翼编码区的下游；所述5’侧翼编码区编码所述成熟miRNA对应的pri-miRNA的5’侧翼区，所述3’侧翼编码区编码所述成熟miRNA对应的pri-miRNA的3’侧翼区；所述5’侧翼编码区和所述3’侧翼编码区均不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性内切酶B位点；所述5’侧翼区和所述3’侧翼区为F1或F2或F3或F4：F1、所述5’侧翼区是SEQIDNo.1的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.1的第88-131位所示的RNA；F2、所述5’侧翼区是SEQIDNo.2的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.2的第88-130位所示的RNA；F3、所述5’侧翼区是SEQIDNo.3的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.3的第88-130位所示的RNA；F4、所述5’侧翼区是SEQIDNo.4的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.4的第88-130位所示的RNA；A12)用所述限制性核酸内切酶B切割所述pMR，得到名称为B粘性末端pMR线性载体的双链DNA片段，所述B粘性末端pMR线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，所述B粘性末端pMR线性载体和所述B粘性末端pre-miRNA基因通过粘性末端互补配对连接得到含有一个pri-miRNA的编码基因的一种pri-miRNA基因载体，所述pri-miRNA基因载体含有两个所述限制性核酸内切酶E位点，所述一个pri-miRNA的编码基因位于两个所述限制性核酸内切酶E位点之间；所述一个pri-miRNA的编码基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点；所述限制性核酸内切酶B和所述限制性核酸内切酶E为识别位点不同的IIs型限制性内切酶。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，每种所述接头载体按照如下方法制备：B1)提供名称为B粘性末端DNA测序接头的两端均为粘性末端的双链DNA和名称为pAD的载体；所述B粘性末端DNA测序接头含有一个DNA测序接头，所述B粘性末端DNA测序接头的两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸；所述B粘性末端DNA测序接头不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点；B2)所述pAD含有所述两个限制性核酸内切酶B位点和所述两个限制性核酸内切酶E位点；用所述限制性核酸内切酶B切割所述pAD，产生名称为pAD线性载体的双链DNA片段，所述pAD线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，所述pAD线性载体和所述B粘性末端DNA测序接头通过粘性末端互补配对连接得到含有一个DNA测序接头的一种接头载体，所述接头载体含有所述两个限制性核酸内切酶E位点，所述一个DNA测序接头位于所述两个限制性核酸内切酶E位点之间；所述一个DNA测序接头不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，所述限制性核酸内切酶B为BsaI或Esp3I(BsmBI)，所述限制性核酸内切酶E为Esp3I(BsmBI)或BsaI。本申请中所述限制性核酸内切酶B位点包括所述限制性核酸内切酶B的识别序列和切割序列，如所述限制性核酸内切酶B为BsaI，所述限制性核酸内切酶B位点为其中，灰色斜体N表示切割序列。本申请中所述限制性核酸内切酶E位点包括所述限制性核酸内切酶E的识别序列和切割序列，如所述限制性核酸内切酶E为Esp3I，所述限制性核酸内切酶E位点为其中，灰色斜体N表示切割序列。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，所述pMR为PR1、PR2或PR3的载体：PR1、所述pMR含有如下两个DNA片段：名称为E位点-5’侧翼-B位点的DNA片段和名称为B位点-3’侧翼-E位点的DNA片段；所述E位点-5’侧翼-B位点是45bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为所述限制性核酸内切酶E位点，第12bp-39bp为所述5’侧翼编码区，第35bp-45bp为所述限制性核酸内切酶B位点；所述B位点-3’侧翼-E位点是62bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为所述限制性核酸内切酶B位点，第8bp-51bp为所述3’侧翼编码区，第52bp-62bp为所述限制性核酸内切酶E位点；PR2、所述pMR含有名称为A1标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因；PR3、所述pMR含有所述E位点-5’侧翼-B位点、所述B位点-3’侧翼-E位点和所述A1标记基因。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，为了便于筛选转化子，所述pMR含有一个ccdB致死基因，所述ccdB致死基因位于两个所述限制性核酸内切酶B位点中间；所述ccdB致死基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点。所述pMR中，所述E位点-5’侧翼-B位点的核苷酸序列可为5’-cgtctcnnnnnctggaggcttgctgaaggctgtatgctggagacc-3’，其中n为a或t或c或g；所述B位点-3’侧翼-E位点的核苷酸序列可为5’ggtctcncaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcnnnnngagacg-3’，其中n为a或t或c或g。所述E位点-5’侧翼-B位点的核苷酸序列具体可为5’-cgtctcccatgctggaggcttgctgaaggctgtatgctggagacc-3’，所述B位点-3’侧翼-E位点的核苷酸序列具体可为5’-ggtctcacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcggaccgagacg-3’。所述A1标记基因可为抗生素抗性基因，如四环素抗性基因TetR。所述pMR具体可为表1中的pMR1、pMR2、pMR3、pMR4、pMR5、pMR6、pMR7、pMR8、pMR9、pMR10和pMR11这十一种载体中的至少一种。所述pMR2是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggac-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-ccag-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR3是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ccag-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-ggcg-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR4是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggcg-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgca-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR5是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-tgca-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-cggt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR6是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-cggt-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR7是将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR8是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggac-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR9是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ccag-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR10是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggcg-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。所述pMR11是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-tgca-3’，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，所述接头在进行Sanger测序时，可根据所述接头设计引物进行编码所述合成miRNA簇的DNA片段的序列测定。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，所述pAD为PA1或PA2或PA3的载体：PA1、所述pAD含有如下两个DNA片段：名称为E位点-B位点的DNA片段和名称为B位点-E位点的DNA片段；所述E位点-B位点是22bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为Esp3I(BsmBI)位点，第12-22bp为BsaI位点；所述B位点-E位点是22bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为BsaI位点，第12-22bp为所述Esp3I(BsmBI)位点。PA2、所述pAD含有名称为A2标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因；PA3、所述pAD含有所述E位点-B位点和所述B位点-E位点和所述A2标记基因。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，为了便于筛选转化子，所述pAD含有一个ccdB致死基因，所述ccdB致死基因位于两个所述限制性核酸内切酶B位点中间；所述ccdB致死基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点。所述pAD中，所述E位点-B位点的核苷酸序列可为5’-cgtctcnnnnnnnnnngagacc-3’，其中n为a或t或c或g；所述B位点-E位点的核苷酸序列可为5’-ggtctcnnnnnnnnnngagacg-3’，其中n为a或t或c或g。所述A2标记基因可为抗生素抗性基因，如四环素抗性基因TetR。所述E位点-B位点的核苷酸序列具体可为5’-cgtctcgctattgctggagacc-3’；所述B位点-E位点的核苷酸序列具体可为5’-ggtctcacaggcatgggagacg-3’。所述pAD具体可为表1中的pAD1和/或pAD2和/或pAD3和/或pAD4和/或pAD5和/或pAD6。所述pAD2是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-tgtt-3’，将pAD1的第2468-2471位的5’-catg-3’突变为5’-gaaa-3’，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。所述pAD3是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-gaaa-3’，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。所述pAD4是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-tgtt-3’，将pAD1的第2468-2471位的5’-catg-3’突变为5’-gctc-3’，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。所述pAD5是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-gctc-3’，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。所述pAD6是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-tgtt-3’，将pAD1的第2468-2471位的5’-catg-3’突变为5’-tcga-3’，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，所述pMM为下述PM1或PM2或PM3的载体：PM1、所述pMM含有如下两个DNA片段：名称为上游B位点-上游E位点的DNA片段和名称为下游E位点-下游B位点的DNA片段；所述上游B位点-上游E位点是18bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为所述限制性核酸内切酶B位点，第8-18bp为所述限制性核酸内切酶E位点；所述下游E位点-下游B位点是18bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为所述限制性核酸内切酶E位点，第8-18bp为所述限制性核酸内切酶B位点；PM2、所述pMM含有名称为B标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因，所述B标记基因不同于所述A1标记基因和所述A2标记基因；PM3、所述pMM含有所述上游B位点-上游E位点、所述下游E位点-下游B位点和所述B标记基因。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，为了便于筛选转化子，所述pMM含有一个ccdB致死基因，所述ccdB致死基因位于两个所述限制性核酸内切酶E位点中间；所述ccdB致死基因不含所述限制性核酸内切酶E位点和所述限制性核酸内切酶B位点。所述pMM中，所述上游B位点-上游E位点的核苷酸序列为5’-ggtctcnnnnnngagacg-3’,其中n为a或t或c或g；下游E位点-下游B位点的核苷酸序列为5’-cgtctcnnnnnngagacc-3’,其中n为a或t或c或g。所述B标记基因可为抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因KanR。所述上游B位点-上游E位点的核苷酸序列具体可为5’-ggtctctctatggagacg-3’，所述下游E位点-下游B位点的核苷酸序列具体可为5’-cgtctcggaaatgagacc-3’。所述pMM具体可为表1中的pMM1、pMM2、pMM3、pMM4和pMM5这5种载体中的至少一种。pMM2-pMM5与pMM1的区别仅在于上游B位点-上游E位点和下游E位点-下游B位点不同，其它序列均相同。所述pMM2是将pMM1的上游B位点-上游E位点突变为5’-ggtctccgaaaggagacg-3’，将pMM1的下游E位点-下游B位点突变为5’-cgtctcggctctgagacc-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。所述pMM3是将pMM1的上游B位点-上游E位点突变为5’-ggtctctgctcggagacg-3’，将pMM1的下游E位点-下游B位点突变为5’-cgtctcgtcgatgagacc-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。所述pMM4是将pMM1的上游B位点-上游E位点突变为5’-ggtctccgaaaggagacg-3’，将pMM1的下游E位点-下游B位点突变为5’-cgtctcgtcgatgagacc-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。所述pMM5是将pMM1的下游E位点-下游B位点突变为5’-cgtctcgtcgatgagacc-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。上述两种构建所述合成miRNA簇的重组表达载体的方法中，所述pSMC-B可为PB1、PB2或PB3的载体：PB1、所述pSMC-B含有名称为C标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因；所述C标记基因不同于所述B标记基因；PB2、所述pSMC-B在所述启动子下游含有RNA剪接供体位点的编码DNA和RNA剪接受体位点的编码DNA，所述RNA剪接供体位点的编码DNA位于所述启动子和两个所述限制性核酸内切酶B位点中位于上游的限制性核酸内切酶B位点之间，所述RNA剪接受体位点的编码DNA位于两个所述限制性核酸内切酶B位点中位于下游的限制性核酸内切酶B位点的下游；PB3、pZD-SMC-B、pLV-SMC-B、pB-SMC-B或pT2-SMC-B；所述pSMC-E载体为PE1、PE2或PE3的载体：PE1、所述pSMC-E含有所述C标记基因；PE2、所述pSMC-E在所述启动子下游含有RNA剪接供体位点的编码DNA和RNA剪接受体位点的编码DNA，所述RNA剪接供体位点的编码DNA位于所述启动子和两个所述限制性核酸内切酶E位点中位于上游的限制性核酸内切酶E位点之间，所述RNA剪接受体位点的编码DNA位于两个所述限制性核酸内切酶E位点中位于下游的限制性核酸内切酶E位点的下游；PE3、所述pSMC-E为所述pZD-SMC-E、pLV-SMC-E、pB-SMC-E或pT2-SMC-E。其中，pSMC-B具体可为表1的pZD-SMC-B、pLV-SMC-B、pB-SMC-B或pT2-SMC-B。所述pZD-SMC-B、pLV-SMC-B、pB-SMC-B或pT2-SMC-B中的所述C标记基因可为AmpR(氨苄霉素抗性基因)。本发明还提供了用于制备所述合成miRNA簇或所述合成miRNA簇的重组表达载体的成套产品，为C1或C2：所述C1包括C11、C12、C13、C14和C15：所述C11为所述限制性核酸内切酶B和所述限制性核酸内切酶E；所述C12为所述pSMC-B；所述C13为C131或C132，所述C131为所述X种pri-miRNA基因载体，所述C132为所述pMR和所述B粘性末端pre-miRNA基因；所述C14为C141或C142，所述C141为所述Y种接头载体，所述C142为所述B粘性末端DNA测序接头和所述pAD；所述C15为所述Z种pMM载体；所述C2包括C21、C21和C23：所述C21为所述方法中所述限制性核酸内切酶B和所述限制性核酸内切酶E；所述C22为C221或C222，所述C221为所述X种pri-miRNA基因载体，所述C222为所述pMR和所述B粘性末端pre-miRNA基因；所述C23为所述pSMC-E。本发明还提供了使所述合成miRNA簇的编码DNA整合入哺乳动物细胞的方法。本发明所提供的使所述合成miRNA簇的编码DNA整合入哺乳动物细胞的方法，包括通过转座子系统(PBase转座酶与piggyBac系统)或核酸酶系统(CRISPR/Cas9)或慢病毒系统将所述合成miRNA簇的编码DNA整合入哺乳动物细胞。上述方法中，所述哺乳动物细胞可为体外培养的哺乳动物细胞。本发明通过优化miRNA转录本(pri-miRNA)茎环结构的序列，得到了较高成熟miRNA的表达量并且使成熟miRNA对靶基因mRNA具有较高敲低效率的合成miRNA单元(SyntheticmiRNAelement，SME)。本发明基于该合成miRNA单元，还研发了没有明显的位置效应并降低脱靶效应的合成miRNA簇。由于该合成miRNA簇中存在重复序列，本发明还研发了可以使所述合成miRNA簇的编码DNA整合入宿主细胞的载体系统。本发明为开发多基因共敲低技术的载体工具提供扎实的实验证据，发展出进行多基因间相互作用研究的高效的实验方法。附图说明图1.基于天然的鼠pri-miR-155的合成miRNA前体(SyntheticmiRNAprecursor，)pri-miRNA的设计与优化。a、基于鼠pri-miR-155的合成miRNA前体pri-miRNA的结构示意图。其中黑色字母表示侧翼区序列，深灰色字母N表示反义链(5p)序列，浅灰色字母N表示正义链(3p)序列，黑色斜体字母表示末端环，黑色圆圈表示5’起点，灰色圆圈表示3’终点。在设计时，期待的成熟miRNA序列是从反义链5p+1位点到5p+21，其中起始4个核苷酸的GC含量低于末端4个核苷酸的GC含量。下同。b、基于鼠pri-miR-155的合成miRNA前体pri-miRNA的优化与成熟示意图。original表示的是使用的骨架为天然的鼠pri-miR-155的侧翼序列和末端环的SME，M1-M13为进行不同部位的序列改变的合成miRNA前体。深灰色箭头表示来源于反义链的所示位置的成熟miRNA的比例，浅灰色箭头表示来源于正义链的所示位置的成熟miRNA的比例，下同。c、荧光报告实验检测不同的合成miRNA前体的敲低效率。将pZD-miR-FF8和pri-miRNA的表达载体共转染HEK293细胞48h后，通过流失细胞仪检测荧光基因的表达情况。每个数据块代表不同合成miRNA前体所产生的miR-FF3的敲低效率抑制百分比，为三次独立流式细胞实验结果的均值±标准差，图中从左到右的数据块(柱)分别为pZD-hEF1α-mKate2-4xTarget^FF3和pZD-hEF1α-EBFP2和下述依次的一种载体共转染HEK293细胞的结果：pZD-original、pZD-M1、pZD-M2、pZD-M3、pZD-M4、pZD-M5、pZD-M6、pZD-M7、pZD-M8、pZD-M9、pZD-M10、pZD-M11、pZD-M12、pZD-M13和pZD-miR-NC。d、使用小RNA测序技术检测不同合成miRNA前体的成熟方式。使用miR-FF8为实验内参。左上图，不同合成miRNA前体产生的期待成熟miRNA的相对表达量。Log2(期待的成熟miRNA)＝log2(起始于5p+1位的成熟miRNA的测序读数/miR-FF8的所有的成熟miRNA的测序读数)；起始位置为5p+1(右上图)，5p+2(左下图)和3p-1(右下图)的成熟miRNA的长度分布示意图。每个数据块代表每种合成miRNA前体产生的成熟miRNA的长度分布，每个颜色对应的长度如右侧的标尺所示，每种长度的百分比的计算方法为：所示长度的成熟miRNA的测序读数除以所示起始位置的所有成熟miRNA的测序读数。下同。其中，M13在左下图中因为只有一个有效测序读数而被舍弃。图中，ori、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12和M13分别表示pZD-miR-FF8和下述依次的一种载体共转染HEK293细胞的结果：pZD-original、pZD-M1、pZD-M2、pZD-M3、pZD-M4、pZD-M5、pZD-M6、pZD-M7、pZD-M8、pZD-M9、pZD-M10、pZD-M11、pZD-M12和pZD-M13。图2.基于鼠pri-miR-155的合成miRNA前体的成熟特征。a、使用小RNA测序技术检测18种合成miRNA的成熟特征的示意图。计算方法与图例同图1中a，为了简化表示，黑点代表剩余的pri-miRNA-155中的侧翼序列。b、起始于5p+1位点(左图)和3p-1位点的成熟miRNA的长度分布示意图。图中从左到右的数据块(柱)分别为pZD-miR-FF8和pZD-miR-N共转染HEK293细胞的结果：其中N依次为FF3，FF4，FF5，FF6，FF7，FF8，LZ1，LZ3，LZ4，LZ5，LZ6，RR1，RR2，RR3，RR4，RR5，RR6，RR8，RR9，RR10，RR11，RR12，RR13，RR14。c、茎长度为19-nt和21-nt的合成miRNA前体的成熟方式的比较示意图。图例同图1b。d、不同茎长度和起始位点的成熟miRNA的长度分布示意图。左图为茎长度19nt的起始位点5p+1的长度分布图，中图为茎长度21nt的起始位点5p+1的长度分布图，右图为茎长度21nt的起始位点5p+3的长度分布图。e、在HEK293细胞中使用不同表达系统的合成miRNA前体的成熟方式的异同示意图。左图表示同一合成miRNA在不同表达系统中的成熟体的起始位点的比例的异同；中图表示同一合成miRNA在不同表达系统中的起始于5p+1位点的长度分布的异同；右图表示同一合成miRNA在不同表达系统中的起始于3p-1位点的长度分布的异同。每个数据块代表所示起始位点或每种长度的百分比。图中，MiR-FF3,MiR-FF4,MiR-LZ1,MiR-RR4,MiR-RR5,MiR-RR6,MiR-LZ4,MiR-LZ5,MiR-LZ6,MiR-FF6,MiR-FF7,MiR-FF8,MiR-RR11,MiR-RR1,MiR-RR2,MiR-RR8,MiR-RR12,MiR-LZ3,MiR-FF5,MiR-RR3,MiR-RR9,MiR-RR10,MiR-RR13,MiR-RR14,MiR-RR9L,MiR-RR10L,MiR-RR11L,MiR-RR12L,MiR-RR13L和MiR-RR14L分别表示pZD-miR-FF8和pZD-miR-N共转染HEK293细胞的结果：其中N依次为：pZD-miR-N，其中N＝FF3,FF4,LZ1,RR4,RR5,RR6,LZ4,LZ5,LZ6,FF6,FF7,FF8,RR11,RR1,RR2,RR8,RR12,LZ3,FF5,RR3,RR9,RR10,RR13,RR14,RR9L,RR10L,RR11L,RR12L,RR13L或RR14L。图3.含有18个SME的合成miRNA簇(SMC)的组装示意图。该方法分为三步，第一步由两部分组成，分别为将化学合成的靶向不同的特异基因的合成miRNA的oligo插入至不同的pMR载体获得pri-miRNA基因载体和将接头序列连接进入pAD载体得到接头载体；第二步是将1-6个pri-miRNA基因和合适的接头载体根据GoldenGate载体产生的粘性末端，按顺序与合适的pMM载体组装成亚SMC载体；第三步为通过一步“酶切-连接”构建最终的包含18个SME的载体。其中，发卡状结构表示合成miRNA前体(pre-miRNA)；含有B的圆圈，BsaI位点；含有的E圆圈，Esp3I位点；含有数字或字母的方块，限制性内切酶BsaI或Esp3I酶切产生的粘性末端；含有5’或3’的方块分别为5’侧翼序列和3’侧翼序列；pMR，miRNA前体载体；pAD1-AD1和pAD2-AD2，接头载体；pMM，中间载体；pSMC，SMC载体；TetR，四环素抗性基因；KanR，卡那霉素抗性基因；AmpR，氨苄霉素抗性基因；灰色大箭头，人EF1α启动子；GOI(geneofinterest)共表达的目的基因；灰色三角形，mRNA剪切的供点位置；黑色三角形表示mRNA剪切的受点位置，下同。图4.合成miRNA簇的特性测试。a和b、按照图9中所示的转染量在HEK293细胞进行共转染实验，转染后48小时，使用流式细胞仪进行定量检测。每个数据块代表来自三次独立的实验的平均值±标准误差。HEF1α，人延伸因子1α启动子；CMV，组成型巨细胞病毒启动子。a、合成miRNA前体的数目对敲低效率的影响。左图为基于荧光报告系统的检测示意图。右上图为使用定量PCR技术测试特定合成miRNAmiR-FF3和miR-FF5的表达，横坐标中的数字代表合成miRNA簇中合成miRNA前体的数目，其中1和1’分别代表只表达miR-FF3和miR-FF5。深色数据块表示miR-FF3表达量，浅色数据块表示miR-FF5表达量。右下图为使用报告基因系统测试特定合成miRNAmiR-FF3和miR-FF5的敲低效率。b、不同数目的合成miRNA前体对敲低效率和脱靶效应的影响。左图为实验设计示意图。右上图为miR-FF3的靶序列和脱靶序列，右下图中的灰色线和黑色线分别表示敲低效率和脱靶效率的强度。c、上图为含有相同合成miRNA前体数目但排布不同的合成miRNA簇的结构示意图。下图为转染48小时后使用定量RT-PCR技术检测所示的合成miRNA的相对表达量。实验结果是自三次独立的实验的平均值±标准误差。d、起始于5p+1的成熟miRNA的百分比在合成miRNA前体表达载体和不同合成miRNA簇表达载体中的差异。散点图表示同一合成miRNA的起始位置为5p+1的成熟miRNA的分布情况。热度图表示合成miRNA的起始位置为5p+1的成熟miRNA的分布的差异程度。矩阵中每个方块代表相应对合成miRNA前体表达载体、不同合成miRNA簇表达载体的百分比进行成对t-test进行显著性检验的结果。e、合成miRNAmiR-FF4和miR-RR1的加工情况的示意图。黑色和灰色箭头代表起始于5p+1位点和3p-1位点的成熟miRNA的百分比。图5.位置对合成miRNA簇中成熟miRNA长度分布的影响。起始位置为5p+1的成熟miRNA的长度分布在每对合成miRNA簇中a、6F和6R，b、12F和12R，c、18F和18R的差异。每个数据块代表每种长度的百分比，其中灰色数据块代表F，黑色数据块代表R。图6.使用不同整合系统对合成miRNA簇的进行整合实验。a、不同整合系统所使用的SMC载体的示意图。pB,piggyBac转座子表达载体；pT2,CRISPR/Cas9表达载体；pLV,慢病毒表达载体。b、CRISPR/Cas9基于非同源重组依赖的DNA修复进行整合的示意图。选择的特异性位点是位于PPP1R12C基因座的AAVS整合的热点区，放大区域中的灰色字母代表gRNA识别的特异性序列，灰色粗体字母是gRNA识别的PAM序列。c、使用不同载体系统进行合成miRNA簇的整合情况。M为FastDNAladder，数字代表合成miRNA前体的数目，NC为HEK293细胞株。d、含有不同数目的合成miRNA前体的合成miRNA簇表达质粒在有无转座酶pBase(左图)和cas9蛋白(右图)时的荧光表达随时间变化情况。每个小图表示含有特定数目的合成miRNA簇，黑色线表示存在转座酶pBase或cas9蛋白，灰色线表示不存在转座酶pBase或cas9蛋白。图7.pre-miR-A基因至pre-miR-R基因、miR-A靶位点至miR-R靶位点、AD1-AD6的序列。图8.构建由1-18个合成miRNA单元连接而成的合成miRNA簇的表达载体载体所需要的载体组合。图9.各转染实验中质粒加入量。定义本申请中的合成miRNA单元(SyntheticmiRNAelement，SME)是一种人工合成的pri-miRNA，是相对天然pri-miRNA而言的。本申请中的合成miRNA(SyntheticmiRNA)是一种人工合成的miRNA，是相对天然miRNA而言的。本申请中的选择标记基因的产物能使转化细胞产生一种选择压力，致使未转化的细胞在施加选择剂条件下不能生长，而转化细胞对该选择剂具有抗性，可以继续存活。所述选择剂可为抗生素。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体如下：1、材料1.1下述实施例中的pZD-hEF1α-mKate2-4xTarget^FF3是将pCAG-mKate2(NCBIaccessionnumber：KM486815.1，updatedate为Dec16,201408:19PM)中4253-5908位的CAG启动子为替换为hEF1α启动子(序列见表1中pZD的45-1218位)，6715-6780位替换为如下序列所示的DNA片段，保持其他序列不变得到的载体：5’-AAACGATATGGGCTGAATACAATACCAAACGATATGGGCTGAATACAATACCAAACGATATGGGCTGAATACAATACCAAACGATATGGGCTGAATACAATACAAGCTTGGTGGCGGCTCA-3’。1.2下述实施例中的pZD-hEF1α-EBFP2是将pCAG-EBFP2(NCBIaccessionnumber：KM486812.1，updatedate为Dec16,201408:19PM)中4253-5908位的CAG启动子为替换为hEF1α启动子(序列见表1中pZD的45-1218位),保持其他序列不变得到的载体。1.3下述实施例中的pZD-hEF1α-TagBFP-4xTarget^FF5，含有hEF1α启动子(序列见表1中pZD的45-1218位)、TagBFP-4xTarget^FF5(来自pENTR_L1-TagBFP-FF5_L2)。pZD-hEF1α-TagBFP-4xTarget^FF5是由pZDonor_1-GTW-2,pENTR_L4-hEF1α_L1和pENTR_L1-TagBFP-FF5_L2通过GatewayLR反应得到，该三种质粒见参考文献Yuan,Y.etal.Model-guidedquantitativeanalysisofmicroRNA-mediatedregulationoncompetingendogenousRNAsusingasyntheticgenecircuit.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences112,3158-3163(2015)。公众可从清华大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。1.4下述实施例中的pCMV-iRFP(Yuan,Y.etal.Model-guidedquantitativeanalysisofmicroRNA-mediatedregulationoncompetingendogenousRNAsusingasyntheticgenecircuit.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences112,3158-3163(2015))公众可从清华大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。1.5下述实施例中的pDT7004(Li,Y.etal.ModularconstructionofmammaliangenecircuitsusingTALEtranscriptionalrepressors.Naturechemicalbiology11,207-213(2015))公众可从清华大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。1.6下述实施例中的pZD-hEF1α-mKate2-1xTarget^multiple是将pCAG-mKate2(NCBIaccessionnumber：KM486815.1，updatedate为Dec16,201408:19PM)中4253-5908位的CAG启动子为替换为hEF1α启动子(序列见表1中pZD的45-1218位)，6715-6780位替换为如下序列所示的DNA片段，保持其他序列不变得到的载体：5’-CGATATGGGCTGAATACAATACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAAGCACTCTGATTTGACAATTAACACTTACGCTGAGTACTTCGACGATGTACACGTTCGTCACATCAGTAGCGCGGTGTATTATACCTCGAGGACTACACAAATCAGCGATTTGCCTTTCGGCGGTGAAATTATGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGAAGCCAATATTGAAACCCACGAAGCTTGCGACATGTTGTGCCACATATGCCAAGAAGTTTCCTAATACTGGCCAGATGTAAACAAATGAAGCGAGTTCTCAAAAATGAACACTCGTGAAATCCCGTTAGTAAGGTGAAGTTCGTCGTCCAACAGAATTCGCAGCATATCTTGAACCATTCGGCCTGATATTGAAGAAGATAGCTGCAGTCGAGAACGCATGGTGAACTTCTTAATTTAACGGACGCGGCCTCTTCTTATTTAACCGGCCAGGATTCTTTTCCAATAACGGCCATGATTGGGGTGCTTGTAACGGCATCTGGTAATGGTTCTTAAACGCCAGTAGCGCGGTGTATTATCCCGGGATCCACCGGA-3’。1.7下述实施例中的pZD-hEF1α-EBFP2-4xTarget^FF3-mis是将pCAG-EBFP2(NCBIaccessionnumber：KM486812.1，updatedate为Dec16,201408:19PM)中4253-5908位的CAG启动子为替换为hEF1α启动子(序列见表1中pZD的45-1218位)，6724-6727位替换为如下序列所示的DNA片段，保持其他序列不变得到的载体：5’-TGTAATAGCGAGATCGCCTGAATACAATACGAGATCGCCTGAATACAATACGAGATCGCCTGAATACAATACGAGATCGCCTGAATACAATAACTAGTTAAT-3’。1.8下述实施例中的Pbase(CAGG-PBase)(Wang,W.etal.ChromosomaltranspositionofPiggyBacinmouseembryonicstemcells.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences105,9290-9295(2008))公众可从清华大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。1.9下述实施例中的pCMV-dR8.2dvpr为addgene公司产品(http://www.addgene.org/8455/)。2.0下述实施例中的pCMV-VSV-G为addgene公司产品(http://www.addgene.org/8454/)。2.1下述实施例中的pZD-CAG-Cas9是将pCAG-EBFP2(NCBIaccessionnumber：KM486812.1，updatedate为Dec16,201408:19PM)中5998-6717位的EBFP2基因为替换为Cas9基因(序列见表1),保持其他序列不变得到的载体。2.2下述实施例中的pgRNA-T2是将pMR1的1765-2530位替换为如下序列所示的DNA片段，保持其他序列不变得到的载体：5’-AGAATTCGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGGCCACTAGGGACAGGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTAAGCTT-3’。下述实施例中涉及的质粒、基因和DNA的序列如表1：表1、2、实验方法2.1细胞培养与细胞转染HEK293(293-H)细胞系采购自Invitrogen公司。HEK293细胞培养在高糖DMEM完全培养基内(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM)，4.5g/L葡萄糖，0.045units/mL青霉素和0.045g/mL链霉素以及10％FBS(购自Invitrogen公司))，温度37℃，湿度100％，CO2浓度5％。对于细胞系转染实验，取24孔板(Falcon公司)，向每孔中加入0.5mL含约7.5×104个HEK293细胞的高糖DMEM培养基培养24小时。在转染前，换液，加入新的DMEM完全培养基。根据图9中按手册描述使用Attractene转染试剂(Qiagen公司)或使用LipofectamineLTX(Lifetechnologies公司)，接下来将介绍转染方案。简单来说，当使用Attractene时，将DNA按量混合后加入1.5μLAttractene，室温静置15分钟，之后加入到细胞内。当使用LipofectamineLTX时，首先将DNA按量混合后加入适量Plusreagent后室温静置5分钟，之后加入1.25μLLipofectamineLTX，室温静置25分钟，之后加入到细胞内。pDT7004(pUBI-linker-NOS)包含一个玉米泛素启动子(UBI)，下游为NOS终止子，在UBI与NOS之间没有任何编码蛋白序列，本申请用pDT7004配平质粒DNA(Xieetal.,2011)。每组实验中加入DNA量见图9，细胞经过2天培养进行流式细胞术分析或进行基因组DNA提取或进行总RNA的提取。2.2深度测序与数据分析细胞在转染48小时后加入Trizol进行处理，提取总RNA的过程根据Trizol试剂的操作说明进行，并通过电泳分析总RNA的质量。将质量合格的总RNA通过Agilent2100检测样本浓度和质量。建库和测序工作由贝瑞和康完成。数据分析使用mideep2进行。2.3FACS检测细胞在转染48小时后进行胰蛋白酶处理，并于4℃以250g离心10分钟。去除上清后，细胞重悬于不含钙和镁的1×PBS中。使用Fortessa流式分析仪(BDBiosciences)进行荧光激活细胞分离(FACS)，其设置如下：使用405nm激光器与450/50滤光片检测EBFP与TagBFP，其光电倍增管(PMT)为270V；使用488nm激光器与530/30滤光片检测EYFP，其PMT为210V；使用561nm激光器与670/30滤光片检测mKate2，其PMT为380V；使用640nm激光器与780/60滤光片检测iRFP，其PMT为480V。每个样品收集约5×105至1×106数据点。2.4构建稳定细胞系并检测SMC完整性基因组的整合分为两种不同的策略。其中，使用慢病毒系统进行整合的方法可以简要的描述为慢病毒的包装和感染与阳性细胞的筛选。慢病毒的包装和感染方法按照操作手册(http://www.addgene.org/static/data/56/18/16199a04-af64-11e0-90fe-003048dd6500.pdf)进行。感染2天后通过浓度为1μg/mL的Puromycin筛选稳定的克隆，筛选持续1周后进行基因组DNA的提取。使用PBase或Cas9的整合方法可以简单概括为将相应的整合载体与酶表达载体或gRNA表达载体共转染入HEK293细胞，转染所使用的质粒组合与用量如图9所示。转染2天后通过浓度为1μg/mL的Puromycin筛选稳定的克隆，筛选持续2周后进行基因组DNA的提取。为了检测整合的SMC的完整性，使用LA-Taq酶(Takarra公司)和引物对TT13290_5-link1和TT13293_3-link2进行扩增(表3)。2.5Real-timePCR细胞在转染48小时后加入Trizol进行处理，提取总RNA的过程根据Trizol试剂的操作说明进行，并通过电泳分析总RNA的质量。将质量合格的总RNA按照miScriptIIRTKit(Qiagen公司)的说明书进行逆转录得到cDNA，使用合适的引物(见表2)根据SYBRGreenRealtimePCRmastermix的说明书进行实时荧光定量分析。实施例1、能提高成熟miRNA的表达量并且使成熟miRNA对靶DNA具有较高敲低效率的pri-miRNA(SME)实验证明，能提高成熟miRNA的表达量并且使成熟miRNA对靶DNA具有较高敲低效率的pri-miRNA(合成miRNA单元(SyntheticmicroRNAelement，SME)是SEQIDNo.1-4所示的RNA分子。SEQIDNo.1-4中的N为A或U或C或G。SEQIDNo.1-4中，第29-49位是靶向靶基因mRNA的miRNA的反义序列，第69-87位是靶向靶基因mRNA的miRNA的正义序列。本实施例以能产生针对靶基因mRNA(其序列为5’CGAUAUGGGCUGAAUACAAUA3’)的成熟miRNA的SME为例，阐明能提高成熟miRNA的表达量并且使成熟miRNA对靶DNA具有较高敲低效率的SME：图1中b的original、M4、M5和M9。具体如下：1、鼠pri-miR-155的序列是最优化的SME表达骨架本实施例设计了图1所示的名称分别为original和M1-M13的SME，这些SME是以天然的小鼠pri-miR-155为基础，其结构特征包括5’侧翼序列区，反义链，末端环，正义链和3’侧翼序列区(图1中a)。将反义链定义为5p，其第一个碱基所在的位置定义为5p+1，5p+1上游的第一个碱基定义为5p-1，将正义链定义为3p，碱基位置的定义规则同反义链。对人的pri-miR-30的结构的研究认为，两端的侧翼序列可以提供两种与pri-miRNA加工相关的重要结构：配对序列形成的短的茎结构和非配对序列形成的延伸的单链区；此外，环序列的位置将影响Dicer酶加工的精确性。为了探索pri-miRNA的侧翼序列和茎环结构对miRNA加工过程的影响，本申请根据Drosha-DGCR8复合物所识别的典型pri-miRNA的结构和序列特征设计了三种不同的pri-miRNA侧翼序列(图1中b,M1-M3)，并根据pri-miR-155(图1中a)的侧翼序列的二级结构特征设计了七种不同的序列(图1中b,M4-M10)和三种不同大小的环序列(图1中b,M11-M13)，这些不同侧翼序列或环序列的SME均产生miR-FF3(其核苷酸序列是5’UAUUGUAUUCAGCCCAUAUCG3’)。使用荧光报告基因系统，将表达不同结构的SME的表达载体(下述15种pri-miRNA的表达载体中的任一种：pZD-miR-FF3(又称pZD-original)、pZD-M1、pZD-M2、pZD-M3、pZD-M4、pZD-M5、pZD-M6、pZD-M7、pZD-M8、pZD-M9、pZD-M10、pZD-M11、pZD-M12、pZD-M13和pZD-miR-NC)与在3’非编码区(3’-UTR)含有4次串联重复的miR-FF3序列的荧光蛋白的质粒(pZD-hEF1α-mKate2-4xTarget^FF3和pZD-hEF1α-EBFP2)共转染HEK293细胞系，根据荧光蛋白的表达情况来研究不同序列结构的SME与RNAi敲低效率之间的关系(图1中c上图)。其中，pZD-hEF1α-EBFP2作为转染效率的内参照。理论上，上述15种pri-miRNA的表达载体均可产生成熟miRNAmiR-FF3。此外，将pZD-miR-FF8(作为miRNA表达量的内参)和如下14种SME的表达载体中的任一种共转染HEK293细胞系：pZD-miR-FF3(又称pZD-original)、pZD-M1、pZD-M2、pZD-M3、pZD-M4、pZD-M5、pZD-M6、pZD-M7、pZD-M8、pZD-M9、pZD-M10、pZD-M11、pZD-M12和pZD-M13。转染48小时后提取细胞系的总RNA进行深度测序，通过分析不同骨架序列的SME加工得到的成熟miRNA的表达量，进一步探索pri-miRNA的序列对miRNA加工过程的影响(图1中b和d)。结果表明，天然的鼠pri-miR-155骨架(图1中b的original)表达出的成熟体的数量是最高的(图1中c下图的ori)，反义链(antisensestrand)经过加工形成的成熟miRNA的5’端具有固定的起点5p+1，其含量在所有成熟体中约占98.59％，但长度具有一定的差异，集中于23nt，24nt和25nt，且以24nt为最多(图1中b和d)。正义链(sensestrand)经过加工后形成的成熟miRNA比例除M13外均低于5％，但5’端仍具有固定的起点3p-1，长度集中于20nt，21nt和22nt，且以21nt为最多(图1中b和d)。虽然改造的pri-miRNA具有类似的结构，但与天然的骨架相比，其表达量均有不同程度的降低(图1中c，下图)，且加工的精确度也发生了下降(图1中b)，成熟miRNA的长度分布变化不大(图1中d)。在13种改造的SME中，以M9，M4和M5的表现为最好，且具有很高的敲低效率。此外，在PolIII启动子表达shRNA时被验证有效的环序列(图1中b,M13)，当填充在PolII启动子控制的天然的pri-miR-155的骨架中，只能加工出数目较少的期待的成熟miRNA，也不能进行有效的基因敲低。本申请认为，天然的鼠miR-155的骨架是较为优化的pri-miRNA骨架序列，其表达量和期待miRNA成熟体的比例都是最高的，具有很高的敲低效率。其中，图1中b的original和M1-M13这14种SME的表达载体使用pZD构建，pZD的序列见表1，其特征元件为启动子hEF1α:45-1218,EYFP-2A-PuroR(mut)：1283-2671(EYFP:1283-1999，2A:2000-2065，PuroR：2072-2671)，剪接供体位点(splicingdonorsite)的编码DNA:2680-2682,剪接受体位点(splicingacceptorsite)的编码DNA:3587-3589,pri-miRNA的5’侧翼区-ccdB-3’侧翼区:2714-3479,5’侧翼区：2714-2741，3’侧翼区：3436-3479，AmpR(mut):4766-5626；两个BsaI位点：上游BsaI位点：2737-2747，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端的序列为5’-agca-3’；下游BsaI位点：3429-3439，BsaI切割产生的粘性末端的序列为5’-cagg-3’。将pZD的2714-3479位的序列替换成表1中的相应SME基因序列即得到相应的SME的表达载体，如将pZD2714-3479位的序列替换为表1中M4基因，保持pZD的其他序列不变，得到M4的表达载体pZD-M4。同时以miR-NC的表达载体作为对照。miR-NC的表达载体是将pZD的2714-3479位的序列替换为表1中miR-NC基因，保持pZD的其他序列不变，得到miR-NC的表达载体pZD-miR-NC。按照该方法得到表达15种不同结构的SME的表达载体：pZD-miR-FF3(又称pZD-original)、pZD-M1、pZD-M2、pZD-M3、pZD-M4、pZD-M5、pZD-M6、pZD-M7、pZD-M8、pZD-M9、pZD-M10、pZD-M11、pZD-M12、pZD-M13和pZD-miR-NC。miR-FF8的表达载体pZD-miR-FF8按照如下方法构建：将pZD的2741-3435位的序列替换为表1中miR-FF8基因，保持pZD的其他序列不变，得到miR-FF8的表达载体pZD-miR-FF8。2、将茎长度为19nt作为设计合成miRNA的标准，可提高填充在SME里的合成miRNA产生期望的成熟miRNA的效率若确保填充在SME的合成miRNA经过加工后能够得到期望的成熟miRNA，将有效降低合成miRNA的脱靶效应。本申请构建了24种不同的21nt(茎长度19nt，带有2nt的凸起)的合成miRNA的SME载体和6种不同的23nt(茎长度21nt，带有2nt的凸起)，将pZD-miR-FF8(作为内参)和如下30种SME的表达载体中的任一种共转染HEK293细胞系：pZD-miR-N，其中N＝FF3,FF4,LZ1,RR4,RR5,RR6,LZ4,LZ5,LZ6,FF6,FF7,FF8,RR11,RR1,RR2,RR8,RR12,LZ3,FF5,RR3,RR9,RR10,RR13,RR14,RR9L,RR10L,RR11L,RR12L,RR13L或RR14L)。转染48小时后提取细胞系的总RNA进行深度测序与数据分析来检测每种合成miRNA的加工模式(图2中a，b，c和d)。结果表明，合成miRNA的加工具有与miR-FF3类似的相对固定的模式。其具体表现为成熟miRNA的5’端的位置是主要起始于5p+1和3p-1，这两种固定起点的成熟miRNA的总和均超过90％，且绝大部分(在24种21ntSME中，有21种，简称为21/24，下同)的总和超过了97％。而3’端的位置则存在一定的变化，以反义链加工形成的成熟体中，以24nt的长度最常见；以正义链加工形成的成熟体中，以22nt的长度最常见(图2中b)。虽然设计SME的时候遵循了相同的原则，但是来源于反义链和正义链的成熟miRNA的比例具有较大的差异，半数以上(15/24)miRNA的成熟体与期待的一致(其反义链的成熟体比例超过80％)，部分miRNA(7/24)的正义链和反义链都可以被加工成成熟的miRNA(其反义链的成熟体比例超过33％)，还有少部分miRNA(2/24)在最终的成熟体中存在大量的正义链的成熟体(其反义链的成熟体比例低于33％)(图2中a)。本申请对起始位置在5p+1和3p-1的总和低于97％的三种合成miRNA的加工情况进行进一步的分析表明，其次要的起始位置为3p+1。但凸起在茎中间的位置变化时，其对Dicer的加工没有明显的影响(图2中c)。由于所有来源于反义链的成熟miRNA具有相对固定的5’位置，本申请设计了表达23nt(茎长度21nt，带有2nt的凸起)的合成miRNA的SME载体(图2中c)，利用深度测序技术比较不同茎长度对pri-miRNA加工的影响。结果表明，当合成miRNA的茎长度由19nt增长为21nt时，反义链形成的成熟miRNA5’端的加工位置出现了变化，主要为5p+1和5p+3(图2中c)，且以5p+3为起点的成熟miRNA的长度分布与19nt的成熟miRNA的长度分布较为相似(图2中d)。因此，茎的长度对Drosha-DGCR8的识别和切割有着重要的影响。此外，本申请将同一合成miRNA(miR-FF3和miR-FF5)在不同的载体系统中表达，包括瞬时表达载体pZD，慢病毒表达载体pLV以及利用慢病毒表达载体整合后的细胞株(Stablecelllines)，发现其加工方式没有明显改变，包括成熟miRNA来源于正义链和反义链的比例，起始于5p+1的成熟miRNA的长度分布和起始于3p-1的成熟miRNA的长度分布(图2中e)。因此，为了提高合成miRNA的敲低效应，本申请认为应该将茎长度为19nt作为设计合成miRNA的标准，以此提高填充在SME里的合成miRNA产生期望的成熟miRNA的效率。其中pZD-miR-N的构建方法是将pZD的2741-3435位的序列替换为表1中miR-N基因，保持pZD的其他序列不变，得到miR-N基因的表达载体pZD-miR-N。表1中的miR-N基因为下述30种中的任一种：miR-FF3基因，miR-FF4基因，miR-FF5基因，miR-FF6基因，miR-FF7基因，miR-FF8基因，miR-LZ1基因，miR-LZ3基因，miR-LZ4基因，miR-LZ5基因，miR-LZ6基因，miR-RR1基因，miR-RR2基因，miR-RR3基因，miR-RR4基因，miR-RR5基因，miR-RR6基因，miR-RR8基因，miR-RR9基因，miR-RR10基因，miR-RR11基因，miR-RR12基因，miR-RR13基因，miR-RR14基因，miR-RR9L基因，miR-RR10L基因，miR-RR11L基因，miR-RR12L基因，miR-RR13L基因和miR-RR14L基因。基于上述实验结果，本申请认为基于鼠pri-miR-155的合成miRNA单元的最优化结构为天然的骨架和末端环，且靶向特异性目标的合成miRNA的茎的长度为19nt，能提高成熟miRNA的表达量并且使成熟miRNA对靶基因mRNA具有较高敲低效率的pri-miRNA是SEQIDNo.1所示的SME，SEQIDNo.2所示的SME或SEQIDNo.3所示的SME或SEQIDNo.4所示的SME。实施例2、利用Goldengate体外组装合成miRNA基因簇本实施例设计了包含18个SME的人工合成的miRNA簇(syntheticmiRNAcluster，SMC)，其中SME以串联的形式排列在基因的3’-UTR区域，其两侧为mRNA剪切所需要的内含子剪接供体位点(splicingdonorsite)和剪接受体位点(splicingacceptorsite)，以此提高表达多个SME的mRNA的稳定性和表达水平(图3,step3)。本申请采用了适合有序组装重复序列的GoldenGate组装方法，并在此基础上发展了一种可以用来快速构建合成miRNA簇的等级组装方法(图3)。该方法分为三步，第一步由两部分组成，分别为将化学合成的靶向不同的特异靶基因mRNA的合成miRNA的oligo插入至不同的pMR载体获得pri-miRNA基因载体和将接头序列连接进入pAD载体得到接头载体；第二步是将1-6个pri-miRNA基因和合适的接头载体根据GoldenGate载体产生的粘性末端，按顺序与合适的pMM载体组装成亚SMC载体；第三步为通过一步“酶切-连接”构建最终的包含18个SME的载体。该方法在构建SMC的组分时很灵活，只需要更改少量的pMR载体和pMM载体就可以实现包含1-18个不同数量的SME的载体的构建(图8)；同时，致死基因ccdB的使用保证了该方法的高效性并且可以在一周的时间内完成全部组装。本实施例利用Goldengate体外组装名称为18SME的合成miRNA簇(syntheticmiRNAcluster，SMC)的表达盒，其名称为hEF1α-18SME。hEF1α-18SME包括hEF1α启动子(记为hEF1α)和由hEF1α启动子驱动的编码18SME的DNA分子，18SME由18个合成miRNA单元(miR-A、miR-B、miR-C、miR-D、miR-E、miR-F、miR-G、miR-H、miR-I、miR-J、miR-K、miR-L、miR-M、miR-N、miR-O、miR-P、miR-Q和miR-R)串联而成，该18个合成miRNA单元是人工合成的pri-miRNA，该18个合成miRNA单元中每个合成miRNA单元均特异靶向于1个位点；该18个合成miRNA单元共特异于18个靶位点。这18个合成miRNA单元是SEQIDNo.1所示的RNA分子(图1中a)，SEQIDNo.1中，第29-49位是靶向靶基因mRNA的miRNA的反义序列，第69-87位是靶向靶基因mRNA的miRNA的正义序列。hEF1α-18SME还含有RNA剪接供体位点(splicingdonorsite)的编码DNA和RNA剪接受体位点(splicingacceptorsite)的编码DNA，所述RNA剪接供体位点的编码DNA位于hEF1α启动子和编码18SME的DNA分子之间，所述RNA剪接受体位点位于编码18SME的DNA分子的下游。hEF1α-18SME还含有用于筛选转化子的选择标记基因(氨苄霉素抗性基因，简称为AmpR)。为了便于对18SME进行序列测定，编码18SME的DNA分子含有6个用于对18SME进行测序的接头AD1-AD6，编码18SME的DNA分子被接头AD1-AD6间隔为能进行测序的3个区段，每个区段均编码6个人工合成的miRNA单元。18SME的结构为AD1-miR-A-miR-B-miR-C-miR-D-miR-E-miR-F-AD2-AD3-miR-G-miR-H-miR-I-miR-J-miR-K-miR-L-AD4-AD5-miR-M-miR-N-miR-O-miR-P-miR-Q-miR-R-AD6。本实施例提供了构建名称为18SME的合成miRNA簇的重组表达载体的方法，是利用Goldengate体外组装编码18SME的DNA分子，该构建方法包括：在同一个反应体系内，用BsaI切割3种亚SMC载体和pSMC-B并用连接酶进行连接，得到名称为pSMC-B-X的载体，pSMC-B-X即为所述合成miRNA簇的重组表达载体；其中，3种亚SMC载体按照如下方法构建：用Esp3I(BsmBI)酶切18种pri-miRNA基因载体得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的18种pri-miRNA的编码基因片段；用Esp3I(BsmBI)酶切6种接头载体，得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的6种DNA测序接头片段；用Esp3I(BsmBI)酶切3种pMM载体，得到两端均具有4个游离未配对核苷酸的3种pMM线性载体；将18种pri-miRNA的编码基因片段、6种DNA测序接头片段和3种pMM线性载体通过两端的4个游离未配对核苷酸的互补配对连接得到所述3种亚SMC载体；其中，在同一个反应体系内，对6种pri-miRNA基因载体、2种接头载体和1种pMM载体进行酶切和连接；3种亚SMC载体中，每种亚SMC载体由一种pMM线性载体、6个所述pri-miRNA基因和2种所述DNA测序接头连接而成，所述pMM线性载体含有两个BsaI位点，6个所述pri-miRNA基因连在一起形成pri-miRNA基因簇，2种所述DNA测序接头分别位于所述pri-miRNA基因簇的两侧，所述两个BsaI位点分别位于所述DNA测序接头的两侧；BsaI和Esp3I(BsmBI)为识别位点不同的IIs型限制性内切酶；18种pri-miRNA基因载体中每种pri-miRNA基因载体均携带一个不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点的pri-miRNA基因，18种pri-miRNA基因载体所携带的18种pri-miRNA基因的序列不同；每个所述pri-miRNA基因编码的pri-miRNA是SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的四种RNA中的任一种RNA；所述每种pri-miRNA基因载体含有两个Esp3I(BsmBI)位点，两个Esp3I(BsmBI)位点分别位于所述pri-miRNA基因的上游和下游；所述每种pri-miRNA基因载体经Esp3I(BsmBI)切割后得到两端具有粘性末端的含所述pri-miRNA基因的DNA片段；6种接头载体中每种接头载体均携带一个不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点的DNA测序接头，6种接头载体所携带的DNA测序接头不同，所述每种接头载体含有两个Esp3I(BsmBI)位点，所述两个Esp3I(BsmBI)位点分别位于所述DNA测序接头的上游和下游；所述每种接头载体经Esp3I(BsmBI)切割后得到具有两个粘性末端并含有所述DNA测序接头的DNA片段；每种所述pMM载体均含有两个Esp3I(BsmBI)位点和两个BsaI位点；所述pSMC-B含有启动子，所述启动子是依赖于RNA聚合酶II的组成型启动子或诱导型启动子，所述pSMC-B在所述启动子下游含有两个BsaI位点。上述方法中，每种所述pri-miRNA基因载体按照如下方法制备：A11)制备名称为B粘性末端pre-miRNA基因的两端均为粘性末端的双链DNA和名称为pMR的载体；所述B粘性末端pre-miRNA基因编码1个特异于一个靶位点的pre-miRNA，所述pre-miRNA为成熟miRNA的前体，所述B粘性末端pre-miRNA基因的两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸；所述B粘性末端pre-miRNA基因不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点；所述pMR含有两个Esp3I(BsmBI)位点、两个BsaI位点、5’侧翼编码区、3’侧翼编码区；两个BsaI位点分别位于所述5’侧翼编码区的下游和所述3’侧翼编码区的上游；两个Esp3I(BsmBI)位点分别位于所述5’侧翼编码区的上游和所述3’侧翼编码区的下游；所述5’侧翼编码区编码所述成熟miRNA对应的pri-miRNA的5’侧翼区，所述3’侧翼编码区编码所述成熟miRNA对应的pri-miRNA的3’侧翼区；所述5’侧翼编码区和所述3’侧翼编码区均不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点；所述5’侧翼区是SEQIDNo.1的第1-28位所示的RNA，所述3’侧翼区是SEQIDNo.1的第88-131位所示的RNA；A12)用BsaI切割所述pMR，得到名称为B粘性末端pMR线性载体的双链DNA片段，所述B粘性末端pMR线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，所述B粘性末端pMR线性载体和所述B粘性末端pre-miRNA基因通过粘性末端互补配对连接得到含有所述一个pri-miRNA的编码基因的一种pri-miRNA基因载体，所述pri-miRNA基因载体含有两个Esp3I(BsmBI)位点，所述一个pri-miRNA的编码基因位于两个Esp3I(BsmBI)位点之间；所述一个pri-miRNA的编码基因不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点。上述方法中，所述pMR含有名称为A1标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因和如下两个DNA片段：名称为E位点-5’侧翼-B位点的DNA片段和名称为B位点-3’侧翼-E位点的DNA片段；所述E位点-5’侧翼-B位点是45bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为所述限制性核酸内切酶E位点，第12bp-39bp为所述5’侧翼编码区，第35bp-45bp为所述限制性核酸内切酶B位点；所述B位点-3’侧翼-E位点是62bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为BsaI位点，第8bp-51bp为所述3’侧翼编码区，第52bp-62bp为Esp3I(BsmBI)位点；为了便于筛选转化子，所述pMR含有一个ccdB致死基因，所述ccdB致死基因位于两个BsaI位点中间；所述ccdB致死基因不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点。所述pMR中，所述E位点-5’侧翼-B位点的核苷酸序列可为5’-cgtctcnnnnnctggaggcttgctgaaggctgtatgctggagacc-3’，其中n为a或t或c或g；所述B位点-3’侧翼-E位点的核苷酸序列可为5’ggtctcncaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcnnnnngagacg-3’，其中n为a或t或c或g。所述E位点-5’侧翼-B位点的核苷酸序列具体可为5’-cgtctcccatgctggaggcttgctgaaggctgtatgctggagacc-3’，所述B位点-3’侧翼-E位点的核苷酸序列具体可为5’ggtctcacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcggaccgagacg-3’。所述A1标记基因具体可为四环素抗性基因TetR。上述方法中，每种所述接头载体按照如下方法制备：B1)提供名称为B粘性末端DNA测序接头的两端均为粘性末端的双链DNA和名称为pAD的载体；所述B粘性末端DNA测序接头含有一个DNA测序接头，所述B粘性末端DNA测序接头的两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸；所述B粘性末端DNA测序接头不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点；B2)所述pAD含有所述两个限制性核酸内切酶B位点和所述两个限制性核酸内切酶E位点；用BsaI切割所述pAD，产生名称为pAD线性载体的双链DNA片段，所述pAD线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，所述pAD线性载体和所述B粘性末端DNA测序接头通过粘性末端互补配对连接得到含有一个DNA测序接头的一种接头载体，所述接头载体含有所述两个限制性核酸内切酶E位点，所述一个DNA测序接头位于所述两个限制性核酸内切酶E位点之间；所述一个DNA测序接头不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点。具体地所述pAD含有名称为A2标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因和如下两个DNA片段：名称为E位点-B位点的DNA片段和名称为B位点-E位点的DNA片段；所述E位点-B位点是22bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为Esp3I(BsmBI)位点，第12-22bp为BsaI位点；所述B位点-E位点是22bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为BsaI位点，第12-22bp为Esp3I(BsmBI)位点。为了便于筛选转化子，所述pAD含有一个ccdB致死基因，所述ccdB致死基因位于两个BsaI位点中间；所述ccdB致死基因不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点。所述pAD中，所述E位点-B位点的核苷酸序列可为5’-cgtctcnnnnnnnnnngagacc-3’，其中n为a或t或c或g；所述B位点-E位点的核苷酸序列可为5’-ggtctcnnnnnnnnnngagacg-3’，其中n为a或t或c或g。所述A2标记基因具体可为四环素抗性基因TetR。所述E位点-B位点的核苷酸序列具体可为5’-cgtctcgctattgctggagacc-3’；所述B位点-E位点的核苷酸序列具体可为5’-ggtctcacaggcatgggagacg-3’。上述方法中，所述pMM含有名称为B标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因和如下两个DNA片段：名称为上游B位点-上游E位点的DNA片段和名称为下游E位点-下游B位点的DNA片段；所述上游B位点-上游E位点是18bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为BsaI的识别位点，第8-18bp为Esp3I(BsmBI)位点；所述下游E位点-下游B位点是18bp的双链DNA，从上游计，第1-11bp为Esp3I(BsmBI)位点，第8-18bp为BsaI位点。所述B标记基因不同于所述A1标记基因和所述A2标记基因。为了便于筛选转化子，所述pMM含有一个ccdB致死基因，所述ccdB致死基因位于两个Esp3I(BsmBI)位点中间；所述ccdB致死基因不含Esp3I(BsmBI)位点和BsaI位点。所述pMM中，所述上游B位点-上游E位点的核苷酸序列为5’-ggtctcnnnnnngagacg-3’,其中n为a或t或c或g；下游E位点-下游B位点的核苷酸序列为5’-cgtctcnnnnnngagacc-3’,其中n为a或t或c或g。所述B标记基因具体可为卡那霉素抗性基因KanR。所述上游B位点-上游E位点的核苷酸序列具体可为5’-ggtctctctatggagacg-3’，所述下游E位点-下游B位点的核苷酸序列具体可为5’-cgtctcggaaatgagacc-3’。上述方法中，所述pSMC-B含有名称为C标记基因的用于筛选转化子的选择标记基因；所述C标记基因不同于所述B标记基因；所述pSMC-B在所述启动子下游含有RNA剪接供体位点的编码DNA和RNA剪接受体位点的编码DNA，所述RNA剪接供体位点的编码DNA位于所述启动子和两个BsaI位点中位于上游的限制性核酸内切酶B位点之间，所述RNA剪接受体位点的编码DNA位于两个BsaI位点中位于下游的限制性核酸内切酶B位点的下游。所述C标记基因具体可为AmpR(氨苄青霉素抗性基因)。具体方法如下：1.制备所需的18种pri-miRNA(合成miRNA单元)基因载体和所需的6种接头载体1.118种所述pri-miRNA基因载体的制备方法包括：1.1.1制备18种名称为B粘性末端pre-miRNA的两端均为粘性末端的双链DNA该18种名称为B粘性末端pre-miRNA的两端均为粘性末端的双链DNA具体为如图7所示的pre-miRA基因至pre-miRR基因，分别编码名称为pre-miRA至pre-miRR的18种pre-miRNA(pre-miRNA为成熟miRNA的前体)。每种B粘性末端pre-miRNA编码1个特异于一个靶位点的pre-miRNA，每种B粘性末端pre-miRNA的两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸；每种B粘性末端pre-miRNA不含(Esp3I(BsmBI))位点和BsaI位点。其制备方法如下：针对18个不同的靶位点位点设计合成miRNA，这18个不同的靶位点是由21nt组成。miR-A靶位点的序列为：5’-CGAUAUGGGCUGAAUACAAUA-3’，则需要合成的pre-miRNA基因(名称为pre-miR-A基因)两条链的序列如下：M1-oligo1：5’-TGCTGTATTGTATTCAGCCCATATCGGTTTTGGCCACTGACTGACCGATATGGTGAATACAATA-3’；M1-oligo2：5’-CCTGTATTGTATTCACCATATCGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCGATATGGGCTGAATACAATAC-3。将oligo1和oligo2进行磷酸化并退火，反应条件为A，得到图7中的两端具有粘性末端(两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸)的双链pre-miR-A基因。反应条件A为A体系和A程序A体系：2μl10×PNK缓冲液；2μl10μMM1-oligo1；2μl10μMM1-oligo2；1μl10mMATP；1μlT4PNK。A程序：37℃60min→94℃2min→94℃1min，57个循环，每个循环降低1℃→4℃保存。按照同样的反应条件分别得到针对其他的17个靶位点(miR-B靶位点至miR-R靶位点)的两端具有粘性末端(两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸)的双链pre-miRNA基因(pre-miR-B基因至pre-miR-R基因)。1.1.2制备名称为pMR的载体所需的6种具体的pMR，分别是表1中的pMR1、pMR2、pMR3、pMR4、pMR5和pMR6。此处还提供了pMR7、pMR8、pMR9、pMR10和pMR11这五种pMR载体。其中，pMR1的重要元件为：TetR(四环素抗性基因)：272-1462；5’侧翼编码区-ccdB-3’侧翼编码区:1765-2530；5’侧翼编码区：1765-1792；3’侧翼编码区：2487-2530；上游的BsaI位点：1788-1798，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-agca-3’；下游的BsaI位点：2480-2490，BsaI切割产生的粘性末端为5’-cagg-3’；上游的Esp3I位点：1754-1764，Esp3I切割产生的粘性末端为5’-catg-3’；下游的Esp3I位点：2531-2541，Esp3I切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-gtcc-3’。pMR1含有如下两个DNA片段：名称为E位点-5’侧翼-B位点的DNA片段和名称为B位点-3’侧翼-E位点的DNA片段；所述E位点-5’侧翼-B位点的核苷酸序列为5’-cgtctcccatgctggaggcttgctgaaggctgtatgctggagacc-3’，所述B位点-3’侧翼-E位点的核苷酸序列为5’ggtctcacaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcggaccgagacg-3’；pMR2-pMR11与pMR1的区别仅在于上游的Esp3I位点和下游的Esp3I位点不同，其它序列均相同。pMR1的第1761-1764位为5’-catg-3’,Esp3I切割产生的粘性末端为5’-catg-3’；第2531-2534位为5’-ggac-3’，Esp3I切割产生的粘性末端为5’-gtcc-3’，pMR2是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggac-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ggac-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-ccag-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ctgg-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR3是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ccag-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ccag-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-ggcg-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-cgcc-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR4是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggcg-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ggcg-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgca-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-tgca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR5是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-tgca-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-tgca-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-cggt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-accg-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR6是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-cggt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-cggt-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-aaca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR7是将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-aaca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR8是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggac-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ggac-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-aaca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR9是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ccag-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ccag-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-aaca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR10是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-ggcg-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ggcg-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-aaca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。pMR11是将pMR1的第1761-1764位的5’-catg-3’突变为5’-tgca-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-tgca-3’)，将pMR1的第2531-2534位的5’-ggac-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-aaca-3’)，保持pMR1的其他序列不变得到的载体。将pre-miRA基因与pMR1进行第一步的GoldenGate反应，反应条件为B，将反应产物转化大肠杆菌克隆菌株(比如DH5α，EPI300等)，挑选四环素抗性菌落进行菌落PCR鉴定出阳性克隆并进行测序，鉴定正确的克隆即为一种pri-miRNA基因载体，将其命名为pMR1-A。pMR1-A为如下含有pri-miRNA-A基因的载体：用BsaI切割pMR1，得到名称为B粘性末端pMR1线性载体的双链DNA片段，B粘性末端pMR1线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，该B粘性末端pMR1线性载体和所述B粘性末端pre-miRNA基因(即pre-miRNA-A基因)通过粘性末端互补配对连接得到的含有pri-miRNA-A基因的重组载体pMR1-A。反应条件为B为B体系和B程序。其中B体系：2μl10×T4连接酶缓冲液，1μl100ng/μlpMR1，1μlpre-miR-A基因，1μlBsaI，1μlT4连接酶，14μlddH2O。B程序：37℃7min，16℃5min，10个循环→50℃5min，80℃5min→4℃储存。按照同样的反应条件将pre-miR-A基因与pMR1进行如下替换，得到如下17种相应的pri-miRNA基因载体：q2、替换为pre-miR-B基因与pMR2得到pMR2-B(含有pri-miRNA-B基因的pri-miRNA基因载体)，q3、替换为pre-miR-C基因与pMR3得到pMR3-C(含有pri-miRNA-C基因的pri-miRNA基因载体)，q4、替换为pre-miR-D基因与pMR4得到pMR4-D(含有pri-miRNA-D基因的pri-miRNA基因载体)，q5、替换为pre-miR-E基因与pMR5得到pMR5-E(含有pri-miRNA-E基因的pri-miRNA基因载体)，q6、替换为pre-miR-F基因与pMR6得到pMR6-F(含有pri-miRNA-F基因的pri-miRNA基因载体)，q7、替换为pre-miR-G基因与pMR1得到pMR1-G(含有pri-miRNA-G基因的pri-miRNA基因载体)，q8、替换为pre-miR-H基因与pMR2得到pMR2-H(含有pri-miRNA-H基因的pri-miRNA基因载体)，q9、替换为pre-miR-I基因与pMR3得到pMR3-I(含有pri-miRNA-I基因的pri-miRNA基因载体)，q10、替换为pre-miR-J基因与pMR4得到pMR4-J(含有pri-miRNA-J基因的pri-miRNA基因载体)，q11、替换为pre-miR-K基因与pMR5得到pMR5-K(含有pri-miRNA-K基因的pri-miRNA基因载体)，q12、替换为pre-miR-L基因与pMR6得到pMR6-L(含有pri-miRNA-L基因的pri-miRNA基因载体)，q13、替换为pre-miRM基因与pMR1得到pMR1-M(含有pri-miRNA-M基因的pri-miRNA基因载体)，q14、替换为pre-miR-N基因与pMR2得到pMR2-N(含有pri-miRNA-N基因的pri-miRNA基因载体)，q15、替换为pre-miR-O基因与pMR3得到pMR3-O(含有pri-miRNA-O基因的pri-miRNA基因载体),q16、替换为pre-miR-P基因与pMR4得到pMR4-P(含有pri-miRNA-P基因的pri-miRNA基因载体),q17、替换为pre-miR-Q基因与pMR5得到pMR5-Q(含有pri-miRNA-Q基因的pri-miRNA基因载体),q18、替换为pre-miR-R基因与pMR6得到pMR6-R(含有pri-miRNA-R基因的pri-miRNA基因载体)(图7)。1.2、制备所需的6种接头载体pAD1-AD1,pAD2-AD2,pAD3-AD3,pAD4-AD4,pAD5-AD5,pAD6-AD6。设计6种接头序列，其长度不限，可以根据需要进行调整。本实施例的DNA测序接头接头1的序列为：5’-AAAGGTGAAGTTCGTCGTCCAACATTATCA-3’，则需要合成的两条链的序列如下：AD1-oligo1：5’-TGCTAAAGGTGAAGTTCGTCGTCCAACATTATCA-3’；AD1-oligo2：5’-CCTGTGATAATGTTGGACGACGAACTTCACCTTT-3’。将oligo1和oligo2进行磷酸化并退火，反应条件为A，得到两端具有粘性末端(两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸)的双链DNA测序接头AD1。按照同样的反应条件处理其他的5种接头，分别得到两端具有粘性末端(两端的粘性末端均具有4个游离未配对核苷酸)的双链DNA测序接头AD2-AD6。双链DNA测序接头AD1-AD6的序列如图7所示。本发明提供了6种具体的pAD，分别是表1中的pAD1、pAD2、pAD3、pAD4、pAD5和pAD6。其中，pAD1的重要元件为：TetR(四环素抗性基因)：272-1462，ccdB基因:2111-2416，上游BsaI位点：1765-1775，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-agca-3’；下游BsaI位点：2457-2467，BsaI切割产生的粘性末端为5’-cagg-3’；上游Esp3I位点：1754-1764，Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ctat-3’；下游Esp3I位点：2468-2478，Esp3I切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-catg-3’。pAD含有如下两个DNA片段：名称为E位点-B位点的DNA片段和名称为B位点-E位点的DNA片段，所述E位点-B位点的核苷酸序列为5’-cgtctcgctattgctggagacc-3’(位于1754-1775)；所述B位点-E位点的核苷酸序列为5’-ggtctcacaggcatgggagacg-3’(位于2457-2478)。pAD2-pAD6与pAD1的区别仅在于上游的Esp3I位点和下游的Esp3I位点不同，其它序列均相同。pAD1的1761-1764位为5’-ctat-3’，Esp3I切割产生的粘性末端为5’-ctat-3’，2468-2471位为5’-catg-3’，Esp3I切割产生的粘性末端为5’-catg-3’；pAD2是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-tgtt-3’)，将pAD1的第2468-2471位的5’-catg-3’突变为5’-gaaa-3’(Esp3I切割产生的粘性末端5’-tttc-3’)，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。pAD3是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-gaaa-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-gaaa-3’)，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。pAD4是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-tgtt-3’)，将pAD1的第2468-2471位的5’-catg-3’突变为5’-gctc-3’(Esp3I切割产生的粘性末端5’-gagc-3’)，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。pAD5是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-gctc-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-gctc-3’)，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。pAD6是将pAD1的第1761-1764位的5’-ctat-3’突变为5’-tgtt-3’(Esp3I切割产生的粘性末端为5’-tgtt-3’)，将pAD1的第2468-2471位的5’-catg-3’突变为5’-tcga-3’(Esp3I切割产生的粘性末端5’-tcga-3’)，保持pAD1的其他序列不变得到的载体。将1.1.2反应条件B中的pMR1替换为pAD1、将1.1.2反应条件B中的pre-miR-A基因替换为AD1，进行GoldenGate反应，将反应产物进行转化大肠杆菌克隆菌株(比如DH5α，EPI300等)，挑选四环素抗性菌落进行菌落PCR鉴定出阳性克隆并进行测序，鉴定正确的克隆即为一种接头载体，将其命名为pAD1-AD1。pAD1-AD1为如下重组载体：是用BsaI切割pAD1，产生名称为pAD1线性载体的双链DNA片段，pAD1线性载体两端均具有4个游离未配对核苷酸，pAD1线性载体和所述B粘性末端DNA测序接头(即AD1)通过粘性末端互补配对连接得到含有一个DNA测序接头(即AD1)的重组载体。按照同样的反应条件将pAD1与AD1进行如下替换，得到如下6种相应的接头载体：J1、替换为pAD1与AD1得到pAD1-AD1，J2、替换为pAD2与AD2得到pAD2-AD2，J3、替换为pAD3与AD3得到pAD3-AD3，J4、替换为pAD4与AD4得到pAD4-AD4，J5、替换为pAD5与AD5得到pAD5-AD5，J6、替换为pAD6与AD6得到pAD6-AD6。1.3制备pMM：本发明提供了5种具体的pMM，分别是表1中的pMM1、pMM2、pMM3、pMM4和pMM5。此处所需的pMM有三种，是pMM1、pMM2和pMM3。其中，pMM1的重要元件为：KanR-mut：935-1744，ccdB基因:109-414，上游B位点-上游E位点:52-69(核苷酸序列为5’-ggtctctctatggagacg-3’),上游BsaI位点：52-62，BsaI切割产生的粘性末端的序列为5’-ctat-3’，上游Esp3I位点：59-69，Esp3I切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-atag-3’；下游E位点-下游B位点:750-767(核苷酸序列为5’-cgtctcggaaatgagacc-3’)，下游的Esp3I位点：750-760，切割产生的粘性末端为5’-gaaa-3’，下游的BsaI位点：757-767，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-tttc-3’。pMM2-pMM5与pMM1的区别仅在于上游B位点-上游E位点和下游E位点-下游B位点不同，其它序列均相同。pMM2是将pMM1的上游B位点-上游E位点:52-69突变为5’-ggtctccgaaaggagacg-3’,上游BsaI位点：52-62，BsaI切割产生的粘性末端为5’-gaaa-3’，上游Esp3I位点：59-69，Esp3I切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-tttc-3’；将pMM1的下游E位点-下游B位点:750-767突变为5’-cgtctcggctctgagacc-3’,下游的Esp3I位点：750-760，切割产生的粘性末端为5’-gctc-3’,下游的BsaI位点：757-767，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-gagc-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。pMM3是将pMM1的上游B位点-上游E位点:52-69突变为5’-ggtctctgctcggagacg-3’,上游BsaI位点：52-62，BsaI切割产生的粘性末端为5’-gctc-3’，上游Esp3I位点：59-69，Esp3I切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-gagc-3’；将pMM1的下游E位点-下游B位点:750-767突变为5’-cgtctcgtcgatgagacc-3’,下游的Esp3I位点：750-760，切割产生的粘性末端为5’-tcga-3’,下游的BsaI位点：757-767，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-tcga-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。pMM4是将pMM1的上游B位点-上游E位点:52-69突变为5’-ggtctccgaaaggagacg-3’,上游BsaI位点：52-62，BsaI切割产生的粘性末端为5’-gaaa-3’，上游Esp3I位点：59-69，Esp3I切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-tttc-3’；将pMM1的下游E位点-下游B位点:750-767突变为5’-cgtctcgtcgatgagacc-3’,下游的Esp3I位点：750-760，切割产生的粘性末端为5’-tcga-3’,下游的BsaI位点：757-767，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-tcga-3’)，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。pMM5是将pMM1的下游E位点-下游B位点:750-767突变为5’-cgtctcgtcgatgagacc-3’,下游的Esp3I位点：750-760，切割产生的粘性末端为5’-tcga-3’,下游的BsaI位点：757-767，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，粘性末端的序列为5’-tcga-3’，保持pMM1的其他序列不变得到的载体。1.4制备名称pSMC-B的表达载体pSMC-B含有启动子，所述pSMC-B在所述启动子下游含有两个BsaI的位点；所述pSMC-B还含有RNA剪接供体位点和RNA剪接受体位点，所述RNA剪接供体位点和所述RNA剪接受体位点位于所述启动子的下游；所述RNA剪接供体位点所述RNA剪接受体位点位于两个BsaI的位点之间。其中，pSMC-B具体可为表1的pZD-SMC-B、pLV-SMC-B、pB-SMC-B或pT2-SMC-B。pZD-SMC-B的序列见表1，其特征元件为启动子hEF1α:724-1897,EYFP-2A-PuroR(mut)：1962-3350(EYFP:1962-2678，2A:2679-2744，PuroR：2751-3350)，剪接供体位点(splicingdonorsite)的编码DNA:3359-3361,剪接受体位点(splicingacceptorsite)的编码DNA:3973-3975,LacZ的启动子和部分基因序列：3421-3818；两个BsaI位点：上游BsaI位点：3389-3399，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-atag-3’；下游BsaI位点：3841-3851，BsaI切割产生的粘性末端的序列为5’-tcga-3’。pLV-SMC-B的序列见表1，其特征元件为pCMV启动子：1-408，hEF1α启动子:2434-3607,PuroR(mut)：3672-4271,AmpR(mut):9229-10089.5’LTR:617-805,3’-LTR:5707-6208,cPPT:2229-2346,psi:856-993,SD序列：913-916，WPRE：4913-5502，LacZ的启动子和部分基因序列：4340-4737；两个BsaI位点：上游BsaI位点：4308-4318，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-atag-3’；下游BsaI位点：4760-4770，BsaI切割产生的粘性末端的序列为5’-tcga-3’。pB-SMC-B的序列见表1，其特征元件为5’ITR：1-310,3’ITR：5777-6011,hEF1α:1058-2231,EYFP-2A-PuroR(mut)：2296-3684(EYFP:2296-3012，2A:3013-3078，PuroR：3085-3684),剪接供体位点的编码DNA:3693-3695,剪接受体位点的编码DNA:4307-4309,AmpR(mut):6914-7774.LacZ的启动子和部分基因序列：3755-4152。两个BsaI位点：上游BsaI位点：3723-3733，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-atag-3’；下游BsaI位点：4175-4185，BsaI切割产生的粘性末端的序列为5’-tcga-3’。pT2-SMC-B的序列见表1，其特征元件为hEF1α:100-1273,EYFP-2A-PuroR(mut)：1338-2726(EYFP:1338-2054，2A:2055-2120，PuroR：2127-2726),剪接供体位点的编码DNA:2735-2737,剪接受体位点的编码DNA:3349-3351,AmpR(mut):5104-5964.T2识别位点:21-39和4225-4243，LacZ的启动子和部分基因序列：2797-3194，两个BsaI位点：上游BsaI位点：2765-2775，BsaI切割产生的粘性末端在其互补链上，切割产生的粘性末端为5’-atag-3’；下游BsaI位点：3217-3227，BsaI切割产生的粘性末端的序列为5’-tcga-3’。1.5制备亚SMC载体在进行GoldenGate组装前，需要对合成miRNA簇中SME和测序接头序列的位置进行排列，下面以如下合成miRNA簇为例阐明：AD1-miRA-miRB-miRC-miRD-miRE-miRF-AD2-AD3-miRG-miRH-miRI-miRJ-miRK-miRL-AD4-AD5-miRM-miRN-miRO-miRP-miRQ-miRR-AD6。需要制备三种亚SMC载体，分别是pMM1-SMC1(含有AD1-miRA-miRB-miRC-miRD-miRE-miRF-AD2)、pMM2-SMC2(含有AD3-miRG-miRH-miRI-miRJ-miRK-miRL-AD4)和pMM3-SMC3(含有AD5-miRM-miRN-miRO-miRP-miRQ-miRR-AD6)。GoldenGate组装需要进行3组反应：1.5.1、pMM1+pAD1-AD1+pMR1-A+pMR2-B+pMR3-C+pMR4-D+pMR5-E+pMR6-F+pAD2-AD2；1.5.2、pMM2+pAD3-AD3+pMR1-G+pMR2-H+pMR3-I+pMR4-J+pMR5-K+pMR6-L+pAD4-AD4；1.5.3、pMM3+pAD5-AD5+pMR1-M+pMR2-N+pMR3-O+pMR4-P+pMR5-Q+pMR6-R+pAD6-AD6。以1.5.1组的反应为例，在反应条件C进行GoldenGate反应，将反应产物转化大肠杆菌克隆菌株(比如DH5α，EPI300等)，用卡那霉素进行筛选，挑选卡那霉素抗性菌落进行菌落PCR鉴定出阳性克隆并进行测序鉴定，鉴定正确的克隆即为名称为pMM1-SMC1(图3中的pMM1-ABCDEF)的亚SMC载体。pMM1-SMC1含有从上游至下游依次为AD1、pri-miRNA-A基因、pri-miRNA-B基因、pri-miRNA-C基因、pri-miRNA-D基因、pri-miRNA-E基因、pri-miRNA-F基因和AD2的DNA片段，将该DNA片段命名为SMC1。反应条件C为C体系和C程序。其中，C体系：2μl10×Tungo缓冲液，1μl100ng/μlpMM1，1μl100ng/μlpAD1-AD1，1μl100ng/μlpMR1-A，1μl100ng/μlpMR2-B，1μl100ng/μlpMR3-C，1μl100ng/μlpMR4-D，1μl100ng/μlpMR5-E，1μl100ng/μlpMR6-F，1μl100ng/μlpAD2-AD2，2μl10mMATP，2μl10mMDTT，1.5μlEsp3I，1μlT4DNA连接酶和3.5μlddH2O。C程序：37℃12min，16℃7min，10个循环→50℃5min，80℃5min→4℃储存。按照同样的反应条件进行其他两组GoldenGate反应，转化，鉴定，分别得到名称为pMM2-SMC2(图3中的pMM2-GHIJKL)和pMM3-SMC3(图3中的pMM3-MNOPQR)的亚SMC载体。pMM2-SMC2含有从上游至下游依次为AD3、pri-miRNA-G基因、pri-miRNA-H基因、pri-miRNA-I基因、pri-miRNA-J基因、pri-miRNA-K基因、pri-miRNA-L基因和AD4的DNA片段，将该DNA片段命名为SMC2。pMM3-SMC3含有从上游至下游依次为AD5、pri-miRNA-M基因、pri-miRNA-N基因、pri-miRNA-O基因、pri-miRNA-P基因、pri-miRNA-Q基因、pri-miRNA-R基因和AD6的DNA片段，将该DNA片段命名为SMC3。1.6在同一个反应体系内，用BsaI切割pMM1-SMC1、pMM2-SMC2、pMM3-SMC3和pSMC-B并用连接酶进行连接，得到携带上述人工合成的miRNA基因簇hEF1α-18SME的载体pSMC-18SME。该反应在反应条件D进行。反应条件D为D体系和D程序。D体系：2μl10×T4连接酶缓冲液，1μl100ng/μlpSMC-B，1μl100ng/μlpMM1-SMC1，1μl100ng/μlpMM2-SMC2，1μl100ng/μlpMM3-SMC3，1μlBsaI，1μlT4连接酶，12μlddH2O。D程序：37℃10min，16℃7min，10个循环→50℃5min，80℃5min→4℃储存。按照上述构建方法，将图8中Step1和step2的载体组合在一起参照步骤1.5进行反应得到亚SMC载体，再将亚SMC载体和pSMC-B参照步骤1.6进行反应得到携带含有X个合成miRNA单元的人工合成的miRNA基因簇载体pSMC-(X)SME，X为4-18中的一个自然数。其中，当X为4-6中的一个自然数，携带含有X个合成miRNA单元的人工合成的miRNA基因簇载体pSMC-(X)SME可以通过两种不同的方案进行Goldengate反应得到(图8中a和b)。图8中，pMRvector是一系列不同载体的组合，pMR-A由pMR1、pMR2、pMR3、pMR4、pMR5和pMR6组成，pMR-B表示pMR7，pMR-C由pMR1和pMR8组成，pMR-D由pMR1、pMR2和pMR9组成，pMR-E由pMR1、pMR2、pMR3和pMR10组成，pMR-F由pMR1、pMR2、pMR3、pMR4和pMR11组成；若X是7-11中一个自然数时，可以根据X-6得到的值选择pMR载体组合；若X是13-18中一个自然数时，可以根据X-12得到的值选择pMR载体组合。每个pMM载体可以容纳两个接头载体和不超过6个的pri-miRNA基因。SMC载体具体可为表1的pZD-SMC-B、pLV-SMC-B、pB-SMC-B或pT2-SMC-B，也可为pZD-SMC-E、pLV-SMC-E、pB-SMC-E或pT2-SMC-E。pZD-SMC-E与pZD-SMC-B的区别仅在于将3389-3399位的上游BsaI位点5’-ctatcgagacc-3’替换为序列为5’-catgcgagacg-3’的上游Esp3I位点，将3841-3851位的下游BsaI位点5’-ggtctcctcga-3’替换为序列为5’-cgtctcctgtt-3’的下游Esp3I位点，其它序列与pZD-SMC-B相同；pLV-SMC-E与pLV-SMC-B的区别仅在于将4308-4318位的上游BsaI位点5’-ctatcgagacc-3’替换为序列为5’-catgcgagacg-3’的上游Esp3I位点，将4760-4770位的下游BsaI位点5’-ggtctcctcga-3’替换为序列为5’-cgtctcctgtt-3’的下游Esp3I位点，其它序列与pLV-SMC-B相同；pB-SMC-E与pB-SMC-B的区别仅在于将3723-3733位的上游BsaI5’-ctatcgagacc-3’替换为序列为5’-catgcgagacg-3’的上游Esp3I位点，将4175-4185位的下游BsaI位点5’-ggtctcctcga-3’替换为序列为5’-cgtctcctgtt-3’的下游Esp3I位点，其它序列与pB-SMC-B相同；pT2-SMC-E与pT2-SMC-B的区别仅在于将2765-2775位的上游BsaI位点5’-ctatcgagacc-3’替换为序列为5’-catgcgagacg-3’的上游Esp3I位点，将3217-3227位的下游BsaI位点5’-ggtctcctcga-3’替换为序列为5’-cgtctcctgtt-3’的下游Esp3I位点，其它序列与pT2-SMC-B相同。实施例3、SMC中每个SME是独立加工和独立表达且不存在明显的位置效应目前，对于SMC中每个SME是如何发挥功能的机制方面的研究并不清楚。为了更好的理解SMC中SME的表达情况，本实施例从miRNA表达水平、功能以及位置效应三个方面来研究这一问题。在研究miRNA表达水平时，构建了一系列包含不同SME的SMC载体，它们具有相同的首位和/或末位的SME，而两个SME中间逐渐增加SME的数目(图4中a，左图)，其中首位SME经过加工可以表达miR-FF3，末位SME表达miR-FF5。使用miRNA定量PCR技术来研究合成miRNA的表达水平与数量之间的关系。结果表明，随着miRNA数量的增加，首位或末位合成miRNA的表达水平都有下降(图4中a，右上图)。通过报告基因系统来研究合成miRNA簇中单个miRNA功能。将上述不同的SMC载体与表达mKate2蛋白且3’-UTR含有4×miR-FF3的靶序列的质粒，表达TagBFP2蛋白且3’-UTR含有4×miR-FF5的靶序列的质粒共转染HEK293细胞，通过报告基因的表达情况来测定合成miRNA的功能(图4中a，左图)。结果表明，随着SME数量的增加，首位或末位合成miRNA对靶基因的抑制水平都略有下降，这与其表达量的下降是一致的(图4中a，右上图和右下图)。这可能是随着SME数量的增加，细胞中miRNA生物产生的机器出现了饱和，从而导致单个SME的表达水平下降。此外，构建了含有6个，12个和18个SME但位置非随机互换的两对SMC质粒：6F和6R，12F和12R，18F和18R，用于研究SMC中SME间的位置效应(图4中c)。使用深度测序技术来比较SMC中的SME加工的模式与表达单个SME的加工模式间的异同，并通过定量PCR技术检测不同SMC中每个SME的相对表达水平。结果表明，对于同一个合成miRNA而言，不管其是由表达单个SME所产生的，还是由表达多个SME的SMC产生的，其加工的方式是相似的。其起始于同一位置的主要的成熟miRNA的比例是相对稳定的(图4中d和4中e)。当来源于反义链的成熟miRNA的比例超过90％时，其在SME和SMC时的成熟miRNA比例具有很好的一致性。而对于合成miRNA的长度而言，对于含有相同SME个数的两对SMC，其分布比例没有明显的差异(图5)。定量PCR的结果显示，从整体上看合成miRNA基因簇不存在明显的位置效应(图4中c)。其中，图4中a中1、2、3、6、9、12、15、18和1’表示分别转合成miRNA簇表达载体pZD-SMC-miR-1F、pZD-SMC-miR-2F、pZD-SMC-miR-3F、pZD-SMC-miR-6F、pZD-SMC-miR-9F、pZD-SMC-miR-12F、pZD-SMC-miR-15F、pZD-SMC-miR-18F和pZD-SMC-miR-1R的细胞；NC表示转染pZD-miR-NC(作为表达载体的对照)的细胞。将上述任一种表达载体和pZD-hEF1α-mKate2-4xTarget^FF3和pZD-hEF1α-TagBFP-4xTarget^FF5共同转染共转染HEK293细胞系，对转染的细胞进行FACS检测。将表达载体替换为pZD-miR-NC和pZD-hEF1α-mKate2-4xTarget^FF3和pZD-hEF1α-TagBFP-4xTarget^FF5共同转染HEK293细胞系，作为对照(NC)，对转染的细胞进行FACS检测。得到图4中a的结果。上述表达载体pZD-SMC-miR-XF(X＝1,2,3,6,9,12,15或18),是将表1中的pZD-SMC-B中3389-3851的序列替换成相应的miR-XF(SMC)序列，保持pZD-SMC-B的其它序列不变即得到pZD-SMC-miR-XF的完整序列。以pZD-SMC-miR-18F为例，将pZD-SMC-B按照实施例2利用Goldengate体外组装miRNA基因簇的方法，通过BsaI和T4连接酶介导的GoldenGateassembly将pZD-SMC-B的3389-3851替换为miR-18F，即得到pZD-SMC-miR-18F。对于pZD-SMC-miR-18F而言，其中SMC中各个SME的位置为：AD1:9-38,AD2:891-905,AD3:918-932,AD4:1754-1768,AD5:1781-1794,AD6:2646-2675.SME1:47-177；SME2:182-312；SME3:317-447；SME4:452-582；SME5:587-717；SME6:722-852；SME7:941-1071；SME8:1076-1206；SME9:1211-1341；SME10:1346-1476；SME11:1481-1611；SME12:1616-1746；SME13:1833-1963；SME14:1968-2098；SME15:2103-2233；SME16:2238-2368；SME17:2373-2503；SME18:2508-2638。图4中c中，18F表示pZD-SMC-miR-18F，18R表示pZD-SMC-miR-18R。pZD-SMC-miR-18R是将pZD-SMC-B按照实施例2利用Goldengate体外组装miRNA基因簇的方法，通过BsaI和T4连接酶介导的GoldenGateassembly将pZD-SMC-B的3389-3851替换为miR-18R，即得到pZD-SMC-miR-18R。6F、12F和18F分别表示pZD-SMC-miR-6F、pZD-SMC-miR-12F和pZD-SMC-miR-18F；6R、12R和18R分别表示pZD-SMC-miR-6R、pZD-SMC-miR-12R和pZD-SMC-miR-18R。pZD-SMC-miR-1R、pZD-SMC-miR-6R、pZD-SMC-miR-12R和pZD-SMC-miR-18R是将pZD-SMC-B按照实施例2利用Goldengate体外组装miRNA基因簇的方法，通过BsaI和T4连接酶介导的GoldenGateassembly将pZD-SMC-B的3389-3851替换为miR-1R即得到pZD-SMC-miR-1R，将pZD-SMC-B的3389-3851替换为miR-6R即得到pZD-SMC-miR-6R，将pZD-SMC-B的3389-3851替换为miR-12R即得到pZD-SMC-miR-12R，将pZD-SMC-B的3389-3851替换为miR-18R即得到pZD-SMC-miR-18R。将pZD-miR-FF8(作为内参)和如下6种SMC表达载体中的任一种共转染HEK293细胞系：pZD-SMC-miR-6F、pZD-SMC-miR-12F、pZD-SMC-miR-18F、pZD-SMC-miR-6R、pZD-SMC-miR-12R和pZD-SMC-miR-18R(图9)，转染48小时后提取细胞系的总RNA进行深度测序与数据分析，得到图4中d的结果。将pZD-miR-FF8(作为内参)和如下6种SMC表达载体中的任一种共转染HEK293细胞系：pZD-SMC-miR-6F、pZD-SMC-miR-12F、pZD-SMC-miR-18F、pZD-SMC-miR-6R、pZD-SMC-miR-12R和pZD-SMC-miR-18R(图9)，转染48小时后提取细胞系的总RNA用表2中的引物进行RT-PCR，检测表2中的pri-miRNA基因的表达量，得到图4中c的结果。表2、RT-PCR引物pri-miRNA基因上游引物序列(5'->3')下游引物序列(5'->3')miR-FF3基因CCTATTGTATTCAGCCCATATCGAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-FF4基因CCTTTAATTAAAGACTTCAAGCGAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-FF5基因CCTTAATTGTCAAATCAGAGTGCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-FF6基因CCTCGAAGTACTCAGCGTAAGTGAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-FF7基因CCATGTGACGAACGTGTACATCGAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-FF8基因CCGGGTTGGCACCAGCAGCGCACAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-LZ1基因CCAAATCGCTGATTTGTGTAGTCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-LZ3基因CCTTCTGCTTCAATCAGCGTGCCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-LZ4基因CCAATCCGAGCCAGTTTACCCGCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-LZ5基因CCCTCGCCGCACATCTGAACTTCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-LZ6基因CCCGTGGGTTTCAATATTGGCTTAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR1基因CCATATGTGGCACAACATGTCGCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR2基因CCAGTATTAGGAAACTTCTTGGCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR4基因CCTGTTCATTTTTGAGAACTCGCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR5基因CCTTACTAACGGGATTTCACGAGAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR6基因CCTGTTGGACGACGAACTTCACCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR8基因CCTATCTTCTTCAATATCAGGCCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR11基因CCATTGGAAAAGAATCCTGGCCGAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-RR12基因CCACAAGCACCCCAATCATGGCCAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGmiR-21基因CCTAGCTTATCAGACTGATGTTGAAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCGU6基因CCTCGTGAAGCGTTCCATATTCTAAAATCGAGCACCAGTTACGCATGCCG实施例4、合成miRNA簇靶向同一基因会显著降低脱靶效应若成熟miRNA的种子区(2-8nt)能够与非靶mRNA进行完全配对就可能引起RNAi发生，从而引起脱靶效应。为了检测SMC中单个SME的脱靶效应，本实施例设计了如图4中b所示的荧光报告基因检测系统。构建了一系列包含不同SME的SMC载体(下述8种载体中的任一种：实施例3中的pZD-SMC-miR-1F、pZD-SMC-miR-2F、pZD-SMC-miR-3F、pZD-SMC-miR-6F、pZD-SMC-miR-9F、pZD-SMC-miR-12F、pZD-SMC-miR-15F和pZD-SMC-miR-18F)，根据SMC中SME的组分，将18个串联的与合成miRNA完全互补的靶序列克隆到荧光报告基因(mKate)的3’-UTR中，得到质粒pZD-hEF1α-mKate2-1xTarget^multiple；同时，将miR-FF3的4个重复的具有相同种子区的不完全匹配的脱靶序列克隆至荧光报告基因(EBFP)的3’-UTR中，得到质粒pZD-hEF1α-EBFP2-4xTarget^FF3-mis；最后，这三种质粒与转染参照pCMV-iRFP(表达荧光报告基因iRFP)同时共转染HEK293细胞(图9)，通过FACS检测报告基因mKate2和EBFP的表达情况。结果表明，随着SMC中SME数量的增加，miR-FF3引起的脱靶效应在逐渐降低(图4中b，右下图)。图4b中，横坐标1、2、3、6、9、12、15、18分别表示转染pZD-SMC-miR-1F、pZD-SMC-miR-2F、pZD-SMC-miR-3F、pZD-SMC-miR-6F、pZD-SMC-miR-9F、pZD-SMC-miR-12F、pZD-SMC-miR-15F和pZD-SMC-miR-18F的细胞。实施例5、SMC可以通过合适的方法整合进入哺乳动物细胞系SMC含有大量的重复SME，SME间的序列重复度高达69.5％，其转录的mRNA可能存在复杂的二级结构。这些序列特征无疑将会增加SMC基因组整合的难度。本实施例探讨了基于慢病毒载体系统、转座子系统(PBase转座酶与piggyBac系统)和核酸酶系统(CRISPR/Cas9)在哺乳动物细胞系中进行SMC基因组整合的可行性。研究发现CRISPR/Cas9技术在进行基因定点敲入时，非同源依赖的DNA修复(homology-independentDNArepair)的成功率远高于同源重组(Homologousrecombination)。因此，选择了AAVS在人基因组中的整合的热点区进行基于非同源依赖的DNA修复的整合(图6中b)。根据每种载体系统的特点构建了一系列包含不同数目的SME的SMC质粒(图6中a)，并在HEK293细胞中进行基因组整合实验。其中，对于piggyBac转座系统和CRISPR/Cas9技术，通过测定一定时间内荧光报告基因的表达变化情况对整合效率进行定量描述。对感染或转染后细胞进行抗性筛选，提取感染后7天和转染后15天的细胞系的基因组DNA，通过PCR技术检测SMC的完整性。结果表明，对于慢病毒载体系统而言，在成功整合至基因组的细胞中，当SMC中包含的SME超过6个，保持SMC完整的比例将大大降低(图6中c，右图)。说明慢病毒载体对重复片段的容忍度较低。通过piggyBac系统和CRISPR/Cas9技术均可以检测到成功整合的包含18个SME的完整的SMC(图6中c，左图和中图)，但整合效率随着SMC中包含的SME数量的增加而降低，其中，当SMC数量不超过6个时，PBase介导的整合率高于CRISPR/Cas9技术(图6中d)。这可能因为PBase介导的是多位点随机整合，而CRIPSR/Cas9是特异性位点整合。当SMC数量超过15个时，两种整合方法筛选到的细胞系中能成功检测到完整SMC的概率很低(图6中c和d)。图6中c左图和d左图的实验方法如下：将Pbase和一系列包含不同SME的SMC载体(下述10种载体中的任一种：pB-SMC-miR-1F、pB-SMC-miR-2F、pB-SMC-miR-3F、pB-SMC-miR-4F、pB-SMC-miR-5F、pB-SMC-miR-6F、pB-SMC-miR-9F、pB-SMC-miR-12F、pB-SMC-miR-15F和pB-SMC-miR-18F)共转染HEK293细胞，使用pDT7004使转染的DNA总量相同。通过FACS检测转染后2、5、7、9、11、15和17天的HEK293细胞中报告基因EYFP的表达情况，同时设置转染不含转座酶质粒的对照，即对照只转染pDT7004和上述一系列包含不同SME的SMC载体，得到图6中d左图的结果。转染HEK293细胞2天后通过浓度为1μg/mL的Puromycin筛选稳定的克隆，筛选持续2周后进行基因组DNA的提取；然后，对提取的基因组DNA使用LA-Taq酶和表3中的引物对TT13290_5-link1和TT13293_3-link2进行PCR扩增来鉴定转染7天后细胞中的SMC的完整性，得到图6c左图的结果。该实施例中pB系列的表达载体分别是将pB-SMC-B按照实施例2利用Goldengate体外组装miRNA基因簇的方法，通过BsaI和T4连接酶介导的GoldenGateassembly将pB-SMC-B的3723-4185替换为相应的miR-XF即得到pB-SMC-miR-XF。如替换为miR-1F即得到pB-SMC-miR-1F，替换为miR-2F即得到pB-SMC-miR-2F，替换为miR-3F即得到pB-SMC-miR-3F，替换为miR-4F即得到pB-SMC-miR-4F。图6中c中图和d右图是用pZD-CAG-Cas9、pgRNA-T2和一系列包含不同SME的SMC载体(下述10种pT2载体中的任一种：pT2-SMC-miR-1F、pT2-SMC-miR-2F、pT2-SMC-miR-3F、pT2-SMC-miR-4F、pT2-SMC-miR-5F、pT2-SMC-miR-6F、pT2-SMC-miR-9F、pT2-SMC-miR-12F、pT2-SMC-miR-15F和pT2-SMC-miR-18F)共转染HEK293细胞，使用pDT7004使转染的DNA总量相同。通过FACS检测转染后2、5、7、9和11天的HEK293细胞中报告基因EYFP的表达情况，同时设置转染不含pZD-CAG-Cas9质粒的对照，即对照只转染pDT7004、pgRNA-T2和上述一系列包含不同SME的SMC载体，得到图6中d右图的结果。转染HEK293细胞2天后通过浓度为1μg/mL的Puromycin筛选稳定的克隆，筛选持续2周后进行基因组DNA的提取；然后，对提取的基因组DNA使用LA-Taq酶和表3中的引物对TT13290_5-link1和TT13293_3-link2进行PCR扩增来鉴定转染7天后细胞中的SMC的完整性，得到图6c中图的结果。其中，pT2-SMC-miR-1F、pT2-SMC-miR-2F、pT2-SMC-miR-3F、pT2-SMC-miR-4F、pT2-SMC-miR-5F、pT2-SMC-miR-6F、pT2-SMC-miR-9F、pT2-SMC-miR-12F、pT2-SMC-miR-15F和pT2-SMC-miR-18F是分别将表1的pT2-SMC-B按照实施例2利用Goldengate体外组装miRNA基因簇的方法，通过BsaI和T4连接酶介导的GoldenGateassembly将pT2-SMC-B的2765-3227位替换为相应的miR-XF(X＝1,2,3,4,5,6,9,12,15或18)得到pT2-SMC-miR-XF，如替换为miR-1F即得到pT2-SMC-miR-1F，替换为miR-2F即得到pT2-SMC-miR-2F，替换为miR-3F即得到pT2-SMC-miR-3F，替换为miR-4F即得到pT2-SMC-miR-4F。图6中c右图是用pCMV-dR8.2dvpr、pCMV-VSV-G和一系列包含不同SME的SMC载体(下述10种慢病毒载体中的任一种：pLV-SMC-miR-1F、pLV-SMC-miR-2F、pLV-SMC-miR-3F、pLV-SMC-miR-4F、pLV-SMC-miR-5F、pLV-SMC-miR-6F、pLV-SMC-miR-9F、pLV-SMC-miR-12F、pLV-SMC-miR-15F和pLV-SMC-miR-18F)共转染HEK293FT细胞，转染48小时候收集病毒上清。将病毒上清感染HEK293细胞2天后通过浓度为1μg/mL的Puromycin筛选稳定的克隆，筛选持续1周后进行基因组DNA的提取；然后，对提取的基因组DNA使用LA-Taq酶和表3中的引物对TT13290_5-link1和TT13293_3-link2进行PCR扩增来鉴定转染7天后细胞中的SMC的完整性。其中，pLV-SMC-miR-1F、pLV-SMC-miR-2F、pLV-SMC-miR-3F、pLV-SMC-miR-4F、pLV-SMC-miR-5F、pLV-SMC-miR-6F、pLV-SMC-miR-9F、pLV-SMC-miR-12F、pLV-SMC-miR-15F和pLV-SMC-miR-18F是分别将表1的pLV-SMC-B按照实施例2利用Goldengate体外组装miRNA基因簇的方法，通过BsaI和T4连接酶介导的GoldenGateassembly将pLV-SMC-B的4308-4770位替换为相应的miR-XF(X＝1,2,3,4,5,6,9,12,15或18)得到pLV-SMC-miR-XF，如替换为miR-1F即得到pLV-SMC-miR-1F，替换为miR-2F即得到pLV-SMC-miR-2F，替换为miR-3F即得到pLV-SMC-miR-3F，替换为miR-4F即得到pLV-SMC-miR-4F。表3.基因组DNA扩增引物TT13290_5-link1TGCTAAAGGTGAAGTTCGTCGTCCAACATTATCATT13293_3-link2CCTGCAGAATGTAGCCATCCATCCTTGTCAATCA当前第1页1 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